CN111465703A - 分析乙型肝炎病毒突变的方法及其用途 - Google Patents
分析乙型肝炎病毒突变的方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111465703A CN111465703A CN201880079424.8A CN201880079424A CN111465703A CN 111465703 A CN111465703 A CN 111465703A CN 201880079424 A CN201880079424 A CN 201880079424A CN 111465703 A CN111465703 A CN 111465703A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbv
- orf
- subject
- subgenotype
- genotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 205
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 136
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title abstract description 550
- 101000713368 Bovine immunodeficiency virus (strain R29) Protein Tat Proteins 0.000 claims abstract description 446
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 116
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 114
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 112
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 claims abstract description 108
- 241000285424 HBV genotype C Species 0.000 claims abstract description 43
- 241000285387 HBV genotype A Species 0.000 claims abstract description 40
- 241000285452 HBV genotype B Species 0.000 claims abstract description 39
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 174
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 172
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 169
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 169
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 80
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 75
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 63
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 63
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 47
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 47
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 38
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 33
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 31
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 claims description 21
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 20
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 claims description 20
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 claims description 13
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 claims description 13
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 claims description 13
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 7
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 7
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims description 6
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 abstract description 19
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 abstract description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 64
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 13
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 3
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 208000016350 chronic hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 101001122597 Homo sapiens Ribonuclease P protein subunit p20 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000532838 Platypus Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 102100028674 Ribonuclease P protein subunit p20 Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
基于HBV基因组S ORF区域的非同义突变的频率，在感染HBV基因型A、B或C的受试者中确定肝脏炎症状态或鉴定对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的方法，以及相关***、试剂盒、测量工具、试剂、设备、计算机可读介质、寡核苷酸引物对和装置，及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及用于确定乙型肝炎病毒(HBV)在感染HBV基因型A、基因型B或基因型C的受试者中乙型肝炎病毒(HBV)的肝脏炎症状态、确定乙型肝炎病毒(HBV)的遗传状态、鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的方法，以及相关***、试剂盒、用途、设备、计算机可读介质和装置。
背景技术
慢性乙型肝炎(CHB)是由乙型肝炎病毒(HBV)在感染乙型肝炎病毒的患者的肝细胞中的高水平复制所引起的慢性肝脏炎症的一种形式。如果不治疗，CHB会导致肝脏并发症，包括炎症、肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。现代抗病毒治疗能抑制活动性肝脏炎症患者的乙型肝炎病毒复制，从而降低肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的发病率。这些治疗还可以逆转预先存在的肝损伤。
HBV感染患者通过定期血液检测来测量血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，其是一种肝酶，当肝损伤发生时会释放到血液中，表明有肝脏炎症。对血清ALT升高的患者开始抗病毒治疗大大降低了未来出现肝脏并发症的风险。然而，对于一个子集的患者来说，在血清ALT水平没有升高的情况下，会出现肝脏炎症和CHB。因此，这些患者出现了通常无法治疗的晚期疾病。
持续需要替代的实验室检查来检测或监测HBV感染患者的肝脏炎症，鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，和/或为关于HBV感染患者的抗病毒治疗的临床决策提供信息。
本发明的目的是满足这些需要中的一个或多个，或者至少为公众提供有用的选择。
在一个方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S开放阅读框(S ORF)的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的方法，该方法包括
a)基于与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，获得存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，以确定在S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率；和
b)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
在另一个方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的***，该***包括
a)测量工具，其分析关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
b)处理器，
c)计算机可读介质，和
d)存储在计算机可读介质上的分析工具，其适配成在处理器上执行根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定HBV的S ORF区域的非同义突变频率，确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症；
步骤(a)的分析或步骤(d)的确定基于与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列。
在一个实施方案中，该***包括测量工具，测量工具包括一种或多种寡核苷酸引物，该一种或多种寡核苷酸引物靶向或基于与受试者所感染的该HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，用于确定该S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。
在一个实施方案中，该***包括测量工具，测量工具包括一种或多种寡核苷酸引物，该一种或多种寡核苷酸引物靶向与受试者所感染的该HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，用于确定该S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。
在一个实施方案中，该***包括测量工具，测量工具包括一种或多种寡核苷酸引物，该一种或多种寡核苷酸引物基于与受试者所感染的该HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，用于确定该S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。
在一个替代性实施方案中，***包括测量工具，该测量工具产生关于存在于从该受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分域的序列信息，并且分析工具适配成选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，并将测量工具产生的序列信息与S ORF参考序列进行比较，以确定S ORF区域中两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。
在另一个方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的方法，该方法包括
通过包括以下的方法确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
a)提供关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，
b)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
c)将该序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
d)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
在又一方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的***，该***包括
a)测量工具，其产生关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，
b)处理器，
c)计算机可读介质，以及
d)分析工具，其存储在计算机可读介质上，该分析工具适配成通过以下在处理器上执行以确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
i)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
ii)将由该测量工具产生的序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
iii)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
在再一方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的试剂盒，该试剂盒包括
a)寡核苷酸引物对，其用于扩增存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物，
引物对包括：
i)正向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当HBV是基因型A时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
ii)反向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸100-2000，
b)扩增试剂，
c)分析工具，其用于在处理器上通过以下执行以确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
i)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
ii)将由测量工具产生的关于存在于扩增引物中的S ORF区域的至少一部分的序列信息与S ORF参考序列进行比较，以确定S ORF区域中两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
iii)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或
d)a)至c)中任何两个或多个的任何组合。
在再一方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的试剂盒，该试剂盒包括
a)寡核苷酸引物对，其用于扩增存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物，
引物对包括：
i)正向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当HBV是基因型A时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
ii)反向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸100-2000，
b)扩增试剂，
c)一个或多个核苷酸探针，其与HBV的S ORF区域中的特异性核苷酸序列杂交，以产生关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，
d)分析工具，其用于在处理器上通过以下执行以确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
i)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
ii)将由测量工具产生的关于存在于扩增引物中的S ORF区域的至少一部分的序列信息或由一个或多个核苷酸探针产生的序列信息与S ORF参考序列进行比较，以确定SORF区域中两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
iii)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或
e)a)至d)中的任何两个或多个的任何组合。
在另一方面，本发明涉及测量工具在***制造中的用途，该测量工具生成关于从受试者获得的样本中存在的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，该***用于在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险；
其中在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险是通过本文所述的方法进行的。
在又一方面，本发明涉及试剂在试剂盒或***制造中的用途，该试剂生成关于从受试者获得的样本中存在的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，该试剂盒或***用于在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险；
其中在受试者中确定HBV肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险是通过本文所述的方法进行的。
在另一个方面，本发明涉及用于在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率的设备，该设备包括：
a)存储器，其存储指令；和
b)处理器，其从存储器检索指令并执行指令
i)通过以下来确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
将从受试者获得的样本中存在的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息与SORF参考序列进行比较，以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率。
在另一方面，本发明涉及一种其上存储有指令的计算机可读介质，这些指令在由处理器执行时使该处理器执行实施一种方法的操作，该方法通过以下来确定感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者的HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
选择与受试者感染HBV的S ORF亚基因型相对应的S ORF参考序列，
将存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息与SORF参考序列进行比较，以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸引物对在制备试剂盒或***中的用途，寡核苷酸引物对用于扩增从受试者获得的样本中存在的HBV的S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物，试剂盒或***用于测定的在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中，受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，
引物对包括
a)正向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C型时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当HBV是基因型A型时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
b)反向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸100-2000；
其中，在受试者中确定HBV肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险是通过本文所述的方法进行的。
在另一个方面，本发明涉及与HBV的S ORF区域中的特定核苷酸序列杂交的一种或多种核苷酸探针在制造试剂盒或***中的用途，用于产生关于存在于从制造HBV的受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，该试剂盒或***用于在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，
其中在受试者中确定HBV肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险是通过本文所述的方法进行的。
在另一方面，本发明涉及使用
a)测量工具，其产生关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，
b)处理器，
c)计算机可读介质，和
d)分析工具，其存储在计算机可读介质上，该分析工具适配成通过以下在处理器上执行以确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
将由该测量工具产生的序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率；
在制备一种***，该***在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险。
在另一个方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的装置，该装置包括
a)用于扩增存在于从所述受试者获得的样本中的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物的工具，
b)以及用于从扩增引物产生序列信息的工具，
c)通过以下用于确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率的工具
i)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
ii)将该序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
iii)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
在另一个方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的装置，该装置包括
a)用于产生受试者所感染的HBV的S ORF的序列信息的工具，和
b)用于通过以下确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率的工具
i)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
ii)将该序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
iii)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
在一个实施方案中，用于扩增存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物的工具包括本文的寡核苷酸引物对。
在一个实施方案中，用于产生序列信息的工具是核苷酸测序仪。在另一个实施方案中，用于产生序列信息的工具包括一个或多个核苷酸探针，其与HBV的S ORF区域中的特异性核苷酸序列杂交，以产生关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息。
在另一方面，本发明涉及使用
a)寡核苷酸引物对，其用于扩增存在于从所述受试者获得的样本中的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物，
引物对包括
i)正向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当HBV是基因型A时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
ii)反向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸100-2000；和
b)核苷酸测序仪，其用于从扩增引物产生序列信息，
c)处理器，
d)计算机可读介质，和
e)分析工具，其存储在计算机可读介质上，该分析工具适配成通过以下在处理器上执行以确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
将由该核苷酸测序仪产生的序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率；
在制备一种***，该***在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险。
在另一方面，本发明涉及使用
a)寡核苷酸引物对，其用于扩增存在于从所述受试者获得的样本中的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物，
引物对包括
i)正向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当HBV是基因型A时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
i)反向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸100-2000；和
b)扩增试剂，和
c)分析工具，其存储在计算机可读介质上，该分析工具适配成通过以下在处理器上执行以确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
将由测量工具产生的关于存在于扩增引物中的S ORF区域的至少一部分的序列信息与S ORF参考序列进行比较，以确定S ORF区域中两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率；
在制备一种***，该***在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险。
在另一方面，本发明涉及使用
a)一个或多个核苷酸探针，其与HBV的S ORF区域中的特异性核苷酸序列杂交，以产生关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，和
b)分析工具，其存储在计算机可读介质上，该分析工具适配成通过以下在处理器上执行以确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
将所述序列信息与所述S ORF参考序列进行比较以确定所述S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的所述频率，
基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率；
在制备一种***，该***在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险。
在另一方面，本发明涉及在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中监测对治疗的应答，预测对治疗的应答，选择治疗，确定治疗的最佳时机、持续时间或方案的方法，该方法包括
通过包括以下的方法确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
i)提供关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，
ii)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
iii)将该序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
iv)基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率，以基于HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率监测对免疫治疗的应答，预测对免疫治疗的应答，选择治疗，或确定治疗的最佳时机、持续时间或方案。
在各种实施方案中，治疗为化学治疗、药物治疗、免疫治疗、基因治疗或其任何两种或更多种的组合。在一个实施方案治疗是免疫治疗。
在另一方面，本发明涉及监测对免疫治疗的应答，预测对免疫治疗的应答，选择治疗，确定感染HBV的受试者中的治疗的最佳时机，持续时间或方案的方法，HBV包括HBV基因型A，B或C型的S ORF，方法包括
通过包括以下的方法确定HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
i)提供关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，
ii)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
iii)将该序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
iv)基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率，以基于HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率监测对免疫治疗的应答，预测对免疫治疗的应答，选择治疗，或确定治疗的最佳时机、持续时间或方案。
除非另外说明或指示，否则本文中描述的任何实施例或优选项可涉及本文中单独或与本文中描述的任何一个或多个实施例或优选项组合的任何方面。
在一个实施方案中，受试者感染了包括HBV基因型C型、HBV基因型B型、HBV基因型A型或其任何两种或更多种的组合的S ORF的HBV。
在各种实施方案中，非同义突变的频率在S ORF区域中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、35、40、45、50、55或60个或更多个密码子处确定，并且各种范围可以选自任何这些值之间，例如HBV的S ORF区域的约2至约60、约2至约50、2至约40、约2至约35、约2至约31、约2至约30、约2至约25、约2至约20、约2至约15、约2至约10、约2至约5、约3至约60、约3至约50、约3至约40、约3至约30、约3至约20、约3至约10、约4至约40、约4至约30、约4至约20、约4至约10、约5至约60、约5至约50、约5至约40、约5至约30、约5至约20、约5至约10、约7至约40、约7至约30、约7至约20、约7至约10、约10至约60、约10至约50、约10至约40、约10至约30、约10至约20、约10至约15、约20至约60、约20至约50、约20至约40、约25至约60、约25至约50或约25至约40个密码子。
在各种实施方案中，非同义突变的频率在与SEQ ID NO：1-14任一个的S ORF参考序列的4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387和391位处的密码子相对应的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个密码子处确定，并且各种范围可以选自任何这些值之间，例如与SEQ ID NO：1-14任一个的S ORF参考序列的4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387和391位处的密码子相对应的约0至约32、约0至约25、约0至约20、约2至约32、约2至约25、约2至约20、约3至约32、约3至约25、约3至约20、约5至约32、约5至约25、约5至约20、约8至约31、约8至约25、约8至约20、约10至约32、约10至约25、约10至约20、约12至约32、约12至约25、约12至约20、约15至约32、约15至约25或约15至约20个密码子。
在各种实施方案中，在与SEQ ID NO：1-14任一个，或其任何两个或多个的组合的SORF参考序列的4、35、51、54、56、120、132、135、141、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、334、358、363、377、378、382和387位处的密码子相对应的两个或多个密码子处测定非同义突变的频率。在一个实施方案中，在与SEQ ID NO：1-14中任一个的S ORF参考序列的4、120、132、135和378位处的密码子相对应的两个或多个密码子处确定非同义突变的频率。
在一个实施方案中，在正选择压力下的两个或多个密码子处测定非同义突变的频率。
在各种实施方案中，在包括与SEQ ID NO：1-14中任一个的S ORF参考序列的密码子1-400、1-350、1-300、1-250、1-200、1-150、1-100、1-50、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200、100-150、150-400、150-350、150-300、150-250、150-200、200-400、200-350、200-300、200-250、250-400、250-350、250-300、300-400、300-350或350-400相对应的密码子的HBV的S ORF区域的一部分内的两个或多个密码子处确定非同义突变的频率。
在一个实施方案中，选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列，包括
a)将所述序列信息与一个或多个S ORF亚基因型参考序列比较，以确定所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型，和
b)选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列。
在另一个实施方案中，选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列，包括
a)提供关于所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型的信息，和
b)选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列。
在各种实施方案中，S ORF参考序列是
a)当HBV的亚基因型为A1基因型，SEQ ID NO：1；
b)当HBV的亚基因型为A2基因型，SEQ ID NO：2；
c)当HBV的亚基因型为B1基因型，SEQ ID NO：3；
d)当HBV的亚基因型为B2基因型，SEQ ID NO：4；
e)当HBV的亚基因型为B3基因型，SEQ ID NO：5；
f)当HBV的亚基因型为B4基因型，SEQ ID NO：6；
g)当HBV的亚基因型为B5基因型，SEQ ID NO：7；
h)当HBV的亚基因型为C1基因型，SEQ ID NO：8；
i)当HBV的亚基因型为C2基因型，SEQ ID NO：9；
j)当HBV的亚基因型为C3A基因型，SEQ ID NO：10；
k)当HBV的亚基因型为C3B基因型，SEQ ID NO：11；
l)当HBV的亚基因型为C4基因型，SEQ ID NO：12；
m)当HBV的亚基因型为C5基因型，SEQ ID NO：13；或
n)当HBV的亚基因型为C6基因型，SEQ ID NO：14。
在一个实施方案中，方法包括选择包括与2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个亚基因型相对应的序列的S ORF参考序列，或该S ORF参考序列包括与HBV基因型A、B或C的2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个亚基因型相对应的序列。在一个实施方案中，S ORF参考序列与HBV基因型A、B或C的所有已知亚基因型相对应。
在各种实施方案中，产生关于包括HBV的S ORF的至少10、20、50、100、200、250、300、400、500、750、1000或1200个连续核苷酸的HBV的S ORF区域的一部分的序列信息，或寡核苷酸引物对扩增包括HBV的S ORF的至少10、20、50、100、200、250、300、400、500、750、1000或1200个连续核苷酸的HBV的S ORF区域的一部分，并且各种范围可以在任何这些值之间选择，例如约10至约1200、约200至约1200、约500至约1200、约750至约1200或约1000至约1200个连续核苷酸。
在一个实施方案中，该方法包括使用寡核苷酸引物对扩增从受试者获得的样本中存在的HBV的S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物，并产生关于扩增引物的序列信息。
在一个实施方案中，该方法包括将样本或扩增引物加入到与HBV的S ORF区域中的特定核苷酸杂交以产生序列信息的一个或多个核苷酸探针中。
在一个实施方案中，所述测量工具包括用于扩增从所述受试者获得的样本中存在的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物的寡核苷酸引物对。在一个实施方案中，测量工具包括用于从扩增引物或从样本产生序列信息的核苷酸测序仪。在一个实施方案中，测量工具包括用于扩增从受试者获得的样本中存在的HBV的S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物的寡核苷酸引物对和用于从扩增引物产生序列信息的核苷酸测序仪。
在一个实施方案中，测量工具包括与HBV的S ORF区域中的特定核苷酸杂交以从样本或扩增引物产生序列信息的一种或多种核苷酸探针。
在各种实施方案中，寡核苷酸引物对包括
a)正向引物，其包括与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C型时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当HBV是基因型A型时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
b)反向引物，其包括与所述受试者感染的所述HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，所述HBV基因组参考序列包括所述HBV基因组的核苷酸100-2000。
在各种实施方案中
a)寡核苷酸引物对包括
i)正向引物，其包括HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当HBV是基因型A时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
ii)反向引物，其包括与HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸100-2000；或
b)寡核苷酸引物对包括
i)正向引物，其包括HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV的亚基因型包括当HBV是基因型B或C型时的核苷酸1800-3215或当HBV是基因型A型时的核苷酸1800-3221；和
ii)反向引物，其包括与HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸700-1800；或
c)寡核苷酸引物对包括
i)正向引物，其包括HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸1500-2848；和
ii)反向引物，其包括与HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸700-1800；或
d)寡核苷酸引物对包括
i)正向引物，其包括HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸1800-3215；和
ii)反向引物，其包括与HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸832-1800；或
e)寡核苷酸引物对包括
i)正向引物，其包括HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸1800-2848；和
ii)反向引物，其包括与HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸832-1800；或
f)寡核苷酸引物对包括
i)正向引物，其包括HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸2000-2848；和
ii)反向引物，其包括与HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，HBV基因组参考序列包括核苷酸832-1500；
其中HBV基因组参考序列是与受试者感染的HBV的亚基因型相对应的SEQ ID No：15-28的任一个的序列。
在各种实施方案中，正向引物包括HBV基因组参考序列的一部分的至少约5、6、7、8、9、10、12、15、17、18、20、25、30、35、40、45或50个连续核苷酸的序列，并且各种范围可以选自这些值之间，例如HBV基因组的一部分的约5至50、5至30、7至30、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、7至25、10至25、15至25、20至25、5至20、7至20、10至20、15至20、5至15、7至15、10至15个连续核苷酸。
在各种实施方案中，反向引物包括与HBV基因组参考序列的一部分的至少约5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、25、30、35、40、45或50个连续核苷酸互补的序列，并且各种范围可以选自这些值之间，例如HBV基因组的一部分的约5至50、5至30、7至30、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、7至25、10至25、15至25、20至25、5至20、7至20、10至20、15至20、5至15、7至15、10至15个连续核苷酸。
在各种实施方案中，HBV基因组参考序列是
a)当HBV的亚基因型为A1基因型，SEQ ID NO：15；
b)当HBV的亚基因型为A2基因型，SEQ ID NO：16；
c)当HBV的亚基因型为B1基因型，SEQ ID NO：17；
d)当HBV的亚基因型为B2基因型，SEQ ID NO：18；
e)当HBV的亚基因型为B3基因型，SEQ ID NO：19；
f)当HBV的亚基因型为B4基因型，SEQ ID NO：20；
g)当HBV的亚基因型为B5基因型，SEQ ID NO：21；
h)当HBV的亚基因型为C1基因型，SEQ ID NO：22；
i)当HBV的亚基因型为C2基因型，SEQ ID NO：23；
j)当HBV的亚基因型为C3A基因型，SEQ ID NO：24；
k)当HBV的亚基因型为C3B基因型，SEQ ID NO：25；
l)当HBV的亚基因型为C4基因型，SEQ ID NO：26；
m)当HBV的亚基因型为C5基因型，SEQ ID NO：27；和
n)当HBV的亚基因型为C6基因型，SEQ ID NO：28。
在一个实施方案中，该方法包括使用两种或更多种引物来扩增包括两种或更多种密码子的S ORF区域的至少一部分，其中该两种或更多种引物各自包括SEQ ID No：1-14中任一个的S ORF参考序列的5个或更多个连续核苷酸或与SEQ ID No：1-14中任一个的S ORF参考序列的5个或更多个连续核苷酸互补。在一个实施方案中，引物中的一个或多个被设计成与S ORF参考序列的野生型密码子特异性退火，在该野生型密码子处有待确定非同义突变的频率。在一个实施方案中，一个或多个引物被设计成与包括非同义突变的S ORF参考序列的密码子特异性退火。
在一个实施方案中，基于与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，获得存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，以使用扩增受阻突变***(ARMS)确定在S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。
在各种实施方案中，HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率表明
a)受试者具有阳性肝脏炎症状态，
b)HBV受到阳性选择压力，
c)受试者易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症或具有更高的风险发展成慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或
d)a)至c)中任何两个或多个的组合。
在各种实施方案中，HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率由以下确认
a)将序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
b)基于那个密码子处非同义突变的频率为每个密码子赋予数值得分，
c)组合每个密码子的数值得分以提供代表HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率的组合数值得分。
在各种实施方案中，为具有至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或至少约50％的非同义突变的频率的每个密码子指定阳性数值得分。在各种实施方案中，每个密码子的阳性得分独立地为0.5、1、1.5、2或2.5。
在各种实施方案中，代表大于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的HBV的S ORF中的非同义突变的频率的组合数值得分表明
a)受试者具有阳性肝脏炎症状态，
b)HBV受到阳性选择压力，
c)受试者易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症或具有更高的风险发展成慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或
d)a)至c)中任何两个或多个的组合。
在各种实施方案中，受试者
a)为HBeAg阴性，
b)血清ALT水平正常，
c)具有大于约2,000IU/ml的血清HBV-DNA滴度，或
d)具有任何两个或多个a)至c)的组合。
在另一个实施方案中，受试者为HBeAg阳性或血清ALT水平升高，或为HBeAg阳性且血清ALT水平升高。
在各种实施方案中，慢性HBV感染的肝脏并发症包括肝硬化、肝癌、肝功能衰竭、肝脏炎症、肝脏损伤、肝脏功能障碍或其任何两种或更多种的组合。
本说明书中使用的术语“包括(comprising)”是指“至少部分由…组成”。当解释本说明书中包括该术语的语句时，在每个语句中该术语开头的特征都需要存在，但也可以存在其他特征。相关术语例如“包括(comprise)”和“包括的(comprised)”将以相同的方式解释。
可以广义地说本发明在于在本申请说明书中单独地或共同地参考或指示的部分、要素和特征，以及任何两个或更多个所述部分、要素或特征的任何或所有组合，并且其中本文提及的具体整数在本发明涉及的领域中具有已知的等同物，认为这些已知的等同物并入本文，如同单独阐述一样。
提及本文公开的数字范围(例如，1至10)还旨在包括提及该范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的有理数的任何范围(例如，2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围特此明确公开。这些仅仅是具体意图的实例，并且在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合被认为以类似的方式在本申请中明确地陈述。
在本说明书中，已经参考外部信息源，包括专利说明书和其他文献，这通常是为了提供用于讨论本发明的特征的上下文。除非另有说明，否则对这样的信息源的引用不应解释为在任何权限下承认这样的信息源是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。
本发明的其他方面可从以下仅通过实例并参考附图给出的描述中变得显而易见。
附图说明
现在将仅通过实例并参考附图来描述本发明，在附图中：
图1是受试者工作特征(ROC)曲线，显示HBV的S ORF非同义突变的频率对预测肝脏疾病的敏感性和特异性之间的关系。将16位患HBeAg阴性、基因型C型的慢性HBV感染(HBV-DNA>2,000IU/ml和正常血清ALT水平)的受试者分类为已经发展为严重的乙型肝炎相关的肝脏疾病(肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌-A组)或在获得血清样本后10年无活性肝脏疾病(B组)(每组8名受试者)。分析来自每个受试者的6个克隆。在每个受试者中计数在表6中鉴定的32个阳性选择的密码子(Pr>0.90)的数目，表6具有包括非同义突变的6个克隆中的2个或更多个。ROC曲线绘制了各可能得分(以小方块表示)的测试敏感性(具有大于或等于该得分的A组受试者的数目除以A组受试者的总数)和特异性(具有大于或等于该得分的B组受试者的数目除以B组受试者的总数)之间的关系。
图2是生存分析，将9名得分大于或等于3的受试者(组1)和7名得分小于或等于2的受试者(组0)在10年随访时的结果进行比较。如以上针对图1计算得分。
具体实施方式
本发明人已经鉴定了HBV基因组的S ORF中处于正选择压力下的密码子。本发明人已经出人意料地确定，基于在阳性选择压力下密码子处的非同义突变的频率来确定跨越HBV的S ORF区域的非同义突变的频率对于在感染HBV的患者中检测或预测早期肝脏炎症和/或发展慢性HBV感染的肝脏并发症的风险增加是有用的。因此，本发明涉及在感染HBV基因型A，B或C型的受试者中通过确定HBV的S ORF区域中两个或多个密码子处的非同义突变的频率来确定HBV的肝脏炎症状态，确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险的方法。本发明还提供了相关***、试剂盒、测量工具、试剂、设备、计算机可读介质、寡核苷酸引物对和装置及其用途。
1.定义
如本文所用的短语“包括HBV基因型A，B或C型的S ORF的HBV”是指包括基本上对应于HBV基因型A，B或C型中的任一种的亚基因型的S ORF区域的S ORF的HBV。其包含包括与本文的HBV亚基因型A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3A、C3B、C4、C5和C6型中的任一种的SORF参考序列具有基本上序列同一性的S ORF的HBV。它还包含包括与HBV基因型A、B或C的任何尚未分类或未鉴定的亚基因型的S ORF共有序列具有基本上序列同一性的S ORF区域的HBV。在各种实施方案中，HBV具有与本文描述的SORF参考序列具有至少约70％、75％、80％、90％、95％或至少99％序列同一性的S ORF。在一个实施方案中，除了一个或多个同义替换之外，S ORF的核苷酸序列基本上与本文描述的S ORF参考序列相同。
本文所用的术语“***缺失(indel)”是指野生型HBV基因组中一个或多个核苷酸的***或缺失。
本文所用的术语“非同义突变”是指HBV的S ORF序列中的单核苷酸突变，其导致编码与野生型、共有或参考HBV的S ORF序列中在等同密码子位置编码的氨基酸不同的氨基酸的密码子。
本文所用的术语“同义突变”或“同义替换”是指HBV的S ORF序列中的单核苷酸突变或替换，其导致编码与野生型、共有或参考HBV的S ORF序列中在等同密码子位置编码的氨基酸相同的氨基酸的密码子。
如本文所用，术语“引物”是指包括10个或更多个核苷酸的序列的短核苷酸链，其与模板DNA序列杂交并且充当聚合酶链反应(PCR)的起始点。为了用于本文的PCR反应，合适的正向引物包括HBV基因组的非模板链(也称为正链或有义链)的序列的至少约5个连续核苷酸的序列。正向引物结合HBV基因组的模板链(也称为负链或反义链)。用于本文描述的PCR反应的合适的反向引物包括HBV基因组的模板链(也称为负链或反义链)的序列的至少约5个连续核苷酸。反向引物结合HBV基因组的非模板链(以下也称为正链或有义链)。
本文所用的短语“在正选择压力下”是指HBV的S ORF中的密码子，在该密码子处非同义替换的速率超过随机过程所预期的速率。密码子进化的替换率可以使用本领域已知的方法确定，包括本文实施例中描述的方法。例如，替换率可以通过构建从一个或多个受试者获得的HBV的S ORF序列的***发育，然后使用例如最大似然***发育分析(PAML)等方法估计跨越***发育树的处于正选择压力下的密码子的总比例来推断。
术语“基因型”、“亚基因型”和“亚亚基因型”(以及相关的分类)是指在病毒进化过程中已经出现的乙型肝炎病毒的遗传上不同的组。本文描述了本领域目前公认、的共有的野生型核苷酸序列。这些术语旨在包含将来确认的任何新的基因型、亚基因型和亚亚基因型。
“受试者”是指脊椎动物，其为哺乳动物，例如人。
本文所用的短语“慢性HBV(CHB)感染的肝脏并发症”和相关术语总体涉及由慢性HBV感染引起的任何肝脏病理或病症，包括但不限于肝脏炎症、肝脏损伤、肝脏功能障碍、肝硬化、肝癌(例如肝细胞癌)和肝功能衰竭。
如本文所用，术语“和/或”意指“和”或“或”，或两者。
如本文所用，跟随名词的“(s)”意指名词的复数和/或单数形式。
本文所用术语“野生型”与基因组序列、S ORF序列及其密码子有关，给定的HBV基因型、亚基因型或亚亚基因型的氨基酸序列是指该HBV基因型、亚基因型或亚亚基因型的公认共有序列或密码子。
2.HBV基因组
HBV是属于嗜肝DNA病毒科的DNA病毒。
HBV环状基因组封装在蛋白核心中，部分为双链。该基因组由在其5'端附着于聚合酶蛋白的非编码阴性(模板)链组成。负链的3'端核苷酸与5'序列重叠。阳性编码链通常长度为1700-2800个核苷酸，并且阳性链的5'序列桥接阴性链的3'和5'端之间的间隙。在进入肝细胞核时，两条链都完成产生称为共价闭合环状DNA(cccDNA)的环状双链基因组。基因型B型和基因型C型病毒的cccDNA长3,215个核苷酸。基因型A型病毒cccDNA长3221个核苷酸。cccDNA含有4个重叠的开放阅读框(ORF)。C ORF编码HBeAg的核心蛋白和P25前体蛋白。预计X ORF编码转录反式激活因子。S ORF编码成熟病毒体的3种包膜蛋白，P ORF编码与HBV基因组复制相关的具有几种功能的蛋白。
个体慢性感染受试者之间HBV序列有很大的差异。该序列变异存在保守模式，使得大多数HBV被分为广泛的组，称为基因型、亚基因型和亚亚基因型。到目前为止，已经在人群中定义了9种乙型肝炎病毒的基因型。它们被称为基因型A、B、C、D、E、F、G、H和I型，并且它们通过在它们的核苷酸序列的至少8％中的核苷酸替换的单倍型来区分。这些基因型在其世界各地的地理分布以及引起疾病的能力方面不同。例如，基因型C型的乙型肝炎病毒主要出现在东亚和太平洋，并且与发展成肝硬化和肝癌的最高速率相关。
在称为亚基因型的每种基因型内存在第二水平的变异。这些亚基因型的地理分布也不同。公认的乙型肝炎病毒的基因型A、B和C型的亚基因型有A1和A2；B1、B2、B3、B4和B5；以及C1、C2、C3、C4、C5和C6。此外，在汤加(Tong)描述了亚基因型C3型的两个亚亚基因型，它们被称为亚亚基因型C3A和C3B型。鉴于仍在鉴定含有固定核苷酸替换单倍型的乙型肝炎病毒序列，这些单倍型与任何已知的亚基因型或亚亚基因型都不匹配，很可能在未来会鉴定出更多的亚型和更多的亚亚基因型。
定义HBV的基因型、亚基因型和亚-亚基因型的一些序列变异出现在S ORF中。因此，为了确定跨S ORF的非同义突变的频率，有必要选择如下的与受试者病毒的亚基因型相对应的S ORF参考序列用于根据本发明的方法的分析。
乙型肝炎病毒序列变异的另一个来源是来自感染相同患者的不同基因型的两种病毒的遗传物质的重组。其中最常见的是基因型B/C型、基因型C/D型或基因型A/D型。最后，在患者体内，由于选择压力和基因漂变，乙型肝炎病毒的优势序列随时间变化。这种个体内变异可以包括定义基因型、亚基因型和亚亚基因型的单倍型中包括的核苷酸突变。
HBV亚基因型A1和A2型的基因组的共有核苷酸序列分别在SEQ ID NO：15和16中列出。
HBV亚基因型B1、B2、B3、B4和B5型的基因组的共有核苷酸序列分别在SEQ ID NO：17-21中列出。
HBV亚基因型C1、C2、C3A、C3B、C4、C5和C6型的基因组的共有核苷酸序列分别在SEQID NO：22-28中列出。以下描述了用于确定特定HBV亚基因型的HBV基因组的共有核苷酸序列的方法。
3.发明方法
本发明的方法包括以下步骤
a)基于与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，获得存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，以确定在S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，
b)根据两个或多个密码子的非同义突变频率确定S ORF区域的非同义突变频率，以确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变频率确定受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
获取样本和提取病毒DNA
从受试者获得的包括HBV DNA的任何样本是合适的。
在一些实施方案中，将从受试者获得的样本加工以在本发明的方法中使用。例如，在一个实施方案中，样本包括从提取自受试者的全血样本中分离的血清或血浆。在另一个实施方案中，样本包括新鲜冷冻组织或***固定的组织。在各种实施方案中，样本包括全血、血清、血浆或肝组织。在各种实施方案中，组织样本在活组织检查或手术期间获得。
可以使用本领域已知的任何合适的方法从样本中提取HBV DNA，方法包括但不限于实施例中描述的方法。用于提取病毒DNA的合适的商业试剂盒是广泛可获得的并且是本领域熟知的。
选择S ORF参考序列
由于HBV亚基因型之间(包括S ORF区域内)的核苷酸序列变异，在各种实施方案中，该方法包括选择或设计合适的S ORF参考序列。HBV基因组之间的重组事件可以导致HBV基因型和亚基因型的混合，因此可能需要特异性地确定S ORF区域的亚基因型。
在一个实施方案中，方法包括提供关于染受试者的HBV的S ORF的亚基因型的信息，例如来自早期测试的信息，并选择与该亚基因型相对应的S ORF参考序列。
在另一个实施方案中，方法包括将关于来自如本文描述的从受试者获得的样本的HBV的S ORF区域的序列信息与一个或多个亚基因型S ORF共有序列进行比较以确定受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型，并且选择相应的S ORF参考序列。
在一个实施方案中，方法包括将关于S ORF的至少一部分的序列信息与一个或多个HBV基因型、亚基因型或亚基因型S ORF共有序列的一个或多个序列比对。
在一个实施方案中，方法包括将关于S ORF的至少一部分的序列信息与一个或多个HBV基因型、亚基因型或亚基因型S ORF共有序列的一个或多个成对序列比对。在实施例1中描述了这种确定S ORF亚基因型的方法的实例。在各种实施方案中，序列比对使用一对多成对比对(使用但不限于BLAST、Smith-Waterman或Needleman-Wunsch算法)进行。软件可以选自一组程序，包括但不限于Burrows-Wheeler比对程序、novoalign、bowtie、mrsFAST、Partek、SOAP、MAQ、Segemehl、SSHA和Stampy。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。
在一个实施方案中，方法包括将关于S ORF的至少一部分的序列信息与一个或多个HBV基因型、亚基因型或亚基因型S ORF共有序列的一个或多个多重序列比对。用于进行多重比对的技术包括但不限于逐步比对构建、迭代方法、共性方法、隐马尔科夫模型(hidden Markov models)、***感知模型(phylogeny-aware models)、基序发现或非编码多重序列比对。可以使用的软件包括但不限于Clustal、MAFFT、T-Coffee、PRRN/PRRP、CHAOS/DIALIGN、M-Coffee、MergeAlign、POA、SAM、HMMER、PRANK、PAGAN、MEME/MAST和EDNA。
在一个实施方案中，方法包括确定序列信息优先比对的亚基因型S ORF共有序列并且选择优先比对的S ORF序列作为S ORF参考序列。
在一些实施方案中，有必要区分在感染重组病毒的患者中来自不同基因型、亚基因型或亚亚基因型的S ORF区域。在一个实施方案中，方法包括通过鉴定受试者感染的HBV的S ORF的两个或多个区域的基因型、亚基因型或亚亚基因型来构建S ORF参考序列，选择本文公开的S ORF参考序列的与不同亚基因型或亚亚基因型的每个区域相对应的区域，并且将这些区域组合以形成针对该受试者定制的全长S ORF参考序列。
在感染HBV的两种或更多种基因型、亚基因型或亚亚基因型的受试者中，在各种实施方案中，可能需要针对每种不同的基因型分别鉴定S ORF区域中非同义突变的频率。
本发明的方法适用于确定S ORF亚基因型序列可用于的HBV基因型A、B或C的任何亚基因型的S ORF中的非同义突变的频率。
HBV亚基因型的合适的S ORF参考序列可以通过比对从鉴定为该亚基因型的HBV获得的两个或多个S ORF核苷酸序列并产生共有序列来产生。适于产生共有序列的比对软件是本领域熟知的，包括本文的软件程序。
在各种实施方案中，一个或多个HBV的S ORF参考序列包括SEQ ID No：1-14的一个或多个序列。
用于HBV亚基因型A1和A2型的S ORF参考序列分别由SEQ ID NO：1和2提供。用于HBV亚基因型B1、B2、B3、B4和B5型的S ORF参考序列分别由SEQ ID NO：3-7提供。亚基因型C1、C2、C3A、C3B、C4、C5和C6的S ORF参考序列分别由SEQ ID NO：8-14提供。在各种实施方案中，与该受试者感染的HBV的S ORF区域的亚基因型相对应的S ORF参考序列包括与本文描述的那个亚基因型相对应的S ORF参考序列具有至少约90％、95％、97％、98％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，S ORF参考序列包括关于S ORF区域的一部分的序列信息。在一个实施方案中，该S ORF参考序列仅包括关于这两个或多个密码子的序列信息，在这些密码子处针对患者感染的HBV的基因型或亚基因型来确定非同义突变的频率。例如，在一个实施方案中，S ORF参考序列包括两个或多个离散的序列，其中每个序列与待确定非同义突变的频率的密码子相对应。在另一个实施方案中，参考序列包括S ORF区域的序列或其部分，其中将与待确定非同义突变的频率的两个或多个密码子不相对应的一个或多个核苷酸指定为“n”。
在一个实施方案中，S ORF参考序列包括被设计成与HBV的两个或多个亚基因型相对应的序列。例如，在一个实施方案中，S ORF参考序列包括HBV的两个或多个亚基因型的共有序列。例如，如果将S ORF参考序列设计成与HBV)的特定基因型的所有已知亚基因型相对应，则为了实施本发明的方法可能不必确定受试者感染的HBV的亚基因型。在一个实施方案中，S ORF参考序列包括与基因型C的两个或多个、三个或更多个、四个或更多个或五个或更多个亚基因型相对应的序列。在另一个实施方案中，S ORF参考序列包括与HBV基因型C型的所有已知亚基因型相对应的序列。在另一个实施方案中，S ORF参考序列包括被设计成与HBV的所有已知基因型和亚基因型相对应的序列。
将来可以鉴定HBV的另外的亚基因型。可以如上产生与这些新的亚基因型相对应的S ORF参考序列。随着新的亚基因型的核苷酸序列变得可用，这些序列可以包括在上述方法中以鉴定这些亚基因型是否存在于从受试者获得的样本中。
提供序列信息
在一个实施方案中，该方法包括
a)通过包括以下的方法确定受试者感染的HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率
i)提供关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的S ORF区域的至少一部分的序列信息，
ii)选择与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
iii)将该序列信息与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率，和
iv)基于两个或多个密码子处的非同义突变的频率确定S ORF区域中的非同义突变的频率；和
b)确定所述受试者的所述肝脏炎症状态或所述HBV的所述遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变的所述频率确定所述受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
生成序列信息
HBV基因型A的S ORF区域包括1,200个核苷酸，包括环状HBV基因组的核苷酸2854-3221和1-832。HBV亚基因型A1和A2型的S ORF的共有核苷酸序列分别在SEQ ID NO：1和2中列出。
HBV基因型B和C型的S ORF区域包括1,200个核苷酸，包括环状HBV基因组的核苷酸2848-3215和1-832。HBV亚基因型B1、B2、B3、B4和B5型的S ORF的共有核苷酸序列分别在SEQID NO：3-7中列出。HBV亚基因型C1、C2、C3a、C3b、C4、C5和C6型的S ORF的共有核苷酸序列分别在SEQ ID NO：8-14中列出。
1,200个核苷酸的S ORF区域包括400个密码子。为了在此鉴定S ORF区域的特定密码子，密码子从上述鉴定的相关亚基因型S ORF共有序列的5'端连续编号。例如，密码子1包括S ORF的核苷酸1-3，密码子2包括核苷酸4-6等至密码子400包括S ORF的核苷酸1,198-1,200。对于包括一个或多个***缺失(indel)的S ORF序列，通过参考相关亚基因型S ORF参考序列鉴定位于***缺失(indel)之后的特定密码子。
在一个实施方案中，方法包括产生关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的SORF区域的至少一部分的序列信息。在一个实施方案中，方法包括产生关于S ORF区域的整个1,200个核苷酸的序列信息。在另一个实施方案中，方法包括产生关于包括两个或多个密码子的S ORF区域的一部分的序列信息，在密码子非同义突变的频率待测定。
在一个实施方案中，方法包括扩增S ORF区域或其部分以产生扩增引物。在一个实施方案中，使用连续巢式PCR反应或本领域已知的其他扩增策略扩增S ORF或其部分，以减少引导错误、非特异性扩增或增强所需扩增引物的特异性扩增。
在一个实施方案中，方法包括使用寡核苷酸引物进行两轮初始DNA合成，其中3'部分由随机核苷酸序列组成，5'部分是确定的序列。这种策略的实例在Bohlander等，2002，Genomics，13：1322-1324中有描述。在一个实施方案中，寡核苷酸引物包括5'“限定”序列，该序列包括HBV和人类基因组中所没有的序列，并根据本技术人员已知的标准优化用于PCR反应，以及3'“随机”序列，该序列包括3个或更多个随机选择的核苷酸，该序列退火到HBVDNA，并使用聚合酶(例如T7 DNA聚合酶)进行扩展，产生第一链DNA合成。在变性和再退火之后，使用相同或类似设计的引物进行第二链合成以产生互补的第二链。然后在PCR反应中使用退火到5’限定序列的引物来扩增该双链DNA，以扩增S ORF区域或其一部分。
在一个实施方案中，方法包括使用大规模平行测序技术(也称为第二代测序或下一代测序)产生关于扩增引物的序列信息，其中多个空间分离的DNA模板被同时测序。可以使用本领域已知的任何合适的大规模平行测序技术。在各种实施方案中，方法包括焦磷酸测序、可逆终止子化学、通过连接或磷酸连接的荧光核苷酸测序。合适的平台技术是本领域熟知的，并且包括但不限于Illumina、离子激流公司(Ion Torrent)、罗氏(Roche)、美国生命技术公司(Life Technologies)、全基因组学公司(Complete Genomics)、螺旋生物科学公司(Helicos Biosciences)、GS FLX Titanium或太平洋生物科学平台(PacificBiosciences platforms)。
在实施例中描述了示例性方法。简单地说，通过超声处理将扩增引物片段化。使用用于Illumina平台的NEBNext Ultra文库制备试剂(NEB)，在片段化、端修复、3'端的腺苷酰化、衔接蛋白连接和衔接蛋白连接文库的扩增之后进行。在文库形成时使用NEBNext多重寡核苷酸组-I添加单独的条码。在NextSeq500仪器(Illumina公司)上对Illumina文库测序，以从每个样本获得约1亿个配对端(PE)读段(150bp×2)。
在一个实施方案中，方法包括使用大规模平行测序技术从受试者获得的合适样本中提取的HBV DNA直接产生关于S ORF的序列信息。可以使用本领域已知的产生适用于测序的部分或完全HBV DNA的任何合适的提取方法。可以使用本领域已知的任何合适的大规模平行测序技术，包括上述方法。
在一个实施方案中，方法包括使用DNA杂交以从样本获得关于HBV的核苷酸或氨基酸序列信息。合适的DNA杂交技术包括但不限于DNA、RNA或cDNA与附着于固相如玻璃、塑料或硅生物芯片或显微聚苯乙烯珠的DNA、cDNA或RNA探针的杂交。这些技术可用于从提取自样本或扩增引物的部分或完全HBV DNA产生序列信息。
在一个实施方案中，方法包括使用基于单分子的测序技术产生关于S ORF的序列信息。可以使用本领域已知的任何合适的测序技术。在各种实施方案中，方法包括通过杂交进行测序或通过合成进行测序。合适的平台技术是本领域熟知的，并且包括但不限于离子激流公司(Ion Torrent)、美国生命技术公司(Life Technologies)或太平洋生物科学平台(Pacific Biosciences platforms)。
适用于产生关于S ORF区域的测序信息的其他测序方法是本领域熟知的，包括例如Sanger测序。
寡核苷酸引物设计
可以使用本领域已知的策略和方法设计合适的寡核苷酸引物。第一步是鉴定包括待扩增的S ORF的HBV基因组的一部分。该部分包括待评估的S ORF中的所有密码子。下一步骤是鉴定获得期望扩增引物的合适引物：在待扩增部分的5'端包括5个或更多个连续核苷酸的正向引物和在待扩增基因组部分的3'端包括与5个或更多个连续核苷酸互补的序列的反向引物。基于考虑参数选择上游和反向引物，参数包括但不限于引物长度、引物熔融温度、引物退火温度、GC含量和引物二级结构。多种引物设计工具可用于辅助引物设计，包括但不限于Primer Premie、Primer-BLAST、DNASTAR、Primer3和Oligo引物分析软件(OligoPrimer Analysis Software)。对于本领域技术人员显而易见的是，对于特定的HBV亚基因型可能需要独特的引物对，并且这样的引物可以使用上面概述的方法来设计。
在一个实施方案中，正向引物衍生自包括核苷酸1500-3215和核苷酸1-60(当HBV是基因型B或C型时)或核苷酸1500-3221和核苷酸1-60(当HBV是基因型A型时)的HBV基因组区域，反向引物衍生自包括核苷酸1-2000的HBV基因组区域。
在一个实施方案中，两个引物都退火到位于S ORF之外的HBV基因组区域，使得PCR反应扩增整个S ORF。在一个实施方案中，正向引物被设计成退火到部分与HBV基因组的SORF区域重叠或完全落在HBV基因组的S ORF区域内的位置，而反向引物退火到HBV基因组的S ORF区域之外的HBV基因组区域，反之亦然。
在一个实施方案中，将两种引物设计为退火至与HBV基因组的S ORF区域部分重叠或完全落入HBV基因组的S ORF区域内的位置。例如，正向引物衍生自包括HBV基因组的核苷酸1500-2848的HBV基因组区域，反向引物衍生自包括核苷酸832-2000的S ORF区域。
在一个优选的实施方案中，引物是设计用于结合和扩增任何基因型或亚基因型的任何HBV的HBV基因组的一部分的通用引物。这样的通用引物可以通过靶向HBV基因组的足够长度的高度保守区域以容纳引物来设计。在下面的实施例中提供了这样的引物的实例。由于HBV病毒的频繁和快速突变，可能需要设计一套一个或多个正向引物和一个或多个反向引物，其设计用于特定基因型或亚基因型，或者如果第一引物对不产生期望的扩增引物，则设计用作备份。
确定S ORF区域中的非同义突变的频率
在一个实施方案中，本发明的方法包括将关于从受试者获得的样本中的HBV的SORF区域的一部分的序列信息(例如，通过下一代测序获得的读段)与S ORF参考序列进行比较以确定S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。然后基于每个密码子处非同义突变的频率确定跨越S ORF区域的非同义突变的频率。
在一个实施方案中，将序列信息组装成单倍型，然后将组装的序列(通常称为重叠群)与S ORF参考序列比对，并进行单个重叠群之间的遗传变异的分析。
在一个实施方案中，方法包括进行生物信息学分析，例如，如上文和在实例中的序列信息与S ORF参考序列之间的序列相似性分析，以鉴定在S ORF中的两个或多个密码子中的每一个处存在或不存在非同义突变。适用于突变鉴定的软件程序是本领域熟知的，包括，但不限于，SAMtools、GATK Haplotypecaller、Freebayes、GATK UnifiedGenotyper、SOAPSnp、VarScan和Platypus。
在一个实施方案中，方法包括确定每个检测到的突变是同义突变还是非同义突变。这将参照本领域技术人员熟悉的遗传密码进行。
在一个实施方案中，方法包括确定S ORF中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。将每个序列单独与S ORF参考序列比对，然后计数与S ORF内的每个密码子比对的来自该受试者的所有序列读段的数目。这将为非同义突变频率计算提供分母。将通过将在每个密码子处检测到的非同义突变的数目除以在该密码子处的序列读段的数目来计算在S ORF中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的频率。
在一个实施方案中，方法包括确定代表跨越S ORF的非同义突变的频率的数值得分。在一个实施方案中，方法包括基于跨越该S ORF的非同义突变的频率来指定类别或等级。
在一个实施方案中，方法包括基于每个密码子处非同义突变的频率为该密码子分配数值得分。在一个实施方案中，基于每个密码子处非同义突变的阈值频率指定数值得分。例如，该方法包括如果在该密码子处的非同义突变的频率小于阈值频率，则赋予0的得分，并且如果在该密码子处的非同义突变的频率等于或大于阈值频率，则赋予阳性得分。在一个实施方案中，方法包括对每个密码子处的非同义突变指定由阈值频率定义的类别或等级。
可以对在每个密码子处赋予的阳性得分进行加权，例如，可以对最强阳性选择压力下的密码子赋予较高的得分。
在一个实施方案中，在每个密码子处指定的数值得分被组合以提供表示HBV的SORF区域中的非同义突变的频率的组合数值得分。在一个实施方案中，将在每个密码子处指定的类别或等级组合以提供表示HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率的组合等级。
ARMS测定和其他方法
在替代实施方案中，方法包括通过扩增受阻突变***(ARMS)测定来检测每一密码子处非同义突变的频率。在ARMS测定中，使用包括3'端序列的引物进行通过PCR的扩增，3'端序列被设计为区分S ORF参考序列中的每个密码子处的碱基和存在于从受试者获得的样本中的存在于HBV的S ORF中的该密码子处的非同义突变。
用于ARMS的PCR引物是基于与受试者感染的HBV的S ORF区域的亚基因型相对应的S ORF参考而设计的。为了确定在S ORF中的两个或多个目的密码子处的非同义突变的频率，设计PCR引物用于PCR反应以特异性地扩增的至少一部分仅在存在野生型密码子时包括每个密码子的S ORF，即，受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型的S ORF参考序列中的密码子的核苷酸序列。设计其他引物用于PCR反应以特异性扩增S ORF的至少一部分，该S ORF包括在该密码子出现每个可能的非同义突变时。将每个反应的扩增引物进行琼脂糖凝胶电泳，使用本领域已知的方法检测并定量每个扩增引物相对应的条带以确定非同义突变的频率。
在其他实施方案中，方法包括使用质谱分析、标记的抗体、荧光标记的探针、金属标记的探针或区分野生型和突变氨基酸的任何其他分子来检测S ORF的蛋白质序列中存在或不存在氨基酸替换。每个位置的野生型氨基酸为S ORF参考序列中相应位置密码子编码的那些氨基酸。
在一些实施方案中，标记的抗体，探针或其他分子通过流式细胞术或通过飞行时间细胞术(CyTOF)分析来检测。
在其他实施方案中，将通过分析体外培养物中转染，转导或感染细胞或通过体外培养物上清液的任何分析来检测S ORF的核苷酸或蛋白质序列中非同义突变的存在。
在这些实施方案中，可以使用本文描述的任何方法确定基于每个密码子处的非同义突变的频率的S ORF区域中的非同义突变的频率。
使用频率预测HBV的遗传状态和临床疾病
慢性乙型肝炎(CHB)与肝脏并发症有关，包括肝脏炎症、肝硬化和肝癌。CHB患者可能多年没有症状，仅在疾病晚期出现临床症状。
本发明的方法适用于筛选任何感染HBV基因型A，B或C型的受试者。该方法特别考虑用于筛选患有慢性HBV的受试者，这些受试者没有表现出HBV的临床症状，或没有被诊断出具有HBV的肝脏并发症，例如，被认为是HBV的无活性健康携带者(IHC)的受试者。
在其他实施方案中，受试者测试为肝炎e抗原阴性(HBeAg阴性)，具有正常血清ALT水平，具有大于约2,000IU/ml的血清HBV-DNA滴度，或其任何组合。HBeAg阴性通常表明患者发展为肝脏炎症和肝硬化的风险低，并且大多数患者被认为是无活性的健康携带者(IHC)。然而，具有正常基线ALT水平和高于2,000IU/ml的HBV-DNA水平的HBeAg阴性患者的亚组可以发展为称为HBeAg阴性慢性乙型肝炎(e-CHB)的慢性肝脏炎症的形式，其与肝硬化的快速进展相关。
在各种实施方案中，HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率被用于基于S ORF区域中的非同义突变的频率来确定受试者的肝脏炎症状态或HBV的遗传状态或受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
在一个实施方案中，HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率指示受试者患有肝脏炎症，例如，没有临床症状的早期肝脏炎症。
在一个实施方案中，方法用于确定患者感染的HBV的遗传状态。在一个实施方案中，非同义突变的频率指示HBV处于正选择压力下。
在一个实施方案中，HBV的S ORF区域中的非同义突变的频率指示受试者易患慢性HBV感染的肝脏炎症或一种或多种肝脏并发症或处于发展为慢性HBV感染的肝脏炎症或一种或多种肝脏并发症的风险中。在各种实施方案中，慢性HBV感染的肝脏并发症包括肝硬化、肝癌、肝功能衰竭、肝脏炎症、肝脏损伤、肝脏功能障碍或其任何两种或更多种的组合。
在其他实施方案中，受试者为HBeAg阳性或血清ALT水平升高，或为HBeAg阳性且血清ALT水平升高。在一些实施方案中，方法用于确认受试者患有肝脏炎症，例如早期肝脏炎症。
在一个实施方案中，S ORF区域中的非同义突变的频率指示受试者在1年或2、3、4、5、6、7、8、9或10年内易患肝脏炎症或肝脏并发症或处于发展为肝脏炎症或肝脏并发症的风险中。
在一个实施方案中，使用代表S ORF区域中非同义突变的频率的数值得分来确定临床结果。例如，大于或等于预定阈值得分的数值得分指示HBV处于阳性选择压力下或受试者易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症或处于发展为慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的风险中。
在各种实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高的数值得分指示HBV处于阳性选择压力下受试者易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症或处于发展为慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的风险中。
在各种实施方案中，S ORF中的非同义突变的频率被用于确定受试者应该经历进一步的临床检验，例如肝脏扫描或活组织检查以鉴定HBV的肝脏并发症。在其他实施方案中，使用非同义突变的频率来确定该患者的临床筛选方案，例如，确定检查血清ALT、HBeAg、HBV DNA水平的频率。在其他实施方案中，使用非同义突变的频率来推荐应当在一定时间范围内重复本发明的方法。
在各种实施方案中，S ORF区域中的非同义突变的频率用于监测对治疗的应答，预测对治疗的应答，选择治疗，或确定受试者中治疗的最佳时机、持续时间或方案。
免疫治疗包括改变或增强受试者对病原体，特别是病毒如HBV的免疫应答的任何治疗。术语免疫治疗特别涵盖给予患有慢性HBV感染的受试者的治疗或治疗。
在各种实施方案中，S ORF区域中的非同义突变的频率用于监测对免疫治疗的应答，预测对免疫治疗的应答，选择治疗，或确定受试者中治疗的最佳时机、持续时间或方案。
在各种实施方案中，以规律的间隔在受试者中确定S ORF区域中的非同义突变的频率。在一个实施方案中，S ORF区域中的非同义突变的频率增加指示发展为慢性HBV的肝脏炎症或肝脏并发症的风险增加，或者受试者应当开始特定的免疫治疗或其他治疗方案。
实施例
实施例1
本实施例描述了来自感染HBV的第一患者组的HBV S ORF的克隆和分析。
1.方法
新西兰乙型肝炎筛查方案以6-12个月的间隔监测1,439名慢性HBV感染的汤加成年人。这些受试者中的345名在常规血液检查时被招募入本研究。再取3mL血清用于HBV-DNA分析，并从外周血白细胞中提取基因组DNA进行HLA I类基因分型。
所有受试者均获得书面同意，该研究经新西兰***Northern X区域伦理委员会批准。
最初，对来自345名受试者中的47名的血清的全HBV基因组进行测序，目的在于确定汤加的HBV的野生型序列，并且鉴定用于测序和PCR的保守引物位点。然后，选择具有正常血清ALT水平和基因型C型感染的，具有PCR可检测HBV DNA的所有HBeAg阴性受试者进行SORF突变的横断面分析。这些受试者都没有接受过慢性乙型肝炎的治疗。
HBV基因组的克隆和测序
使用高纯病毒核酸试剂盒(罗氏诊断，印第安纳波利斯，美国)从300μl血清中提取HBV-DNA。在汤加人群中，HBV序列存在受试者间和受试者内差异。因此有必要设计用于扩增和测序来自一些个体受试者，特别是HBeAg阴性者的HBV的特异性PCR引物。
第一步是获得碱基对1700-2411的共有序列。用于扩增该序列的引物是通过在NCBI核苷酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)中获得的54个基因型C型和基因型D型的Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)比对中找到保守序列来鉴定的。根据比对，确定了三个正向引物，它们都与两个反向引物匹配(均如表1所示)。使用Oligo引物分析软件(Oligo Primer AnalysisSoftware)7.58版(Molecular Biology Insights Inc，CO)计算TM值。
表1：用于扩增区域1700-2411HBV基因组的引物
| 引物 | 序列 | 碱基对 | SEQ ID NO |
| 正向1 | 5'-ttcacctctgcaegteg | 1590-1606 | 29 |
| 正向2 | 5'-atgtcaacgaccgaccttga | 1680-1699 | 30 |
| 正向3 | 5'-gaggctgtaggcataaattggtct | 1777-1801 | 31 |
| 反向1 | 5'-aggagtgcgaatccacact | 2287-2269 | 32 |
| 反向2 | 5'-ccgagattgagatcttctgegaegeg | 2437-2412 | 33 |
碱基编号与基因型C3序列相对应(基因库编号X75656)。
HBV基因组克隆为两个片段。使用与上述1700-2411bp序列中的保守序列互补的引物扩增出2.6kb的克隆，该克隆包括S ORF、P ORF的末端2455bp和X ORF的起始403bp，并设计成用于扩增HBV的负链。通过目测检查Multalin序列比对程序中的47个1700-2411bp序列来鉴定保守序列
(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)。表2和表3描述了用作引物克隆2.6kb片段的保守序列。
表2：用于克隆2.6kb片段的外部引物对
| 引物 | 序列 | 碱基对 | SEQ ID NO |
| 正向4 | 5'-actttttcacctctgcctaateatctc | 1819-1845 | 34 |
| 正向5 | 5'-tgttcatgtcctactgttcaage | 1847-1869 | 35 |
| 反向3 | 5'-aaaaagttgcatggtgttggt | 1799-1819 | 36 |
| 反向4 | 5'-cagaccaatttatgcctacagcctc | 1777-1801 | 37 |
表3：用于巢式PCR反应的引物
| 引物 | 序列 | SEQ ID NO |
| 上游6 | 5'-caggtcccctagaagaagaact | 38 |
| 上游7 | 5'-gaagaagaactccctcgcctcg | 39 |
| 反向4 | 5'-cagaccaatttatgcctacagcctc | 37 |
表4：内部测序引物
| 引物 | 序列 | SEQ ID NO |
| 测序1 | 5'-tctttgggtatacattt | 40 |
| 测序2 | 5'-aatatgttcttgtggtaaggta | 41 |
| 测序3 | 5'-gatatgggagaggcagtagtcgga | 42 |
第一次PCR反应的上游引物是正向4或正向5，下游引物是反向3或反向4(表2)。使用聚乙二醇(PEG)MW＝8000(P5413，Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州)纯化和浓缩第一反应产物，并将其重新悬浮在5μl的水中，并使用0.1-5.0m-I之间的等分试样作为模板，使用包括上部6或上部7的引物对作为上游引物，反向4作为下游引物进行第二次巢式PCR反应(表3)。
使用Oligo引物分析软件(Oligo Primer Analysis Software)(版本6)确定每个反应的PCR循环条件(Molecular Biology Insights；www.oiigo.net)。上述所有PCR反应的PCR策略是3阶段降落(touchdown)方案。第一阶段变性温度为96℃10秒，最后两个阶段高于产物Tm 2℃10秒。第一和第二阶段退火温度设定在引物的Tm(最大值为72℃)下15秒，对于第一和第二阶段，分别以每个循环0.2℃和0.5℃降低8个循环和4个循环。第三阶段退火温度设定在Oligo引物分析软件(Oligo Primer Analysis Software)计算的最优值，进行30个循环。延伸温度为72℃，并且延伸时间为每千碱基产物50至60秒。所有扩增均采用AccuprimeTaq DNA聚合酶高保真(Invitrogen Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。
来自巢式PCR反应的PEG清洗的扩增产物呈A-尾(30-300ng的扩增引物，0.88μl的10×硫酸铵缓冲液(pH＝8.4)，0.8μl的2mM dATP，0.33μl的25mM MgCl2，3U Taq聚合酶，加水至8.8μl)反应在72℃持续30分钟，连接到pGEM-T(Promega，Madison，WI)，并用于转化大肠杆菌(E.coli，DH5a)。
Sanger测序反应包括20-40ng克隆的DNA和1μl的ABI Prism BigDye Terminatorv3.1循环测序混合物(应用生物***公司(Applied Biosystems)，福斯特市，加利福尼亚州)。根据测序引物的Tm，使用56℃或50.5℃的退火温度进行测序反应。测序反应产物用磁珠纯化(CleanSEQ，Agencourt Biosciences Corp.，Beverly，马萨诸塞州)，并在配备有50cm毛细管阵列的ABI Prism遗传分析仪3130XL上使用POP7聚合物进行分析。使用Chromas1.61(Technelysium Pty Ltd，昆士兰，澳大利亚)进行序列分析和重叠群装配。
为了使样本之间污染的风险最小化，所有PCR混合物在PCR工作站(Bigneat Ltd，Hampshire，英国)中制备，并转移到单独的房间用于添加模板。在第三室中进行PCR产物的热循环和琼脂糖凝胶分析。PCR产物的转化和克隆在外部通风的通风柜中进行，具有紧邻的专用4-8℃冰箱、37℃孵化器和水浴。在来自所有受试者的HBV群体中存在独特的突变谱型，并且可以从突变谱鉴定受试者之间的交叉污染。
对HBV进行基因分型
通过将由任一引物对产生的扩增引物的序列与从NCBI核苷酸数据库(括号中为基因库登录号和版本)获得的一组序列比对确定每个HBV序列的基因型：基因型A型(AF297623.1、AY128092.1、AB126580.1)、基因型B型(AY167100.1、AY206391.1、AY206390.1)、基因型C型(AY167090.1、AY167096.1、AY167092.1、X75656.1)、基因型D型(AB126581.1、AB104711.1、AB104712.1)、基因型E型(AB091256.1、AB091255.1)、基因型F型(AB036920.1、AY179734.1、AY179735.1)、基因型G型(AB064315.1、AF405706.1)和基因型H型(AY090460.1、AY090457.1)。测序的第一扩增引物(含有碱基1700-2411，参见上文)含有52个碱基的单倍型，其区分汤加人群中的基因型C型和基因型D型，并且该序列用于排除基因型D型受试者。通过将2.6kb克隆的序列与上述序列组进行比对，排除了任何受试者具有混合基因型病毒的可能性。未鉴定出携带包括基因型C型和基因型D型序列的混合物的病毒的汤加受试者。
共获得142个克隆，包含19名受试者HBV基因型C型的S-ORF全长序列，每个受试者5至12个克隆。将含有***缺失(indel)和/或无义突变的克隆从进一步分析中排除。
实施例2
本实施例描述了从感染HBV的第二患者组获得的HBV基因组的克隆和分析。
1.方法
新西兰乙型肝炎筛查方案以6-12个月的间隔监测超过10,000名慢性HBV感染的成年人。其中250名在进入筛查程序时呈HBeAg阴性且ALT水平正常的受试者，在进行常规血液检查时，独立于年龄、种族或性别被纳入这项研究。所有受试者都书面同意他们的初步筛查血清样本用于这项研究，这项研究得到了新西兰***Northern X地区伦理委员会的批准。使用COBAS Ampliprep/COBAS Taqman HBV Test 2.0版测量HBV-DNA水平，其线性范围为1.30至8.23logio IU/ml。本研究包括12名HBV DNA>2,000IU/ml的受试者和5名HBV-DNA<2,000IU/ml的受试者，均为基因型C型。
HBV基因组的克隆和测序。
用QiAamp Ultrasens病毒试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，德国)从500μl血清中提取HBV DNA。在序列巢式PCR反应中扩增HBV的S开放阅读框。所有的PCR反应均使用5m-I的模板和高保真DNA聚合酶(Finnzymes，Espoo，芬兰)。从厂家网站(www.finnzynies.com)确定了最佳退火温度。
使用上面表2中列出的正向引物4或正向引物5与反向引物4进行初始PCR反应。使用3阶段降落(touchdown)方案。变性温度为98℃10秒。第一和第二阶段退火温度在引物的Tm(最大值为72℃)处开始10秒，对于第一和第二阶段，分别以每个循环0.2℃和0.5℃降低8个循环和4个循环。第三阶段退火温度设定为厂家网站计算的最优值25个循环。延伸温度为72℃，并且延伸时间为每千碱基产物30秒。
对初始PCR的产物进行巢式PCR。巢式PCR使用HF缓冲液和包括下面表5中列出的正向引物和反向引物之一的引物对。如上所述使用3阶段降落(touchdown)方案进行初始PCR。
表5：用于巢式PCR的引物对
| 引物 | 序列 | Tm(℃) | SEQ ID NO |
| 正向6 | 5'-gaagaagaactccctcgcctcg | 68 | 39 |
| 反向5 | 5'-aggagttccgcagtatggatcg | 67 | 43 |
| 反向6 | 5'-gcgacgtgcagaggtgaag | 66 | 44 |
如实施例1所述，经PEG清洗的扩增产物呈A-尾并转化到大肠杆菌中。
如实施例1所述进行Sanger测序。
如实施例1所述采取使污染风险最小化的措施。
对HBV进行基因分型
每个HBV序列的基因型是通过将这些引物对中的任一个所产生的序列与如以上针对实例1所描述的一组HBV序列进行比对来确定的。
从17名受试者中获得了156个含有全长S ORF序列的克隆。将含有***缺失(indel)和/或无义突变的克隆从进一步分析中排除。
实施例3
本实施例描述了HBV基因型C型的PAML分析以鉴定正选择压力下的S ORF密码子。
1.方法
对如上述实施例1和2获得的S ORF克隆进行PAML分析。
使用Yang等人(分子生物学与进化(Mol.Biol.Evol.)，2005；22：1107-1118)的方法研究了作用于HBV病毒的选择压力的性质。在这些方法中，将密码子序列中发生非同义替换的速率(dN)与同义替换的速率(dS)进行比较。这些比率通常通过计算其比率(通常表示为ω)进行比较。当通过核苷酸的突变和漂移的随机过程发生进化时，预期非同义替换的速率与同义替换(ω＝1)的速率是相同的并且选择中性的。当氨基酸改变替换是不利的并且被清除时，则比率将落在0-1的范围内。这表示阴性选择。当选择有利于氨基酸多样性时，非同义替换率超过随机过程所预期的比率(ω>1)，以给出阳性选择。这些密码子进化的替换率必须根据***发育树推断。
使用PhyML中的最大似然方法构建如实施例1和2中获得的病毒的***发育(Guindon等人，美国科学学院学报，美国2004；101：12957-12962)。然后使用最大似然的***发育分析(PAML；2a型)，(Yang等人，分子生物学与进化(Mol.Biol.Evol.)，2005；22：1107-1118)程序估计整个比对中处于正、中性或负选择压力下的密码子在整个树中的总比例。然后将每个密码子指定到它具有最大后验概率的选择类别(阴性、中性或阳性)，如使用Bayes Empirical Bayes(BEB)标准计算的那样。
2.结果
表6总结了从实施例1和实施例2中的36个受试者获得的298个S ORF克隆的PAML分析。列出所有ω>2.0的密码子，鉴定阳性选择压力最强的密码子。用星号(*或**)标记的密码子的正选择压力已达到双尾统计显著性的常规水平(Pr>0.95)。
表6：HBV基因型C型克隆的PAML分析结果
实施例4
本实施例研究了阳性选择压力下S ORF中密码子处的非同义突变频率与慢性乙型肝炎(CHB)发展的相关性。
1.方法
来自实施例1(n＝4)和实施例2(n＝12)的16位受试者被鉴定为具有HBeAg阴性，基因型C型慢性乙型肝炎病毒感染，血清HBV-DNA>2,000IU/ml和血清ALT水平正常。通过当地实验室数据库和医院记录收集所有这些受试者的分析血清样本，随访最少10年。这使得每个受试者被分类为具有发展的严重乙型肝炎相关的肝脏疾病(肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌)或在这段时间具有发展的非活性肝脏疾病。每组8名受试者。每个受试者具有6个可用于分析的克隆的全长S ORF序列。仅在获得6个以上克隆的受试者中分析获得的前6个克隆。在每个受试者中计数具有包括非同义突变的6个克隆中的2、3、4、5或6个的上述32个阳性选择的密码子(Pr>0.90)的数目。这可能导致从0到32的任何数。该数字是该受试者的得分。16名受试者的得分范围为0至11。
2.结果
根据该数据生成受试者工作特征(ROC)曲线(图1)，以显示每种可能得分的测试敏感性和特异性之间的关系。
敏感性(或真阳性率)被计算为具有大于或等于患肝脏疾病的得分的受试者的数目除以患肝脏疾病的受试者的总数。将特异性计算为具有大于或等于未患肝脏疾病的得分的受试者数除以未患肝脏疾病的受试者总数。这在ROC曲线中表示为1-特异性，其为假阳性率。由于所有受试者具有大于或等于零的得分，所以该得分是100％敏感的并且具有100％假阳性率。大于或等于2的得分是100％敏感的，并且具有38％的假阳性率。大于或等于5的得分是75％敏感的，假阳性率为0％。
图2所示的生存曲线比较了得分大于或等于3的9名受试者(组1)的10年随访结果与得分小于或等于2的7名受试者(组0)的结果。
x轴显示组1中的7名受试者和组0中的1名受试者中肝脏炎症发展的时间；8名持续有10年以上无活动疾病的受试者的随访持续时间也显示(+)为截尾观察。图2显示了两组之间的统计学显著性差异(Wilcoxon卡方＝7.2，p＝0.007)。在来自组0的单一受试者(得分为2)中肝脏疾病发展的时间长于来自组1的任何受试者。第1组中未发生肝脏疾病的受试者得分均为3分。此外，这些受试者之一具有不符合任何目前已知的亚基因型的C型亚基因型，因此该受试者的得分可能不是免疫介导的阳性选择的反映。
结果表明，HBV非同义突变频率的测定对预测HBV感染患者肝脏疾病的发展具有较高的敏感性和特异性。
实施例5
本实施例中描述的研究目的是
i)确定66个混合克隆的下一代测序(NGS)测序是否与相同的66个单个克隆的Sanger测序检测到相同的阳性选择突变的谱型。这是为了证实NGS可以在32个阳性选择的目的密码子处鉴定与AT克隆发现的相同范围的突变。
ii)为了确定在36个Sanger测序克隆中发现的突变的全部谱型是否可以在一次包含每个受试者的一个PCR反应池的NGS测序中找到，该克隆来自6名患有肝脏炎症或非活动性疾病的受试者。这是为了确定PCR反应中的扩偏倚差是否导致无法鉴定某些突变。
iii)在NGS测序之前评估用于模板DNA分级的最佳方法。
1.第一项研究
在第一项研究中，汇集来自实施例2中11名受试者的66个已知序列的S ORF克隆(10ng DNA/克隆)用于Illumina NGS测序。首先通过在Epishear超声发生器(Activemotif)上在65％振幅和4℃下机械剪切15分钟使克隆片段化，开30秒和关30秒循环。使用用于Illumina平台的NEBNext Ultra文库制备试剂(NEB)，在片段化、端修复、3'端的腺苷酰化、衔接蛋白连接和衔接蛋白连接文库的扩增之后进行。然后在NextSeq500仪器(Illumina公司)上对Illumina文库测序，以从每个样本获得约1亿个成对端(PE)读段(150bp×2)。
为了进行生物信息学分析，用Burrow-Wheeler比对将NGS序列与亚基因型C1、C2、C3a、C3b和C4型(SEQ ID No：22-26)的一组参考基因型C亚基因型序列进行比对。用SAMtools程序和定制过滤器分析比对，以鉴定实施例3中鉴定的阳性选择密码子(即密码子4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387或391)包括频率大于0.01个读段的非同义突变。在NGS序列中鉴定了来自66个Sanger测序克隆的32个阳性选择密码子中的31个中鉴定的所有突变。由于我们无法确定的原因，NGS序列中缺少密码子84周围的DNA序列，因此无法评估该密码子处的突变谱型。我们的结论是，NGS具有足够的准确性，可以在正选择条件下检测S ORF密码子的所有突变。
2.第二项研究
将来自实施例2的6个肝脏炎症受试者中每个人用于AT克隆的一个90ng的PCR反应产物合并在一起，并且还将来自实施例2的6个非活动性疾病受试者每个人的另一个90ng的PCR反应产物合并在单独的试管中。通过超声(6名肝脏炎症受试者)或限制性酶消化(6名无活性疾病受试者)将这两种PCR产物的复杂混合物分级。使用Sau96I按照制造商的说明(新英格兰生物实验室，#R0165)。
使用用于Illumina平台的NEBNext Ultra文库制备试剂(NEB)，在端修复、3'端的腺苷酰化、衔接蛋白连接和衔接蛋白连接文库的扩增之后进行。在Illumina下一代测序平台上对文库进行测序。超声处理是最好的分级分离方法，因为它在32个目的密码子的每一个上产生85万至110万个读段。相反，限制性酶分级导致32个密码子中5个读段数低，每个密码子的读段数范围在9,000至813,000之间。结果表明，超声处理是PCR产物分级的最佳方法。
在来自超声处理的扩增引物的Sanger测序的克隆中检测到43个非同义突变。其中41个被NGS检测到。在来自限制性酶消化的扩增引物的Sanger测序克隆中检测到20个非同义突变。其中15个被NGS检测到。
本实施例证明了在本发明的方法中用于检测HBV的S ORF中的非同义突变的下一代测序的效用。
实施例6
本实施例的目的是
a)确定在诊断活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病(定义为需要治疗的肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌)时，血清ALT水平正常的基因型C型、HBeAg阴性的慢性乙型肝炎病毒受试者中，阳性选择密码子4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387或391的非同义突变是否增加，和
b)在血清ALT水平正常的基因型C型、HBeAg阴性的慢性乙型肝炎病毒受试者中，鉴定对活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病(定义为需要治疗的肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌)的发展最强预测的阳性选择密码子。
1.方法
招募中国广州南方医科大学南方医院门诊HBeAg阴性的基因型C型慢性HBV感染的连续受试者150例，血清ALT水平正常，血清HBV-DNA>2,000IU/ml。根据目前的亚洲指南(亚太乙型肝炎临床实践指南：2015年更新(Asian-Pacific clinical practice guidelineson the management of hepatitis B:a 2015 update)，《国际肝病》(HepatologyInternational)2015；DOI：10.1007/s 12072-015-9675-4)，医生对患者进行评估，以确定是否存在需要治疗的活动性肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。对47例患者进行了评估。
为了本研究的目的，活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病的定义是具有慢性乙型肝炎病毒感染的受试者，他或她的医生认为他或她至少患上了需要治疗的肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌中的一种。
使用Qiagen Ultrasens病毒提取试剂盒从HBV-DNA>2,000IU/ml的血清中提取HBVDNA。
如上述实施例2所述，进行一次PCR反应，该PCR反应扩增来自每个受试者的乙型肝炎病毒的S ORF。在文库形成时使用NEBNext多重寡核苷酸集-I(NEBNext MultiplexOligos Set-I)对其进行单独条码编码。使用上述实施例5中描述的方法，在超声分离之后，对来自每个受试者的文库进行下一代测序。
通过将来自下一代序列的S ORF的共有序列与本文描述的HBV亚基因型A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3A、C3B、C4、C5和C6的参考序列进行比对，来确定来自每个受试者的病毒的基因型和亚基因型。
按照上述实施例5所述进行生物信息学分析。计算每个受试者在每个S ORF密码子4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387或391处超过0.10的读段中出现非同义突变的频率。
将每个受试者的得分计算为非同义突变的频率大于0.10的正选择密码子的数目。
根据进入研究时的临床评估，确定了被认为需要医生治疗慢性乙型肝炎病毒感染的患者中得分大于或等于4分的百分比。
还将进行5年的分析。在该分析中，将针对阳性选择的密码子的不同组合创建ROC曲线，以确定阳性选择的密码子的哪个组合提供曲线下的最大面积，并因此确定在先前5年内已经治疗活动性肝脏疾病的受试者和继续患有非活动性疾病的患者之间差别的最高水平。
2.结果
通过纤维扫描具有肝纤维化或肝硬化迹象的所有受试者具有大于或等于4的得分。这表明本发明的方法可用于鉴定具有正常ALT水平和HBV-DNA水平>2,000IU/ml的基因型C型慢性HBV感染的HBeAg阴性患者的严重慢性肝脏疾病。
ROC分析鉴定了阳性选择的密码子，其最有力地预测了活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病的发展。
实施例7
本实施例的目的是在血清ALT水平正常的基因型C型HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒受试者的新群组中，利用实施例6中鉴定的阳性选择密码子的最佳组合，评估本发明的方法在预测活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病发展中的效用。
1.方法
100例HBeAg阴性、初次血液检查ALT正常的慢性乙型肝炎病毒感染受试者的储存血清样本来自中国广州南方医科大学南方医院门诊部。根据上面实施例6描述的当前亚洲指南，由他们的医师评估这些患者是否存在需要治疗的活动性肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。测试样本以鉴定HBV-DNA水平大于2,000IU/ml的所有受试者。
使用如以上实例6所述的下一代测序对来自所有具有基因型C型感染的受试者的乙型肝炎病毒的S ORF进行扩增、条码编码和测序。
如实施例6所述对受试者进行基因分型和亚基因分型。
如上述实施例6所述进行生物信息学和ROC分析，其中在对每个患者进行5年随访后可获得临床信息。将每个受试者的得分计算为非同义突变的频率大于0.10的如上述实施例6所述的正选择密码子的数目。
2.结果
结果确定了鉴定患有活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病的受试者的最低受试者得分，其假阳性率为0％。建议任何得分大于或等于这个数字的受试者开始抗病毒治疗，以预防或逆转活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病。
结果用于确定任何继续发展为活动性肝脏疾病的受试者的最低得分。建议任何得分低于这个数值的受试者继续参加筛查计划，主要是为了在没有肝硬化的情况下早期鉴定可能发生的肝癌。这些受试者不应给予抗病毒治疗。
对于在发展为活动性肝脏疾病的受试者和发展为非活动性肝脏疾病超过10年的受试者中都有一个或多个得分的受试者，建议进行进一步的检查，例如肝脏纤维扫描、肝脏超声、肝脏活检。建议在5-10年内在这些患者中重复此检测。
实施例8
本实施例的目的是在HBeAg阴性且具有正常血清ALT水平的受试者中鉴定处于阳性选择压力下的基因型B型的乙型肝炎病毒中的S开放阅读框密码子。评估了这些密码子中非同义突变的频率在预测活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病中的效用。
1.方法
第1阶段
100例HBeAg阴性、初次血液检查ALT正常的慢性乙型肝炎病毒感染受试者的储存血清样本来自中国广州南方医科大学南方医院门诊部。根据上面实施例6描述的当前亚洲指南，由他们的医师评估这些患者是否存在需要治疗的活动性肝脏炎症、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。使用Qiagen Ultrasens病毒提取试剂盒从这100份血清中提取HBV DNA。
在上述实施例2中，对50份血清进行了乙型肝炎病毒S ORF的克隆和测序。从50份血清中测定了300个克隆的序列。
如以上实施例3所述，在正选择压力下对300个HBV克隆进行***发育分析以鉴定密码子。
第2阶段
从这些血清的第二个50个中扩增S ORF，并进行如上所述的下一代测序。使用上述实施例7中描述的方法，执行ROC分析以确认对在阶段1中鉴定的阳性选择密码子的非同义突变进行计数可以预测活动性乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病的发展。
2.结果
第1阶段鉴定在阳性选择压力下的基因型B型HBV S ORF中的密码子。
第2阶段确定在第1阶段鉴定的密码子的非同义突变的频率是否可以预测患者在接下来的5年中是否会发展为活动性肝脏疾病或非活动性肝脏疾病。
ROC分析确定哪个患者得分预测活动性肝脏疾病的发展，具有0％的假阳性率，如以上实施例4中。
工业实用性
本发明提供了一种确定感染HBV基因型A、B或C的患者的CHB肝脏炎症状态或对CHB的肝脏并发症的易感性或其风险增加的方法。本发明在医学、临床和实验室研究应用中具有适用性。
如果在前面的描述中提到了具有已知等价物的元素或整数，那么这些等价物就被包括在内，就像它们被单独列出一样。
尽管已经通过实施例并参考特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以进行修改和/或改进。
序列表
<110> W·G·H·阿尔伯特
<120> 分析乙型肝炎病毒突变的方法及其用途
<130> 838615 AJG/HEF
<160> 44
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 1
atgggaggtt ggtcatcaaa acctcgcaaa ggcatgggga cgaacctttc tgttcccaac 60
cctctgggat tctttcccga tcatcagttg gaccctgcat tcggagccaa ttcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc catcaaggac cactggccac aagccaacca ggtaggagtg 180
ggagcattcg ggccagggtt cactccccca cacggaggtg ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattggccac agtgccagca gttcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaatt ccacagcttt ccaccaagct ctgcaagatc ccagagtcag gggcctgtat 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca ctcaaccctg ttccaaatat tgcctctcac 480
atctcgtcaa tctcctcgag gactggggac cctgcgccga acatggagaa catcacatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggatcaccc 660
gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcctgtcct 720
ccaatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttattggtt cttctggatt atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggatc cacaacaacc agtacgggac cctgcaaaac ctgcacgact 900
cctgctcaag gcaactctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggatggaaat 960
tgcacctgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agctatatgg atgatgtggt actgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat accgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 2
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 2
atgggaggtt ggtcatcaaa acctcgcaaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaac 60
cctctgggat tctttcccga tcatcagttg gaccctgcat tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc catcaaggac cactggccag cagccaacca ggtaggagtg 180
ggagcattcg ggccagggct cacccctcca cacggcggta ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgaccac agtgtcaaca attcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaatt ccactgcctt ccaccaagct ctgcaggatc ccagagtcag gggtctgtat 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ctccgaatat tgcctctcac 480
atctcgtcaa tctccgcgag gactggggac cctgtgacga acatggagaa catcacatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggatcaccc 660
gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcctgtcct 720
ccaatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttattggtt cttctggatt atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggatc aacaacaacc agtacgggac catgcaaaac ctgcacgact 900
cctgctcaag gcaactctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggatggaaat 960
tgcacctgta ttcccatccc atcgtcctgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agctatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
agcatcgtga gtccctttat accgctgtta ccaattttct tttgtctctg ggtatacatt 1200
<210> 3
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 3
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgaaaa ggcatgggga caaatctttc tgtccccaat 60
cccctgggat tcttccccga tcatcagttg gaccctgcat tcaaagccaa ctcagaaaat 120
ccagattggg acctcaaccc acacaaggac aactggccgg acgcccacaa ggtgggagtg 180
ggagcattcg ggccagggtt cacccctccc catgggggac tgttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tactcacatc tgtgccagca gctcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc cttatctcca cctctaaggg acactcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccaccacttt ccaccaaact cttcaagatc ccagagtcag ggctctgtac 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtaagccctg ctcagaatac tgtctcagcc 480
atatcgtcaa tcttatcgaa gactggggac cctgtgccga acatggagaa catcgcatca 540
ggactcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tctcgttgac aaaaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca gttttctagg gggaacaccc 660
gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccaa atctccagtc actcaccaac ctgttgtcct 720
ccaatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctctgcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggatc atcaaccacc agcacgggac catgcaagac ctgcacaact 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggacggaaac 960
tgcacctgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tctggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat gccgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 4
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 4
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgaaaa ggcatgggga caaatctttc tgtccccaat 60
cccctgggat tcttccccga tcatcagttg gaccctgcat tcaaagccaa ctcagaaaat 120
ccagattggg acctcaaccc gcacaaggac aactggccgg acgccaacaa ggtgggagtg 180
ggagcattcg ggccagggtt cacccctccc catgggggac tgttggggtg gagccctcag 240
gctcagggcc tactcacaac tgtgccagca gctcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc cttatctcca cctctaaggg acactcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccaccacttt ccaccaaact cttcaagatc ccagagtcag ggccctgtac 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtgagccctg ctcagaatac tgtctctgcc 480
atatcgtcaa tcttatcgaa gactggggac cctgtaccga acatggagaa catcgcatca 540
ggactcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tctcgttgac aaaaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg ggaaacaccc 660
gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccaa atctccagtc actcaccaac ctgttgtcct 720
ccaatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctctgcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggatc atcaacaacc agcaccggac catgcaaaac ctgcacaact 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggacggaaac 960
tgcacctgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tctggctttc agttatatgg atgatgtggt tttgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat gccgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 5
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 5
atgggaggtt ggtcctccaa acctcgacaa ggcatgggga caaatctttc cgtccccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcat tcaaagccaa ctccgacaat 120
cccgattggg acctcaaccc acacaaggac aactggccgg actccaacaa ggtgggagtg 180
ggagcattcg ggccgggatt cactccaccc catgggggac tgttggggtg gagccctcaa 240
gctcagggca tactcacaac tgtgccagca gctcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
gtaggaagga agcctactcc cctgtctcca cctctaagag acactcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccaccacgtt ccaccaaact cttcaagatc ccagagtcag ggctctgtac 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtgaaccctg ttcagaacac tgcctcttcc 480
atatcgtcaa tcttatcgaa gactggggac cctgtgccga acatggagaa catcgcatca 540
ggactcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aaaaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaacaccc 660
gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccaa atctccagtc actcaccaac ttgttgtcct 720
ccgatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctctgcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggatc atcaaccacc agcaccggac catgcaaaac ctgcacgact 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggacggaaac 960
tgcacctgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tctggctttc agttatatgg atgatgtggt tttgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat gccgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 6
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 6
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgaaaa ggcatgggga caaatctttc tgtccccaat 60
ccactgggat tcttccccga tcatcagttg gaccctgcat tcaaagccaa ctcagaaaat 120
ccagattggg acctcaatcc acacaaggac aattggccgg acgccaacaa ggtgggagtg 180
ggagcattcg ggccagggtt cacccctccc catgggggcc tgttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tactcacaac tgtgccagca gcacctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc cttatctcca cctctaaggg acactcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccaccacttt ccatcaaact cttcaagatc ccagagtcag ggctctgtac 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtgagccctg ctcagaatac tgcctctgcc 480
atatcgtcaa ccttctcgaa gactggggac cctgtaccga acatggagaa catcgcatca 540
ggactcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aaaaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaacaccc 660
gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccaa atctccagtc actcaccaac ttgttgtcct 720
ccaatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctctgcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggatc atcaaccacc agcaccggac catgcagaac ctgcacgact 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggacggaaac 960
tgcacctgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tctggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat gccgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 7
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 7
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgaaaa ggcatgggga caaatctttc tgtccccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcat tcaaagccaa ctccgacaat 120
ccagattggg acctcaaccc acacaaggac aactggccgg acgccaacaa ggtgggagtg 180
ggagcattcg ggccgggatt cactcctccc catgggggac tattggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tactcacatc tctgccagca gctcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
gtaggaaggc agcctactcc cctttctcca cctctaagag acactcatcc tcaagccatg 360
cagtggaact ccaccacgtt ccaccaaact cttcaagatc ccagagtcag ggctctgtac 420
tttcctgctg gtggctccag ttcaggagca gtgaaccctg ctcagaatac tgcctcttcc 480
atatcgtcaa tcttatcgaa gactggggac cctgtaccga acatggagaa catcgcatca 540
ggactcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aaaaatcctc 600
acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaacaccc 660
gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccaa atctccagtc actcaccaac ctgttgtcct 720
ccaatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctttgcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggatc atcaaccacc agcaccggac catgcaagac ctgcacgact 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggacggaaat 960
tgcacctgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccctttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tctggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat gccgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 8
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 8
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaacctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gacccagcgt tcggagccaa ttcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat caatggccag cggcaaacca ggtaggagtg 180
ggatcattcg ggccagggtt cactccacca cacggcagtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccagcacatt ccaccaagct ctgctagatc ccagagtgag gggcctatac 420
tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctctccc 480
atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga atatggagag caccacatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggagcaccc 660
acgtgtcctg gccaaaattt gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720
ccaatttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact accaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctac ttccaggaac atcaactacc agcacgggac catgcaagac ctgcacgatt 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctct tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaat 960
tgcacttgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa gattcctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga atcccttttt acctctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 9
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 9
atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagta gcacctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccacaacatt ccaccaagct ctgctagacc ccagagtgag gggcctatac 420
tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctcaccc 480
atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga acatggagaa cacaacatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggagcaccc 660
acgtgtcctg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720
ccaatttgtc ctggctatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact accaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctac ttccaggaac atcaactacc agcacgggac catgcaagac ctgcacgatt 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctct tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 960
tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgcaa gattcctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtcccttttt acctctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 10
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 10
atgggaggtt ggtcttccaa acctcggaaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat caatggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggaggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccaaca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca ccgctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaatt ccacaacatt ccaccaagct ctgctagatc ccagagtaag gggcctttac 420
tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctctccc 480
atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga acatggagag cacaacatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggtgtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg ggaagcacca 660
aggtgtcctg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720
ccaatttgtc ctggctatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact accaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctac ttccaggaac atccactacc agcacgggac catgcaagac ctgcacgatt 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 960
tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgtaa gattcctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gcgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat acctctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 11
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 11
atgggaggtt ggtcttccaa acctcggaaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcatcagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180
ggggcattcg ggccagggtt caccccacca cacggaggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattaacaac agtgcccgca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggacgac agcctactcc catctctcca cctctaagag atactcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccacaacatt ccaccaagct ctgctagatc ccagagtgag gggcctttat 420
tatcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctctccc 480
atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga acatggagaa cacagcatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggtgtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg ggaagcaccc 660
gtgtgtcctg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720
ccaacttgtc ctggctatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttattggtt cttctggact accaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctac ttccaggaac ctcaactaca agcacgggac catgcaagac ctgcacgatt 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 960
tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgtaa gattcctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gcgccatttg ttcagtggtt cgccgggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtccctttat accgctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 12
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 12
atgggaggtt ggtcttccaa acctcggaaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tttttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggccaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt cactccccca cacggaggtc ttttggggtg gagcccgcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagca gctcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acactcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccacagcatt tcaccaagct ctgcaagatc ccagagtaag gggcctgtat 420
tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgaatac tgtctctcac 480
atctcatcaa tcttcacgac gactggggac cctgcaacga acatggagaa cacaacatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggagctccc 660
gcgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccaa acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720
ccaacctgtc ctggctatcg ttggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggatt atcaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctac ttccaggatc aacgaccacc agcacgggac cttgcagaac ctgcacgatc 900
actgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaat 960
tgcacttgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aattcctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gcgccatttg ttcagtggtt cgcagggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatctggt attgggggcc aagtctatac 1140
aacatcttga gtcccttttt tccgctgtta ccacttttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 13
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 13
atgggaggtt attcttccaa acctcgaaaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tcttgccaga ccatcagttg gacccggctt tcggagccaa ttcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggac ccttggccag aggcttggca ggtaggagct 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggcc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagca gctcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg 360
cagtggaact ccacaacatt tcatcaagct ctgctagatc ccagagtaag gggcctatac 420
tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gcaaaccctg ttccgactac tgcctctccc 480
atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga acatggagaa cacaacatca 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aaaaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggagcaccc 660
acgtgtcctg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720
ccaatttgtc ctggctatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact accaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctaa ttccaggaac atccacaaca agcacgggac catgcaagac ctgcacgact 900
cctgctcaag gcacctctat gtttccctct tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 960
tgcacctgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgcaa aattcctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gcgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
aacatcttga gtcccttttt acctctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 14
<211> 1200
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 14
atgggaggtt ggtcttccaa acctcggaaa ggcatgggga cgaatctgtc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaaa 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cattggccaa aggcaaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggaggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaaggc agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcaccc tcaggccatg 360
cagtggaact ccacagcatt ccaccaagct ctgctagatc ccagagtgag gggcctttat 420
tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactat tgcctctccc 480
atctcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga acatggagag cacaacatcc 540
ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggtgtttt tcttgttgac aagaatcctc 600
acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg ggaagcaccc 660
atgtgtcctg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct 720
ccaatttgtc ctggctatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc 780
ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggatt accaaggtat gttgcccgtt 840
tgtcctctac ttccaggaac atcaactacc agcacgggac cttgcaagac ctgcacaatt 900
cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaac 960
tgcacttgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcgcaa gattcctatg ggagtgggcc 1020
tcagtccgtt tctcctggct cagtttacta gcgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt 1080
tcccccactg tctggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac 1140
agcatcttga gtccctttat acctctatta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt 1200
<210> 15
<211> 3221
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 15
ttccacagct ttccaccaag ctctgcaaga tcccagagtc aggggcctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cactcaaccc tgttccaaat attgcctctc acatctcgtc 120
aatctcctcg aggactgggg accctgcgcc gaacatggag aacatcacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatcac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tccacaacaa ccagtacggg accctgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggcaactct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtactggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa agagatgggg ttattcccta aatttcatgg ggtatgtaat tggaagttgg 900
ggtacattgc cacaggatca tattatacaa aaaatcaaac actgttttag aaaacttcct 960
gtcaatcggc ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgcc 1020
gctccattta cacaatgtgg ttaccctgca ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagcg 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatatgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggccat cggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaaa 1320
ctcatcggga ctgataattc tgtcgtcctt tctcggaaat atacatcatt tccatggctg 1380
ctaggttgta ctgccaactg gattcttcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcgcggggc cgcttgggac tctatcgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgtacc gtccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgttgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca tcagatcctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctcccagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcctacttca aagactgtgt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aagatctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gcgcaccatc atcatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgta catgtcccac 1860
ttttcaagcc tccaagctgt gccttggatg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct tctgacttct ttccttccgt 1980
ccgggatcta ctagatacag cctcagctct gtatcgggaa gccttagagt ctcctgagca 2040
ttgctcacct caccatacag cactcaggca agccattctc tgctgggggg aattaatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca tccagggatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaat actaacatgg gcctaaagat caggcaacta ttgtggtttc atatttcttg 2220
ccttactttt ggaagagaaa ctgtccttga gtatttggtc tctttcggag tgtggattcg 2280
cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgagacc gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag 2400
acgaagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta 2460
ttccttggac tcataaggtg ggaaatttta ctgggcttta ttcttctact gtccctatct 2520
ttaatcctga atggcaaact ccttcttttc ctaaaattca tttacatgaa gacattgcta 2580
ataggtgtca gcaatttgta ggccctctca ctgtaaatga aaagagaaga ctgaaattaa 2640
ttatgcctgc taggttttat cctaacagca ctaaatattt gcctctagac aaagggatta 2700
aaccttatta tcctgatcat gtagttaatc attactttca aacccgacat tatttacata 2760
ctctttggaa ggctgggatt ctatataaga gggaaactac acgtagcgcc tcattttgcg 2820
ggtcaccata ttcttgggaa caagagctac atcatgggag gttggtcatc aaaacctcgc 2880
aaaggcatgg ggacgaacct ttctgttccc aaccctctgg gattctttcc cgatcatcag 2940
ttggaccctg cattcggagc caattcaaac aatccagatt gggacttcaa ccccatcaag 3000
gaccactggc cacaagccaa ccaggtagga gtgggagcat tcgggccagg gttcactccc 3060
ccacacggag gtgttttggg gtggagccct caggctcagg gcatattggc cacagtgcca 3120
gcagttcctc ctcctgcctc caccaatcgg cagtcaggaa ggcagcctac tcccatctct 3180
ccacctctaa gagacagtca tcctcaggcc atgcagtgga a 3221
<210> 16
<211> 3221
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 16
ttccactgcc ttccaccaag ctctgcagga tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc 120
aatctccgcg aggactgggg accctgtgac gaacatggag aacatcacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatcac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcaacaacaa ccagtacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggcaactct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcgtcct gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatcgt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctc tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa aaagatgggg ttattcccta aacttcatgg gttacataat tggaagttgg 900
ggaacattgc cacaggatca tattgtacaa aagatcaaac actgttttag aaaacttcct 960
gttaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gctccattta cacaatgtgg atatcctgcc ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtacatgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaag 1320
ctcatcggaa ctgacaattc tgtcgtcctc tcgcggaaat atacatcgtt tccatggctg 1380
ctaggctgta ctgccaactg gatccttcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctctcggggc cgcttgggac tctctcgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgttcc agccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgttgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca tcagatcctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctcccagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcctacttca aagactgtgt gtttaaggac tgggaggagc 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gcgcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgta catgtcccac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct tctgacttct ttccttccgt 1980
cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa gccttagagt ctcctgagca 2040
ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc tgctgggggg aattgatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca tccagggatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta ttgtggtttc atatatcttg 2220
ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc tctttcggag tgtggattcg 2280
cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag 2400
acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta 2460
ttccttggac tcataaggtg ggaaacttta cggggcttta ttcctctaca gtacctatct 2520
ttaatcctga atggcaaact ccttcctttc ctaagattca tttacaagag gacattatta 2580
ataggtgtca acaatttgtg ggccctctca ctgtaaatga aaagagaaga ttgaaattaa 2640
ttatgcctgc tagattctat cctacccaca ctaaatattt gcccttagac aaaggaatta 2700
aaccttatta tccagatcag gtagttaatc attacttcca aaccagacat tatttacata 2760
ctctttggaa ggctggtatt ctatataaga gggaaaccac acgtagcgca tcattttgcg 2820
ggtcaccata ttcttgggaa caagagctac agcatgggag gttggtcatc aaaacctcgc 2880
aaaggcatgg ggacgaatct ttctgttccc aaccctctgg gattctttcc cgatcatcag 2940
ttggaccctg cattcggagc caactcaaac aatccagatt gggacttcaa ccccatcaag 3000
gaccactggc cagcagccaa ccaggtagga gtgggagcat tcgggccagg gctcacccct 3060
ccacacggcg gtattttggg gtggagccct caggctcagg gcatattgac cacagtgtca 3120
acaattcctc ctcctgcctc caccaatcgg cagtcaggaa ggcagcctac tcccatctct 3180
ccacctctaa gagacagtca tcctcaggcc atgcagtgga a 3221
<210> 17
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 17
ctccaccact ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggctctgt actttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtaagccc tgctcagaat actgtctcag ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtgcc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttctcgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct cagttttcta gggggaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacca ccagcacggg accatgcaag acctgcacaa ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cacaaaacaa aaagatgggg atattccctt aacttcatgg gatatgtaat tgggagttgg 900
ggcacattgc cacaggaaca tattgtacaa aaaatcaaac tatgttttag gaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tgggtctttt ggggtttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg atatcctgct ttaatgcctt tatatgcatg tatacaagca 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatctgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc tggagcaaaa 1320
ctcatcggga ctgacaattc tgtcgtgctc tcccgcaagt atacatcatt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcccggggc cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgt 1500
ctgccgtacc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacctg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttactgag tgggaggagc 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctagtc atctcttgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttagggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccgtcggt 1980
gcgagacctc ctagataccg ctgctgctct gtatcgggaa gccttagaat ctcctgaaca 2040
ttgctcacct caccacacag cactcaggca agctattctg tgctgggggg aattaatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttaca agatccagcg tccagggatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaac actaacatgg gcctaaagat caggcaatta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcctacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa ccccaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttacggggc tctattcttc tacagtacct gtctttaatc 2520
ctgaatggca aactccttct tttccagaca ttcatttgca ggaggacatt gttgatagat 2580
gtaagcaatt tgtgggaccc cttacagtaa atgaaaacag gagactaaaa ttaataatgc 2640
ctgctagatt ttatcctaat gttaccaaat atttgccctt agataaaggg atcaaacctt 2700
attatccaga gcatgtagtt aatcattact tccagacgag acattatttg catactcttt 2760
ggaaggcggg tatcttatat aaaagagagt caacacatag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagat ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatccc ctgggattct tccccgatca tcagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc agaaaatcca gattgggacc tcaacccaca caaggacaac 3000
tggccggacg cccacaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat 3060
gggggactgt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tcacatctgt gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct 3180
ctaagggaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 18
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 18
ctccaccact ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggccctgt actttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtgagccc tgctcagaat actgtctctg ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttctcgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggaaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacaa ccagcaccgg accatgcaaa acctgcacaa ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gttttggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cacaaaacaa aaagatgggg atattccctt aacttcatgg gatatgtaat tgggagttgg 900
ggcacattgc cacaggaaca tattgtacaa aaaatcaaaa tgtgttttag gaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tgggtctttt ggggtttgcc 1020
gcccctttca cgcaatgtgg atatcctgct ttaatgcctt tatatgcatg tatacaagca 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatctgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc tggggcaaaa 1320
ctcatcggga ctgacaattc tgtcgtgctc tcccgcaagt atacatcatt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcccggggc cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgc 1500
ctgttgtacc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca caggaacctg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaatgag tgggaggagt 1740
tgggggagga ggttaggtta aagatctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtgt 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttagggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga agatccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaac gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt gggagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcatatagac cacaaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgaagaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtattcctt 2460
ggacacataa ggtgggaaac tttacggggc tttattcttc tacggtacct tgctttaatc 2520
ctaaatggca aactccttct tttcctgaca ttcatttgca ggaggacatt gttgatagat 2580
gtaagcaatt tgtggggccc cttacagtaa atgaaaacag gagactaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ttatcccaat gttactaaat atttgccctt agataaaggg atcaaaccgt 2700
attatccaga gtatgtagtt aatcattact tccagacgcg acattattta cacactcttt 2760
ggaaggcggg gatcttatat aaaagagagt ccacacgtag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagat ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatccc ctgggattct tccccgatca tcagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc agaaaatcca gattgggacc tcaacccgca caaggacaac 3000
tggccggacg ccaacaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat 3060
gggggactgt tggggtggag ccctcaggct cagggcctac tcacaactgt gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct 3180
ctaagggaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 19
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 19
ctccaccacg ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggctctgt actttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtgaaccc tgttcagaac actgcctctt ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtgcc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acttgttgtc ctccgatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacca ccagcaccgg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gttttggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cataaaacaa aaagatgggg ctactccctt aacttcatgg ggtatgtaat tggaagttgg 900
ggcaccttac cccaggaaca tattgtgttg aaaatcaaac aatgttttag gaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaggtgtgt caacgaattg tgggtctttt gggatttgct 1020
gctcctttca cacaatgtgg ttatcctgct ttaatgcctt tatatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taaacaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggccaggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggga ctgacaattc tgtcgtcctt tcccgcaaat atacatcgtt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcccggggc cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgt 1500
ctgccgtacc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacctg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttactgag tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctt ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttaatgaa 2100
tctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcatatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtattcctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttacggggc tttattcttc tacggtacct agctttaatc 2520
ctaaatggca aactccttct tttcctgaca ttcatttgca ggaggacatc attaataggt 2580
gtaaacaatt tgtgggaccc ctcacagtga atgaaaacag gagactaaaa ttgattatgc 2640
ctgctaggtt ctatcctaat gttactaaat atttgccctt agataaagga attaaacctt 2700
attatccaga gcatgtagtt aatcattact tccagacgag acattattta catactcttt 2760
ggaaggcggg tatcttatat aaaagagaga caacacgtag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cctccaaacc tcgacaaggc 2880
atggggacaa atctttccgt ccccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc cgacaatccc gattgggacc tcaacccaca caaggacaac 3000
tggccggact ccaacaaggt gggagtggga gcattcgggc cgggattcac tccaccccat 3060
gggggactgt tggggtggag ccctcaagct cagggcatac tcacaactgt gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcaggta ggaaggaagc ctactcccct gtctccacct 3180
ctaagagaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 20
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 20
ctccaccact ttccatcaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggctctgt actttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtgagccc tgctcagaat actgcctctg ccatatcgtc 120
aaccttctcg aagactgggg accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acttgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacca ccagcaccgg accatgcaga acctgcacga ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cacaaaacaa aaagatgggg atattccctt aatttcatgg gatatgtaat tgggagttgg 900
ggctccttgc cacaggaaca tattgtacaa aaaatcaaat tatgttttag gaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tgggtctttt ggggttcgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg atatcctgct ttaatgcctt tatatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatctgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctatgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgcg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaaa 1320
cttatcggga ctgacaattc tgtcgtgctc tcccgcaagt atacatcgtt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcccggggc cgcttggggc tctaccgccc gctcctccgt 1500
ctgccgtacc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttactgag tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttagggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctt ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacgg cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctagccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcatatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatca ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtattcctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttacggggc tttattcttc tacggtacct aactttaatc 2520
ctgattggca aactccttct tttcctgaca ttcatttgca ggaagacatt gttgataggt 2580
gtaagcaatt tgtgggaccc ctaacagtaa atgaaaacag gagactaaaa ttaattatgc 2640
ctgctagatt ttatcccaat gttaccaaat acttgccctt agataaagga atcaaaccct 2700
attatccaga gcatgtagtt aatcattact tccagacgag acattattta catactcttt 2760
ggaaggcggg tatcttatat aaaagagaga caacacgtag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatcca ctgggattct tccccgatca tcagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc agaaaatcca gattgggacc tcaatccaca caaggacaat 3000
tggccggacg ccaacaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat 3060
gggggcctgt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tcacaactgt gccagcagca 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct 3180
ctaagggaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 21
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 21
ctccaccacg ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggctctgt actttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggag cagtgaaccc tgctcagaat actgcctctt ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctttgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacca ccagcaccgg accatgcaag acctgcacga ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggacggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccctt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
cataaaacaa aacgttgggg ttactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggcacattac ctcaagaaca catcgtgtca aaaatcaaac aatgttttag aaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaggtgtgt caacgaattg tgggtctttt gggatttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg gtatcctgct ttaatgcctt tatatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttat aaggcctttc taaacaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggccaggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggctat cggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc tggagcgaaa 1320
ctcatcggga ctgacaattc ggttgtcctt tcccgcaaat atacatcgtt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctctcggggc cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgt 1500
ctgccgttcc gaccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaatgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaatgag tgggaggagt 1740
tgggggagga gatgaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctagtc atctcttgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttagggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc tttcttgcct tctgacttct ttccgtcggt 1980
tcgagatctc ctagacaccg ccgctgcttt gtatcgggaa gccttagagt ctcctgaaca 2040
ttgctcgcct caccatacag cactcaggca agctattttg tgctgggggg aattaatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttaga agatccagca tccagagacc tagtagtcaa 2160
ttatgttaac actaacatgg gactaaagat caggcaatta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttaccttt ggaagagaga ctgttcttga atatttggtg tcctttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcatatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttattaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
atctcaatca ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa ccccaatgtt agtattcctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttacggggc tttattcttc tacggtacct gtctttaatc 2520
ctgaatggca aactccttct tttcctaaca tacatttgca ggagaacatt attgataggt 2580
gtaaacaatt tgtgggaccc ctcacagcaa atgaaaacag gagactaaaa ttgatcatgc 2640
ctgctaggtt ttatcctaat actactaaat atttgccctt agataaagga attaaacctt 2700
attatccaga gcatgtagtt aatcattact tccagacgag acattattta catactcttt 2760
ggaaggcggg tatcttatat aaaagagaaa caacgcgtag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacatcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc cgacaatcca gattgggacc tcaacccaca caaggacaac 3000
tggccggacg ccaacaaggt gggagtggga gcattcgggc cgggattcac tcctccccat 3060
gggggactat tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tcacatctct gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcaggta ggaaggcagc ctactcccct ttctccacct 3180
ctaagagaca ctcatcctca agccatgcag tggaa 3215
<210> 22
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 22
ctccagcaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat actttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctctc ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaatatggag agcaccacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300
tggccaaaat ttgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaag acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa attgcacttg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gaatcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtaccttgc cacaggaaca tattgtacaa aaaatcaaac aatgttttcg gaaacttcct 960
ataaatagac ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tggggcttct gggctttgcc 1020
gctcccttta cacaatgtgg ttacccagca ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggtcaggt ctttgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaaa 1320
cttatcggca ccgacaactc tgttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgtttgggac tctaccgtcc ccttcttcgt 1500
ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgcccg ccaggtcttg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt atttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta atgatctttg tactgggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcccac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgtgatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactaaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtaag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ctgactggca aactccctct tttcctcaca ttcatttgaa agaggatatt atcaacagat 2580
gtcaacaata tgtaggccct cttacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttgattatgc 2640
ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt agataaaggc attaaacctt 2700
attatcctga acatacagtt aatcattact tccaaactag acattattta catactctgt 2760
ggaaggctgg tattttatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880
atggggacga acctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
ccagcgttcg gagccaattc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcaa 3000
tggccagcgg caaaccaggt aggagtggga tcattcgggc cagggttcac tccaccacac 3060
ggcagtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacagt gccagcagcg 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 23
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 23
ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga ccccagagtg aggggcctat actttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag aacacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaag acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtactttac cgcaagaaca tattgtacta aaaatcaagc aatgttttcg aaaactgcct 960
gtaaatagac ctattgattg gaaagtatgt cagagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc ttaatgcctt tatatgcatg tatacaatct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggatggg gcttggctat tggccatcgc cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggaa ccgacaactc tgttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380
ctagggtgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgtttgggac tctaccgtcc ccttcttcat 1500
ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaggac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta atgatctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ctgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ctgagtggca aactccctcc tttcctcaca ttcatttaca ggaggacatt attaatagat 2580
gtcaacaata tgtgggccct cttacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt ggacaaaggc attaaaccat 2700
attatcctga acatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta catactctgt 2760
ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000
tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 3060
ggcggtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacagt gccagtagca 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 24
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 24
ttccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagta aggggccttt actttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctctc ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggtgtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggaagcac caaggtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatccacta ccagcacggg accatgcaag acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgt aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagcgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
aataagacca agagatgggg ctattccctt aacttcatgg gctatgtaat tggaagttgg 900
ggtaccttac cacaagaaca tattagacta aaaatcaaaa actgttttcg aaaacttcct 960
gtaaataggc ctattgattg gaaggtgtgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg atatcctgcc ttaatgcctt tgtatgcatg tattcaagct 1080
aaacaagctt tcactttttc gtcaacttac aaagtttttc tgtgtaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtccggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggatggg gcttggccat tggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact ccttgcagct tgttttgctc gcagccggtc tggggcgaaa 1320
cttatcggaa ctgacaactc tgttgtcctt tctcgcaaat acacctcgtt tccatggctg 1380
ctcggttgtg ctgccaactg gatccttcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgcttggggc tctaccgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgttcc ggccaaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cgggccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca catggtattg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctctcagcga 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt atttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattagatta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgatttct ttccgtctat 1980
tcgagacctc ctcgacaccg cctcagctct gtaccgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctgttctg tgttggggtg agttaatgaa 2100
tctggctacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtggtcag 2160
ttatgtcaac attaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg tcttttggag tgtggatccg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatca ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc cactgtacct gtctttaatc 2520
ctgagtggca aactccctct tttcctgaca ttcatttgaa agaggacatt atcaataggt 2580
gtcaacaata tgtgggccct cttacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ttatcctaac cttaccaaat atttgccgtt agataaaggc attaaaccct 2700
attatcctga acacgcagtt aatcattact ttaaaactag gcattattta catactctgt 2760
ggaaatctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacggcatg ggaggttggt cttccaaacc tcggaaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcaa 3000
tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 3060
ggaggtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacagt gccaacagcg 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccaccg 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 25
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 25
ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggccttt attatcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctctc ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag aacacagcat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggtgtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggaagcac ccgtgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acctcaacta caagcacggg accatgcaag acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgt aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagcgccatt tgttcagtgg ttcgccgggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ataccgctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
aataaaacca agcgatgggg atattccctt aatttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtaccttac cacaagaaca tattgtacgc aaaatcaaac aatgtttcag aaaacttcct 960
gtaaataggc ctattgattg gaaagtgtgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg atatcctgcc ttaatgcctt tgtatgcatg tattcaagct 1080
aagcaagctt tcactttttc gtccacttac aaggtgtttc tgtgtaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtccggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat tggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact ccttgcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggaa ctgacaactc tgttgtcctt tctcgcaaat acacctcgtt tccatggctg 1380
ctcggttgtg ctgccaactg gatccttcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgcttgggga tctatcgtcc ccttcttcgt 1500
ctgccgttcc ggccaaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cgggccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca catggtattg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctctcatcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaaggac tgggaggagt 1740
taggggagga gatcaggtta aaggtctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gcttccgtgg aattactctc ttttttgcct tctgatttct ttccgtctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctcagcttt gtaccgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctgttctg tgttggggtg agttaatgaa 2100
tctggctacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagttgtcag 2160
ttatgttaac attaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatca ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc cactgtacct gtctttaatc 2520
ctgagtggca aactccctct tttcctgaca ttcatttaaa agaggacatt atcaataggt 2580
gtcaacaata tgtgggccct cttacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ttatcctaac cttaccaaat atttaccttt agataaaggc attaaaccct 2700
attatcctga acacgcagtt aatcattact ttaaaactag gcattattta catactctgt 2760
ggaaagctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcggaaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca tcagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000
tggccagagg caaatcaggt aggagcgggg gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 3060
ggaggtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat taacaacagt gcccgcagcg 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggacgacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagata ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 26
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 26
ctccacagca tttcaccaag ctctgcaaga tcccagagta aggggcctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgaat actgtctctc acatctcatc 120
aatcttcacg acgactgggg accctgcaac gaacatggag aacacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagctc ccgcgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacctg 360
tcctggctat cgttggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga tcaacgacca ccagcacggg accttgcaga acctgcacga tcactgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct tcggacggaa attgcacttg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagcgccatt tgttcagtgg ttcgcagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatctg gtattggggg ccaagtctat acaacatctt 780
gagtcccttt tttccgctgt taccactttt cttttgtctt tgggtataca tttaaatccc 840
cacaaaacaa aacgatgggg ttattccctc aacttcatgg gatatgtgat tggtagctgg 900
ggaagcttac cacaagatca tattgtacaa aaaatcaaac acagttttag aaaacttccc 960
gttaataggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg taggtctctt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg gtatcctgcc ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgcaaaca atatctgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acgggctggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggccat aggccatcag cgcctgcggg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggca ccgacaactc cgttgtcctt tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380
ctcggttgtg ctgcgaactg gatcctacgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaaccccg cggacgaccc gtctcgcggc cgcttgggga tctaccgtcc ccttcttcgt 1500
ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc atgtcgcatg gcgaccaccg 1620
tgaacgccca catgatcttg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcaacga 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgatttct ttccgtctat 1980
tcgagatctc cttgacactg cctccgctct atatcgggat gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag ccctcaggca agctattctg tgttggggtg agttaatgaa 2100
tctggctacc tgggtaggaa gtaatttgga agatccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ttatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat tagacaatta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttctaga gtatttggta tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgaagaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tcccaatgtt agtatcccgt 2460
ggactcataa ggtgggaaat tttacggggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ctgagtggca aactccctct tttcctgata ttcatttaaa agaagacatt atcaataggt 2580
gtcaacaata tgtgggcccc cttacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ttatcctaac attaccaaat atttgccctt agataaaggc attaaacctt 2700
attatcctga acatgcagtt aatcattact tcaagactag gcattattta catactctgt 2760
ggaaggctgg tattctatat aagagagaaa ccacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcggaaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggatttt ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000
tggccagagg ccaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac tcccccacac 3060
ggaggtcttt tggggtggag cccgcaggct cagggcatat tgacaacagt gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 27
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 27
ctccacaaca tttcatcaag ctctgctaga tcccagagta aggggcctat actttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagcaaaccc tgttccgact actgcctctc ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag aacacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga acatccacaa caagcacggg accatgcaag acctgcacga ctcctgctca 540
aggcacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aaaattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagcgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ttacctctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
cacaaaacca agcgttgggg ctactccctt aatttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtaccttac cacaggatca tattgtacta aaaatcaagc aatgttttcg aaaactccct 960
gttaatcgac cgatagattg gaaagtatgc caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg ttatcctgca ttactgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcttttc tgtgtaaaca atatttgacc 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggccaggt ctatgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat gggccatcgg cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact ccttgcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaaa 1320
ctcataggaa ccgacaactc tgttgtcctc tctcggaaat acacctcgtt tccatggctg 1380
ctcggttgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggg cgcttgggga tctatcgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgttcc agccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcgtacttca aagactgttt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gcgtaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttccgtgg agttactctc ttttttgcct tctgatttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agatccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat caggcaactg ttgtggtttc acatttcttg 2220
tcttactttt ggaagagaaa cggttcttga gtatctggtg tccttcgggg tgtggattcg 2280
tacacccccc gcatataggc caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggacacataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc taatgtacct gtctttaacc 2520
ctgagtggca aactccctct tttcctgata tacatttgca ggaggacatt attaatagat 2580
gtcaacaatt tgtgggcccg cttactgtaa atgaaaaaag gagactaaag ttaattatgc 2640
ctgctagatt ttttcctaac cttaccaaat atttgccctt agataaaggc attaaacctt 2700
attatcctga acatatagtt aatcattact tcaaaactag gcattatttg catacccttt 2760
ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttatt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct tgccagacca tcagttggac 2940
ccggctttcg gagccaattc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggaccct 3000
tggccagagg cttggcaggt aggagctgga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 3060
ggcggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacagt gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 28
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 28
ctccacagca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggccttt attttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact attgcctctc ccatctcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat ccggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggtgtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggaagcac ccatgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ttaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatcaacta ccagcacggg accttgcaag acctgcacaa ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagcgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatctt 780
gagtcccttt atacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
aacaaaacta aacgatgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtaccttac cacaggaaca tattgtacta aaaatcaagc agtgttttcg aaaacttcct 960
gtaaataggc ctattgattg gaaggtgtgt caacggattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg gtatcctgcc ttgatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtcaaca atatatgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtctggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggcttt aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggaa ccgacaattc tgttgtcctc tctcggaaat acacctcctt cccatggctg 1380
ctcggttgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgcttggggc tctaccgtcc ccttcttcgt 1500
ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca catggtcttg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctctcagcga 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcgtacttca aagactgtgt gtttaaggac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactgggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgatttct ttccgtctat 1980
tcgagacctc ctcgacaccg cctcagcctt gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgctcacct caccatacag ccctcaggca agctgttctg tgttggggtg agttaatgaa 2100
tctggctacc tgggtgggaa gtaatttaga agacccagca tccagagaat tagtagtcag 2160
ttatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat tagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tctcacattt ggaagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgacg 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgcc gaagatctca atctcgggaa tcccaatgtt agtatacctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ctgagtggca aactccctct tttcctgaca ttcatttgca ggaggacatt atcaataggt 2580
gtcaacaatt tgtgggccct cttacagtta atgaaaagcg gagattaaaa ttaataatgc 2640
ctgcgaggtt ctatcctaac cttaccaaat acttgccatt agataaaggc attaaacctt 2700
attatcctga acatgcagtt aatcattact ttaaaaccag gcattattta catactctgt 2760
ggaaggctgg catactatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcggaaaggc 2880
atggggacga atctgtctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaaacca gattgggact tcaaccccaa caaggatcat 3000
tggccaaagg caaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 3060
ggaggtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacagt gccagcagcg 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcaccctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 29
ttcacctctg cacgtcg 17
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 30
atgtcaacga ccgaccttga 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 31
gaggctgtag gcataaattg gtct 24
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 32
aggagtgcga atccacact 19
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 33
ccgagattga gatcttctgc gacgcg 26
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 34
actttttcac ctctgcctaa tcatctc 27
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 35
tgttcatgtc ctactgttca agc 23
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 36
aaaaagttgc atggtgttgg t 21
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 37
cagaccaatt tatgcctaca gcctc 25
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 38
caggtcccct agaagaagaa ct 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 39
gaagaagaac tccctcgcct cg 22
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 40
tctttgggta tacattt 17
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 41
aatatgttct tgtggtaagg ta 22
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 42
gatatgggag aggcagtagt cgga 24
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 43
aggagttccg cagtatggat cg 22
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 44
gcgacgtgca gaggtgaag 19
Claims (33)
1.一种方法，其在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的肝脏炎症状态，或确定HBV的遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，所述方法包括
a)基于与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，获得存在于从所述受试者获得的样本中的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分的序列信息，以确定在所述S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的所述频率；和
b)根据两个或多个密码子的非同义突变的所述频率确定S ORF区域的非同义突变的所述频率，以确定所述受试者的所述肝脏炎症状态或所述HBV的所述遗传状态，或根据S ORF区域的非同义突变的所述频率确定所述受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
2.一种***，其在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的所述肝脏炎症状态，或确定HBV的所述遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，所述***包括
a)测量工具，其分析关于存在于从所述受试者获得的样本中的HBV的所述S ORF区域的至少一部分的序列信息，以确定所述S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的所述频率，
b)处理器，
c)计算机可读介质，和
d)分析工具，其存储在所述计算机可读介质上，适配成在所述处理器上执行根据所述两个或多个密码子的非同义突变的所述频率确定所述HBV的所述S ORF区域的非同义突变的所述频率，以确定所述受试者的所述肝脏炎症状态或HBV的所述遗传状态，或根据所述SORF区域的非同义突变的所述频率确定所述受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症；
步骤(a)的分析或步骤(d)的确定基于与受试者感染的HBV的S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列。
3.一种方法，其在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的所述肝脏炎症状态，或确定HBV的所述遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，所述方法包括
通过包括以下的方法确定所述HBV的S ORF区域中的非同义突变的所述频率
a)提供关于存在于从所述受试者获得的样本中的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分的序列信息，
b)选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
c)将所述序列信息与所述S ORF参考序列进行比较以确定所述S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的所述频率，和
d)根据所述两个或多个密码子的非同义突变的所述频率确定所述S ORF区域的非同义突变的所述频率，以确定所述受试者的所述肝脏炎症状态或所述HBV的所述遗传状态，或根据所述S ORF区域的非同义突变的所述频率确定所述受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
4.一种***，其在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的所述肝脏炎症状态，或确定HBV的所述遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，所述***包括
a)测量工具，其产生关于存在于从所述受试者获得的样本中的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分的序列信息，
b)处理器，
c)计算机可读介质，和
d)分析工具，其存储在所述计算机可读介质上，适配成通过以下在所述处理器上执行以确定所述HBV的所述S ORF区域中的非同义突变的所述频率
i)选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
ii)将由所述测量工具产生的所述序列信息与所述S ORF参考序列进行比较以确定所述S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的所述频率，
iii)根据所述两个或多个密码子的非同义突变的所述频率确定所述S ORF区域的非同义突变的所述频率，以确定所述受试者的所述肝脏炎症状态或所述HBV的所述遗传状态，或根据所述S ORF区域的非同义突变的所述频率确定所述受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其包括使用寡核苷酸引物对扩增从所述受试者获得的样本中存在的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物，并产生关于所述扩增引物的序列信息。
6.根据权利要求2或4所述的***，其中，所述测量工具包括用于扩增从所述受试者获得的样本中存在的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物的寡核苷酸引物对。
7.根据权利要求2或4或6所述的***，其中，所述测量工具包括用于从所述样本或所述扩增引物产生序列信息的核苷酸测序仪。
8.根据权利要求2或4所述的***，其中，所述测量工具包括用于扩增从所述受试者获得的样本中存在的所述HBV的所述S ORF区域的至少一部分以产生扩增引物的寡核苷酸引物对和用于从所述扩增引物产生序列信息的核苷酸测序仪。
9.根据权利要求1、3或5所述的方法，其包括将所述样本或所述扩增引物加入到与HBV的所述S ORF区域中的特定核苷酸杂交以产生所述序列信息的一个或多个核苷酸探针中。
10.根据权利要求2、4或6所述的***，其中，所述测量工具包括与HBV的所述S ORF区域中的特定核苷酸杂交以从所述样本或扩增引物产生所述序列信息的一种或多种核苷酸探针。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法或***，其中，所述寡核苷酸引物对包括
a)正向引物，其包括与所述受试者感染的所述HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，所述HBV的亚基因型包括当所述HBV是基因型B或C时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当所述HBV是基因型A时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
b)反向引物，其包括与所述受试者感染的所述HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，所述HBV基因组参考序列包括所述HBV基因组的核苷酸100-2000。
12.一种试剂盒，其在感染了包括HBV基因型A、B或C的S ORF的HBV的受试者中确定HBV的所述肝脏炎症状态，或确定HBV的所述遗传状态，或鉴定对慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症的易感性或检测其发生风险，所述试剂盒包括
a)寡核苷酸引物对，其用于扩增存在于从所述受试者获得的样本中的所述HBV的所述SORF区域的至少一部分以产生扩增引物，
引物对包括
i)正向引物，其包括与所述受试者感染的所述HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸的序列，所述HBV的亚基因型包括当所述HBV是基因型B或C时的核苷酸1500-3215和核苷酸1-60或当所述HBV是基因型A时的核苷酸1500-3221和核苷酸1-60；和
ii)反向引物，其包括与所述受试者感染的所述HBV的亚基因型相对应的HBV基因组参考序列的一部分的至少约5个连续核苷酸互补的序列，所述HBV基因组参考序列包括所述HBV基因组的核苷酸100-2000，
b)扩增试剂，
c)一个或多个核苷酸探针，其与HBV的所述S ORF区域中的特异性核苷酸序列杂交，以产生关于存在于从受试者获得的样本中的HBV的所述S ORF区域的至少一部分的序列信息，
d)分析工具，其用于在处理器上通过以下执行以确定所述HBV的所述S ORF区域中的非同义突变的所述频率
i)选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的亚基因型相对应的S ORF参考序列，
ii)将由测量工具产生的关于存在于所述扩增引物中所述S ORF区域的至少一部分的序列信息或由所述一个或多个核苷酸探针产生的所述序列信息与所述S ORF参考序列进行比较，以确定所述S ORF区域中两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的所述频率，
iii)根据所述两个或多个密码子的非同义突变的所述频率确定所述S ORF区域的非同义突变的所述频率，以确定所述受试者的所述肝脏炎症状态或所述HBV的所述遗传状态，或根据所述S ORF区域的非同义突变的所述频率确定所述受试者是否易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或是否有更高的风险发生慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或
e)a)至d)中的任何两个或多个的任何组合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中所述受试者被包括HBV基因型C的S ORF的HBV感染。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中所述受试者被包括HBV基因型B的S ORF的HBV感染。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，所述S ORF区域中的所述两个或多个密码子选自包括与SEQ ID NO：1-14任一个的S ORF参考序列的4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387和391位处的密码子相对应的密码子的组。
16.根据权利要求3至15中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列，包括
a)将所述序列信息与一个或多个S ORF亚基因型参考序列比较，以确定所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型，和
b)选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列。
17.根据权利要求3至15中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列，包括
a)提供关于所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型的信息，和
b)选择与所述受试者感染的所述HBV的所述S ORF的所述亚基因型相对应的S ORF参考序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法、***或试剂盒，包括选择以下的所述SORF参考序或其中所述S ORF参考序列包括
a)当所述HBV的所述亚基因型为A1基因型，SEQ ID NO：1；
b)当所述HBV的所述亚基因型为A2基因型，SEQ ID NO：2；
c)当所述HBV的所述亚基因型为B1基因型，SEQ ID NO：3；
d)当所述HBV的所述亚基因型为B2基因型，SEQ ID NO：4；
e)当所述HBV的所述亚基因型为B3基因型，SEQ ID NO：5；
f)当所述HBV的所述亚基因型为B4基因型，SEQ ID NO：6；
g)当所述HBV的所述亚基因型为B5基因型，SEQ ID NO：7；
h)当所述HBV的所述亚基因型为C1基因型，SEQ ID NO：8；
i)当所述HBV的所述亚基因型为C2基因型，SEQ ID NO：9；
j)当所述HBV的所述亚基因型为C3a基因型，SEQ ID NO：10；
k)当所述HBV的所述亚基因型为C3b基因型，SEQ ID NO：11；
l)当所述HBV的所述亚基因型为C4基因型，SEQ ID NO：12；
m)当所述HBV的所述亚基因型为C5基因型，SEQ ID NO：13；和
n)当所述HBV的所述亚基因型为C6基因型，SEQ ID NO：14。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法、***或试剂盒，包括选择与HBV基因型A、B或C的两种或多种亚基因型的相对应的S ORF参考序列或其中所述S ORF参考序列对应于HBV基因型A、B或C的两种或多种亚基因型。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，慢性HBV感染的所述肝脏并发症包括肝硬化、肝癌、肝功能衰竭、肝脏炎症、肝脏损伤、肝脏功能障碍或其任何两种或更多种的组合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，所述方法包括确定，或所述***或试剂盒包括适配成在处理器上执行的分析工具，其用以确定，所述HBV的所述S ORF区域的3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或10个或更多个密码子处的非同义突变的所述频率。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，所述方法包括确定，或者所述***或试剂盒包括适配成在处理器上执行的分析工具以确定与SEQ ID NO：1-14中任一个的S ORF参考序列的至少4、35、51、54、56、73、81、84、120、132、135、141、184、188、192、195、198、214、219、221、242、270、275、300、334、358、363、377、378、382、387和391位处的密码子相对应的至少2、3、5、10、15、20或25个密码子处的非同义突变的所述频率。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，所述方法包括确定，或所述***或试剂盒包括适配成在处理器上执行的分析工具，其用以确定，HBV的所述SORF区域的一部分内的两个或更多个密码子处的非同义突变的所述频率，所述HBV的所述SORF区域的一部份包括与SEQ ID NO：1-14中任一个的S ORF参考序列的密码子1-400、密码子1-300、密码子1-200、密码子1-100、密码子100-400、密码子100-300、密码子100-200、密码子200-400、密码子200-300或密码子300-400相对应的密码子。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中所述方法包括提供有关的序列信息，所述***包括产生有关的序列信息的测量工具，或所述试剂盒包括用于扩增所述HBV的所述S ORF区域的一部分的寡核苷酸引物对，所述HBV的所述S ORF区域的一部份包括与SEQ ID NO：1-14中任一个的S ORF参考序列的密码子1-400、1-300、密码子1-200、密码子1-100、密码子100-400、密码子100-300、密码子100-200、密码子200-400、密码子200-300或密码子300-400相对应的密码子。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中所述方法包括提供有关的序列信息，所述***包括产生有关的序列信息的测量工具，或所述试剂盒包括用于扩增所述HBV的所述S ORF区域的一部分的寡核苷酸引物对，所述HBV的所述S ORF区域的一部份包括所述HBV的所述S ORF的至少约10、20、50、100、200、250、300、400、500、750、1000或1200个连续核苷酸。
26.根据权利要求11至25任一项所述的方法、***或试剂盒，其中所述HBV基因组参考序列是
a)当所述HBV的所述亚基因型为A1基因型，SEQ ID NO：15；
b)当所述HBV的所述亚基因型为A2基因型，SEQ ID NO：16；
c)当所述HBV的所述亚基因型为B1基因型，SEQ ID NO：17；
d)当所述HBV的所述亚基因型为B2基因型，SEQ ID NO：18；
e)当所述HBV的所述亚基因型为B3基因型，SEQ ID NO：19；
f)当所述HBV的所述亚基因型为B4基因型，SEQ ID NO：20；
g)当所述HBV的所述亚基因型为B5基因型，SEQ ID NO：21；
h)当所述HBV的所述亚基因型为C1基因型，SEQ ID NO：22；
i)当所述HBV的所述亚基因型为C2基因型，SEQ ID NO：23；
j)当所述HBV的所述亚基因型为C3a基因型，SEQ ID NO：24；
k)当所述HBV的所述亚基因型为C3b基因型，SEQ ID NO：25；
l)当所述HBV的所述亚基因型为C4基因型，SEQ ID NO：26；
m)当所述HBV的所述亚基因型为C5基因型，SEQ ID NO：27；或
n)当所述HBV的所述亚基因型为C6基因型，SEQ ID NO：28。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中所述序列信息通过下一代测序产生。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中所述HBV的所述SORF区域中的非同义突变的所述频率表明
a)所述受试者具有阳性肝脏炎症状态，
b)所述HBV受到阳性选择压力，
c)所述受试者易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症或具有更高的风险发展成慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或
d)a)至c)中任何两个或多个的组合。
29.根据权利要求1至28所述的方法、***或试剂盒，包括
a)将所述序列信息与所述S ORF参考序列进行比较以确定所述S ORF区域中的两个或多个密码子中的每一个处的非同义突变的所述频率，
b)基于那个密码子处非同义突变的所述频率为每个密码子赋予数值得分，和
c)组合每个密码子的所述数值得分以提供代表所述HBV的所述S ORF区域中的非同义突变的所述频率的组合数值得分。
30.根据权利要求29所述的方法、***或试剂盒，包括为具有至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或至少约50％的非同义突变的频率的每个密码子分配阳性数值得分。
31.根据权利要求30所述的方法、***或试剂盒，其中，每个密码子的所述阳性得分独立地为0.5、1、1.5、2或2.5。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法、***或试剂盒，其中，代表大于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的所述HBV的所述S ORF中的非同义突变的所述频率的组合数值得分表明
a)所述受试者具有阳性肝脏炎症状态，
b)所述HBV受到阳性选择压力，
c)所述受试者易患慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症或具有更高的风险发展成慢性HBV感染的肝脏炎症或肝脏并发症，或
d)a)至c)中任何两个或多个的组合。
33.根据权利要求1至32所述的方法、***或试剂盒，其中，所述受试者
a)为HBeAg阴性，
b)血清ALT水平正常，
c)具有大于约2,000IU/ml的血清HBV-DNA滴度，或
d)具有任何两个或多个a)至c)的组合。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NZ73855817 | 2017-12-21 | ||
| NZ738558 | 2017-12-21 | ||
| PCT/IB2018/060480 WO2019123398A1 (en) | 2017-12-21 | 2018-12-21 | Method of analysis of mutations in the hepatitis b virus and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111465703A true CN111465703A (zh) | 2020-07-28 |
Family
ID=66993168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880079424.8A Pending CN111465703A (zh) | 2017-12-21 | 2018-12-21 | 分析乙型肝炎病毒突变的方法及其用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111465703A (zh) |
| TW (1) | TW201928064A (zh) |
| WO (1) | WO2019123398A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114250325A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-29 | 广西壮族自治区疾病预防控制中心 | 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111621607A (zh) * | 2020-07-21 | 2020-09-04 | 中南大学湘雅二医院 | 检测HBV基因型和/或X区突变的方法、试剂盒，HBx的CDS标准序列、引物及应用 |
| CN113593639B (zh) * | 2021-08-05 | 2023-08-25 | 湖南大学 | 一种用于病毒基因组变异分析、监测方法和*** |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002029098A2 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-11 | Isis Innovation Limited | Genetic factors affecting the outcome of viral infections |
| CN101586170A (zh) * | 2009-07-06 | 2009-11-25 | 重庆医科大学 | 一种检测乙型肝炎病毒基因型的方法及试剂盒 |
| EP2629096A1 (en) * | 2012-02-20 | 2013-08-21 | Roche Diagniostics GmbH | HBV immunocomplexes for response prediction and therapy monitoring of chronic HBV patients |
-
2018
- 2018-12-21 WO PCT/IB2018/060480 patent/WO2019123398A1/en active Application Filing
- 2018-12-21 CN CN201880079424.8A patent/CN111465703A/zh active Pending
- 2018-12-21 TW TW107146397A patent/TW201928064A/zh unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002029098A2 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-11 | Isis Innovation Limited | Genetic factors affecting the outcome of viral infections |
| CN101586170A (zh) * | 2009-07-06 | 2009-11-25 | 重庆医科大学 | 一种检测乙型肝炎病毒基因型的方法及试剂盒 |
| EP2629096A1 (en) * | 2012-02-20 | 2013-08-21 | Roche Diagniostics GmbH | HBV immunocomplexes for response prediction and therapy monitoring of chronic HBV patients |
Non-Patent Citations (9)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114250325A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-29 | 广西壮族自治区疾病预防控制中心 | 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019123398A1 (en) | 2019-06-27 |
| TW201928064A (zh) | 2019-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070042381A1 (en) | Bioinformatically detectable group of novel regulatory viral and viral associated oligonucleotides and uses thereof | |
| CN111465703A (zh) | 分析乙型肝炎病毒突变的方法及其用途 | |
| US20130338012A1 (en) | Genetic risk factors of sick sinus syndrome | |
| JP2011525365A (ja) | Ｈｉｖ親和性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 | |
| JP6092655B2 (ja) | テスト体液サンプルの分類方法 | |
| WO2021188881A2 (en) | Compositions and methods for detecting and treating sars-cov-2 | |
| WO2009026116A2 (en) | Genemap of the human genes associated with longevity | |
| CN110573628A (zh) | 检测癌症的探针组合 | |
| WO2017107545A1 (zh) | Scap基因突变体及其应用 | |
| CN109082469B (zh) | 乙肝病毒肝内整合状况的感染者外周血检测方法 | |
| CN111621607A (zh) | 检测HBV基因型和/或X区突变的方法、试剂盒，HBx的CDS标准序列、引物及应用 | |
| JP5845489B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス群を検出し、遺伝子多様性を評価するためのオリゴヌクレオチドのセット、並びにそれを用いた方法 | |
| CN116445659A (zh) | 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 | |
| Mahmood et al. | Analysis of complete and partial genome sequences of hepatitis B virus and determination of its genotypes and sub-genotypes from Pakistan | |
| JP2017512324A (ja) | ハイスループットシークエンシング用途における変異分析 | |
| Hene et al. | Deep analysis of cellular transcriptomes–LongSAGE versus classic MPSS | |
| CN107475420A (zh) | 无头***症致病新基因及其应用 | |
| TWI646198B (zh) | Method for screening high risk of liver cancer by using hepatitis B virus gene sequence | |
| JP2008531036A (ja) | 抗ウイルス分子に対して耐性を示すｂ型肝炎の遺伝子型解析および表現型解析方法 | |
| AU2014347768A1 (en) | HCV genotyping algorithm | |
| JP2004135659A (ja) | 塩基変異分析方法 | |
| Kiryanov et al. | Spread of variants with gene N hot spot mutations in russian SARS-CoV-2 isolates | |
| KR20130113208A (ko) | 만성 ｂ형 간염 치료제의 약제내성 예측용 조성물 및 그 예측 방법 | |
| JP2003180357A (ja) | 新規なｂ型肝炎ウイルスが持つ核酸分子、及びその検出方法 | |
| Bielawski et al. | Hepatitis delta virus infection in chronically HBV-infected patients from northern Poland |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40026537 Country of ref document: HK |
|
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |