TWI646198B

TWI646198B - Method for screening high risk of liver cancer by using hepatitis B virus gene sequence

Info

Publication number: TWI646198B
Application number: TW105126801A
Authority: TW
Inventors: 張定宗; 劉紋君
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2016-08-22
Filing date: 2016-08-22
Publication date: 2019-01-01
Also published as: TW201807196A

Abstract

本發明提供一種以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，包括以下步驟：提供一受B型肝炎病毒感染個體的受測檢體；檢測該個體中B型肝炎病毒基因體上預定位點之DNA序列；比對該DNA序列上是否具有發展成肝癌的核苷酸變異標記；當該預定位點之DNA序列具有該核苷酸變異標記時，該感染B型肝炎病毒的個體被判斷為有發展成肝癌的高危險性。藉此，能對感染B型肝炎之病患進行篩選與追蹤，而能達到早期發現肝癌進而早期治療的目標。

Description

以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法

本發明係關於一種個體是否具有肝癌高危險性的篩檢方法，尤其是一種針對個體感染B型肝炎病毒後篩檢其是否有發展成為肝癌高危險性的方法。

感染B型肝炎病毒(Human hepatitis B virus，HBV)的病患有非常高的風險會導致肝硬化或發展成肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，一直是世界上許多國家其疾病死亡之重要因素之一，因此對於該病毒的檢測，及其相關疾病進程的進一步預防與治療方法，也是各國研究人員汲汲努力發展的目標。

B型肝炎病毒的基因體為部分呈單股的環狀雙股DNA，長約3.2kb，由一條較長的(-)股DNA，藉由5’端和較短的(+)股DNA形成鍵結，兩者相對應的鹼基互補。病毒在寄主細胞內複製時，會利用反轉錄酶，將完整長度的(+)股RNA，轉錄成病毒所需的DNA基因型。B型肝炎病毒基因體都是蛋白質編碼區，而且每個基因之間都有重疊的序列，其具有4個開放讀取框架(ORF)，分別為表面抗原基因S，核心抗原基因C，核酸聚合酶基因P和功能有待確定的X蛋白基因。目前已發現B型肝炎病毒基因體有10種基因型，分別為基因型A至J，其中基因型B與基因型C主要發現在亞洲，而基因型A與基因型D則主要發現在非洲或歐洲。

由於B型肝炎病毒其反轉錄酶並不具有校對(proofreading)的活性，使得B型肝炎病毒在世代的繁殖複製以及例如宿主免疫反應之選擇環境下，逐漸產生許多DNA序列發生變異之準株種(quasispecies)。雖然病毒準株種的存在被懷疑與慢性B型肝炎之惡化或肝癌之發生有關，且相關之變異株之序列已被研究，但仍然無法經由該些變異序列找出一較確定且不產生矛盾或錯誤之判斷方式。

另一方面，傳統檢測肝癌的方式是透過血清檢測胎兒甲蛋白的數值，或透過病患肝臟超因波之檢測來偵測肝癌的發生與追蹤，然而前者其敏感性(sensitivity)低，後者則由於屬非侵入式的檢測，對於小的肝腫瘤並不能輕易辨別，因此皆非有效且準確之檢測與追蹤方式。此外，電腦斷層掃描(CT)和核磁共振(MRI)雖然也可用於肝癌的篩檢，但其使用成本高，還可能存在輻射、造影劑的腎毒性等危害，仍非一理想之篩檢方式。尚且，該些檢測皆是感染B型肝炎病毒後有相關症狀後之追蹤與檢測，並無法於病患感染B型肝炎病毒後早期預測其是否有發展成肝癌之可能，因此無法透過早期預防而能及早治療。

因此，有必要尋找一種能夠容易預測或監測，且能準確判斷感染B型肝炎病毒的病患是否會發展成肝癌的方法。

本發明的目的之一在於提供了一種能夠提高預測感染B型肝炎病毒之病患是否會發展成肝癌(HCC)準確率之方法，藉由本發明方法檢測該病患體內B型肝炎病毒之特定DNA序列是否存在，即可判斷其是否具有發展成為肝癌的可能，以能夠在兼具簡易性與準確性的情況下，針對該些病患進行更精密的檢測與治療，進而在及早治療的優勢下，提高其治癒效果。

為了達成前述之目的，本發明提供一種以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，包括以下步驟：提供一受B型肝炎病毒感染個體的受測檢體；檢測該個體中B型肝炎病毒基因體上預定位點之DNA序列；比對該DNA序列上是否具有肝癌高危險性的核苷酸變異標記；以及當該預定位點之DNA序列具有該核苷酸變異標記時，該感染B型肝炎病毒的個體被判斷為有發展成肝癌的高危險性；其中，該核苷酸變異標記係選自第一變異序列組、第二變異序列組以及第三變異序列組所組成之群組；其中，該第一變異序列組包括選自基因型B的B型肝炎病毒中組(1-1)：216C、273G、529G、530A、724C、1173G、1221C、1242G、1359A、2095G、2120G、2213G、2226T、2227G、2583G、2690A及其任一組合；與組(1-2)：53C、1896A、1899A、1913C、2441C、2444C、2525T中任一或任一組合再與組(1-1)中任一相組合所組成之群組，其中數字係變異之核苷酸位點，其後之英文字母係變異之核苷酸；該第二變異序列組包括選自基因型C的B型肝炎病毒中組(2-1)：293G、446G、633A、834G、1092C、1155C、2201T、2573C、2594A、2708G、2840T、2889G、2901T、2931C、2988C、2989A、2997T、2998C、3009G、3016C、3021A、3066T、3097A及其任一組合；與組(2-2)：53C、456G、1386A、1613A、1653T、1674C、1753G、1764A、1846T、2875A、3006A、3120G中任一或任一組合再與組(2-1)中任一相組合所組成之群組，其中數字係變異之核苷酸位點，其後之英文字母係變異之核苷酸；及該第三變異序列組包括基因型C的B型肝炎病毒其基因體中第2977至3013核苷酸間之缺失。

第一變異序列組與第二變異序列組中個別核苷酸變異標記，皆得單獨作為檢測篩檢的標的，惟若有更多變異位點的確認，對於肝癌高危險性的篩檢與預測準確率將更為提高。雖然其中組(1-2)與組(2-2)所列核苷酸變異位點已為期刊所發表，但利用本發明所發現新的核苷酸變異標記搭配組(1-2)與組(2-2)的變異位點進行篩檢，同樣可進一步提升篩選準確率。

在本發明的一實施例中，所述以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該第一變異序列組可包括選自基因型B的B型肝炎病毒中由216C、273G、529G、530A、724C、1173G、1221C、1242G、1359A、2095G、2120G、2213G、2226T、2227G、2583G、2690A及其任一組合所組成之群組。

在該實施例中的一態樣中，該第一變異序列組可包括選自基因型B的B型肝炎病毒中由273G、724C、1173G、2095G及其任一組合，以及上述與2441C任一組合所組成之群組。

在另一態樣中，該核苷酸變異標記可進一步選自由724C及1896A及2444C、273G及724C及2095G及2444C、273G及1242G及2444C、1173G及2444C及2690A、724C及2525T、273G及1221C及2444C、1913C及2227T及2444C、724C及2441C、1173G及1359A及2095G及2444C、724C及1899A及2095G、273G及2583G及其任一組合所組成之群組。

在本發明的另一實施例中，所述以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該第二變異序列組可包括選自基因型C的B型肝炎病毒中由293G、446G、633A、834G、1092C、1155C、2201T、2573C、2594A、2708G、2840T、2889G、2901T、2931C、2988C、2989A、2997T、2998C、3009G、3016C、3021A、3066T、3097A及其任一組合所組成之群組。

在該實施例中的一態樣中，該第二變異序列組可包括選自基因型C的B型肝炎病毒中由293G、446G、834G、2201T及其任一組合，以及上述與1613A、1764A任一組合所組成之群組。

在另一態樣中，該核苷酸變異標記可選自由446G及1155C及1764A、293G及2594A及3097A、1155C及1674C及1764A、456G及1155C及2988C及其任一組合所組成之群組。

在本發明的一實施例中，所述以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該B型肝炎病毒係由該個體之血清中所分離，但並不僅限於此。

在另一實施例中，本發明提供一種利用B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的套組，其中該套組包括至少一與前述之核苷酸變異標記相雜交之一探針或引子，以及反應試劑。

藉由本發明之方法，即可針對感染B型肝炎病毒病患所採集之檢體中B型肝炎病毒上特定序列進行檢測，而判斷其是否具肝癌高危險性，以進一步追蹤或治療後續病情的發展。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1A係肝癌組與非肝癌組病患血清中B型肝炎病毒經次世代高通量定序後，基因型B上發生變異之分布以及其SNV頻率比較圖。

圖1B係肝癌組與非肝癌組病患血清中B型肝炎病毒經次世代高通量定序後，基因型C上發生變異之分布以及其SNV頻率比較圖。

圖1C顯示肝癌組與非肝癌組病患血清中B型肝炎病毒經次世代高通量定序後，基因型B上發生變異分布之位點以及所替換的核苷酸。

圖1D顯示肝癌組與非肝癌組病患血清中B型肝炎病毒經次世代高通量定序後，基因型C上發生變異分布之位點以及所替換的核苷酸。

圖2A係肝癌組與非肝癌組病患血清中B型肝炎病毒經次世代高通量定序後，基因型B上發生缺失之分布以及其比例之比較圖。

圖2B係肝癌組與非肝癌組病患血清中B型肝炎病毒經次世代高通量定序後，基因型C上發生缺失之分布以及其比例之比較圖。

定義

本發明中所謂DNA序列之「檢測」，係指利用發明所屬技術領域中所使用之DNA定序技術，針對基因體DNA或其中某一段DNA進行定序或雜交(hybridization)的步驟程序。可使用的定序方法例如Sanger等人之鏈終止定序法(chain termination sequencing，參見Sanger et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74：5463-5467(1977)；Sambrook et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler,Gene Transferand Expression：A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1994))或Maxam-Gilbert的化學切割法，或是基於前述與其他原理所發展出新興一代的定序法，包括：接合酶定序法(sequencing by ligation，參見Pfeifer GP,Steigerwald SD,Mueller PR,et al：Genomic sequencing and methylation analysis by ligation mediated PCR.Science 1989；246(4931)：810)、雜交定序法(sequencing by hybridization，參見Drmanac R,Labat I,Brukner I,et al：Sequencing of megabase plus DNA by hybridization：theory of the method.Genomics 1989；4(2)：114)、焦磷酸定序法(Pyrosequencing，參見Hyman ED：A new method of sequencing DNA.Analytical Biochemistry 1988；174(2)：423-436)等，以及為因應低成本、長序列定序所發展出新的定序策略，例如由羅式(Roche)、伊陸名(Illumina)、應用生物系統(Applied Biosystems)、赫立克斯(Hilicos)、太平洋生物科學(Pacific Biosciences)、牛津奈米實驗室(Oxford Nanolabs)等公司所發展出高通量的次世代定序(next-generation sequencing，NGS)方式與自動定序儀。定序方法並未有特別的限制，也未限於上述。至於雜交則同樣可利用發明所屬技術領域中所使用之雜交技術，於預訂長度的核酸上標記以螢光、放射線、冷光或顯色酵素或受質，再與受測核酸進行雜交，檢測是否有標記或顯色的存在。此外，例如即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction)以及近來較為普遍之基因晶片(biochip)亦可利用之，雜交方法同樣未有特別的限制，也未限於上述。

本發明中所謂檢測「預定位點之DNA序列」，可包括利用含括該待檢測DNA位點及其上下游DNA序列之定序方式，以讀取該預定位點之DNA序列，或是利用與該預定DNA位點相對應配對之引子或探針進行擴增或雜交配對，以知悉該預定位點是否具有所欲檢測之DNA序列。

本發明中所謂「比對」該DNA序列上是否具有肝癌高危險性的核苷酸變異標記，係將該定序出之DNA序列與相對應之核苷酸變異標記比對，判斷是否屬於與該核苷酸變異標記符合之核苷酸。但在某些情況下，因為B型肝炎病毒基因體中之一或數個核苷酸***(insertion)或缺失(deletion)，導致核苷酸位點平移時，此比對亦需參照相鄰之核苷酸序列平移比對。亦即，在比對時，原則係以核苷酸變異標記所指定的位點進行核苷酸比較，但有上述位點平移時，則以平移後之相對位點進行比對。

本發明中所謂當該預定位點之DNA序列「具有」該核苷酸變異標記，係指該定序出之DNA序列與相對應之核苷酸變異標記比對時，與該核苷酸變異標記之核苷酸相符合。但若以前述利用與該預定DNA位點相對應配對之引子或探針進行擴增或雜交配對時，有產物或雜交訊號時，也可認定為該預定位點之DNA序列具有該核苷酸變異標記。

本發明中所謂包含某一位點至某一位點核苷酸之「缺失(deletion)」，係指含括該段DNA序列之任何一種型態缺失，包括單純該段DNA之缺失，或是由上游延伸至該段區域或由該區域延伸至下游之缺失。

實施例1-1 病患選擇

首先由國立成功大學與台北榮民總醫院選擇475位慢性B型肝炎病毒感染而有肝癌之病患以及1036位慢性B型肝炎病毒感染而無肝癌之病患，該些病患已經抗病毒治療且無抗C型肝炎病毒之抗體。由該些病患中選取檢測病毒數超過10,000IU/ml者，以能夠順利利用數組引子進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)，將B型肝炎病毒基因體分段放大，再接續進行高通量定序(NGS)策略。進一步為配合基因型B與基因型C以及肝癌(HCC)與非肝癌(non-HCC)之分組分析，最後選擇93位肝癌病患與108位非肝癌病患(請參見表1)。其中，該些病患於性別、年齡、肝功能指數GOT(AST)或GPT(ALT)、肌肝酸以及B型肝炎e抗原(HBeAg)在肝癌/非肝癌以及基因型B/C組中的分布相當近似。

實施例1-2 B型肝炎病毒DNA之萃取與PCR

分離前述病患血液之血清，分別取200μl以DNA萃取套組(Viogene Blood & Tissue Extraction Mini DNA Extractor kit)萃取出DNA，並以9對引子(請參見表2，其序列分別為SEQ ID NO：1~18所示)以及高準確聚合酶(Fermentas)進行PCR反應(反應條件為：94℃，1分鐘；50℃，1分鐘；72℃，1.5分鐘；40個循環)。之後將PCR產物置於1%之瓊脂凝膠電泳後，將DNA斑分離並純化(FavorPreP^TM)。此9段DNA片段將用於後續之高通量定序。

除前述血清之外，任何存在B型肝炎病毒之檢體，均可做為其病毒DNA之取得來源，因此，例如血漿、全血、血液細胞、淋巴液、腦脊隨液、關節液等液體或是皮膚或器官切片等固態組織都可作為檢體之來源。

實施例1-3 高通量定序

本實施例所採用之高通量定序係以伊陸名公司(Illumina)的Illumina Genome Analyzer II進行，其係利用多重標籤(tags)以大量平行方式定序之系統。

實施例1-4 B型肝炎病毒基因型檢測

關於B型肝炎病毒基因型之檢測，可利用已知之LightCycler雜交探針進行融化曲線分析(melting curve analysis，請參見Liu WC,Mizokami M,Buti M,et al.Simultaneous quantification and genotyping of hepatitis B virus for genotypes A to G by real-time PCR and twostep melting curve analysis.J Clin Microbiol 2006；44：4491-7)。或是將前述經高通量定序後之DNA序列與GenBank上之B型肝炎病毒基因體之基因型(A至H)進行比對，以確定其基因型。

實施例1-5 變異DNA序列之比對

將NGS定序出之DNA序列利用BWA法(請參見Li H,Durbin R.Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics 2009；25：1754-60.)與參考基因序列(例如B型肝炎病毒基因型B之SEQ ID NO：19與基因型C之SEQ ID NO：20)進行比對，而分析時所使用之參考序列則為特定樣本參考序列(sample-specific reference sequence，其係各樣本本身中病毒群體基因型間的保留序列)，之後再利用SAMTools(請參見Li H,Handsaker B,Wysoker A,et al.The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.Bioinformatics 2009；25：2078-9.)，將對應到多位點之序列以及對應品質分數較差之序列移除。

實施例2 B型肝炎病毒基因型B與C上之核苷酸變異標記分析

之後，針對肝癌組與非肝癌組中發生核苷酸變異之位點進行統計分析，以找出與HCC發生高度相關之核苷酸變異標記。連續變數係利用學生氏t檢定(Student’s test)或曼惠特尼檢定(Mann-Whitney test)分析，而類別變數則以卡方檢定(Chi-square test)或費雪精確性檢定(Fisher’s exact test)分析。同時以下述公式1計算出單一核苷酸變異(SNV)頻率f_m/quasi(即單一個體中產生某一特定替換變異的頻率)：

另外則以公式2，計算出具有發展成肝癌(HCC)的風險值(Odds ratio，OR值)：

其中，「E」表示其單一核苷酸變異頻率(f_m/quasi)大於致病率(cut-off value或pathogenic frequency)的病患數，而「NE」表示其單一核苷酸變異頻率(f_m/quasi)小於致病率的病患數。針對每一特定SNV，係以其相對應最高OR值的單一核苷酸變異頻率的致病率用作統計分析。風險值的P值係以卡方檢定計算，因此得出具有顯著OR值的單一核苷酸變異頻率。

前述所選擇病患體內之B型肝炎病毒進行高通量定序比對後，如圖1A、1C(基因型B)與圖1B、1D(基因型C)所示，各病患體內以及在肝癌(H)與非肝癌(N)分組中，呈現多種且複雜之核苷酸變異位點分布，而存在著眾多準株種的情形。進一步，將前述位點與肝癌存在與否進行統計分析後，發現其中60個病毒核苷酸位點與肝癌之發生相關(其中僅位點53的核苷酸變異同時發生在基因型B與C)，其核苷酸變異及其變異位點、SNV頻率之風險值如表3(基因型B)與表4(基因型C)所示。

其中，SNV I係指主要發現在非肝癌組的核苷酸變異點，SNV II則指在同一位點但變異核苷酸不同於SNV I組者。關於每一變異位點之特性，以表4基因型C中變異點53之SNV II組為例，係指在前述與HCC相關性之分析中，發現位點53變異為核苷酸C之準株種為60個與HCC高相關位置其中之一。由於病患感染B型肝炎病毒後，在其體內之病毒並非以單一病毒基因體存在，而係以多種變異準株種之型態彼此共存，由多種準株種病毒形成一病毒池(viral pool)。因此，在53C變異位點所形成之核苷酸變異標記係指當該病患體內眾多B型肝炎病毒基因體被定序後，在核苷酸第53個位點表現C的病毒株佔所定序所有病毒株的比例為52.4%(即致病頻率，cut off value)以上時，該病患即有發展成肝癌的風險，而其風險值(OR)為5.1。

由圖1A與1C可知，在B型肝炎病毒基因型B中，25個變異位點中，有17個錯義突變(missense mutation)分別發生在聚合酶(polymerase)、preS2/S與preC/C等區域中，而17個錯義突變中的7個與8個沉默突變(silent mutation)中的4個則發生在CpG I/II/III(CpG Island I/II/III)、X promoter(X啟動子)、Enh(促進子，Enhancer)I、ε loop(ε環)與BCP(基礎核心啟動子，basal core promoter)中。

相較之下，由圖1B與1D可知，在B型肝炎病毒基因型C中，35個變異位點中，有28個錯義突變分別發生4個ORF中，特別是在preS1區域與聚合酶(polymerase)的spacer(間隔序列)中，而28個錯義突變中的21個與6個沉默突變(silent mutation)中的3個則發生在CpG I/II/III、NRE/CURS(負調節因子/核心上游調節序列，negative regulatory element/core upstream regulatory sequence)、Enh I/II、core promoter(核心啟動子)與S2 promoter(S2啟動子)中。特別的是，在過去的研究中，preS區域多半是關於缺失的研究，幾乎沒有關於點突變的現象被探討。

此外，除了單一核苷酸變異之比對外，本發明也發現，無論是基因型B或C，其在preC/C基因、prsS區域以及BCP區域都有很高比例的缺失現象發生，特別是在preS區域。請參閱第2A與2B圖，相較之下，基因型C病患於prsS區域缺失之比例遠高於基因型B者，且肝癌組與非肝癌組病患皆是如此。特別的是，肝癌組相對於非肝癌組病患，含括位點2977至3013(亦即胺基酸43至56)產生缺失之病患數最多。此外，在2977至3013核苷酸間發生此缺失變異的B型肝炎病毒族群(f_m/quasi)也最高，因此藉由第2977至3013核苷酸間缺失之篩檢，可大幅提高預測的準確率。

實施例3 B型肝炎病毒基之變異位點分析

關於B型肝炎病毒上與HCC發生高度相關之單核苷酸變異(SNV)位點分析，於本實施例中係同時採用三種演算法所得出：(1)支持向量機法(Support Vector Machine，請參見Cortes C,Vapnik V.Support-Vector Networks.Machine Learning 1995；20：273-297.)；(2)關聯分類規則分類法(Classification based on Multiple class-Association Rules，CMAR，請參見Li W,Han J,Pei J.CMAR：accurate and efficient classification based on multiple class-association rules.Data Mining 2001：369-376.)；(3)決策樹(decision tree，請參見Kass GV.An Exploratory Technique for Investigating Large Quantities of Categorical Data Applied Statistics.1980；29：119-127.)。其中，支持向量機法再分別以雙類(binary)與數類(numeric)進行演算分析。

在支持向量機(双類)的演算法下，以前述60個與肝癌高相關之SNV進一步分析其中具更高相關係的變異位點。當該位點SNV超過致病率(cut-off value)時視為1，低於致病率則視為0，經由支持向量機(双類)演算法分析，發現變異位點273G、724C、1173G、896A、899A、2213G、2583G、2690A與肝癌(HCC)的發生最相關。

另外，支持向量機(數類)的演算法下，其涉及定量，同樣以前述60個與肝癌高相關之SNV進一步分析其中具更高相關性的變異位點。以致病率(cut-off value)配合相關位點，發現273A/G、530A、1221C、1359A、1896A、2227T、2690A與肝癌(HCC)的發生最相關。

相同的方法下，分析基因型C，其結果如表5所示。其中畫底線者表示同時被兩種以上演算法所分析出。

再一方面，利用關聯分類規則分類演算法，發現如表6所列變異點之組合與HCC的發生最相關，其於基因型B的敏感度為87.5%，特異度為100%，而於基因型C的敏感度則為62.3%，特異度為100%。於表6中，同組之變異位點同時出現時，即有發展成肝癌的傾向。

實施例4 預測感染B型肝炎病毒的個體是否發展成肝癌的套組

藉由前述所發現之核苷酸變異標記，可設計與其相配對之探針或引子，透過雜交反應或是聚合酶鏈鎖反應，偵測或擴大出該探針或引子所識別之核苷酸變異位置。因此，於本實施例套組中，可包括依所述技術領域具有通常知識者所得製備的方法所製備之探針或引子，以及相關雜交反應或擴增反應所需之試劑。

<110> 國立成功大學

<120> 以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法

<130> 104B0425-I1

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<223> Primer

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 9

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 14

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 17

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 18

<210> 19

<211> 3215

<212> DNA

<213> B型肝炎病毒(Hepatitis B virus)基因型B

<400> 19

<210> 20

<211> 3215

<212> DNA

<213> B型肝炎病毒(Hepatitis B virus)基因型C

<400> 20

Claims

一種以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，包括以下步驟：提供一受B型肝炎病毒感染個體的受測檢體；檢測該個體中B型肝炎病毒基因體上預定位點之DNA序列；比對該DNA序列上是否具有肝癌高危險性的核苷酸變異標記；以及當該預定位點之DNA序列具有該核苷酸變異標記時，該感染B型肝炎病毒的個體被判斷為有發展成肝癌的高危險性；其中，該核苷酸變異標記係選自第一變異序列組、第二變異序列組以及第三變異序列組所組成之群組；其中，該第一變異序列組包括選自基因型B的B型肝炎病毒中組(1-1)：216C、273G、529G、530A、724C、1173G、1221C、1242G、1359A、2095G、2120G、2213G、2226T、2227G、2583G、2690A中任一者及其任意組合；與組(1-2)：53C、1896A、1899A、1913C、2441C、2444C、2525T中任一者或其任意組合再與組(1-1)中任一相組合，所組成之群組，其中數字係變異之核苷酸位點，其後之英文字母係變異之核苷酸；該第二變異序列組包括選自基因型C的B型肝炎病毒中組(2-1)：293G、446G、633A、834G、1092C、1155C、2201T、2573C、2594A、2708G、2840T、2889G、2901T、2931C、2988C、2989A、2997T、2998C、3009G、3016C、3021A、3066T、3097A中任一者及其任意組合；與組(2-2)：53C、456G、1386A、1613A、1653T、1674C、1753G、1764A、1846T、2875A、3006A、3120G中任一者或其任意組合再與組(2-1)中任一相組合，所組成之群組，其中數字係變異之核苷酸位點，其後之英文字母係變異之核苷酸；及該第三變異序列組包括基因型C的B型肝炎病毒其基因體中第2977至3013核苷酸間之缺失。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該第一變異序列組包括選自基因型B的B型肝炎病毒中216C、273G、529G、530A、724C、1173G、1221C、1242G、1359A、2095G、2120G、2213G、2226T、2227G、2583G、2690A中任一者及其任意組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該第一變異序列組包括選自基因型B的B型肝炎病毒中由273G、724C、1173G、2095G中任一者及其任意組合，以及上述任一再與2441C組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該核苷酸變異標記係進一步選自由724C及1896A及2444C、273G及724C及2095G及2444C、273G及1242G及2444C、1173G及2444C及2690A、724C及2525T、273G及1221C及2444C、1913C及2227T及2444C、724C及2441C、1173G及1359A及2095G及2444C、724C及1899A及2095G、273G及2583G中任一組及其任意組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該第二變異序列組包括選自基因型C的B型肝炎病毒中由293G、446G、633A、834G、1092C、1155C、2201T、2573C、2594A、2708G、2840T、2889G、2901T、2931C、2988C、2989A、2997T、2998C、3009G、3016C、3021A、3066T、3097A中任一者及其任意組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該第二變異序列組包括選自基因型C的B型肝炎病毒中由293G、446G、834G、2201T中任一者及其任意組合，以及上述再與1613A、1764A任意組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該核苷酸變異標記係選自由446G及1155C及1764A、293G及2594A及3097A、1155C及1674C及1764A、456G及1155C及2988C中任一組及其任意組合所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中於該檢測該個體中B型肝炎病毒基因體上預定位點之DNA序列步驟之後，進一步檢測該B型肝炎病毒之基因型。
如申請專利範圍第1項所述之以B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的方法，其中該B型肝炎病毒係由該個體之血清中所分離。
一種利用B型肝炎病毒基因序列篩檢肝癌高危險性的套組，其中該套組包括至少一與申請專利範圍第1項中所述之核苷酸變異標記相雜交之一探針或引子，以及反應試劑。