CN116445659A - 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 - Google Patents
用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116445659A CN116445659A CN202310103439.6A CN202310103439A CN116445659A CN 116445659 A CN116445659 A CN 116445659A CN 202310103439 A CN202310103439 A CN 202310103439A CN 116445659 A CN116445659 A CN 116445659A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- detecting
- gene
- mutation site
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 81
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 98
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 13
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 13
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 9
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 9
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 9
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 9
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100037111 Uracil-DNA glycosylase Human genes 0.000 claims description 6
- 101710160987 Uracil-DNA glycosylase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 2
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 abstract description 11
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- -1 BHQ3 Chemical compound 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 2
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 2
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 2
- 241000134304 Influenza A virus H3N2 Species 0.000 description 2
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 1
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 1
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 1
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 1
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 1
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 1
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000015001 muscle soreness Diseases 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N romidepsin Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H]2CSSCC\C=C\[C@@H]1CC(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N 0.000 description 1
- 229960003452 romidepsin Drugs 0.000 description 1
- OHRURASPPZQGQM-UHFFFAOYSA-N romidepsin Natural products O1C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(=CC)NC(=O)C2CSSCCC=CC1CC(=O)NC(C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091666 romidepsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000003867 tiredness Effects 0.000 description 1
- 208000016255 tiredness Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用；通过检测新冠病毒ORF1ab基因对新型冠状病毒进行定性检测，对S基因的4个特异性突变位点E484A、N679K、S704L、L452R和N基因特异性突变位点P151S进行检测，从而对Omicron变异株BA.2.12.1、BA.4、BA.5这三种亚型进行鉴别，实现了同时对新型冠状病毒和Omicron变异株分型的检测。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用。
背景技术
自2019年12月新冠疫情暴发以来，世界卫生组织(World Health Organization,WHO)公布需要关注(VOC)和需要留意(VOI)的SARS-CoV2病毒变异株的相关信息，受到全球广泛关注。当前SARS-CoV-2变体的全球流行病学特点是Omicron变体在全球占主导地位，Delta是另一种重要的流行变体。
2021年11月，WHO将南非报告的一种快速传播的SARS-CoV2病毒新变异株，列为需要关注的新冠变种，并命名为Omicron。与Alpha、Beta、Gamma、Delta相比，Omicron的刺突蛋白(spike protein，S蛋白)部分有超过30个变异点，全基因组则有大约50个变异位点。相比之下，Beta变异株在RBD区域有3个突变(K417N、E484K、N501Y)，而Delta变异株在同一区域只有2个(L452R、T478K)。奥密克戎变异株同时具有前4个VOC变异株Alpha(阿尔法)、Beta(贝塔)、Gamma(伽玛)和Delta(德尔塔)刺突蛋白的重要氨基酸突变位点，包括增强细胞受体亲和力、病毒复制能力和免疫逃逸能力的突变位点，导致其具有极强的传播能力和降低部分抗体药物的保护效力。
新冠病毒变异株Omicron在其早期阶段的传染性比德尔塔变异株强4.2倍。研究表明，Omicron变异株在支气管中的感染和繁殖速度比德尔塔变异株以及新冠原始毒株快70倍。传播能力更强，症状不典型，传播过程更为隐蔽。Omicron变异株在人肺部的感染显著低于新冠原始毒株，而肺部感染是导致疾病严重程度的关键，因此感染Omicron变异株的患者，主要以轻型和普通型为主，症状包括肌肉酸疼、疲倦，并伴有轻微咳嗽。
美国莫德纳(Moderna)，在其官网发布了改良版二价新冠候选疫苗mRNA-1273.214加强针对奥密克戎有着优异的中和效果，作为加强针可提供相比正常2针疫苗8倍的中和抗体。它的抗原混合了原始SARS-CoV-2毒株、奥密克戎毒株制成的，覆盖新冠病毒S蛋白的32个突变。
5月10日，腾盛博药官方微信号公布了旗下新冠特效药的最新进展。新的研究数据表明，腾盛博药的长效新冠中和抗体安巴韦单抗和罗米司韦单抗联合疗法对新冠病毒奥密克戎BA.2亚型变异株保持中和活性。一对抗体联合疗法紧急使用授权(EUA)申请正在由美国食品和药品管理局(简称“美国FDA”)进行审核。
现有的新冠病毒核酸检测试剂不能做到对Omicron进行分型检测，可能存在漏检风险，开发一种能够准确检测Omicron变异株分型的试剂盒，对于疫情防控和治疗措施具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用。
本发明的目的在于提供一种基于多重荧光定量PCR法用于新型冠状病毒检测，并结合末端阻滞扩增技术(ARMS-PCR)用于Omicron变异株分型检测的试剂盒和方法。
本发明根据人基因组内标片段(SEQ ID No.25)、新冠病毒ORF1ab基因(SEQ IDNo.26)和或N基因保守区域(SEQ ID No.27)、新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白突变位点E484A(SEQ ID No.28)、N679K(SEQ ID No.29)、S704L(SEQ ID No.30)、L452R(SEQ IDNo.31)和N基因的特异性突变位点P151S(SEQ ID No.32)，分别设计特异性扩增引物和Taqman探针。通过新冠病毒ORF1ab基因和或N基因的阴阳性来判断是否检测到新型冠状病毒，并利用突变位点与ORF1ab基因之间的ΔCt值的差值来实现对新型冠状病毒Omicron变异株的分型。同时，本发明设置了内标，内标为人核糖核酸酶P(RNaseP)，可有效避免检测结果的假阴性，对检测样本的采集、运输和提取过程进行监控。
本发明提供一种基于多重PCR检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的引物探针组，包括检测新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白特异性突变位点和N基因特异性突变位点的引物和探针组；
所述新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白特异性突变位点包括E484A突变位点、N679K突变位点、S704L突变位点、L452R突变位点和N基因特异性突变位点P151S中的至少两种；
用于检测E484A突变位点的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
用于检测N679K突变位点的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
用于检测S704L突变位点的引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
用于检测L452R突变位点的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
用于检测P151S突变位点的引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
用于检测E484A突变位点的探针序列如SEQ ID No.17所示；
用于检测N679K突变位点的探针序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测S704L突变位点的探针序列如SEQ ID No.19所示；
用于检测L452R突变位点的探针序列如SEQ ID No.20所示；
用于检测P151S突变位点的探针序列如SEQ ID No.21所示。
所述引物探针组还包括检测ORF1ab基因保守序列SEQ ID No.26所示的序列的引物探针组：
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID No.22所示。
所述引物探针组还包括检测人内参性基因RNaseP的引物探针组：
用于检测RNaseP的引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
用于检测RNaseP的探针序列如SEQ ID No.23所示。
所述引物探针组还包括检测N基因保守序列的引物探针组：
用于检测N基因保守序列的引物序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
用于检测N基因保守序列的探针序列如SEQ ID No.24所示。
本发明还提供一种包括如上所述的引物探针组的试剂盒。
所述试剂盒包括检测液和酶混合液；
所述检测液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、去RNA酶水、以及权利要求1-4中任一项所述的引物探针组；
所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶。
所述试剂盒进行检测时采用的新型冠状病毒的样本来源于人鼻咽拭子、痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、或粪便样本。
所述试剂盒还包括还包括阳性对照和阴性对照；所述试剂盒还包括还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示、ORF1ab基因如SEQ ID No.26所示和/或N基因保守区域部分片段如SEQ ID No.27所示、以及E484A如SEQ ID No.28所示、N679K如SEQ ID No.29所示、S704L如SEQ ID No.30所示、L452R如SEQID No.31所示、P151S如SEQ ID No.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示的基因。
所述引物探针组在制备检测不同新冠病毒突变株的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种用于Omicron变异株分型的反应体系，所述反应体系包括检测液A、检测液B、酶混合液；阳性对照和阴性对照；
所述检测液A包括PCR缓冲液MgCl2、dNTPs、去RNA酶水以及如下所述的引物和探针组：
用于检测E484A突变位点的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
用于检测N679K突变位点的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
用于检测RNaseP的引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
用于检测E484A突变位点的探针序列如SEQ ID No.17所示；
用于检测N679K突变位点的探针序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID No.22所示。
用于检测RNaseP的探针序列如SEQ ID No.23所示；
所述检测液B包括MgCl2、dNTPs、去RNA酶水以及如下所述的引物和探针组：
用于检测S704L突变位点的引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
用于检测L452R突变位点的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
用于检测P151S突变位点的引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
用于检测S704L突变位点的探针序列如SEQ ID No.19所示；
用于检测L452R突变位点的探针序列如SEQ ID No.20所示；
用于检测P151S突变位点的探针序列如SEQ ID No.21所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID No.22所示；
酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶；
所述阳性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示、ORF1ab基因如SEQ ID No.26所示和/或N基因保守区域部分片段如SEQ ID No.27所示、以及E484A如SEQID No.28所示、N679K如SEQ ID No.29所示、S704L如SEQ ID No.30所示、L452R如SEQ IDNo.31所示、P151S如SEQ ID No.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示的基因。
本发明所述特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5或CY5中的任意一种或几种；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和MGB中的任意一种或几种。
ARMS法(扩增受阻突变***)是将特异性突变位点置于引物的3’端，利用耐热TaqDNA聚合酶缺乏3’至5’核酸外切酶活性，在引物与模板互补配对过程中，若3’端碱基对形成错配，链延伸会受阻，其扩增结果为：野生型模板扩增受阻，对突变型模板有效扩增。引物的3’端倒数第二或三位碱基可以人为进行序列突变，以保证引物与野生型序列在3’端具有两个碱基不匹配，以提高靶标扩增的特异性。
所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶。
所述阳性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示、ORF1ab基因如SEQ ID No.26所示和/或N基因保守区域部分片段如SEQ ID No.27所示、以及E484A如SEQID No.28所示、N679K如SEQ ID No.29所示、S704L如SEQ ID No.30所示、缺乏L452R如SEQID No.31所示、P151S如SEQ ID No.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示的基因。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明用于新型冠状病毒检测及Omicron变异株分型的引物及探针组合物，采用多重荧光定量PCR法结合末端阻滞扩增技术(ARMS-PCR)，能够同时检测多个位点的突变情况，实现快速精准的目标。
2)本发明设置了人基因组内标片段、新冠病毒ORF1ab基因和或N基因保守区域，以及S基因突变位点与N基因突变位点，一次性测试完成新冠病毒检测及变异位点分析，同时，采用突变位点与ORF1ab基因之间的ΔCt值的差值来判断位点阴阳性，避免因病毒浓度差异导致的判断错误。
3)本发明采用的2个突变位点E484A,N679K均为Omicron特有，进一步提高了检测特异性；Omicron变异株的两个亚型BA.4和BA.5同时拥有S基因L452R突变位点，可与Omicron其它亚型进行区分。N基因P151S位点为BA.4亚型所特有，可与BA.5进行区分。S基因S704L位点为BA.2.12.1亚型所特有，可与其它亚型进行鉴别。
4)本发明的关键之处在于所开发的试剂盒能够检测新型冠状病毒同时对Omicron变异株进行分型检测，而现有技术只能检测新型冠状病毒和Omicron变异株，不能对Omicron变异株进行分型检测，因而无法对疫情防控工作起到风险提示的作用，而本申请通过新型冠状病毒S基因L452R、S704L突变位点和N基因P151S突变位点，解决了对Omicron变异株BA.4、BA.5、BA.2.12.1亚型分型的问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为新型冠状病毒Omicron BA.4变异株的扩增曲线示意；
图2为新型冠状病毒Omicron BA.5变异株的扩增曲线示意图；
图3为新型冠状病毒Omicron BA.2.12.1变异株的扩增曲线示意图；
图4为新型冠状病毒Omicron变异株其它亚型的扩增曲线示意图；
图5为新型冠状病毒Omicron变异株BA.2亚型、BA.2.12.1亚型、BA.4亚型、BA.5亚型、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、Zeta变异株、Kappa变异株、Mu变异株、Lambda变异株S基因上突变频率90％以上的突变位点汇总；
图6为新型冠状病毒Omicron变异株BA.2亚型、BA.2.12.1亚型、BA.4亚型、BA.5亚型、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、Zeta变异株、Kappa变异株、Mu变异株、Lambda变异株N基因上突变频率90％以上的突变位点汇总。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供一种对新型冠状病毒检测及Omicron变异株分型的检测方法，具体包括如下步骤：
(1)待测样本DNA的提取：样本核酸提取采用Qiagen公司的Viral RNAMini Kit试剂盒，制备样本核酸RNA体积60μL。
(2)配制试剂反应体系为50μL，反应体系组成如表1所示：
表1反应体系
(3)设置荧光PCR扩增程序
RT-PCR扩增程序的设定如表2
表2 RT-PCR扩增程序的设置
(4)结果判读：
阴阳性判定：
扩增曲线呈S形且Ct值≤40.0，判定为阳性；Ct＞40.0或者未检出，判定为阴性。
突变位点判定：
某样品X突变位点的ΔCt，等于它的突变位点检测反应(Mx)的Ct值减去同一管内ORF1ab反应的Ct值：ΔCt(x)＝Ct(Mx)-Ct(ORF1ab)，ΔCt可以为负数。本试剂盒E484A、N679K、S704L、L452R、P151S突变位点的参考值(Cut-offΔCt)如表3：
表3各突变位点的参考值
| 突变类型 | E484A | N679K | L452R | S704L | P151S |
| Cut-offΔCt | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 6.0 |
当阴性对照检测结果为阴性且阳性对照检测结果为阳性时，样本检测结果的分析如下表4：
表4各突变位点的判读
样本检测结果的判定：
根据以下位点判读结果，进行新型冠状病毒Omicron变异株分型。
表5新型冠状病毒Omicron变异株分型
实施例1新型冠状病毒Omicron变异株检测的特异性引物和探针的设计
针对Omicron变异株分型的特异性突变位点进行分析并且筛选。针对VOC(Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron)变异株、VOI(Lambda、Mu)变异株和Omicron变异株的3个亚型BA.2.12.1、BA.4、BA.5的序列进行生物信息学比对分析，分析结果为E484A、N679K位点为Omicron所特有的突变，突变频率分别在92.7％、99.4％，可与其它VOC/VOI变异株进行有效区分。Omicron变异株的两个亚型BA.4和BA.5同时拥有S基因L452R突变位点，突变频率可达95％以上，可与Omicron其它亚型进行区分。N基因P151S位点为BA.4亚型所特有，突变频率为100％，可与BA.5进行区分。S基因S704L位点为BA.2.12.1亚型所特有，突变频率为97.9％，可与其它亚型进行鉴别。
表6 E484A、N679K、S704L、L452R、P151S突变位点在各变异株中的突变频率
针对新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白突变位点E484A、N679K、S704L、L452R和N基因上的P151S突变位点、ORF1ab基因以及RNaseP基因，利用Primer 5软件，分别设计上述突变位点的特异性扩增引物和Taqman探针，由上海硕颖生物科技有限公司合成。
各突变位点与ORF1ab基因、N基因以及RNaseP基因的扩增序列如下：
RNaseP基因片段SEQ ID No.25
GAATTCGGCACGAGGTGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCTATCAATCATATCGTTGACTTTAAGGAAAAGAAACAGGAAATTGAAAAACCAGTAGCTGTTTCTGAACTCTTCACAACTTTGCCAATTGTACAGGGAAAATCAAGACCAATTAAAATTTTAACTAGATTAACAATTATTGTCTCGGATCCATCTCACTGCAATGTTTTGAGA
ORF1ab基因片段SEQ ID No.26
ATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTT
TTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCA
CTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTT
TTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGAC
AATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACAT
GAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATN基因片段SEQ IDNo.27
CAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGC
CTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAG
ACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACA
AGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG
CGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTG
ACCTACACAGGTGCCATCAAATTGE484A特异性片段SEQ ID No.28
AGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAAGCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTA
TAATTACCAGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATAT
TTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAACAAACCTTGTAATGGTGTTGCAGGTTTTA
ATTGTTACTTTCCTTTACGATCATATGGTTTCCGACCCACTTATGGTGTTGGTCACCA
ACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTG
TGGACCTAAAAAGTCN679K特异性片段SEQ ID No.29
ACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGC
TGTTTAATAGGGGCTGAATATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGT
GCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAAGTCTCATCGGCGGGCACGTAG
TGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTTAGT
TGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACA
GAAATTCTACCAGTGS704L特异性片段SEQ ID No.30
TTAATAGGGGCTGAATATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCA
GGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAAGTCTCATCGGCGGGCACGTAGTGT
AGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTTAGTTGC
TTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAA
ATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGT
GATTCAACTGAATGCL452R特异性片段SEQ ID No.31
TTGTAATTAGAGGTAATGAAGTCAGCCAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAATATT
GCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATT
CTAACAANCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCGGTATAGATTGTTTAG
GAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCG
GTAACAAACCTTGTAATGGTGTTGCAGGTGTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATA
TGGTTTCCGACCCAP151S特异性片段SEQ ID No.32
AAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGA
AGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGG
GAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATTCTGCTAACAATGCT
GCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAG
AAGGGAGCAGAGNCGGNAGNCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAA
CAGTTCAAGAAATTCAACTCCA
用于检测突变位点E484A、N679K、S704L、L452R和N基因上的P151S突变位点、ORF1ab基因、N基因以及RNaseP基因的引物及探针序列如表7所示：
表7引物及探针序列信息
实施例2检测新型冠状病毒(2019-nCoV)并进行Omicron变异株分型的方法
(1)临床样本采集、保存及运输：适用于咽拭子、鼻咽拭子、痰液样本类型。
咽拭子：将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，将拭子头浸入含病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
鼻咽拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻***鼻道鼻咽腔后壁时，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3mL病毒保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。痰液：将咳出的痰液收集于含病毒保存液的50mL螺口塑料管或者痰盒中。痰液样本加入等体积的痰消化液(含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液)，振荡混匀，静置5分钟消化后进行核酸提取。经消化后的痰液样本可以当做常规拭子样本进行后续处理。用于病毒分离和核酸检测的样本应尽快进行检测，能在24小时内检测的样本可置于4℃保存；24小时内无法检测的样本则应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存)。样本冻融不可超过5次，否则影响检测结果。
(2)核酸提取：样本核酸提取采用Qiagen公司的Viral RNA Mini Kit试剂盒，按照说明书进行核酸提取。阳性质控品、阴性质控品均需要进行提取。
(3)反应体系配制：计算需准备反应试剂反应数(n＝样本数+2管对照)，分别使用检测液A和检测液B各配制n份反应液，即每个样本2管检测。每测试反应体系配制如下：
表8反应体系配制
| 反应体系 | 加量(μL)/人份 |
| 检测液A/检测液B | 27 |
| 酶混合液 | 3 |
| 样本核酸 | 20 |
| 总体积 | 50 |
所述检测液A包括PCR缓冲液、3.3mM MgCl2、0.1-0.4mM dNTPs(dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1:1)、引物探针(SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.13的浓度为0.4μM；SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14的浓度为0.04μM；SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23的浓度均为0.2μM)及去RNA酶水。
所述检测液B包括PCR缓冲液、3.3mM MgCl2、0.1-0.4mM dNTPs(dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1:1)、引物探针(SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.11的浓度为0.4μM；SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12的浓度为0.04μM；SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22的浓度均为0.2μM)及去RNA酶水。
酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶。
阳性对照为人工合成含RNaseP基因片段、ORF1ab基因和或N基因保守区域部分片断以及E484A、N679K、S704L、L452R、P151S突变位点的基因片段，阴性对照为含RNaseP基因片段的人工合成的基因。
(4)加样：向已分装有试剂的PCR反应管中分别加入提取好的待测样本、阳性对照、阴性对照各20μL，终体积为50μL/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
(5)扩增：按照以下程序进行RT-PCR扩增：50℃10min；97℃1min；97℃5s，58℃30s，共进行45个循环。
(6)结果分析：根据各荧光通道的扩增曲线图和Ct值情况，确定各突变位点的检出情况，各突变位点的判读标准如表9所示。再根据5个突变位点E484A、N679K、S704L、L452R、P151S的突变情况来判断样本中是否存在待检的新型冠状病毒及对Omicron变异株进行分型。
表9突变位点的结果判读
根据以下位点判读结果，进行新型冠状病毒Omicron变异株分型。
表10新型冠状病毒Omicron变异株分型
图1为新型冠状病毒Omicron BA.4变异株的检测结果；
图2为新型冠状病毒Omicron BA.5变异株的检测结果；
图3为新型冠状病毒Omicron BA.2.12.1变异株的检测结果；
图4为新型冠状病毒Omicron变异株其它亚型的检测结果；
图5为新型冠状病毒Omicron变异株BA.2亚型、BA.2.12.1亚型、BA.4亚型、BA.5亚型、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、Zeta变异株、Kappa变异株、Mu变异株、Lambda变异株S基因上突变频率90％以上的突变位点汇总；
图6为新型冠状病毒Omicron变异株BA.2亚型、BA.2.12.1亚型、BA.4亚型、BA.5亚型、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株、Zeta变异株、Kappa变异株、Mu变异株、Lambda变异株N基因上突变频率90％以上的突变位点汇总。
实施例3灵敏度分析
将含有新型冠状病毒Omicron变异株5个突变位点E484A、N679K、S704L、L452R、P151S目的片段的人工合成基因按照2倍倍比梯度稀释，进行20复孔的多重荧光定量PCR扩增分析其检测的最低检测限，检测下限为5×102copies/mL。
表11检测体系的LoD验证
| 检测样本浓度 | 检出情况 | 检出率 |
| 2000copies/mL | 20/20 | 100％ |
| 1000copies/mL | 20/20 | 100％ |
| 500copies/mL | 19/20 | 95％ |
| 250copies/mL | 13/20 | 65％ |
实施例4特异性分析
采用本发明方法对冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒HKU1型、冠状病毒NL63型、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、含新型冠状病毒2019-nCoV核酸的咽拭子以及人类基因组进行多重荧光定量PCR扩增分析。
表12特异性检测结果
| 各类病原体及人基因组 | 检测结果 |
| 冠状病毒229E型 | 阴性 |
| 冠状病毒OC43型 | 阴性 |
| 冠状病毒HKU1型 | 阴性 |
| 冠状病毒NL63型 | 阴性 |
| SARS冠状病毒 | 阴性 |
| MERS冠状病毒 | 阴性 |
| 甲型流感病毒H1N1 | 阴性 |
| 甲型流感病毒H3N2 | 阴性 |
| 含新型冠状病毒2019-nCoV核酸的咽拭子 | 阴性 |
| 人类基因组 | 阴性 |
实施例5鉴别检测
采用本发明方法对含新型冠状病毒Alpha变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒Beta变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒Gamma变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒Delta变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒Lambda变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒Mu变异株核酸的咽拭子进行多重荧光定量PCR扩增分析。
表13新型冠状病毒各变异株检测结果
本发明的试剂盒包括人基因组内标片段、新冠病毒ORF1ab基因和N基因保守区域和5对新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白与N基因特异性突变位点的引物和探针，具有较高的识别能力，可以实现对新型冠状病毒进行检测与Omicron变异株的准确分型。通过同一反应管内突变位点与ORF1ab基因之间的ΔCt值的差值来判断突变位点的阴阳性，避免因病毒浓度差异导致的判断错误。E484A、N679K位点为Omicron所特有的突变，突变频率分别在92.7％、99.4％，可与其它VOC/VOI变异株进行有效区分。Omicron变异株的两个亚型BA.4和BA.5同时拥有S基因L452R突变位点，可与Omicron其它亚型进行区分。N基因P151S位点为BA.4亚型所特有，可与BA.5进行区分。S基因S704L位点为BA.2.12.1亚型所特有，可与其它亚型进行鉴别。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种基于多重PCR检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的引物探针组，其特征在于，包括检测新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白特异性突变位点和N基因特异性突变位点的引物和探针组；
所述新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白特异性突变位点包括E484A突变位点、N679K突变位点、S704L突变位点、L452R突变位点和N基因特异性突变位点P151S中的至少两种；
用于检测E484A突变位点的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
用于检测N679K突变位点的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
用于检测S704L突变位点的引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
用于检测L452R突变位点的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
用于检测P151S突变位点的引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
用于检测E484A突变位点的探针序列如SEQ ID No.17所示；
用于检测N679K突变位点的探针序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测S704L突变位点的探针序列如SEQ ID No.19所示；
用于检测L452R突变位点的探针序列如SEQ ID No.20所示；
用于检测P151S突变位点的探针序列如SEQ ID No.21所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括检测ORF1ab基因保守序列SEQ ID No.26所示的序列的引物探针组：
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID No.22所示。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括检测人内参性基因RNaseP的引物探针组：
用于检测RNaseP的引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
用于检测RNaseP的探针序列如SEQ ID No.23所示。
4.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括检测N基因保守序列的引物探针组：
用于检测N基因保守序列的引物序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
用于检测N基因保守序列的探针序列如SEQ ID No.24所示。
5.一种包括如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测液和酶混合液；
所述检测液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、去RNA酶水、以及所述的引物探针组；
所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行检测时采用的新型冠状病毒的样本来源于人鼻咽拭子、痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本或粪便样本。
8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示、ORF1ab基因如SEQID No.26所示和/或N基因保守区域部分片段如SEQ ID No.27所示、以及E484A如SEQ IDNo.28所示、N679K如SEQ ID No.29所示、S704L如SEQ ID No.30所示、L452R如SEQ ID No.31所示、P151S如SEQ ID No.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示的基因。
9.如权利要求1-4中任意一项所述引物探针组在制备检测不同新冠病毒突变株的试剂盒中的应用。
10.一种用于Omicron变异株分型的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括检测液A、检测液B、酶混合液、阳性对照、阴性对照；
所述检测液A包括PCR缓冲液MgCl2、dNTPs、去RNA酶水以及如下所述的引物和探针组：
用于检测E484A突变位点的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
用于检测N679K突变位点的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
用于检测RNaseP的引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；
用于检测E484A突变位点的探针序列如SEQ ID No.17所示；
用于检测N679K突变位点的探针序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID No.22所示。
用于检测RNaseP的探针序列如SEQ ID No.23所示；
所述检测液B包括MgCl2、dNTPs、去RNA酶水以及如下所述的引物和探针组：
用于检测S704L突变位点的引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
用于检测L452R突变位点的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
用于检测P151S突变位点的引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
用于检测S704L突变位点的探针序列如SEQ ID No.19所示；
用于检测L452R突变位点的探针序列如SEQ ID No.20所示；
用于检测P151S突变位点的探针序列如SEQ ID No.21所示；
用于检测新冠病毒ORF1ab基因的探针序列如SEQ ID No.22所示；
酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶；
所述阳性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示、ORF1ab基因如SEQID No.26所示和/或N基因保守区域部分片段如SEQ ID No.27所示、以及E484A如SEQ IDNo.28所示、N679K如SEQ ID No.29所示、S704L如SEQ ID No.30所示、L452R如SEQ ID No.31所示、P151S如SEQ ID No.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含RNaseP基因片段如SEQ ID No.25所示的基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310103439.6A CN116445659A (zh) | 2023-02-08 | 2023-02-08 | 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310103439.6A CN116445659A (zh) | 2023-02-08 | 2023-02-08 | 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116445659A true CN116445659A (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=87119009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310103439.6A Pending CN116445659A (zh) | 2023-02-08 | 2023-02-08 | 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116445659A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117265187A (zh) * | 2023-11-23 | 2023-12-22 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.4亚系的引物和探针组合物、试剂盒和应用 |
-
2023
- 2023-02-08 CN CN202310103439.6A patent/CN116445659A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117265187A (zh) * | 2023-11-23 | 2023-12-22 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.4亚系的引物和探针组合物、试剂盒和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110982942B (zh) | 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN111074011A (zh) | 检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN111808989A (zh) | 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法 | |
| CN114369688B (zh) | 检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN113881812B (zh) | 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN113981152B (zh) | 检测SARS-CoV-2变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN113652505B (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
| CN108504774B (zh) | 一种检测鼻病毒分型和肠道病毒的方法 | |
| CN114410848B (zh) | 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| WO2023279042A2 (en) | Compositions and methods for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 variants | |
| CN116445659A (zh) | 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 | |
| CN112501358B (zh) | 一种用于检测9种儿童消化道病原体的引物探针组合及试剂盒 | |
| CN103966356A (zh) | 人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN112725535B (zh) | 同时检测全长与截短的HBV pgRNA荧光定量PCR试剂盒及其应用 | |
| CN117025846A (zh) | 一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用 | |
| CN112662809A (zh) | 一种用于新型冠状病毒covid-19检测的核酸组合物及其应用 | |
| CN116024386B (zh) | 用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒 | |
| CN113637795A (zh) | 一种甲型/乙型流感病毒、新型冠状病毒检测方法与试剂盒 | |
| CN111676315A (zh) | 检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法 | |
| CN111154920A (zh) | 一种用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒及其专用引物探针组 | |
| CN115323075B (zh) | 一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的rt-raa引物探针组、试剂盒及其应用 | |
| CN116479177A (zh) | 一种用于新型冠状病毒s基因6种突变位点检测的引物探针组合 | |
| CN114561490B (zh) | 检测SARS-CoV-2突变位点的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN111549175B (zh) | 一种检测口岸输入2019新型冠状病毒多重荧光rt-pcr检测试剂 | |
| CN112029901A (zh) | 一种提高核酸扩增反应特异性的试剂、核酸扩增反应液和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |