CN111443197A - 一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,包括如下步骤,1)构建包括两个处理单元的微流控芯片,其中,每个处理单元包括:由多个横截面为三角形的微柱组成的微阵列、以及位于该三角形微阵列入口一侧的两个进样口和位于该三角形微阵列出口一侧的两个出样口;两个处理单元分别修饰上皮细胞粘附分子EpCAM抗体和去唾液酸糖蛋白受体ASGPR抗体2)样品分别从两个处理单元的入口进入,并从出口流出;3)对两个处理单元捕获后的循环肿瘤细胞通过免疫染色法鉴定上皮表型与非上皮表型。本发明方法能够提高肝癌循环肿瘤细胞的捕获效率、纯度和检出率,并可对肝癌循环肿瘤细胞进行表型分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法。
背景技术
肝细胞癌的发病率在所有癌症中位列世界第五,是癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌诊断的金标准为组织活检,然而该方法存在取样难、代表性不全、并发症等风险。肝细胞癌早期筛查主要依赖影像学方法和血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)检测。影像学方法较依赖操作者的主观判断,且灵敏度不够。AFP检测灵敏度和特异度分别仅有39–64%和76–91%,假阳性、假阴性率高。因此,迫切需要寻找准确度高、灵敏度高、无创的肝细胞癌诊断方法。
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是指从肿瘤病灶脱落,进入血液循环的肿瘤细胞,是造成肿瘤扩散和转移的重要原因。已有研究表明肝细胞癌循环肿瘤细胞与肝细胞的预后和恶性进展有关,因此检测肝细胞癌CTC可用于肝细胞癌的早期诊断,复发转移监测,疗效评估等领域。目前基于亲和法分离肝细胞癌CTC的方法主要依赖上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)识别,其中最经典的方法为CellSearch法,该方法是目前唯一通过美国FDA认证的CTC分离方法,该方法通过偶联有EpCAM抗体的磁珠从全血中分离CTC。研究表明,肝细胞癌组织的EpCAM阳性率仅有20%-35%,因此通过单一上皮标志物的识别分离,势必造成漏检,难以提供有意义的临床指导。CTC在循环***中发生上皮间质转换(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程将导致CTC的异质性。此过程将增加上皮细胞转移和侵袭能力,伴有CTC上皮样特性的消失和间质特征的获得,在CTC从原发灶脱落进入血液循环***并形成肿瘤转移灶的过程中发挥重要作用,与肿瘤转移、复发过程密不可分。多项研究表明,间质型标志物波形蛋白的过度表达与晚期肝细胞癌及更差的预后有较强相关性,因此,仅仅基于EpCAM识别捕获肝癌循环肿瘤细胞会造成捕获效率低、捕获表型单一、临床应用有限的问题。同时分离上皮型与间质型肝细胞癌CTC对于探究癌症的形成机制、理解转移侵袭过程等具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的,在于提供一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法。
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是:
一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,包括如下步骤:
1)构建捕获芯片,所述的捕获芯片包括两个处理单元,其中,每个处理单元包括:
由多个横截面为三角形的微柱组成的微阵列、以及位于该三角形微阵列入口一侧的进样口和位于该三角形微阵列出口一侧的出样口;
其中,微阵列的采用如下排布方式:Dc=1.4*G*(Δλ/λ)0.48,其中G指微柱间的水平间距,λ为同一列中两微柱中心的距离,Δλ指同一行中第二个三角形相对于第一个三角形的侧向偏移值,Dc为微流控整体临界尺寸;
第一处理单元的微阵列上修饰有设有上皮细胞粘附分子抗体,第二处理单元的微阵列设有去唾液酸糖蛋白受体抗体;
2)样品分别从两个处理单元的入口进入,并从出口流出;
3)对两个处理单元捕获后的循环肿瘤细胞通过免疫染色法鉴定上皮表型与非上皮表型。
在本发明中,G为38-50μm,λ为110-130μm,Δλ为2-5μm,Dc为11-13μm。进一步优选,G为50μm,λ为120μm,Δλ为3.8μm,Dc为13μm。
在本发明中,样品在每个处理单元的流速为0.5-0.7mL/h。
在本发明中,样品在每个处理单元的流速为0.6mL/h。
在本发明的优选实施例中,步骤3)中,免疫染色方法为,使用DAPI作为细胞核染料,ASGPR鉴定肝细胞癌CTC,EpCAM鉴定上皮型CTC,CD45作为白细胞的标志物。
在本发明的优选实施例中,上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,EpCAM+,ASGPR+/-,CD45-,非上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,ASGPR+,EpCAM-,CD45-,白细胞的鉴定标准为DAPI+,EpCAM-,ASGPR1-,CD45+。
在本发明的优选实施例中,微阵列排列为长方形,左侧设有一列条形柱组成的入口。
在本发明的优选实施例中,微阵列被中间的隔条被分为上下两个微阵列单元,每个微阵列单元对应一出样口。
在本发明的优选实施例中,所述的芯片从下至上设载玻片、PDMS下层、PDMS通道层、PDMS上层,其中两个进样口和两个出样口位于PDMS上层,微阵列位于PDMS通道层。
在本发明的优选实施例中,在和PDMS上层的第一进样口对应的位置,PDMS通道层设有圆形进样口,该圆形进样口通过第一连接臂和微阵列连接,该第一连接臂的右端位于微阵列左侧的中间;在和PDMS上层的第二进样口对应的位置,PDMS通道层设有圆形进样口,该圆形进样口右侧设第二连接臂,该第二连接臂再分叉为两个环形臂和微阵列入口连接,其中上环形臂的连接处位于第一连接臂和微阵列连接处的上侧,下环形臂的连接处位于第一连接臂和微阵列连接处的下侧。
本技术方案与背景技术相比,它具有如下优点:
1、本发明设置两个处理单元,同时采用肝实质性细胞标志物ASGPR以及上皮型癌细胞标志物EpCAM捕获肝细胞癌CTC,并通过免疫染色法区分上皮型与非上皮型CTC,弥补现有方法依赖上皮型标志物而造成捕获效率低、间质型CTC漏检的问题,实现多种表型肝细胞癌CTC的分析,解决CTC异质性的问题。
2、微阵列采用如下排布方式:Dc=1.4*G*(Δλ/λ)0.48,采用该具有临界尺寸碰撞效应的微流控芯片,使癌细胞与血细胞在流体中有不同的流体路径,可实现癌细胞高效捕获,血细胞的非特异吸附低,提高纯度。
3.G为38-50μm,λ为110-130μm,Δλ为2-5μm,Dc为11-13μm。为适合肝癌细胞捕获的最佳排列方式;
4.在0.5-0.7mL/h流速下EpCAM通道和ASGPR通道的平均捕获效率高,最高能够分别达到90%和87%,CCRF-CEM的非特异吸附率分别为4%和11%。
5.微阵列被中间的隔条分为上下两个镜面对称的单元,可增加样本中细胞分散度,提高分离效率。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的肝癌循环肿瘤细胞捕获芯片剖视结构示意图。
图2为本发明的俯视图。
图3为图2的A处局部放大。
图4为图3的B处局部放大。
图5为柱子之间的关系示意图。
图6为结果图之一,其中:A.HUH-7模式细胞的流式细胞图;B.SK-HEP-1模式细胞的流式细胞图;C.CCRF-CEM阴性对照细胞的流式细胞图;D.HUH-7,SK-HEP-1,CCPF-CEM,WBCs的尺寸分布图
图7为结果图之二,其中A.优化EpCAM通道的流速;B.优化ASGPR通道的流速;C.缓冲液环境EpCAM通道的线性范围;D.缓冲液环境ASGPR通道的线性范围;E.全血环境EpCAM通道的捕获效率(选择20或100个细胞);F.全血环境ASGPR通道的捕获效率(选择20或100个细胞)
图8血样分析结果图。
图9(A)单独EpCAM,(B)单独ASGPR以及(C)EpCAM-ASGPR联用的CTC总数统计分析。
图10临床诊断价值考察—与AFP对比。以良性肝病患者为对照组,肝细胞癌患者为实验组对三种捕获方法以及临床常用的早筛标志物AFP进行接受者操作特性曲线(ROC)分析(图10A);对不同AFP水平的患者CTC总数分析(图10B)。
图11CTC表型与肝细胞癌分期的相关性。EpCAM通道无法区分早期与晚期患者(P>0.05),而加入ASGPR后可以区分早期与晚期患者(P<0.05)(图11A);不同表型CTC与分期的相关性分析(图11B)。
具体实施方式
请查阅图1至图5,一种肝癌循环肿瘤细胞捕获芯片,它包括由下至上包括四层,分别是:载玻片1、PDMS下层2、PDMS通道层3、PDMS上层4。
其中,在PDMS上层4上设有四个进样口和四个出样口,分别是:第一进样口41、第二进样口42、第三进样口43、第四进样口44,第一出样口45、第二出样口46、第三出样口47和第四出样口48。
在PDMS通道层3上设有平行的两个相同的处理单元,即第一处理单元3A和第二处理单元3B。其中,
第一处理单元3A包括:由多个横截面为三角形的微柱35组成的微阵列、以及位于该三角形微阵列左侧的第一进样口41、第二进样口42和位于该三角形微阵列右侧的第一出样口45和第二出样口46。
第二处理单元3B包括:由多个横截面为三角形的微柱35组成的微阵列、以及位于该三角形微阵列左侧的第三进样口43、第四进样口44和位于该三角形微阵列右侧的第三出样口47和第四出样口48。
其中,参见图2和图3,以第一处理单元3A为例,微阵列排列为长方形,左侧设有一列条形柱38组成的入口,样品进入入口处的微阵列之后,通过中间的隔条36被分为上下两个微阵列单元处理,其中上微阵列单元对应第一出样口45,下微阵列单元对应第二出样口46。
在和PDMS上层4的第一进样口41对应的位置,PDMS通道层3设有圆形进样口31,该圆形进样口31通过连接臂32和微阵列连接,该连接臂32的右端位于微阵列左侧的中间。在和PDMS上层4的第二进样口42对应的位置,PDMS通道层3设有圆形进样口33,该圆形进样口33右侧连接臂34,连接臂34再分叉为两个环形臂37和微阵列入口连接,其中上环形臂的连接处位于连接臂34和微阵列连接处的上侧,下环形臂的连接处位于连接臂34和微阵列连接处的下侧。
参见图4和图5,微阵列的排布采用如下排布:其中G指柱子间的水平间距,λ为同一列中两柱子中心的距离,Δλ指同一行中第二个三角形相对于第一个三角形的偏移值,微流控整体临界尺寸Dc,在微流控芯片中流体以层流的方式流动,在微流体中大于临界尺寸的肝癌细胞突破原始层流,与微阵列频繁接触,可提高捕获率,小于临界尺寸的血细胞在原始层流中流动,与微阵列碰撞概率低,提高纯度;由公式Dc=1.4*G*(Δλ/λ)0.48得出临界尺寸。本实施例中,G设为50μm,λ设为120μm,Δλ设为3.8μm,得到Dc为13μm。
以上芯片制备好之后,通过化学修饰偶联抗体,从入口加入无水乙醇配制的4.75%(V/V)(3-巯丙基)三甲氧基硅烷,置于室温下1h,用无水乙醇清洗,置于100℃烘箱中1h。待芯片降至室温时,从入口加入用无水乙醇配制的0.5mg/mL的GMBS,置于室温下30min,用PBS冲洗。再从入口加入PBS配制的20μg/mL链霉亲和素,室温放置1h或4℃过夜。再从入口加入PBS洗涤,加入PBS配制的20μg/mL生物素化的抗体,室温放置1h。最后用PBS冲洗。
之后,从第一处理单元3A和第二处理单元3B分别加入20μg/mL EpCAM抗体和20μg/mL ASGPR(去唾液酸糖蛋白受体)抗体,室温孵育1h。去唾液酸糖蛋白受体是一种肝特异性跨膜糖蛋白,具有肝细胞特异性,可用于识别从肝细胞癌病灶中脱落的CTC。异质性CTC捕获后通过免疫染色法鉴定上皮表型与非上皮表型。免疫染色方法为,使用DAPI作为细胞核染料,ASGPR鉴定肝细胞癌CTC,EpCAM鉴定上皮型CTC,CD45作为白细胞的标志物。上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,EpCAM+,ASGPR+/-,CD45-,非上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,ASGPR+,EpCAM-,CD45-,白细胞的鉴定标准为DAPI+,EpCAM-,ASGPR1-,CD45+。
模拟肝癌细胞捕获表征。
之后,采用荧光预染色的靶细胞(HUH-7&SK-HEP-1)和对照细胞(CCRF-CEM或者WBC)的进行流式细胞分析。从图6A中可以得到HUH-7可以作为高表达EpCAM的肝癌细胞的模式细胞,从图6B中可以得到SK-HEP-1可以作为高表达ASGPR的肝癌细胞的模式细胞,图6CCCRF-CEM作为阴性对照,图6D可以得到需要的芯片的临界尺寸为13μm,即模式细胞大于此临界尺寸,阴性对照细胞小于此临界尺寸。
流速的优化及捕获细胞效率。
使用模式细胞进行流速的优化及捕获效率的实验。图7为在PBS中优化EpCAM通道(上)和ASGPR通道(下)的流速,最后选择0.6mL/h为流速。可以看出在0.6mL/h流速下EpCAM通道和ASGPR通道的平均捕获效率为90%和87%,CCRF-CEM的非特异吸附率分别为4%和11%。更低的流速下靶细胞的捕获效率提升不大,非特异吸附较高,而更高的流速会导致靶细胞的捕获效率降低,因此选择0.6mL/h为最佳捕获条件。对线性范围考察(图7B)表明,将5-200个肝癌细胞悬浮于PBS中以0.6mL/h的速度注射入芯片,EpCAM通道(图7B,上)和ASGPR通道(图7B,下)在该范围内均有较好的线性,具有较高的捕获效率和较低的非特异吸附率。模拟肝细胞癌患者全血实验如图7C所示,对于加标20/100个HuH-7和SK-HEP-1的细胞系捕获效率分别为89%和85%,EpCAM通道(图7C,上)和ASGPR通道(图7C,下)的CCRF-CEM非特异吸附率分别6%和5%,而白细胞的残留率仅为0.005%。
临床样本分析。
(1)肝癌患者CTC荧光染色。在最佳的流速条件(0.6mL/h)下分别向两个通道中注射肝癌患者外周血1mL,注射后使用免疫荧光染色鉴定。使用DAPI作为细胞核染料,ASGPR鉴定肝细胞癌CTC,EpCAM鉴定上皮型CTC,CD45作为白细胞的标志物。上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,EpCAM+,ASGPR+/-,CD45-,非上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,ASGPR+,EpCAM-,CD45-,白细胞的鉴定标准为DAPI+,EpCAM-,ASGPR1-,CD45+。如图8所示。结果表明成功捕获到上皮型及非上皮型CTC。
(2)临床分析—区分癌症患者与健康人、良性肝病患者的能力。由于上样方式为EpCAM通道和ASGPR通道各上样1mL。最终单独EpCAM通道及单独ASGPR通道的CTC个数均换算为个/2mL,EpCAM-ASGPR联用法CTC个数为两个通道的CTC个数之和。对45例肝细胞癌患者CTC检测结果表明EpCAM通道检出率为66.7%,ASGPR通道检出率为93%,EpCAM-ASGPR联用法检出率为100%,使用双抗体联用避免漏检。对三种方法:单独EpCAM,单独ASGPR以及EpCAM-ASGPR联用的CTC总数进行统计分析。P值计算分为两组,第一组对照组为健康人CTC个数,实验组为肝细胞癌患者CTC个数;第二组对照组为良性肝病患者CTC个数,实验组为肝细胞癌患者CTC个数。每种方法的每组P值均小于0.05,表明这三种方法均能将肝细胞癌患者与健康人区分,以及肝细胞癌患者与良性肝病患者区分的能力。而其中EpCAM-ASGPR联用的方法P值最低,区分性最佳(图9)。
(3)临床诊断价值考察—与AFP对比。以良性肝病患者为对照组,肝细胞癌患者为实验组对三种捕获方法以及临床常用的早筛标志物AFP进行接受者操作特性曲线(ROC)分析(图10A)。在最佳cutoff值为1的条件下,EpCAM通道的灵敏度为66.7%,特异性为100%,曲线下面积为0.667。cutoff为3的条件下ASGPR通道灵敏度为91.1%,特异性为100%,曲线下面积为0.911。EpCAM-ASGPR联用时,在最佳cutoff值为1.5的情况下灵敏度为97.8%,特异性为100%,曲线下面积为0.978。而AFP的曲线下面积仅为0.477,灵敏度为6.44%,s特异性为83.3%。肝细胞癌的AFP诊断标准为≥400μg/L,肝病的诊断标准为≥8.1μg/L。在临床诊断中发现肝癌患者的AFP范围在1.3μg/L至236940μg/L,因此当AFP<400μg/L时极易造成假阴性的误诊。对不同AFP水平的患者CTC总数分析(图10B),EpCAM通道对每个AFP水平的患者的阳性率为58-85%,存在漏检的情况。当AFP<8.1,ASGPR通道阳性率79%,存在漏检。而EpCAM-ASGPR联用对所有AFP水平患者都能检出CTC,因此EpCAM-ASGPR联用可作为弥补AFP低阳性率的辅助诊断方法。因此,通过联合使用EpCAM抗体和ASGPR抗体,提高了肝细胞癌检测的灵敏度和特异性,诊断价值最高。
(4)CTC表型与肝细胞癌分期的相关性。考察CTC总数以及不同表型CTC个数与分期的相关性,结果如图11所示。EpCAM通道无法区分早期与晚期患者(P>0.05),而加入ASGPR后可以区分早期与晚期患者(P<0.05)(图11A)。由于ASGPR与EpCAM联用的诊断价值最高,因此对该结果下不同表型CTC与分期的相关性进行分析(图11B),结果表明晚期患者非上皮型CTC显著高于早期患者,因此非上皮型CTC可能与更差的预后相关。因此,通过对肝细胞癌CTC的总个数以及不同表型CTC个数的分析具有肝细胞癌分期诊断及预后评估的应用潜力。
以上所述,仅为本发明较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,包括如下步骤:
1)构建捕获芯片,所述的捕获芯片包括两个处理单元,其中,每个处理单元包括:
由多个横截面为三角形的微柱组成的微阵列、以及位于该三角形微阵列入口一侧的进样口和位于该三角形微阵列出口一侧的出样口;
其中,微阵列的采用如下排布方式:Dc=1.4*G*(Δλ/λ)0.48,其中G指微柱间的水平间距,λ为同一列中两微柱中心的距离,Δλ指同一行中第二个三角形相对于第一个三角形的侧向偏移值,Dc为微流控整体临界尺寸;
第一处理单元的微阵列上修饰有设有上皮细胞粘附分子EpCAM抗体,第二处理单元的微阵列设有去唾液酸糖蛋白受体ASGPR抗体;
2)样品分别从两个处理单元的入口进入,并从出口流出;
3)对两个处理单元捕获后的循环肿瘤细胞通过免疫染色法鉴定上皮表型与非上皮表型。
2.根据权利要求1所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:G为38-50μm,λ为110-130μm,Δλ为2-5μm,Dc为11-13μm。
3.根据权利要求2所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:样品在每个处理单元的流速为0.5-0.7mL/h。
4.根据权利要求2所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:样品在每个处理单元的流速为0.6mL/h。
5.根据权利要求1所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:步骤3)中,免疫染色方法为,使用DAPI作为细胞核染料,ASGPR鉴定肝细胞癌CTC,EpCAM鉴定上皮型肝细胞癌CTC,CD45作为白细胞的标志物。
6.根据权利要求5所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,EpCAM+,ASGPR+/-,CD45-,非上皮型CTC的鉴定标准为DAPI+,ASGPR+,EpCAM-,CD45-,白细胞的鉴定标准为DAPI+,EpCAM-,ASGPR1-,CD45+。
7.根据权利要求1所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:微阵列排列为长方形,左侧设有一列条形柱组成的入口。
8.根据权利要求7所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:微阵列被中间的隔条被分为上下两个微阵列单元,每个微阵列单元对应一出样口。
9.根据权利要求1至8任一项所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:所述的芯片从下至上设载玻片、PDMS下层、PDMS通道层、PDMS上层,其中两个进样口和两个出样口位于PDMS上层,微阵列位于PDMS通道层。
10.根据权利要求9所述的一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法,其特征在于:在和PDMS上层的第一进样口对应的位置,PDMS通道层设有圆形进样口,该圆形进样口通过第一连接臂和微阵列连接,该第一连接臂的右端位于微阵列左侧的中间;在和PDMS上层的第二进样口对应的位置,PDMS通道层设有圆形进样口,该圆形进样口右侧设第二连接臂,该第二连接臂再分叉为两个环形臂和微阵列入口连接,其中上环形臂的连接处位于第一连接臂和微阵列连接处的上侧,下环形臂的连接处位于第一连接臂和微阵列连接处的下侧;第一进样口为样本进样口,第二进样口为缓冲液进样口。
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Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102732415A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-10-17 | 武汉介观生物科技有限责任公司 | 一种高效稀有细胞捕获集成芯片及其制作方法和应用方法 |
CN104651315A (zh) * | 2015-03-19 | 2015-05-27 | 武汉大学 | 一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法 |
CN105861297A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-17 | 厦门大学 | 一种循环肿瘤细胞检测芯片及其应用 |
CN107723207A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-02-23 | 深圳市瑞格生物科技有限公司 | 一种分离捕获细胞的芯片及其在肿瘤细胞分选中的应用 |
CN108181458A (zh) * | 2018-02-26 | 2018-06-19 | 北京华科泰生物技术有限公司 | 一种基于荧光免疫联合检测的微流控芯片及其制备方法和用途 |
CN108535228A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-14 | 厦门大学 | 一种从孕妇外周血中分离游离胎儿细胞的方法 |
CN108753571A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种细胞分型捕获芯片及方法 |
CN109212211A (zh) * | 2017-07-07 | 2019-01-15 | 叶健 | 一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片 |
CN109946230A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-06-28 | 山东师范大学 | 一种用于ctc高通量单细胞表型分析的微流控装置 |
CN110055158A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-07-26 | 厦门大学 | 一种微流控芯片的动态修饰方法及其捕获CTCs的应用 |
CN110142068A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-08-20 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 |
CN110726838A (zh) * | 2019-09-29 | 2020-01-24 | 武汉纺织大学 | 一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法 |
CN110756238A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-07 | 安徽工业大学 | 一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片 |
-
2020
- 2020-03-04 CN CN202010143064.2A patent/CN111443197A/zh active Pending
Patent Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102732415A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-10-17 | 武汉介观生物科技有限责任公司 | 一种高效稀有细胞捕获集成芯片及其制作方法和应用方法 |
CN104651315A (zh) * | 2015-03-19 | 2015-05-27 | 武汉大学 | 一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法 |
CN105861297A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-17 | 厦门大学 | 一种循环肿瘤细胞检测芯片及其应用 |
CN109212211A (zh) * | 2017-07-07 | 2019-01-15 | 叶健 | 一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片 |
CN107723207A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-02-23 | 深圳市瑞格生物科技有限公司 | 一种分离捕获细胞的芯片及其在肿瘤细胞分选中的应用 |
CN108181458A (zh) * | 2018-02-26 | 2018-06-19 | 北京华科泰生物技术有限公司 | 一种基于荧光免疫联合检测的微流控芯片及其制备方法和用途 |
CN108535228A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-14 | 厦门大学 | 一种从孕妇外周血中分离游离胎儿细胞的方法 |
CN108753571A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种细胞分型捕获芯片及方法 |
CN109946230A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-06-28 | 山东师范大学 | 一种用于ctc高通量单细胞表型分析的微流控装置 |
CN110055158A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-07-26 | 厦门大学 | 一种微流控芯片的动态修饰方法及其捕获CTCs的应用 |
CN110142068A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-08-20 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 |
CN110726838A (zh) * | 2019-09-29 | 2020-01-24 | 武汉纺织大学 | 一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法 |
CN110756238A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-07 | 安徽工业大学 | 一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CHANGQING YIN 等: "Molecular Profiling of Pooled Circulating Tumor Cells from Prostate Cancer Patients Using a Dual-Antibody-Functionalized Microfluidic Device", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
METAGES GASHAW AHMED 等: "Isolation,Detection,andAntigen-Based Profiling of Circulating TumorCells Using a Size-Dictated Immunocapture Chip", 《ANGEWANDTE CHEMIE INTENATIONAL EDITION》 * |
朱琳 等: "组合抗体法用于循环肝癌细胞高效捕获及分型分析", 《第十一届全国化学生物学学术会议》 * |
王艳敏: "微流控芯片技术检测肺癌外周血循环肿瘤细胞的应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库·医药卫生科技辑》 * |
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