CN111413442A - 一种药物的含量检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物的含量检测方法及其应用，该药物的处方由蒲公英360份、败酱草360份、薏苡仁360份、赤芍288份、苍术288份、当归360份、川芎288份、香附288份、延胡索120份、泽泻216份、白花蛇舌草216份组成。该药物的检测方法所包含的检测步骤较为复杂，且在实际生产过程中应用还存在成本较高的缺陷，需要进一步研究。

Description

一种药物的含量检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种药物的含量检测方法及其应用，属于药品检测领域。
背景技术
赤芍药材中的有效成份芍药苷含量测定方法的进行梳理分析，其该成分的测定方法主要包括薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相串联质谱法等。如，杨烨，郑艳萍等，蒲茵护肝颗粒质量标准研究，中国中医药信息杂志，2018-7，该文章建立鉴别蒲茵护肝颗粒中牡丹皮、白芍、黄芪的薄层色谱法，该方法简单易行，结果准确可靠。杜安全，周正华，精芪参固本胶囊薄层鉴别及芍药苷含量测定，化学分析计量，2019-7，该文章采用HPLC色谱法，以乙腈–0.4％的磷酸溶液(20∶80)为流动相，测定精芪参固本胶囊中芍药苷的含量。再如，廖日房，温预关等人，HPLC-MS/MS测定益智合剂中芍药苷的含量，中国医药导报，2008-11，该文章采用高效液相串联质谱法对益智合剂中痕量的芍药苷进行分析，该操作简单、快捷，结果准确可靠。
对川芎药材中的有效成份川芎嗪含量测定方法进行***检索整理分析如下，该含量测定包括：高效液相色谱荧光法、反相高效液相色谱法、气相色谱法等。夏磊，高效液相荧光色谱法测定注射用盐酸川芎嗪的含量，海峡药学，2019-12，该文章中还采用高效液相色谱荧光检测器，甲醇-水(40∶60)为流动相；流速1.0mL·min-1，激发波长为289nm，发射波长为321nm。该检测方法简便、准确、重复性好、灵敏度高，可用于注射用盐酸川芎嗪的质量控制。王忠成，顾尔莉等，RP-HPLC法同时测定加味补阳还五汤剂中4种成分的含量，中国药房，2017-9，该文章采用反相高效液相色谱法，色谱柱为YMC C18，流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液(梯度洗脱),流速为1.0m L/min，检测波长为320nm(阿魏酸)、230nm(芍药苷)、207nm(苦杏仁苷)、280nm(川芎嗪)，柱温为30℃，该测定方法用于加味补阳还五汤剂中芍药苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪含量的方法。刘玉云，张琳等，气相色谱法同时测定川芎中藁本内酯、川芎嗪和α-细辛脑的含量。中华中医药学刊，2016-10，并建立GC同时测定川芎中藁本内酯、川芎嗪和α-细辛脑含量的分析方法。
蒲公英中有效成分绿原酸含量测定进行检索总结，该含量测定主要有：高效液相色谱、超高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-二极管阵列检测器法等进行测定。如：夏琴，张新选。HPLC法测定蒲公英中绿原酸和咖啡酸的含量，西北药学杂志，2019-7，该文章测定蒲公英中咖啡酸和绿原酸的含量，用于控制蒲公英药材的质量品质。原琦，张凤等，超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蒲公英中4种有效成分的含量，该文章采用UPLC-MS/MS法，Dikma Endeavorsil C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm)，流动相为0.1％甲酸溶液-甲醇，梯度洗脱，测定蒲公英中对香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷含量。李盛建，王慧等人，HPLC-DAD法同时测定蒲公英配方颗粒中6种成分的含量，中南药学，2019-10，该论文采用高效液相色谱-二极管阵列检测器法，采用HPLC-DAD法，色谱柱为Agilent C18柱(4.6mm×150mm,5μm)，流动相为乙腈-0.2％甲酸水溶液梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，柱温为30℃，检测波长为325nm和350nm。该测定方法蒲公英配方颗粒中绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、阿魏酸、菊苣酸、木樨草素的含量。
败酱草药材中有效成分含量测定方法，现有技术文献主要集中公开了薄层色谱鉴别法、双波长RP-HPLC、反相高效液相色谱法等检测方法。如：陈惠玲，曾荣洁，妇炎消胶囊质量标准的研究，中国药品标准，2014-8，该文章中采用薄层色谱法鉴别败酱草药材，该方法适用于妇炎消胶囊的质量控制。刘海涛，雷鹏，双波长RP-HPLC法同时测定败酱草中5种有机酸类成分的含量，中药新药与临床药理，2019-3，该文章采用双波长反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，以乙腈-0.1％磷酸溶液(10∶90)作为流动相,梯度洗脱；检测波长:260、327nm；流速:1.0mL·min-1，柱温:30℃，同时测定败酱草中5种有机酸类成分原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸C的含量。刘海涛，朱露等。反相高效液相色谱法同时测定败酱草中槲皮素、山奈酚的含量，中南药学，2014-12，该期刊论文方法采用Odyssil C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.1％磷酸(55:45),流速为1.0m L·min-1,检测波长为360nm，柱温为25℃，建立反相高效液相色谱法同时测定败酱草中槲皮素、山奈酚的含量。
药物中含有上述药材组成的含量检测方法所包含的检测步骤较为复杂，且在实际生产过程中应用还存在成本较高的缺陷，需要进一步的研究开发。
发明内容
本发明目的在于提供一种药物的含量检测方法及其应用，该药物以芍药苷、绿原酸，齐墩果酸作为检测指标含量，该含量检测方法具有此操作简单、快速、准确度好的特点，且该方法能有效的控制该药物的内在质量。
本发明具体的技术方案如下：
一种药物的含量检测方法，所述含量检测方法包括以下步骤：
(1)、所述药物的原料药组成及其重量比为：蒲公英360份、败酱草360份、薏苡仁360份、赤芍288份、苍术288份、当归360份、川芎288份、香附288份、延胡索120份、泽泻216份、白花蛇舌草216份；
(2)、制备方法为：取延胡索用70％乙醇，回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.13的清膏，备用；苍术、香附、当归、川芎，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并收集水溶液备用；药渣加蒲公英等其余六味药材，加水煎煮二次，每次1.5小时，分次滤过，合并滤液，加入提取挥发油后的滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.30～1.35的稠膏，真空干燥，粉碎，加入淀粉与上述挥发油，混匀，制成颗粒，装入胶囊，即得；
(3)、供试品溶液制备：
取步骤(2)所制的内容物，混匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；
(4)、对照溶液制备
取芍药苷对照品10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)、含量测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明药物含量测定还增加了绿原酸和齐墩果酸成分，提供其内控质量标准。本发明药物中君药蒲公英中主要含有机酸类、黄酮类等多种化学成分。研究表明，有机酸类化合物为蒲公英的主要活性成分，其中以绿原酸较高。因此，本实验利用HPLC法，建立能同时快速准确测定本发明药物中绿原酸含量。
绿原酸含量测定方法如下：
供试品溶液制备：
精密称取本发明药物内容物2g，置于100mL具塞锥形瓶中，加甲酸-甲醇-水溶液如下配置比例的(6：45：42)溶液50mI，密塞，摇匀，称定质量，超声处理30min，取出后放冷至室温，再称定质量，加甲酸-甲醇-水溶液(6：45：42)补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
对照溶液制备：
分别精密称取绿原酸对照品和5.98mg，置于同一100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液1mL，置于5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成绿原酸11.96μg·mL-1的对照品溶液。
色谱含量条件测定
色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-c18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-20mL·L-1磷酸盐缓冲液(pH值为4.0，25：75)；检测波长：326nm；柱温：室温；流速：1.0mL·min；进样量：5μL。
齐墩果酸的含量测定
对照品溶液制备：
精密称定齐墩果酸对照品适量，并置于10mL量瓶中，再加流动相溶解并定容，即得对照品，其中齐墩果酸的浓度为9.8μg/L备用。
供试品溶液制备：
取本发明药物内容物粉末1.18，精密称定，置于100mL具塞的锥形瓶中，加入甲醇30mL超声(500W，40Hz)提取30分钟，放冷，补足减失的重量，静置10分钟后滤过。精密量取续滤液lmL，置于10mL量瓶中，用甲醇适量定容，即得。
色谱条件：
色谱柱为HypersilODS2C18色谱柱；齐墩果酸、的色谱条件为：以乙腈-甲醇-0.7％醋酸铵溶液(60：13：25)为流动相，检测波长为215nm，流速为lmL/min，柱温：25℃室温。
本发明所述药物在制备治疗慢性咽炎疾病药物中的应用，所述药物的原料药组成及其重量比为：蒲公英360份、败酱草360份、薏苡仁360份、赤芍288份、苍术288份、当归360份、川芎288份、香附288份、延胡索120份、泽泻216份、白花蛇舌草216份。
所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂等。为使上述剂型能够实现，在制备上述药物中加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、矫味剂等，填充剂包括：淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素等，崩解剂包括：微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙纤维素等，润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉等，粘合剂包括，淀粉浆、羟丙基甲基纤维素等，甜味剂包括：果糖、蔗糖等，矫味剂包括：桂花香精等。
咽炎属于中医的“喉痹”或“梅核气”范畴，其主要病机多因外邪侵袭，饮食失调、情志所伤，脏腑失调，环境污染及粉尘刺激而使火热之邪壅滞咽部，而所致的咽部病症，包括急喉痹、慢喉痹等。《诸病源候论·喉痛》认为是“风热毒客于其间”，邪气搏于脏气，则生热，热乘其肺而搏咽喉”。故对该病的治疗偏重于清热解毒、通泻脏腑内热。咽炎临床上表现为咽部红肿、疼痛或微红、咽中不适，患者有咽喉干燥并有异物感。中医辩证为虚火上炎、痰热症或热毒壅阻咽喉所致。依咽炎的发病机制和临床症状，虚火和热毒贯穿于本病始末。经过中医治疗原则及药物组方的解释试着说明该药物治疗慢性咽炎的中医基础。方中蒲公英、白花蛇舌草，具有清热解毒之功，赤芍，清热凉血，薏苡仁，清热排浓，苍术、当归、川芎、香附、泽泻、延胡索，上述诸药共同发挥清热解毒，消肿利咽之功。经长期使用偶然意外的发现，本发明药物治疗慢性咽炎、疗效甚佳。
为了说明该药物的临床治疗妇科炎症外的其他抗炎作用，我们采取问卷方式调查进行，情况说明如下：
患者某某，女，44岁，每年秋冬季节常感觉到咽喉疼痛周期性发作，咽部不适，常感干痒，并伴有阵发性咳嗽，对照症状自认为患有慢性咽炎。患者两年前，伴随患有***炎、***等妇科炎症，同时咽部症状也存在，按照药物说明书的服用方法：每次3粒，每日2次。患者用药4日后，感觉咽喉疼痛开始减轻，继续治疗2周后，咽痛、咳嗽、咽部干痒等症状消失，患者自我感觉良好，持续观察一年多，没有咽部不适症状再发生。
本发明人为了深入研究该药物治疗慢性咽炎的疗效，对该药物进行抗炎抗菌作用药理学研究。其采用酚红分泌试验，结果表明，本发明药物对小鼠酚红分泌量有显著的促进分泌作用，与空白对照组比较差异均有统计学意义。对小鼠二甲苯致炎实验结果发现，该药物的胶囊剂型中、高剂量组，其抑制肉芽肿作用最佳，均有统计学意义。这进一步说明本发明药物对棉球所致的慢性炎症有显著的抗炎作用。本实验采用体外抑菌实验，用稀释法测定抑菌浓度(MIC)，实验结果表明，本发明药物具有广谱抑菌及一定的杀菌作用。通过止咳实验证实，本发明药物还具有对小鼠的止咳作用。上述结果可为其治疗慢性咽炎临床应用提供相应的理论依据。
本发明药物发掘一个新治疗用途，并扩大该药的临床用药治疗疾病范围，为慢性咽炎疾病治疗提供新的用药选择。该药物具有安全，药理活性作用强的特点，并有良好的市场应用前景。
为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。以下及通过药效学，以证明药物的有益的治疗效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：按照本发明检测方法所测定的药物的液相色谱图
图2：对小鼠祛痰实验结果
图3：本发明药物对小鼠二甲苯致炎实验结果图。
关于图1、图2的进一步解释如下：
图1所述色谱图中9.112分钟检测的指标成分为芍药苷，其检测指标成分的峰面积(mAU﹡s)为4147.29492，峰高(mAU)为234.07227，对称因子为1.03，峰宽(min)0.28，塔板数为5869；
图2中包括：空白对照组、阳性对照药、本发明药物组合物低剂量组、本发明药物组合物中剂量组、本发明药物组合物高剂量组。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面列举二个实验例，说明其在制药领域中的新用途。以下实验旨在说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1药物制备为胶囊剂
处方：蒲公英360g、败酱草360g、薏苡仁360g、赤芍288g、苍术288g、当归360g、川芎288g、香附288g、延胡索120g、泽泻216g、白花蛇舌草216g。
制法：采用延胡索用70％乙醇，回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.13(50℃)的清膏，备用；苍术、香附、当归、川芎，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并收集水溶液备用；药渣加蒲公英等其余六味药材，加水煎煮二次，每次1.5小时，分次滤过，合并滤液，加入提取挥发油后的滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃)的稠膏，真空干燥，粉碎，加入淀粉与上述挥发油，混匀，制成颗粒，装入胶囊，即得。
实施例2药物制备为片剂
处方：蒲公英360g、败酱草360g、薏苡仁360g、赤芍288g、苍术288g、当归360g、川芎288g、香附288g、延胡索120g、泽泻216g、白花蛇舌草216g。
制法：采用延胡索用70％乙醇，回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.13(50℃)的清膏，备用；苍术、香附、当归、川芎，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并收集水溶液备用；药渣加蒲公英等其余六味药材，加水煎煮二次，每次1.5小时，分次滤过，合并滤液，加入提取挥发油后的滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃)的稠膏，真空干燥，粉碎，加入淀粉与上述挥发油，混匀，制成颗粒，装入胶囊，即得。
实施例3药物制备为丸剂
处方：蒲公英360g、败酱草360g、薏苡仁360g、赤芍288g、苍术288g、当归360g、川芎288g、香附288g、延胡索120g、泽泻216g、白花蛇舌草216g。
制法：延胡索用70％乙醇，回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.13(50℃)的清膏，备用；苍术、香附、当归、川芎，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并收集水溶液备用；药渣加蒲公英等其余六味药材，加水煎煮二次，每次1.5小时，分次滤过，合并滤液，加入提取挥发油后的滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃)的稠膏，真空干燥，粉碎，加入淀粉与上述挥发油，混匀，再加入适量的淀粉浆、硬脂酸镁、混匀，制粒，压制成片剂。
实施例4药物制备为颗粒剂
处方：蒲公英360g、败酱草360g、薏苡仁360g、赤芍288g、苍术288g、当归360g、川芎288g、香附288g、延胡索120g、泽泻216g、白花蛇舌草216g。
制法：采用延胡索用70％乙醇，回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.13(50℃)的清膏，备用；苍术、香附、当归、川芎，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并收集水溶液备用；药渣加蒲公英等其余六味药材，加水煎煮二次，每次1.5小时，分次滤过，合并滤液，加入提取挥发油后的滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃)的稠膏，真空干燥，粉碎，再加入适量的糊精、蔗糖、乳糖，混匀，制粒，干燥，制成颗粒剂。
实施例5、本发明药物的药理活性试验
1、本发明药物对慢性咽炎的药效学实验
1.1、实验材料
1.1.1、实验动物
动物昆明种小鼠，体质量20～22g，动物合格证号:SCXK陕2019-0003，,雄性SD大鼠，体质量180～200g，动物合格证号：SCXK陕2019-0003，均由陕西中医药大学实验动物中心提供，温度25℃，12小时，明暗交替，自由饮水及进食，动物室通风良好。
1.1.2、实验药物与试剂
本发明药物为胶囊剂型，由山东步长神州制药有限公司提供，批号20190215，产品名称为：康妇炎胶囊；阳性对照药物为清喉利咽颗粒，天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂，规格每袋5g。酚红，二甲苯，均为北京化工厂分析纯，水合氯醛，上海吉至生化科技有限公司，醋酸，成都市科龙化学试剂厂分析纯。
1.1.3、实验菌种
α-溶血性链球菌、副流感嗜血菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌菌种均由陕西中医药大学实验中心，提供并进行常规方法鉴定，所用细菌均于实验前置37℃中18h，使用前将菌液稀释至最终浓度105CFU·ml－1，备用。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠祛痰实验
小鼠随机分养饲养盒中，称质量标记后，分别给予不同剂量受试药。本发明药物(胶囊剂型中的内容物)分高(16g/kg)、中(8g/kg)、低(4g/kg)剂量组和阳性对照药(清喉利咽颗粒)组(8g/kg)、空白对照组(蒸馏水)，共5组，每剂量组10只。空白对照组每只小鼠蒸馏水8g/kg灌胃，本发明药物(胶囊剂型中的内容物)、清喉利咽颗粒用温蒸馏水溶解后分别灌胃。给药后40min，各组均腹腔注射10％酚红溶液0.3ml/10g；1h后，并将处死小鼠，采用仰位固定，进行分离气管。采用注射器抽取5％NaHCO3液0.5ml，经气管注入小鼠肺内，并抽洗3次，并将抽洗液注入小试管。重复3次，将3次抽洗液合并，离心，备用。取离心后抽洗液0.5ml，加入2ml，5％的NaHCO3液混匀，于紫外可见分光光度计上，在545nm波长处测定吸光度(A545nm)值，从酚红标准曲线算出各A545nm值的相应浓度。按公式计算各组呼吸道分泌液增加率(％)，呼吸道分泌液增加率(％)＝[(给药组酚红浓度－空白组酚红浓度)/空白组酚红浓度]×100％。
1.2.2 对小鼠二甲苯致炎实验
实验小鼠随机分组，称体质量标记后，分别给予不同剂量受试药。本发明药物(胶囊剂型中的内容物)分高(16g/kg)、中(8g/kg)、低(4g/kg)剂量组和阳性对照药(清喉利咽颗粒)组(8g/kg)、空白对照组(蒸馏水)，共5组，每剂量组10只。取本发明药物(胶囊剂型中的内容物)和清喉利咽颗粒用温蒸馏水溶解后灌胃，每天1次，连续给药3天；最后1次给药后60min，将小鼠的右耳用二甲苯棉球接触5秒；15min后颈脱臼处死，用直径8mm打孔器取等面积左(自身对照)、右耳(二甲苯处理)称质量，观察二甲苯致右耳廓肿胀程度(右耳质量减去左耳质量)及相应变化百分率(％)，耳肿胀率(％)＝[(右耳质量－左耳质量)/左耳质量]×100％。
1.2.3 大鼠棉球肉芽肿
实验取大鼠50只，随机分为5组，分别给予不同剂量受试药。本发明药物(胶囊剂型中的内容物)分高(16g/kg)、中(8g/kg)、低(4g/kg)剂量组和阳性对照药(清喉利咽颗粒)组(8g/kg)、空白对照组(蒸馏水)，每组10只。并按照体质量标记后，采用水合氯醛麻醉后，在无菌条件下作腹部切口手术，再将10mg灭菌棉球植入大鼠右侧腹股沟皮下。并在手术当日开始给药，每天1次，连续7天，第8天，最后1次给药后，在50min后，将动物断头处死，剥离取出棉球肉芽组织，置于60℃恒温烘箱内干燥12h，称质量，减去棉花球质量即为肉芽肿组织净重，肉芽肿减少率(％)＝[(对照组肉芽肿净质量－治疗组肉芽肿净质量)/对照组肉芽肿净质量]×100％。
1.2.4 0.6％醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
将小鼠随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组、本发明药物(胶囊剂型中的内容物)分高(16g/kg)、中(8g/kg)、低(4g/kg)剂量组和阳性对照药(清喉利咽颗粒)组(8g/kg)、空白对照组(蒸馏水)，给药组连续灌胃给药7天，每天2次，末次给药后30min，分别尾静脉注射0.6％伊文思兰生理盐水0.1ml/10g，同时腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，20min后处死动物，剪开腹部皮肤肌肉，用0.9％NaCl溶液6ml洗涤腹腔3次，吸管吸出洗涤液，合并后加0.9％NaCl溶液至20ml，以400r·min-1离心10min。取上清液于590nm处测吸光度(表示渗入腹腔的染料量)，比较各组间差异。
1.2.5 最低抑菌浓度(MIC)测定
采用试管内连续稀释法测定药物对5种细菌的最小抑菌浓度。取2.0ml肉汤培养基，加入本发明药物(胶囊剂型中的内容物)和清喉利咽颗粒稀释成一定浓度，试管液体按二倍稀释法稀释，各管中分别加入菌液0.05ml，37℃培养24h，并设空白对照。观察最后一个澄清试管的药液浓度即为最低抑菌浓度。
1.2.6 小白鼠氨水引咳法
取实验小鼠50只，随机分为5组，分别为空白对照组、本发明药物(胶囊剂型中的内容物)低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组(清喉利咽颗粒)，每组10只，各组给药剂量见表6。各小鼠每天按0.2ml/10克体重，每天灌胃给药1次，连续7d。末次给药后1h，将小鼠逐一放入钟罩内，均匀地喷人氨水的气雾，持续30s，把小鼠移置罩外，立即进行观察，记录各小鼠的咳嗽潜伏期及3min内咳嗽次数。(注：小鼠咳嗽的判断以剧烈收缩腹肌并张嘴为准，时可闻到轻微咳嗽声。潜伏期指从开始喷雾到产生咳嗽的时间)。结果见表6。
1.3 实验结果：
表1-对小鼠酚红分泌量的作用(n＝10)
Figure BDA0002480644080000111
注：与空白对照组比较，★P＜0.01。
从以上表1实验结果可知，本发明药物的低剂量组对小鼠酚红分泌量有一定的促进作用。本发明药物中、高剂量组对小鼠酚红分泌量有显著的促进分泌作用，与空白对照组比较差异均有统计学意义，与阳性对照药组比较，本发明药物对小鼠分泌作用稍弱，但达不到统计学意义上的明显差异。上述数据结果，这说明本发明药物具有较好的祛痰作用。
表2-对二甲苯致小鼠耳廓肿胀作用的影响(n＝10)
Figure BDA0002480644080000112
Figure BDA0002480644080000121
注：与空白对照组比较，★P＜0.01。
由以上表2结果可知，与空白对照组比较，本发明药物对二甲苯所致小鼠右耳廓质量增加有随药物增加而较小的趋势。上述结果说明，小剂量组本发明药物具有抑制耳廓肿胀的作用，但无统计学差异。其中本发明药物中剂量组和高剂量组，与阳性对照药相比，其作用效果相当，且无有统计学意义。这也说明，本发明药物对二甲苯所致的急性炎症有显著的抗炎作用。
表3-对大鼠棉球肉芽肿形成的影响(n＝10)
Figure BDA0002480644080000122
注：与空白对照组比较，★P＜0.05。
由以上表3结果可知，经过7天的大鼠给药，本发明药物对棉球肉芽肿的形成有一定的抑制作用，其高剂量的抑制作用最强。其中本发明低，中，高剂量药物对大鼠肉芽肿净减少3.7％～13.0％，与空白对照组比较，本发明药物中高剂量组，其抑制肉芽肿作用结果，均有统计学意义。这进一步说明本发明药物对棉球所致的慢性炎症有显著的抗炎作用。
表4-对0.6％醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(n＝10)
Figure BDA0002480644080000131
注：与空白对照组比较，★P＜0.05。
从表4结果可知，与空白对照组相比，本发明药物中，高，低3个剂量组和阳性对照药能抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加，其中本发明高剂量组的疗效与阳性对照组对小鼠血管通透性亢进有明显的抑制作用。
表5-对下述5种菌的最低抑菌浓度测定(mg·ml-1)(n＝10)
Figure BDA0002480644080000132
结果见表5，本发明药物对抑制乙型溶血性链球菌、肺炎双球菌、α-溶血性链球菌、副流感嗜血菌效果较好，其抑菌效果稍弱于清喉利咽颗粒，但对副流感嗜血菌的抑制作用不佳，但从上述实验数据可知，本发明药物具有广谱抑菌及一定的杀菌作用。
表6-对小鼠的止咳作用的影响(n＝10)
Figure BDA0002480644080000133
Figure BDA0002480644080000141
注：与空白对照组比较，★P＜0.05。
从表6的结果显示，与空白对照组相比，本发明药物的高剂量组及阳性对照药(清喉利咽颗粒)对小鼠咳嗽模型均有抑制作用(P＜0.05)，且能够明显延长小鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽的次数，并有统计学差异。上述实验数据结果，为其治疗本发明药物治疗慢性咽炎提供实验依据。
实施例6：
本发明药物中芍药苷的分析方法
(1)、供试品溶液制备：
取发明药物装量差异项下的内容物，混匀，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
(2)、对照溶液制备
取芍药苷对照品10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)、含量测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每粒含赤芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于0.4mg。
实施例7：
本发明药物中绿原酸含量测定方法如下：
(1)、供试品溶液制备：
精密称取本发明药物内容物2.0g，置于100mL具塞锥形瓶中，加甲酸-甲醇-水溶液如下配置比例的(6：45：42)溶液50mI，密塞，摇匀，称定质量，超声处理30min，取出后放冷至室温，再称定质量，加甲酸-甲醇-水溶液(6：45：42)补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
(2)、对照溶液制备：
分别精密称取绿原酸对照品和5.98mg，置于同一100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液1mL，置于5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成绿原酸11.96μg·mL-1的对照品溶液。
(3)、色谱含量条件测定
色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-c18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-20mL·L-1磷酸盐缓冲液(pH值为4.0，25：75)；检测波长：326nm；柱温：室温；流速：1.0mL·min；进样量：5μL。
实施例8：
本发明药物中齐墩果酸的含量测定
⑴、对照品溶液制备：
精密称定齐墩果酸对照品适量，并置于10mL量瓶中，再加流动相溶解并定容，即得对照品，其中齐墩果酸的浓度为9.8μg/L备用。
⑵、供试品溶液制备：
取本发明药物内容物粉末1.26g，精密称定，置于100mL具塞的锥形瓶中，加入甲醇30mL超声(500W，40Hz)提取30分钟，放冷，补足减失的重量，静置10分钟后滤过。精密量取续滤液lmL，置于10mL量瓶中，用甲醇适量定容，即得。
⑶、含量检测的色谱条件：
色谱柱为HypersilODS2C18色谱柱；齐墩果酸、的色谱条件为：以乙腈-甲醇-0.7％醋酸铵溶液(60：13：25)为流动相，检测波长为215nm，流速为1mL/min，柱温：25℃室温。

Claims (6)

1.一种药物的含量检测方法，其特征在于，所述含量检测方法包括以下步骤：
(1)、所述药物的原料药组成及其重量比为：蒲公英360份、败酱草360份、薏苡仁360份、赤芍288份、苍术288份、当归360份、川芎288份、香附288份、延胡索120份、泽泻216份、白花蛇舌草216份；
(2)、制备方法为：取延胡索用70％乙醇，回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.13的清膏，备用；苍术、香附、当归、川芎，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并收集水溶液备用；药渣加蒲公英等其余六味药材，加水煎煮二次，每次1.5小时，分次滤过，合并滤液，加入提取挥发油后的滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.30～1.35的稠膏，真空干燥，粉碎，加入淀粉与上述挥发油，混匀，制成颗粒，装入胶囊，即得；
(3)、供试品溶液制备：
取步骤(2)所制的胶囊内容物，混匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；
(4)、对照溶液制备
取芍药苷对照品10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)、含量测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.一种药物在制备治疗慢性咽炎疾病的药物中的应用或含量检测方法，其特征在于，所述药物的原料药组成及其重量比为：蒲公英360份、败酱草360份、薏苡仁360份、赤芍288份、苍术288份、当归360份、川芎288份、香附288份、延胡索120份、泽泻216份、白花蛇舌草216份。
3.如权利要求2所述药物的应用或含量检测方法，其特征在于，所述药物的制备方法为：取延胡索用70％乙醇，回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.13的清膏，备用；苍术、香附、当归、川芎，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并收集水溶液备用；药渣加蒲公英等其余六味药材，加水煎煮二次，每次1.5小时，分次滤过，合并滤液，加入提取挥发油后的滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.30～1.35的稠膏，真空干燥，粉碎，加入淀粉与上述挥发油，混匀，加入药用辅料制成药剂学上允许的各种常用药物剂型，即得。
4.如权利要求2或3中所述药物的应用或含量检测方法，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂等口服制剂。
5.如权利要求4中所述药物的应用或含量检测方法，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂。
6.如权利要求2～5中任一所述药物在制备治疗慢性咽炎疾病中的应用。
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