CN111406118A - 呼吸道合胞病毒种属的切口产生和延伸扩增反应(near) - Google Patents
呼吸道合胞病毒种属的切口产生和延伸扩增反应(near) Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及使用等温核酸扩增来检测生物样品中是否存在呼吸道合胞病毒靶核酸的方法和组合物。
Description
技术领域
本发明涉及使用等温核酸扩增来检测生物样品中是否存在靶核酸的方法和组合物。更具体地，本发明涉及检测生物样品中的呼吸道合胞病毒(Respiratory SyncytialVirus)靶核酸。
背景技术
某些等温扩增方法能够在数分钟内将靶核酸从痕量水平扩增到非常高且可检测的水平。此类等温方法(例如，切口产生和延伸扩增反应(NEAR))允许用户检测痕量的特定核苷酸序列，从而促进床旁测试并提高诊断的可及性和速度。
呼吸道合胞病毒(“RSV”)是一种单链包膜RNA副粘病毒，其具有至少十种蛋白质和三种表面蛋白质。RSV是最常见的小儿呼吸道感染(例如，细支气管炎和肺炎)的病原体。尽管大多数RSV感染影响1岁以下的婴儿，但在美国每年有超过170,000人的5岁以下儿童由于RSV住院(参见例如Stockman等人，(2012)Pediatr.Infect.Dis.J.31(1):5-9；Hall等人，(2013)Pediatrics 132(2):e341-348；以及Langley等人，(2011)Pediatr.Infect.Dis.J.30(6):517-517)。在老年人和高危成年人(即，免疫功能低下的患者)中也可看到RSV感染。在3-5天的潜伏期内，RSV感染通常保持在几天内不被发现。与RSV感染相关的症状包括通常与感冒症状相关的那些症状(例如，充血、咳嗽和发烧)。这些示例性因素使得早期检测和诊断非常具有挑战性。
发明内容
本公开至少部分地基于以下发现：使用NEAR或重组酶聚合酶扩增(RPA)可以准确且有效地检测生物样品中是否存在RSV。鉴于该发现，本文提供了用于确定(例如，检测)生物样品中是否存在RSV的NEAR组合物和方法。更具体地，本文提供了用于确定(例如，检测)生物样品中是否存在RSV靶核酸(诸如非结构基因NS2或RSV核衣壳基因N)的NEAR组合物和方法。本文提供的组合物可用于检测生物样品中的RSV核酸，并且包含至少一对模板(即，一对正向模板和反向模板)和任选的RSV特异性探针。
本文提供了组合物，所述组合物包含：i)第一正向模板，所述第一正向模板包含核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS2基因反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；和ii)第一反向模板，所述第一反向模板包括核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与RSV非结构NS2基因有义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在切口产生位点上游的稳定化区；或iii)第二正向模板，所述第二正向模板包括核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；和iv)第二反向模板，所述第二反向模板包括核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N有义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区。
在一些实施方案中，在3'端的与RSV非结构NS2基因反义链的3'端互补的识别区的长度为8-30个核苷酸，和/或其中在3'端的与RSV核衣壳基因N反义链的3'端互补的识别区的长度为8-30个核苷酸。
在一些实施方案中，在3'端的与RSV非结构NS2基因有义链的3'端互补的识别区的长度为8-30个核苷酸，和/或其中在3'端的与RSV核衣壳基因N有义链的3'端互补的识别区的长度为8-30个核苷酸。
在一些实施方案中，包含i)和ii)的组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与RSV非结构NS2基因核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含iii)和iv)的组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与RSV核衣壳基因N核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，第一正向模板的核酸序列包含与SEQ ID NO:1(CGACTCACACGAGTCGAAAACTTGATGAAAGA)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；并且第一反向模板的核酸序列包含与SEQ ID NO 2:(AGACTCCACACGGAGTCTAGTTGACCAGGAATG)具有至少80％，至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
在本文描述的任何组合物的一些实施方案中，包含i)和ii)的组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3(ACCAGGAATGTAAATGTGGCCTGGT)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，第二正向模板的核酸序列包含与SEQ ID NO:6(GACTCGCACACGAGTCACGTAGTACAGGAGATAA)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；第二反向模板的核酸序列包含与SEQ IDNO 7:(GACTCCACACGGAGTCGCTTTTGCACATCATAA)具有至少80％，至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含iii)和iv)的组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:8(TGACACATCATAATTGGGAGTGTCA)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
在本文描述的任何组合物的一些实施方案中，还包含DNA聚合酶、一种或多种切口酶、dNTP、或dNTP和ddNTP的混合物中的一种或多种。在一些实施方案中，DNA聚合酶选自由以下组成的组：Geobacillus bogazici DNA聚合酶、Bst(大片段)、外切DNA聚合酶、Manta1.0DNA聚合酶
在一些实施方案中，所述一种或多种切口酶选自由以下组成的组：Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.Bsml、Nb.BsrDI、Nb.Btsl、Nt.Alwl、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BpulOI、Nt.BpulOI和N.BspD61。
在一些实施方案中，组合物是冻干的。
在一些实施方案中，探针缀合至可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记选自由以下组成的组：荧光团、酶、猝灭剂、酶抑制剂、放射性标记、结合对的成员，以及它们的组合。
在一些实施方案中，第一正向模板、第一反向模板、第二正向模板或第二反向模板中的一者或多者包括一个或多个经修饰的核苷酸、间隔区、或封端基团。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸包括2'修饰。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸包括2'-0-甲基。
本文还提供了用于检测生物样品中是否存在RSV的方法，其中所述方法包括：将生物样品与组合物接触，所述组合物包含i)第一正向模板，所述第一正向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV非结构NS2基因反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；和ii)第一反向模板，所述第一反向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV非结构NS2基因有义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；iii)至少一种切口酶；以及iv)DNA聚合酶；在核酸扩增反应中扩增靶核苷酸序列以提供扩增产物；以及检测是否存在所述扩增产物。
在一些实施方案中，至少一种切口酶包括：第一切口酶，所述第一切口酶能够在第一正向模板的切口产生位点产生切口，并且不在RSV非结构NS2基因反义链内产生切口，和/或第二切口酶，所述第二切口酶能够在第一反向模板的切口产生位点处产生切口，并且不在RSV非结构NS2基因有义链内产生切口，其中所述第一切口酶和所述第二切口酶可以相同或不同。在一些实施方案中，所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与RSV非结构NS2基因核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本文还提供了用于检测生物样品中是否存在RSV的方法，其中所述方法包括：将生物样品与组合物接触，所述组合物包含i)第二正向模板，所述第二正向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；和ii)第二反向模板，所述第二反向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N有义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；iii)至少一种切口酶；以及iv)DNA聚合酶；在核酸扩增反应中扩增靶核苷酸序列以提供扩增产物；以及检测是否存在所述扩增产物。
在一些实施方案中，至少一种切口酶包括：第一切口酶，所述第一切口酶能够在第二正向模板的切口产生位点产生切口，并且不在RSV核衣壳基因N反义链内产生切口，和/或第二切口酶，所述第二切口酶能够在第二反向模板的切口产生位点处产生切口，并且不在核衣壳基因N有义链内产生切口，其中所述第一切口酶和所述第二切口酶可以相同或不同。
在一些实施方案中，所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与RSV核衣壳基因N核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在基本上等温的条件下执行扩增。
在一些实施方案中，第一正向模板的核酸序列包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；并且第一反向模板的核酸序列包含与SEQ ID NO 2具有至少80％，至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，第二正向模板的核酸序列包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；并且第二反向模板的核酸序列包含与SEQ ID NO 7具有至少80％，至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述组合物还包含dNTP，或dNTP和ddNTP的混合物。
在一些实施方案中，DNA聚合酶选自由以下组成的组：Geobacillus bogazici DNA聚合酶、Bst(大片段)、外切DNA聚合酶、Manta 1.0DNA聚合酶
在一些实施方案中，第一正向模板和第一反向模板、第二正向模板和第二反向模板包含被相同的至少一种切口酶识别的切口酶结合位点。在一些实施方案中，至少一种切口酶选自由以下组成的组：Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.Bsml、Nb.BsrDI、Nb.Btsl、Nt.Alwl、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BpulOI、Nt.BpulOI和N.SBspD61。
在一些实施方案中，探针缀合至可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记选自由以下组成的组：荧光团、酶、猝灭剂、酶抑制剂、放射性标记、结合对的成员，以及它们的组合。在一些实施方案中，至少一种切口酶在切口酶结合位点的下游产生切口。
在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述方法任选地包括在扩增之前从生物样品中提取/分离核酸。
在一些实施方案中，生物样品选自粪便、口腔/咽喉拭子、唾液、脓液、痰、血液和尿液，或其中生物样品来自受感染或未受感染的组织。
在一些实施方案中，第一正向模板、第一反向模板、第二正向模板或第二反向模板中的一者或多者包括一个或多个经修饰的核苷酸、间隔区、或封端基团。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸包括2'修饰。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸包括2'-0-甲基。
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包括模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸选自由以下组成的组：(a)第一正向模板，所述第一正向模板包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；以及第一反向模板，所述第一反向模板包含与SEQ ID NO 2具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或者(b)第二正向模板，所述第二正向模板包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；以及第二反向，所述第二反向包含与SEQ ID NO 7具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
在本文描述的任何试剂盒的一些实施方案中，(a)还包括探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。在本文描述的任何试剂盒的一些实施方案中，(b)还包括探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
在本文描述的任何试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还包括拭子。
在本文描述的任何试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还包括使用所述试剂盒的使用说明。
在本文描述的任何试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还包括dNTP、或dNTP和ddNTP的混合物中的一种或多种。
在本文描述的任何试剂盒的一些实施方案中，试剂盒任选地包括用于从生物样品中提取/分离核酸的试剂。
在一些实施方案中，模板寡核苷酸包括一种或多种经修饰的核苷酸、间隔区、或封端基团。
在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸包括2'修饰。
在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸包括2'-0-甲基。
在本文描述的任何试剂盒的一些实施方案中，试剂盒还包括聚合酶。
本发明提供了用于检测和诊断受试者中的RSV感染的高度灵敏且快速定性的测定。
术语“模板”或“引物”是指能够充当与核酸链互补的引物延伸产物的5'至3'合成的起始点的寡核苷酸。引物延伸产物是在合适的核苷酸和聚合剂(诸如DNA聚合酶)的存在下，在合适的缓冲液中和合适的温度下合成的。
如本文所用，术语“探针”是指寡核苷酸，所述寡核苷酸由于所述探针中的至少一个序列与进行分析的样品中的靶核酸序列互补而与扩增所述靶序列产生的产物形成杂交结构。任何特定探针的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，和/或合成的核苷酸类似物。
在本发明的上下文中，靶核酸序列是RSV的核酸序列。例如，在本发明的上下文中，靶核酸序列可以是RSV非结构基因NS2的核酸序列或RSV核衣壳基因N的核酸序列。
本发明中使用的术语“一种或多种”或“至少一种”代表1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种化合物。
术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等仅以其相对意义用于本公开中。应当理解的是，除非另有说明，否则仅出于方便描述一个或多个实施方案的目的而使用那些术语。术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等仅用于将一个要素与另一个要素区分开，并且所公开的技术的权利范围不应受限于这些术语。例如，可以将第一要素指定为第二要素，并且类似地，可以将第二要素指定为第一要素。
术语“增加”、“升高”或“上调”在本文中均用于一般地指统计上显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加”或“升高”是指与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或直至并包括增加100％，或与参考水平相比介于10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比增加至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或介于1.0倍与10倍之间的任何增加，或更大。
术语“减少”、“降低”、“减小”或“下调”在本文中通常均用来一般地表示统计上显著量的减少。然而，为避免疑问，“减少”、“降低”、或“减小”是指与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％，或直至且包括减少100％(即与参考样品相比不存在的水平)，或与参考水平相比介于10-100％之间的任何降低，或与参考水平相比减少至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或介于1.0倍与10倍之间的任何减少，或更大。
本文使用的章节标题仅出于组织目的，而不应以任何方式解释为限制所描述的主题。当所并入的参考文献中的术语的定义似乎与本教导中提供的定义不同时，以本教导中提供的定义为准。应当理解的是，在本教导中所讨论的诸如温度、浓度和时间等度量之前存在隐含的“约”，因此轻微和无实质的偏差在本文的本教导的范围内。在本申请中，除非另有明确说明，否则单数的使用包括复数。而且，“包含”、“包括”和“含有”的使用并非旨在为限制性的。应当理解，前面的一般描述和下面的具体实施方式都仅仅是示例性和解释性的，而不限制本发明。冠词“一”和“一个”在本文中用于指代一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一(个)要素”是指一个要素或多于一个要素。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其它合适方法和材料。材料、方法和示例仅是说明性的，而并非旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献全文以引用方式并入本文。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
根据以下详细描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图说明
专利或申请文件包含至少一张彩色附图。本专利或专利申请公开的带彩色附图的副本将在进行请求并支付必要的费用后由专利局提供。
图1是示出使用本文所述的用于检测RSV非结构基因NS2的示例性测定(“RSV A测定”)进行检测限(LOD)研究的结果的图表。
图2是示出使用本文所述的用于检测RSV核衣壳基因N的示例性测定(“RSV B测定”)进行LOD研究的结果的图表。
图3A至图3D是示出在存在0个拷贝(无靶标拷贝“NTC”)(图3A)、50个拷贝(图3B)、250个拷贝(图3C)或500个拷贝(图3D)的靶核酸和不断增加量的背景人类基因组DNA(10ng、100ng和1000ng)的情况下执行的示例性RSV A分析的结果的图表。
图4A至图4D是示出在存在0个拷贝(“NTC”)(图4A)、50个拷贝(图4B)、250个拷贝(图4C)或500个拷贝(图4D)的靶核酸和不断增加量的背景人类基因组DNA(10ng、100ng和1000ng)的情况下执行的示例性RSV B分析的结果的图表。
图5是示出在存在不断增加量的背景人类gDNA(0、10ng、100ng、1000ng)的情况下用0个拷贝的靶核酸执行的示例性RSV B测定的结果的图表。
图6和图7是示出用于确定测定对纯化RNA(图6)和纯化病毒(图7)的反应性的示例性RSV A测定的结果的图表。X轴—周期(1个周期＝10秒)；Y轴—mV。
图8是示出经执行以确定纯化病毒的检测限(LOD)的示例性RSV A的图表。
图9和图10是示出显示测定对纯化RNA(图9)和纯化病毒(图10)的反应性的示例性RSV B测定的图表。X轴—周期(1个周期＝10秒)；Y轴—mV。
图11和图12是示出经执行以确定测定对纯化RNA(图11)和纯化病毒(图12)的反应性的示例性RSV B+IC测定的结果的图表。
图13和图14是示出经执行以确定RSV B性能(图13)和RSV B+IC性能(图14)的纯化病毒检测限(LOD)的示例性测定的结果的图表。
图15至图17是示出RSV A测定(图15)、RSV B测定(图16)和RSV B+IC测定(图17)的“无靶标拷贝”(NTC)平行测定研究的结果的图表，所述NTC平行测定研究用于确定当反应中不存在靶标时所述测定是否会产生假阳性结果。X轴—周期(1个周期＝10秒)；Y轴—mV。
图18和图19是示出RSV A测定(图18)和RSV B测定(图19)的示例性包容性研究的结果的图表，所述示例性包容性研究用于确定所述测定是否跨多个菌株提供相似水平的性能(A2用作开发菌株，示出的是使用A long的结果)。将菌株A Long每个反应一式三份地以5个拷贝(经确定为开发菌株A2的LOD)或10个拷贝的纯化RNA进行筛选。(Rox—靶检测；Fam—内部对照检测)。
图20A至图20B是示出用于确定RSV A测定(图20A)和RSV B(图20B)是否提供对非RSV种属的特异性的示例***叉反应性研究的结果的图表。
图21A至图21B是示出用于确定测定是否将提供针对相反RSV亚型的特异性的示例***叉反应性研究的结果的图表。针对RSV B靶标筛选RSV A测定(图21A)，并针对RSV A靶标筛选RSV B测定(图21B)。
图22和图23是示出使用RSV A产物1序列相对于RSV B序列(图22)和使用RSV B产物1序列相对于RSV A序列(图23)执行的BLAST分析的图表。
示出了代表性的“最佳匹配”与RSV A模板、分子信标和产物序列的比对，以及示出了代表性的RSV A菌株序列和代表性的“最佳匹配”分别与RSV B模板、分子信标和产物序列、以及代表性的RSV B菌株序列的比对。
使用Basic BLAST“核苷酸blast”程序(BLASTN 2.2.30+)、核苷酸集合(nr/nt)数据库，分别专门靶向RSV B型(taxid：208895)和RSV A型(taxid：208893和1439707)在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上进行BLAST分析，其中标准BLAST参数经调节为用于搜索短输入序列。
图24和图25是示出经执行以评定RSV A冻干试剂(图24)和RSV B冻干试剂(图25)在临床基质存在下的性能的示例性实验的结果的图表。两种测定均用不具名的供体拭子池C进行筛选。
图26至图28是示出50个临床拭子样品的RSV A NEAR测定(图26)、RSV B NEAR测定(图27)和RSV B+IC NEAR测定(图28)的汇总结果的图表。
图29示出了描绘使用RSV A NEAR测定和RSV B NEAR测定时被称为阳性的临床拭子样品的子集的实时荧光曲线的示例性结果。
图30至图32示出了描绘使用RSV A NEAR测定(图30)、RSV B NEAR测定(图31)和RSV B+IC NEAR测定(图32)筛选的50个临床UTM样品的实时荧光曲线的示例性结果。
图33示出了描绘使用RSV A NEAR测定和RSV B NEAR测定时被称为阳性的临床UTM样品的子集的实时荧光曲线的示例性结果。
具体实施方式
本文提供了用于在床旁(point-of-care,POC)处使用的超快速、灵敏、特异且可靠的方法。使用DNA或RNA靶标、短产物和几何扩增机制的切口酶扩增反应或即NEAR的等温性质提供了超快速的扩增方法。在临床基质存在下提供稳健性能的能力因为不需要冗长或麻烦的样品制备/核酸纯化而将NEAR与大多数其他分子测试区分开。这些关键属性使NEAR成为用于POC集成的理想技术，在POC集成中快速且可靠的结果是至关重要的。基于这些原理，已开发NEAR测试来检测样品中是否存在RSV。在一个示例性实施方案中，该测试由使用临床患者样品(例如，鼻拭子样品)检测非结构基因NS2和/或核衣壳基因N的两种测定组成。
本公开部分地基于以下发现：使用等温扩增可以检测生物样品中是否存在RSV。为此，本申请公开了组合物，所述组合物用于通过扩增并使用NEAR检测靶核苷酸序列来检测生物样品中是否存在RSV。在一些实施方案中，可以使用实时或终点检测方法，例如利用荧光标记的探针来检测靶核苷酸序列。
使用术语“靶序列”可以指序列的有义链或反义链，并且还指原始靶序列的存在于靶核酸、经扩增的拷贝或扩增产物上的序列。扩增产物可以是包含靶序列以及至少一个其他序列、或其他核苷酸的较大分子。
本发明的方法可用于鉴定来自试样的核酸以诊断RSV感染。在这些方法中使用的本发明的特异性引物和探针允许扩增和监测特异性扩增产物的发展。NEAR对RSV(例如，非结构基因NS2、核衣壳基因N)的检测灵敏度提高使得将该技术实施用于在临床实验室中和床旁进行RSV感染的常规诊断成为可能。
某些等温扩增方法能够在数分钟内将靶核酸从痕量水平扩增到非常高且可检测的水平。此类等温方法(例如，NEAR和RPA)可以允许用户检测痕量的特定序列，从而促进床旁测试并提高诊断的可及性和速度。
进行扩增反应的时间可以在例如约I分钟内，或在约2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、1.5分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟或20分钟内变化。在速度不成问题的情况下，较长的反应时间可产生可接受的结果。在一些实施方案中，反应介于1-20分钟、1-15分钟、或1-10分钟、1-8分钟、1-5分钟、1-2.5分钟、2.5-5分钟、2.5-8分钟、2.5-10分钟或2.5-20分钟之间。如本文所述的扩增过程是有效的，并且在一些实施方案中，在反应的时间范围内，例如在5分钟、10分钟或12分钟内，存在约1×106倍或更大的扩增、约1×i07倍或更大的扩增、约1×108倍或更大的扩增、约1×109倍或更大的扩增，或约1×1010倍或更大的扩增。该反应是高度敏感的，并且能够检测例如样品中的低至约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个拷贝，样品中的多至200个、500个、1,000个.5,000个或10,000个或更多个拷贝，或者例如可以检测以例如约3.32E-13微摩尔至约3.32E-8微摩尔、约1.66E-12微摩尔至约3.32E-8微摩尔、约3.32E-13微摩尔至约3.32E-7微摩尔、或约3.32E-13微摩尔至约3.32E-6微摩尔的浓度存在的靶标。
NEAR方法公开于例如U.S.9,617,586和U.S.9,689,031中，所述专利均以引用方式并入本文。
适用于结合本发明方法进行扩增的核酸(例如，多核苷酸)包括双链和单链核酸分子，诸如DNA分子和RNA分子。所述多核苷酸可以是基因组、染色体、质粒、线粒体、细胞和病毒核酸来源的。对于双链多核苷酸，扩增可以是对一条或两条链的扩增。
适用于本文公开的方法的另一种此类等温扩增方法是RPA。RPA可以允许用户检测痕量的特定序列，从而促进床旁测试并提高诊断的可及性和速度。如在此所述，RPA采用被称为重组酶的酶，所述酶能够将寡核苷酸引物与模板双链核酸中的同源序列配对。以这种方式，DNA合成被引导至模板双链核酸中的限定点。使用两个或更多个序列特异性(例如，基因特异性)引物时，如果存在模板核酸，则启动指数扩增反应。该反应迅速进行，并且导致在几分钟内模板双链核酸中存在的序列从模板核酸的仅几个拷贝特异性扩增成可检测水平的扩增产物。RPA方法公开于例如US 7,270,981；US 7,399,590；US 7,666,598；US 7,435,561；US 8,071,308；和WO 2010/141940中，该等专利均以引用方式并入本文。
术语“模板”和“引物”可互换使用，并且通常是指寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列用作使用聚合酶进行靶序列的核苷酸扩增的起始点。模板被定义为寡核苷酸，所述寡核苷酸与靶序列的识别区结合并且还包含在所述识别区上游的切口酶结合区和在所述切口酶结合区上游的稳定化区。本文公开的组合物可包含一组模板，所述一组模板扩增靶核酸序列。模板可以在一个或多个位置处包含与靶核酸序列互补或与靶核酸序列不同的序列。在例如U.S.9,617,586和U.S.9,689,031中提供了适用于本文公开的NEAR扩增方法的模板的设计，所述专利均以引用方式并入本文。
本发明方法的模板可以包含例如间隔区、封端基团和经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸是在组成和/或结构上与天然核苷酸和核苷三磷酸不同的核苷酸或核苷三磷酸。修饰包括天然存在的修饰，或由修饰核苷酸的酶(诸如甲基转移酶)进行修饰而产生的修饰。经修饰的核苷酸还包括合成或非天然存在的核苷酸。例如，经修饰的核苷酸包括具有2'修饰(诸如2'-0-甲基和2'-氟)的核苷酸。其他经2'修饰的核苷酸在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,096,897中描述，该专利全文以引用方式并入本文。本文中使用的经修饰的核苷酸或核苷三磷酸可以例如以这样的方式修饰：当所述修饰存在于双链核酸的具有限制性核酸内切酶识别位点的一条链上时，所述经修饰的核苷酸或核苷三磷酸保护经修饰的链不被限制酶切割。因此，经修饰的核苷酸或核苷三磷酸的存在促进了双链核酸的切口产生，而不是切割。封端基团是化学部分，所述化学部分可以添加到模板中以抑制聚合酶进行的与靶序列无关的核酸聚合。封端基团通常位于模板的3'端。封端基团的示例包括例如烷基、非核苷酸接头、硫代磷酸酯、链烷二醇残基、肽核酸，以及缺乏3'-OH的核苷酸衍生物，包括例如虫草素。间隔区的示例包括例如C3间隔区。可以例如在模板内以及还例如在5'端处使用间隔区来附接其他基团，诸如标签。
在本发明的另一方面中，提供了一种用于检测样品中的RSV的方法，所述方法包括以下步骤：从受试者获得样品；从所述样品中提取核酸；以及扩增所述核酸；其中所述核酸使用如本文所述的模板和探针进行扩增和检测。
本发明还包括例如通过选自由以下组成的组的方法来检测扩增产物：凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光、SYBR II荧光、SYBR Gold、Pico Green、TOTO-3、嵌入染料检测、FRET、分子信标检测、表面捕获、毛细管电泳，掺入经标记的核苷酸以允许通过捕获、荧光偏振和侧向流捕获进行检测。扩增产物可以例如通过嵌入双链DNA中的化学部分来检测。例如，SYBR
结合双链DNA并在激发时发光；因此，随着产品的积累，荧光增加。扩增产物可以例如使用固体表面方法检测，例如在所述固相表面方法中至少一种捕获探针固定在与扩增序列结合的固体表面上。在所有方面的一些实施方案中，使用“实时荧光”来执行扩增产物的检测。
术语“实时荧光”是指经由通过将荧光染料分子和猝灭剂部分耦接至相同或不同的寡核苷酸底物而产生的荧光信号来检测核酸扩增产物。常用探针的示例是
探针、分子信标探针和
探针。简而言之，
探针、分子信标和
探针均具有彼此紧密附接的荧光报告染料(也称为“荧光剂”)和猝灭剂部分。在未杂交的状态下，荧光剂和猝灭剂分子的接近阻止探针检测到荧光信号；在
探针的情况下，在扩增期间，当聚合酶复制其上结合有探针的模板时，聚合酶的5'核酸酶活性切割探针，由此使得随着荧光剂和猝灭剂彼此分开，荧光随着每个复制周期的进行而增加。分子信标探针在同源产物退火后发出荧光，因为此事件诱发信标结构的构象变化，从而使荧光剂和猝灭剂分开。简而言之，类似于分子信标，
探针和
探针将在特定产物与所述探针退火并延伸时释放荧光信号，所述退火和延伸导致荧光剂和猝灭剂分离。
靶核酸和核酸序列的产生或存在也可以通过侧向流动装置检测和监测。侧向流动装置是众所周知的。这些装置通常包括固相流体可渗透的流动路径，流体通过毛细作用力流过所述固相流体可渗透的流动路径。示例包括但不限于快速试纸法(dipstick assay)和具有各种合适涂层的薄层色谱板。固定在流动路径上的是样品的各种结合试剂、结合配偶体，或涉及样品的结合配偶体和信号产生***的缀合物。样品的检测可以通过若干种方式实现；例如酶促检测、纳米颗粒检测、比色检测和荧光检测。酶促检测可涉及与侧向流动装置表面上的互补或基本上互补的核酸靶杂交的酶标记探针。所得的复合物可以用适当的标记物处理以产生可读信号。纳米粒子检测涉及可使用胶体金、乳胶和顺磁性纳米粒子的微珠技术。在一个示例中，珠粒可以缀合至抗生物素的抗体。靶序列可以直接经生物素化，或者靶序列可以与序列特异性的生物素化探针杂交。金和乳胶产生肉眼可见的比色信号，并且顺磁性颗粒在磁场中被激发时产生非视觉信号并且可以由专门的读取者解译。
核酸也可以被捕获在侧向流动装置上。捕获手段可包括抗体依赖性方法和抗体非依赖性方法。抗体依赖性捕获通常包含抗体捕获线和标记探针，所述标记探针为与靶标互补或基本上互补的序列。抗体非依赖性捕获通常使用两个结合配偶体之间的非共价相互作用，例如，生物素化探针与链霉亲和素线之间的高亲和力和不可逆连接。捕获探针可以直接固定在侧向流动膜上。抗体依赖性方法和抗体非依赖性方法均可用于多样本测序。
靶核酸和核酸序列的产生或存在也可以通过多重DNA测序来检测和监测。多重DNA测序是一种从DNA池中鉴定靶DNA序列的方法。该技术允许同时处理许多测序模板。合并的多个模板可以在过程完成时分解成单独序列。
术语“互补的”和“基本上互补的”是指核苷酸或核酸之间(例如在双链DNA分子的两条链之间或在寡核苷酸引物与待测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间)的碱基配对。互补的核苷酸通常是A和T(或A和U)，以及G和C。在本发明的上下文中，应当理解的是，列出的特定序列长度是说明性的而不是限制性的，并且覆盖相同的图谱位置，但是具有稍微少一些或更多的碱基的序列也被认为是所述序列的等同物，并且落入本发明的范围内，只要它们将与靶标上的与所列序列相同的位置杂交即可。因为应当理解核酸不需要完全互补就可以杂交，因此本文公开的探针和引物序列可以进行一定程度的修饰而不会失去作为特异性引物和探针的用途。通常，具有80％、90％、95％、97％、98％、99％的同源性的序列落入本发明的范围内。如本领域中已知的，可以通过调节杂交条件以增加或降低严格性，即通过调节杂交温度或缓冲液的盐含量，来获得互补和部分互补的核酸序列的杂交。
在所有方面的一些实施方案中，模板和探针可以用可检测标记物进行标记(例如，与所述可检测标记物缀合)。如本文所用，术语“可检测标记物”和“标记物”是指可用于提供可检测的(优选可定量的)信号，并且可通过共价键或非共价相互作用(例如，通过离子键或氢键键合，或通过固定、吸附等)附接至核酸或蛋白质的任何化学部分。标记物通常提供可通过荧光、化学发光、放射性、比色法、质谱、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记物的示例包括半抗原、酶、酶底物、辅酶、酶抑制剂、荧光团、猝灭剂、发色团、磁性颗粒或珠粒、氧化还原敏感部分(例如，电化学活性部分)、发光标记、放射性同位素(包括放射性核苷酸)，以及结合对的成员。更具体的示例包括荧光素、藻胆蛋白、四乙基罗丹明和β-半乳糖苷酶。结合对可包括生物素/链霉亲和素、生物素/亲和素、生物素/中性链亲和素、生物素/captavidin、表位/抗体、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His标签/金属离子(例如，镍、钴或铜)、抗原/抗体、FLAG/MI抗体、麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、钙调蛋白结合蛋白/钙调蛋白、酶-酶底物、受体-配体结合对，以及结合对的类似物和突变体。
如本文所用，术语“荧光标记物”和“荧光团”可互换使用，并且是指这样的物质，所述物质当被不同波长(激发波长)的辐射照射时以一定波长(发射波长)发射电磁能，并且旨在涵盖能够与样品中的感兴趣的分析物特异性相互作用或反应以提供一个或多个光信号的化学或生化分子或其片段。
用于本文提供的方法的代表性荧光团包括例如FAM(四甲基罗丹明)、Texas RedTM、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素、5-异硫氰酸荧光素(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺基)荧光素(5-IAF、6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基氯化物(NBD-C1)、溴化乙锭、荧光黄、罗丹明类染料(5-羧基罗丹明6G盐酸盐、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC(罗丹明-B-异硫氰酸酯)、罗丹明800)；四甲基罗丹明5-(和6-)异硫氰酸酯(TRITC))、Texas RedTM、磺酰氯、萘胺磺酸，包括但不限于1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)、蒽基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青素540、苯乙烯基萘(Naphtyl Styryl)、3,3'-二丙基硫杂二羰花青(diS-C3-(5))、4-(对二戊基氨基苯乙烯基)-1-甲基吡啶鎓(di-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸酯、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、铝酞菁、Oxaxine 1,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙菲啶同二聚体(Ethidium Homodimer)、N(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物荧光素(phytofiuor)、六苯并苯和金属-配体复合物。
应当注意的是，荧光猝灭剂也被认为是可检测的标记。例如，可以使荧光猝灭剂与荧光染料接触并且可以检测猝灭的量。
用于本文提供的方法的半抗原包括例如洋地黄毒苷、谷胱甘肽和生物素。
用于本文提供的方法的酶包括例如碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SBP)、脲酶、β-内酰胺酶和葡糖氧化酶。
用于检测本文描述的生物样品(例如试剂混合物)中是否存在RSV的组合物可包含DNA聚合酶。本文公开的DNA聚合酶可以是真核或原核聚合酶。聚合酶可以选自例如Geobacillus bogazici DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶(大片段)，9°Nm DNA聚合酶，Phi29 DNA聚合酶，DNA聚合酶I(大肠杆菌)，DNA聚合酶I的大(克列诺)片段、克列诺片段(3'-5'外部)，T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，Deep VentRTM(外部)DNA聚合酶，DeepVentRTMDNA聚合酶，DyNAzymeTMEXT DNA，DyNAzymeTMII热启动DNA聚合酶，PhusionTM高保真DNA聚合酶，TherminatorTMDNA聚合酶，TherminatorTMII DNA聚合酶，
DNA聚合酶，
(外部)DNA聚合酶，RepliPHITMPhi29 DNA聚合酶，rBst DNA聚合酶，rBst DNA聚合酶的大片段(IsoThermTMDNA聚合酶)，MasterAmpTMAmpliThermTMDNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Tfl DNA聚合酶，Tgo DNA聚合酶，SP6 DNA聚合酶，Tbr DNA聚合酶，DNA聚合酶β，ThermoPhi DNA聚合酶和Pyrophage 3173(Lucigen)，或它们的组合。
用于检测本文所述的生物学样品(诸如试剂混合物和缓冲溶液)中是否存在RSV的组合物可以包含抗微生物剂或防腐剂。抗微生物剂能够抑制微生物的生长，并延长试剂混合物或缓冲溶液的保质期。该抗微生物剂可以包括苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、
(例如，ProClin
950等)、叠氮化物、硫柳汞、和/或抗生素。在一些实施方案中，抗微生物剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。
“恒定温度”、“等温条件”、“基本上等温”或“等温”是指一组反应条件，其中在扩增反应过程中反应温度保持基本上或实质上恒定。本发明方法的扩增方法的优点在于温度不需要在较高温度与较低温度之间循环。切口产生和延伸反应将在相同温度下或相同窄温度范围内进行。然而，没有必要将温度精确地保持在一个温度。如果用于维持高温的设备允许反应混合物的温度变化几度或十分之几度，诸如小于1度、0.8度、0.6度、0.4度、或0.2度，则这对扩增反应无害，并且仍可以认为是等温反应。
本发明可以用于多重扩增。因此，例如，在本发明的某些实施方案中，能够扩增至少两种靶序列。术语“多重扩增”是指多于一种靶核酸的扩增。“能够被扩增”是指扩增反应包括适当的模板和酶以扩增至少两个靶序列。因此，例如，扩增反应可以经准备以检测至少两个靶序列，但是被测试的样品中可能实际上仅存在一个靶序列，使得即使实际上可能仅扩增一条序列，也能够扩增两条序列。或者，在存在两个靶序列的情况下，扩增反应可导致这两个靶序列均扩增。多重扩增反应可导致其包含的适当模板和酶所针对的一种、一些或所有靶序列的扩增。
如本文所用，术语“生物样品”或“样品”是指获自或来源于受试者(即，患者)的样品。举例来说，生物样品可以是从受试者获得的组织液，所述组织液可以选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、淋巴液、滑液、脑脊液、羊水、羊膜脐带血、泪液、唾液、粘液分泌物、尿液和鼻咽清洗液。来自呼吸道的代表性生物样品包括伤口和咽喉拭子、咽喉清洗液、鼻拭子，以及来自下呼吸道的试样。
如本文所用，“获得”或“获取”可以是任何通过“直接”或“间接”手段拥有样品的方式。直接获得样品是指执行处理(例如，执行诸如提取等物理方法)以获得样品。间接获得样品是指从另一方或来源(例如，直接获取样品的第三方实验室)接收样品。直接获得样品包括执行包括物理物质(例如，原材料，诸如血液，例如先前从患者分离的血液)的物理变化的过程。因此，获得用于表示从受试者收集和/或取得样品。此外，“获得”还用于表示一个人从另一个先前拥有该样品的人那里接收样品的情况。
样品中靶核酸内存在的靶序列可以用本发明的方法扩增，而无需在获得样品后首先纯化靶核酸。术语“纯化”可以表示例如将靶核酸与样品中存在的抑制剂和背景物质基本上分离。根据本发明，可以例如用适合于裂解样品中的细胞的缓冲液稀释获得的样品，而无需浓缩靶核酸或实质去除样品中存在的任何抑制剂和背景物质。
术语“受试者”是指动物或人，或来源于动物或人的一个或多个细胞。优选地，受试者是人。受试者还可以包括非人灵长类动物。细胞可以是任何形式，包括但不限于保留在组织中的细胞，细胞簇，固定、转染或转化的细胞，以及来源于动物的已进行物理或表型改变的细胞。人类受试者可以称为患者。
在其他实施方案中，提供了用于遵循本发明的核酸扩增方法的试剂盒，所述试剂盒包括DNA聚合酶；用于核酸扩增的第一模板，所述第一模板包含在3'端的与靶序列反义链的3'端互补或基本上互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；在所述切口酶结合位点和所述切口产生位点上游的稳定化区；用于核酸扩增的第二模板，所述第二模板包括在3'端的与靶序列有义链的3'端互补或基本上互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；在所述切口酶结合位点和所述切口产生位点上游的稳定化区；一种或多种切口酶，其中任一种酶能够在所述第一模板和所述第二模板的切口产生位置处产生切口，或者第一酶能够在第一模板的切口产生位置处产生切口并且第二酶能够在第二模板的酶位点处产生切口。
用于本发明方法的试剂盒还可以包括在任何数量的单独容器、包装、管、小瓶、微量滴定板等中的一种或多种组分，或者组分可以以各种组合方式在此类容器中组合。
试剂盒的组分可以例如存在于一个或多个容器中，例如所有组分可以在一个容器中，或者例如酶可以在与模板分开的容器中。组分可以例如冻干、冷冻干燥，或在稳定的缓冲液中。在一个示例中，聚合酶和切口酶以冻干形式存在于单个容器中，并且模板经冻干、冷冻干燥或在缓冲液中而存在于不同容器中。或者，在另一个示例中，聚合酶、切口酶和模板以冻干形式存在于单个容器中。或者，可以将聚合酶和切口酶分离到不同的容器中。
试剂盒还可包括例如用于反应的dNTP，或用于反应的经修饰的核苷酸、比色皿或其他容器，或装有用于重新水化冻干组分的水或缓冲液的小瓶。所用的缓冲液可以例如既适合聚合酶活性又适合切口酶活性。
用于本发明方法的试剂盒还可包括用于执行本文所述一种或多种方法的使用说明和/或对本文所述的一种或多种组合物或试剂的描述。使用说明和/或描述可以为印刷形式，并且可以包含在试剂盒插页中。试剂盒还可包括提供此类使用说明或描述的互联网位置的书面说明。
试剂盒还可包括用于检测方法的试剂，诸如用于FRET的试剂、侧向流动装置、试纸条、荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标或聚苯乙烯珠粒。
本发明方法和本发明试剂盒的优点是它们可用于提供恒定温度的任何装置中，包括热循环仪、孵育烘箱、水浴和加热组合单元(heat block)。
使用捕获探针进行检测的方法包括例如使用包含与扩增产物链互补或基本上互补的序列的核酸分子(捕获探针)，从而使捕获探针与扩增的核酸结合。在某些实施方案中，探针可以与可检测标记连接，并且可以基于与扩增产物特异性杂交的探针的可检测标记来检测扩增产物。该反应可以例如还包含针对掺入或附接到捕获探针的分子的抗体。或者，例如，捕获探针或与捕获探针结合的分子可以掺入例如酶标记物，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶；荧光标记物，诸如荧光素或罗丹明，或例如具有化学发光或生物发光活性的其他分子。在一些实施方案中，探针与固体支持物连接，并且扩增产物链可以在本领域普通技术人员已知和选择的条件下特异性地固定到与固体支持物连接的捕获探针。在后面的实施方案中，可以使固定到固体支持物的扩增产物经历处理步骤，诸如洗涤、离子交换、从固体支持物释放、或其他处理步骤。在一些实施方案中，当扩增产物被固定到固体支持物上时，可以检测到所述扩增产物。本发明的实施方案还包括这些检测和分析方法的组合。
在又一个实施方案中，该方法还包括修改受试者的临床记录以鉴定该受试者被诊断为患有RSV感染。优选地，将临床记录存储在计算机可读介质中。
实施例
在以下实施例中进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。本领域的普通技术人员应理解，对于示例性测定，可以对反应的体积和形式、进行测定的时长以及每种反应物的量进行许多修改。
实施例1.在RSV基因组DNA附近
靶标选择
已开发出了靶向非结构基因NS2和基因N的NEAR测定，所述NEAR测定是专用于RSV的，同时跨多个RSV菌株显示出强保守性。使用从NCBF的核苷酸数据库(http://www.ncbi.nltn.nih.gov/nuccore)和基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome？db＝genome)可获得的序列数据来执行初始生物信息学分析。执行多次序列比对以鉴定保守区域。对所有表现出同源性的序列片段进行BLAST分析，以确定这些序列是否为RSV专有的。在进行BLAST分析之后，将被鉴定为RSV专有的所有序列用于模板集合生成(BLAST分析是使用核苷酸集合(nr/nt)数据库执行的)。模板集合是部分地通过使用内部自动化软件工具生成的。然后应用计算机过滤以完成模板集合的选择，以在实验室中进行筛选。通常，这些过滤标准涉及分析模板集合以获得可能降低测定性能的潜在相互作用，包括内部鉴定的可能会特别地影响NEAR性能的几个参数，以及大多数核酸扩增技术所共有的参数。使用这些过滤标准，选择出一组“RSV A”和“RSV B”模板以供筛选。
筛选过程导致开发出以下用于检测RSV的测定。所述测定扩增至少一个RSV靶核酸，即位于参考菌株NC_001803.1的核苷酸位置780-817处的非结构基因NS2；和/或位于参考菌株N2 KF893260.1的位置1220-1261处的核衣壳基因N。NS2基因编码非结构2蛋白(NS2)，所述NS2负责抑制宿主I型干扰素活性(有助于逃避免疫***)。N基因编码核衣壳蛋白，核衣壳蛋白有助于病毒复制和转录。
“RSV A”测定靶向RSV参考菌株NC_001803.1的核苷酸位置780-817(在NS2基因内)，并且“RSV B”测定靶向RSV参考菌株N2KF893260.1的核苷酸位置1220-1261。以下表1和表2中提供了测定模板、探针(分子信标)和产物序列。
表1.RSV A测定细节
表2.RSV B测定细节
为了确认测定靶序列在公共结构域中发现的所有相应的RSV A和RSV B序列之间是保守的，并且是RSV所专有的，执行多个序列比对和BLAST分析。这些序列的多重比对分析显示，对于RSV A和RSV B测定，在公共结构域中发现的所有序列均具有良好的同源性。在BLAST分析后，证实没有其他种属与RSV A靶序列和RSV B靶序列具有显著同源性。应注意的是，RSV A靶标确实显示出与RSV B基因组的显著同源性，并且RSV B靶标序列确实显示出与RSV A基因组的显著同源性。
RSV测试形式
RSV NEAR测定可以开发为在AlereTMi平台上运行。AlereTMi平台由以下组成：提供加热、混合和荧光检测以及自动结果输出的AlereTMi仪器；以及一组一次性用品，所述一组一次性用品由以下组成：样品接收器(存储洗脱/裂解缓冲液的地方)、测试基座(容纳两支装有冻干NEAR试剂的管)和转移盒(被设计用于将洗脱样品的100μl等分试样从样品接收器转移到位于测试基座中的两支装有冻干NEAR试剂的管中的每一个)。
RSV测定是一种两管测定—在一根管中进行RSV A靶标特异性测定，在第二根管中进行RSV B/内部对照(IC)双重测定(测试在测试基座中的AlereTMi仪器上并排进行)。
洗脱/裂解缓冲液(存储在样品接收器中)经设计用于允许RSV生物体从临床样品鼻/鼻咽拭子中快速释放，以及提供快速且有效的裂解(强酸)，同时还包含必要的盐以驱动NEAR测定(MgS04和(NH4)2S04两者)。
在测定开发期间，进行研究以比较2X对照3X对照4X体积的冻干混合物。根据这些研究，可以确定3X体积的混合物提供了性能和稳定性的最佳组合，因此选择3X混合物以进一步提高可行性。同样在测定开发期间，分析将洗脱/裂解缓冲液预热所需的时间长度。比较了1分钟、2分钟和3分钟的预热时间，并且根据这些数据得出的结论是，最佳表现的条件是3分钟的预热步骤。
图1和图2示出了使用纯化的病毒RNA，分别使用RSV A和RSV B测定执行的LOD研究的结果。将纯化的RNA储备液稀释至合适的浓度，以便将5μl的体积加入到100μl的补液缓冲液中提供适当的靶标拷贝数。使用标准的“热启动”方法在Stratagene Mx3005P热循环仪上执行反应。使用标准的NEAR“热启动”方法执行LOD研究，其中样品和冻干混合物均在56℃下预热3分钟，然后合并。从图1可以得出结论，当使用标准的“热启动”方法时，LOD是RSV A的纯化的病毒RNA的5个拷贝。从图2可以得出结论，当使用标准的“热启动”方法时，LOD是RSVB的纯化的病毒RNA的50个拷贝。
内部对照
内部对照(IC)的存在是POC诊断装置的必需组分。对于NEAR，内部对照提供以下验证：测定试剂功能正常且在测试期间未被灭活或抑制。当临床样品被称为“阴性”时，此为尤其重要的。为了确保“阴性”命名不是由于测定失败，而是由于事实上靶标生物不存在，IC是必不可少的。RSV测试是一种两管测试，其中在一根管中发生RSV A检测，并且在第二根管中发生RSV B检测。代替将对照掺入每个管中，将单个IC掺入含有RSV B测定的管中。IC体系由RSV B测定共享的一组模板、独特的短RNA寡核苷酸靶标和IC产物特异性分子信标(表2)组成。RNA寡核苷酸含有与靶模板集合的识别区互补的5'端和3'端，但是具有的间隔区不同于靶标的间隔区。简而言之，使用相同的模板集合来扩增靶标和IC两者。
冻干
为了提供可行的POC技术，用于RSV检测的试剂需要在环境温度(至多30℃)下或至少在2-8℃的温度下存储时稳定达较长时间段(例如，六个月至三十六个月)。为了提供这种水平的稳定性，需要将NEAR测定试剂冻干，然后进行包装，以最小化试剂对水分和氧气两者的暴露。
为此，将NEAR测定试剂混合在包含赋形剂葡萄糖和海藻糖的混合物中，并进行冷冻干燥。执行混合物组成和冷冻干燥方法的优化以产生合适的冻干混合物，所述冻干混合物保持活性，同时提供长期稳定性。选择的最终冻干混合组合物和冻干方法分别显示在下面的表3和表4中。RSV测试形式提供用于两支管，一支管提供RSV A靶标测定，另一支管提供RSV B测定和IC测定。这些试剂使用相同的冻干方法冷冻干燥，并包含基本上相同的试剂集合(不包括以下事实：每个试管均包含用于靶标和/或IC特异性扩增和检测的一组独特寡核苷酸)。
表3.RSV A和RSV B冻干混合物-试剂组成
| 试剂 | [1x]RSV A | [1x]RSV B+IC |
| 500Kd葡聚糖 | 1.67％ | 1.67％ |
| 海藻糖 | 33.3mM | 33.3mM |
| 水，无核酸酶 | - | - |
| Tris pH 9.0 | 40mM | 40mM |
| Tris pH 8.0 | 60mM | 60mM |
| Na<sub>2</sub>S0<sub>4</sub> | 25mM | 40mM |
| Triton X-100 | 0.02％ | 0.02％ |
| EDTA | 0.5mM | 0.5mM |
| dNTP | 0.3mM | 0.3mM |
| DTT | 2mM | 2mM |
| DNA pol I(MG79) | 3.6μg | 4.4μg |
| N.BspD6 I | 0.2μg | 0.2μg |
| EIAV RT | 2.4μg | 3.2μg |
| 50X T/MB | IX | IX |
| IC RNA | - | 40K拷贝 |
| 聚丙烯酸 | - | 20μg |
表4.RSV B冻干方法—热处理和干燥方案
两种混合物均以3X(33.3μl)冻干，这意味着将混合物以3X的浓度干燥，然后再重悬于100μl的体积中，以提供每种试剂的最终IX浓度。相对于如果使用IX混合物进行冷冻干燥，这种方法有效地将加入到每种混合物中的两种赋形剂(葡聚糖和海藻糖)的浓度降低了三倍。使冻干的NEAR材料的稳定性最大化的最终步骤是包装。一旦冻干过程完成，就将干燥的试剂暴露于相对湿度小于10％的气氛中，然后将其装在含有干燥剂的防潮和防氧箔袋中。然后可以将试剂贮藏较长的时间段，而不会明显损失性能。
RSV洗脱/裂解
为了检测RSV的存在，需要在靶标扩增和检测之前进行两个步骤，即从用于收集临床样品的拭子中洗脱下病毒，并在洗脱后将病毒裂解或贮藏在通用运输介质(UTM)中，以允许获取靶病毒RNA基因组。对于POC产物，洗脱和裂解必须高效、快速且简单。发明人开发了一种基于酸的洗脱和裂解缓冲液，所述缓冲液可从拭子中有效取出RSV病毒，并快速且有效地裂解病毒外壳以暴露出病毒基因组RNA来供用于NEAR扩增。缓冲液组成如表5所示。这些试剂为灵敏的NEAR性能提供足够的洗脱和裂解作用，如将在本文件的后续章节中显示的。
表5.洗脱/裂解缓冲液组成
| 试剂 | [] |
| 盐酸 | 20mM |
| Triton X-100 | 0.10％ |
| (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 15mM |
| MgSO<sub>4</sub> | 15mM |
| 水，无核酸酶 | - |
将洗脱/裂解缓冲液在AlereTMi仪器上预热3分钟，达到约42℃-45℃的温度。此时，将200μl的UTM等分试样加入到洗脱/裂解缓冲液中并混合，或将拭子短暂旋转(10秒)并在洗脱/裂解缓冲液中压榨(expressed)。如将在本文档后面的部分中所述，洗脱/裂解缓冲液已显示为从拭子中有效地洗脱/裂解RSV并裂解从UTM转移的RSV，从而使得能够在重新悬浮NEAR冻干物质后进行灵敏的NEAR扩增和检测。
实施例2.人类基因组DNA对RSV A/B NEAR测定性能的影响
NEAR技术的一种潜在抑制剂是人gDNA。当从有RSV感染症状的患者收集鼻拭子样品时，可能还会在拭子上收集到人gDNA(来自诸如白血细胞等免疫细胞，或来自局部上皮细胞)。为了评估人gDNA对RSV A、RSV B和RSV B+IC测定性能的影响，进行了一项研究，其中将不断增加量的纯化的人gDNA加入到每个测定中，并监测靶标和IC检测两者(图3A至图3D；图4A至图4D；以及图5)。
如图3A至图3D所示，当测试NTC反应时，由于荧光信号停留在基线水平而与人gDNA输入(每个反应0ng至1000ng)无关，所以人gDNA的存在不会产生假阳性。在RSV A测定LOD(5个拷贝)中，人gDNA的影响强。尽管在10ng人gDNA时仍可检测到靶标的5个拷贝，但高于此量的人gDNA的所有输入水平导致几乎完全抑制(图3B)。随着靶标拷贝数的增加，在存在更高水平的人gDNA的情况下，测定性能显著提高(图3C至图3D)，表明了靶标扩增与关键试剂的非特异性消耗之间存在竞争。随着靶标拷贝数的增加，关键试剂更有可能被消耗用于靶特异性扩增和检测，而不被用于对人gDNA的非特异性活性。
在图4A至图4D中，当测试NTC反应时，由于荧光信号停留在基线水平而与人gDNA输入(每个反应0ng至1000ng)无关，所以人gDNA的存在不会产生假阳性。在RSV B测定LOD(50个拷贝)中，人gDNA的影响强，其中人gDNA的所有输入水平导致实际上完全抑制(图4B)。随着靶标拷贝数的增加，在存在更高水平的人gDNA的情况下，测定性能显著提高(图4C至图4D)，表明了靶标扩增与关键试剂的非特异性消耗之间存在竞争(如上所述)。
在图5中，在靶标的0个拷贝(NTC反应)和不断增加量的人gDNA的存在下执行RSV B+IC测定。当被100ng的人gDNA的存在胁迫时，IC分析显示出非常好的性能。
实施例3.在AlereTM i-RSV A上分析反应性(纯化的RNA)
使用纯化的病毒RNA在AlereTMi仪器上进行RSV A分析反应性研究，以评定测定的灵敏度。将纯化的病毒RNA加入到预热的洗脱/裂解缓冲液(预热至45℃以模拟3分钟的预热步骤)，并将100μl的等分试样立即转移至冻干反应中以启动扩增和检测。在每个靶标拷贝数时，执行三次重复反应。实时监测荧光。对于RSV A，该测定能够检测纯化的RNA的5个拷贝，但在纯化的RNA的2个拷贝时，平行测定显示出高于基线的足够荧光信号(图6)。这些数据表明了纯化的RNA的5个拷贝对RSV A测定的灵敏度。该测定能够检测0.005pfu的纯化病毒，而在0.002pfu时，大部分平行测定经检测高于背景荧光水平(图7)。这些数据表明了0.005pfu的纯化的病毒对RSV A测定的灵敏度。
检测限(纯化病毒)—RSV A
为了确认RSV A测定的灵敏度，执行检测限(LOD)研究。研究开始于每个反应0.005pfu(在分析反应性测试期间测定的灵敏度极限，请参见h部分)。LOD定义为平行测定的95％可以被检测到最低靶标浓度。RSV A研究开始于每个反应0.005pfu，但是在20次平行测定研究期间，2次平行测定未被检测阳性，因此将靶标浓度增加到0.01pfu(增加两倍)。在0.01pfu时，所有平行测定均检测为阳性(图8)，因此LOD为0.01pfu/纯化病毒RNA(菌株A2)的反应。
实施例4.在AlereTM i-RSV B上的分析反应性(纯化的RNA)
使用纯化的病毒RNA在AlereTMi仪器上进行RSV B分析反应性研究，以评定测定的灵敏度。将纯化的病毒RNA加入到预热的洗脱/裂解缓冲液(预热至45℃以模拟3分钟的预热步骤)，并将100μl的等分试样立即转移至冻干反应中以启动扩增和检测。在每个靶标拷贝数时，执行三次重复反应。实时监测荧光。对于RSV B，该测定能够检测纯化的RNA的10-25个拷贝，但在纯化的RNA的5个拷贝时，没有一次平行测定显示出高于基线的充足荧光信号(图9)。这些数据表明了纯化的RNA的10-25个拷贝对RSV B测定的灵敏度。在图10中，该测定能够检测到0.02-0.05pfu的纯化病毒；在0.02pfu时，所有三次平行测定均显示弱荧光信号，而在0.01pfu时，大部分平行测定经检测高于基线荧光水平。这些数据表明了0.02-0.05pfu的纯化的病毒对RSV B测定的灵敏度。还在该项研究期间评定了IC性能，并且在所有情况下都提供了稳健的扩增/检测，其中所有平行测定均具有饱和信号(图11至图12)
AlereTM i上的检测限(纯化的病毒)—RSV B
为了确认RSV B测定的灵敏度，执行检测限(LOD)研究。研究开始于每个反应0.05pfu(在分析反应性测试期间测定的灵敏度极限，请参见h部分)。LOD定义为可以检测到19/20平行测定(95％)的最低靶标浓度。在每个反应0.05pfu时，检测到20/20平行测定为阳性(图13)，因此LOD为0.05pfu/纯化病毒RNA(菌株Bl)的反应。还在该项研究期间评定了IC性能，并且在所有情况下都提供了稳健的扩增/检测，其中所有平行测定均具有饱和信号(图14)。
实施例5.NTC可再现性
为确认当相应反应中不存在RSV靶标时，RSV A和RSV B测定不会产生假阳性结果，执行了NTC平行测定研究。对于每个测定，当实时监测荧光以确定是否观察到高于背景荧光水平的任何增加时，在AlereTMi仪器上筛选出了二十个NTC反应。在图15中，示出了RSV A的结果，并且在图16和图17中分别描绘了RSV B和IC测定的结果。RSV A和RSV B检测均未显示任何假阳性，表明所述检测稳定且假阳性不会成为预期的问题。数据还显示了IC体系的可再现性，因为所有平行测定样品均显示出强大的(饱和)IC扩增和检测。
包容性
分别使用RSV毒株A2和RSV毒株Bl开发RSV A和RSV B测定。这些菌株是作为纯化的病毒或纯化的RNA可商购获得的，从而使它们适合且便于用于开发工作。为确保RSV A和RSVB测定作用于开发菌株以外的其他菌株，购买并测试了另外的RSV菌株。对于RSV A，当使用开发菌株A2时，LOD经测定为纯化的RNA的5个拷贝。还对纯化的RNA的5个拷贝进行了A Long菌株测试，证实了在该靶标拷贝数下的检测是稳健的，表明RSV A测定可作用于各RSV A菌株(图18)。对于RSV B，当使用开发菌株Bl时，LOD经测定为0.5pfu的纯化病毒。还以0.5pfu的纯化病毒筛选了菌株B 9320和B 18537，并且数据证实在该靶标拷贝数下的检测是稳健的，表明RSV B测定可以跨多个RSV B菌株工作(图19)。
实施例6.交叉反应性
为了确保RSV A和RSV B测定均提供对RSV的特异性，使用常见的呼吸道感染性致病因子执行了一系列交叉反应性实验。以高靶标浓度筛选甲型流感病毒、乙型流感病毒和链球菌A细菌(常见的呼吸道疾病感染性致病因子)。使所使用的每个靶标的浓度有目的地高，以模拟最坏的情况，并且每个反应的最终浓度是基于向每个反应中加入2μl原料来确定的。以6e5 pfu/反应的甲型流感病毒、1e6 pfu/反应的乙型流感病毒和8e6 pfu/反应的链球菌A筛选RSV A测定和RSV B测定。使所使用的每个靶标的浓度有目的地高，以模拟最坏的情况，并且每个反应的最终浓度是基于向每个反应中加入2μl原料来确定的。每个靶标以三次重复反应进行测试，并且结果示出于图20A至图20B中。RSV A或RSV B测定未检测到甲型流感、乙型流感或链球菌A，表明这些测定提供良好的抗非RSV种属的特异性。对于RSV A，链球菌A的一次平行测定显示出饱和的荧光信号。随后通过ESI-MS对该样品进行分析，所述ESI-MS确认反应被RSV靶标/扩增子污染，因为所产生的产物是从RSV基因组扩增而产生的预期产物(该序列在Strep A基因组中不存在)。
除了针对非RSV种属测试RSV测定以确认特异性外，还针对RSV B靶标筛选RSV A测定，并针对RSV A靶标筛选RSV B测定。RSV A和RSV B靶序列彼此相似，并且预计有一定程度的交叉反应性。如图21A中所示，当用RSV B病毒攻击RSV A测定法时，尽管与RSV A病毒的检测相比灵敏度极大地降低，但是所述测定确实检测到了RSV B病毒。对于RSV A靶标，RSV A测定的LOD为0.01pfu/反应，而在本研究中，RSV A测定仅能够检测到介于400-4,000pfu/反应的RSV B靶标。类似地，当用RSV A病毒攻击RSV B测定时，该测定检测到RSV B病毒，但与RSV B病毒相比灵敏度再次降低(图2IB)。对于RSV B靶标，RSV B测定的LOD为0.5pfu/反应，但仅能够检测到介于10-100pfu/反应之间的RSV A靶标。
图22和图23中示出了RSV A测定的模板和分子信标组分与RSV A和RSV B靶标之间的比对(图22)，以及针对RSV B靶标和RSV A靶标的RSV B测定组分之间的比对(图23)。根据比对可以看出，RSV A靶序列与来自RSV B菌株的子集的基因组序列之间具有显著的同源性。显示的是与RSV A靶序列具有显著同源性的几种菌株(E值<le-04，表示来自前200个列表的前24个命中)。根据BLAST分析，没有其他RSV B菌株显示出与RSV A靶序列的显著同源性(其余的前200个命中(25至200个)均生成大于1的E值)。当使用RSV A试剂时，前面的RSVB命中一定提供足够的同源性，以产生RSV B的一定水平的扩增和检测。
与RSV A测定和RSV B靶标一样，RSV B测定与RSV A的基因组序列之间具有显著的同源性。图23中示出了与RSV B测定模板、分子信标和产物序列比对的代表性RSV A菌株。该RSV A菌株与前200个RSV A BLAST命中相同(所有命中的E值为3e-08)，指示RSV A基因组序列与RSV B测定靶序列具有非常高的同源性，表明将在某种程度上出现从RSV B基因组扩增。
实施例7.在临床基质存在下的测定性能
为了在临床基质存在下进行测试时提供有关RSV A和B测定性能的指示，将一系列匿名供体拭子作为合并样品进行测试。生成了三个池A、B和C，每个池分别由4个独立的匿名供体拭子组成。通过使拭子涡旋10秒并在从缓冲液中移出之前进行压榨，将每个拭子在2.5ml预热(3分钟)的洗脱/裂解缓冲液中洗脱。然后将拭子洗出液合并，以制成每次10ml的合并池。首先使用LOD病毒浓度筛选RSV A和RSV B测定，然后增加病毒浓度直至3/3平行测定产生“阳性”结果。数据表明临床基质可影响测定性能，并且影响变化很大。当用池A攻击时，RSV A测定无法检测到0.01pfu/反应(在不存在临床基质的情况下测定的LOD)，但是加倍至0.02pfu/反应可以以可再现的方式产生良好的扩增和检测。基质池B提供最小的抑制，因为RSV A测定很容易检测到0.01pfu/反应的所有平行测定。如图24中所示，用匿名供体拭子池C筛选的RSV A测定是抑制性最强的池，并且需要加入0.05pfu/反应(比测定的LOD高5倍)才能产生一致的阳性结果。
尽管当用池A、B和C攻击时，RSV B测定能够检测到0.5pfu/反应(不存在临床基质时该测定的LOD)，但是扩增和检测不强(图25)。基质池A是抑制性最高的池，其中只有一些平行测定显示出高于背景的荧光信号，而其他平行测定显示出微弱的信号。对于测试的三个基质池中的每一个，将靶标浓度提高到1pfu/反应都会导致强的扩增和检测，其中所有平行测定均产生饱和荧光信号(是测定的LOD的2倍高)。
使用RNaseP qPCR测定来定量每个基质池中存在的人gDNA的量。qPCR数据表明，每100μl的基质A、B和C样品中分别含有4.6ng、5.0ng和4.9ng的人gDNA。这些浓度不应抑制RSVA、RSV B或IC测定，因为当用与实施例2中的池相似的浓度攻击时，所述测定显示为良好地工作。还使用IDT的RNA酶Alert和DNA酶Alert试剂盒定性地测定每个池的RNA酶和DNA酶水平。这三个池显示出非常低的DNA酶水平，但是所有三个池都保留了显著的RNA酶活性，其中池B表现出最大的活性(数据未示出)。如图22和图23中所示，在每个池中发现的显著水平的RNA酶活性被认为是降低测定性能的主要原因，其中靶标输入必须增加到高于每个测定的LOD以提供良好的扩增和检测。
实施例8.临床样品研究
为了确定RSV A、RSV B和IC测定对临床样品的性能如何，使用在-80℃下冷冻保存的50个直接临床拭子样品，以及也在-80℃下冷冻保存的50个UTM样品。没有对样品进行表征，这意味着哪个样品(如果有的话)对RSV呈阳性是未知的。作为这项研究的一部分，对临床样品执行RSV A和RSV B测试，并通过执行RSV qPCR(用作“黄金标准”，以确定RSV+/-状态和拷贝数(如果适用的话))、RNA酶P qPCR(用于确定人gDNA含量)和RNA酶/DNA酶核酸酶测试(用于确定RNA酶和DNA酶活性水平)来进一步表征。
简而言之，通过先将每个拭子样品在2.5ml预热的洗脱/裂解缓冲液中洗脱，将所述拭子浸渍到所述缓冲液中，涡旋约10秒钟，压榨所述拭子，然后去除所述拭子，来筛选RSVA和RSV B NEAR测定。然后将洗脱液立即转移至仪器上已存在的冻干反应中，以启动扩增和检测。通过将200μl的UTM加入2.5ml预热的洗脱/裂解缓冲液中并短暂混合(通过上下吹打)来筛选UTM中的样品。然后将洗脱液立即转移至仪器上已存在的冻干反应中，以启动扩增和检测。将所有临床样品在使用前解冻并使其达到环境温度。
每个样品的辅助测试执行如下：从每种经洗脱/裂解的拭子洗脱液中使用140μl来分别纯化RNA和DNA。随后使用这些纯化的样品进行RSV A/B qPCR和人gDNA分析。从每个UTM样品中直接(在洗脱/裂解之前)使用140μl来分别纯化RNA和DNA。使用Qiagen QIAamp病毒RNA微型试剂盒(产品目录号52904)来进行核酸纯化。使用IDT RNA酶Alert(产品目录号11-02-01-02)和DNA酶Alert(产品目录号11-02-01-04)试剂盒执行RNA酶/DNA酶测试。在每个核酸酶测试中，从每个经洗脱/裂解的拭子洗脱液中取出1μl，并筛选该1μl的1:10稀释液。在每次核酸酶测试中，从每个UTM样品取出1μl，并筛选该1μl的1:10稀释液，然后进行洗脱/裂解。使用临床样品后，将等分试样在-80℃下冷冻。
下表(表6至表7)中汇总了来自上述所有测试的结果，并且包括每个样品的RSVNEAR命名(对于RSV A和/或RSV B的+/-)、RSV A/B qPCR命名(+/-)和RSV拷贝数、人gDNA浓度(以纳克为单位)和相对的RNA酶/DNA酶活性水平。因为在临床样品测试时尚未开发出具有限定的截止阈值的算法，所以RSV A/B NEAR命名是主观进行的(荧光信号>＝2X背景被视为+)。图26至图33描绘了所筛选的所有临床样品的实时荧光曲线的汇总。
表6 RSV临床样品测试汇总–直接拭子
表6.(续表)
表.7
表7.(续表)
更详细地说，在迄今为止筛选的100个临床样品中，38个临床样品通过qPCR被确定为阳性(9个RSV A，29个RSV B)，具有很广的滴度范围，得出患病率为38％。RSV A滴度的范围为497个拷贝/反应到1,881,600个拷贝/反应。RSV B滴度的范围为26个拷贝/反应到5,388,009个拷贝/反应。执行RSV A/B NEAR测定。除了低于测定的LOD的最低RSV B样品(26个拷贝/反应)外，RSV A和RSV B测定能够将所有qPCR阳性样品检测为NEAR阳性。这些结果提供了97.4％的整体灵敏度和100％的特异性。此外，没有无效命名，从而导致无效率为0％。如实施例6中应注意的，RSV A和B NEAR测定为彼此交叉反应的，并且这可以在临床样品测试中看到。在9个qPCR确认的RSV A阳性样品中，通过RSV B NEAR测定检测到1个为阳性。在29个qPCR确认的RSV B阳性样品中，通过RSV A NEAR测定检测到12个为阳性。
关于所筛选的临床样品的潜在抑制特性，每个样品中存在的人gDNA量从少至无可检测的gDNA极大地变化到每100μl NEAR反应中有1.6μg(表8)。
表8.每100μl临床样品洗脱液中的人gDNA含量
如使用定性RNA酶Alert分析所测量的，RNA酶活性也极大地变化。RNA酶活性水平主观地分为四个水平，高(4星)、中(3星)、低(2星)和极低(1星)。高RNA酶活性的命名是在RNA酶Alert分析中使信号饱和的结果。非常低的水平是在RNA酶Alert测定中信号略高于RNA酶活性的基线水平(阴性对照)的结果(表9)。总体而言，大多数临床样品具有大量的RNA酶活性，当靶标是RNA种属(诸如在RSV测试中)时，这可潜在地导致测定抑制。最后，在所测试的100个临床样品中，只有7个具有可测量的DNA酶活性，并且所有7个样品均具有非常低的DNA酶水平，表明在RSV抑制测试中这种潜在的抑制剂没有对鼻拭子发挥显著作用。
表9.每100μl临床样品洗脱液中的RNA酶含量
其他实施方案
应当理解，尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 爱奥尼安技术公司(IONIAN TECHNOLOGIES INC.)
<120> 呼吸道合胞病毒种属的切口产生和延伸扩增反应(NEAR)
<130> ALERE-35646/WO-1/ORD
<150> US 62/552,546
<151> 2017-08-31
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)
<400> 1
cgactcacac gagtcgaaaa cttgatgaaa ga 32
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)
<400> 2
agactccaca cggagtctag ttgaccagga atg 33
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)
<400> 3
accaggaatg taaatgtggc ctggt 25
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)
<400> 4
acttgatgaa agacaggcca catttacatt cctggtca 38
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)
<400> 5
tgaccaggaa tgtaaatgtg gcctgtcttt catcaagt 38
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞病毒B株N2 (Human respiratory syncytial virus B strainN2)
<400> 6
gactcgcaca cgagtcacgt agtacaggag ataa 34
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞病毒B株N2 (Human respiratory syncytial virus B strainN2)
<400> 7
gactccacac ggagtcgctt ttgcacatca taa 33
<210> 8
<211> 25
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<222> (14)..(14)
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<220>
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<211> 22
<212> DNA
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ccgtcaacca cacacctgac gg 22
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<212> RNA
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<400> 10
auuugcacau cauaaccaca caccugacgu uaucuccugu acuaca 46
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞病毒B株N2 (Human respiratory syncytial virus B strainN2)
<400> 11
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<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞病毒B株N2 (Human respiratory syncytial virus B strainN2)
<400> 12
ttgcacatca taattgggag tgtcaatatt atctcctgta ct 42
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人呼吸道合胞病毒B株N2 (Human respiratory syncytial virus B strainN2)
<400> 13
agtacaggag ataacgtcag gtgtgtggtt atgatgtgca a 41
<210> 14
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<400> 14
ttgcacatca taaccacaca cctgacgtta tctcctgtac tdsncsdncn dtnrsvatma 60
ttcgactcac acgagtcgaa aacttgatga aaganmrsva tmattmagac tccacacgga 120
gtctagttmg maccaggaat gnmrsvmcar bacnmbrmac caggaatgmt aaamtgtggm 180
cctggtnmrs vaacttgatg aaagacaggc cacatttaca ttcctggtca rsvatgacca 240
ggaatgtaaa tgtggcctgt ctttcatcaa gtmmthymdd nctdmrcdsm ddnctdndtn 300
mncatrbdsa crsncrtarg trdcttabrs vbassaydta sdsncsdncn dtnrsvbtma 360
ttgactcgca cacgagtcac gtagtacagg agataanmrs vbtmattgac tccacacgga 420
gtcgcttttg cacatcataa nmrsvbmcar bacnmbrmtg acacatcata amttgggmag 480
tgtcanmrsv bntrnacntr cmcarbacnm bamccgtcaa ccacacacct gacggnmrsv 540
bcagcacaca aaccacacac cgacgacccg acacakcsrs vbagtacagg agataatatt 600
gacactccca attatgatgt gcaarsvbtt gcacatcata attgggagtg tcaatattat 660
ctcctgtact rsvbcagtac aggagataac gtcaggtgtg tggttatgat gtgcaarsvb 720
cttgcacatc ataaccacac acctgacgtt atctcctgta ctmmthymdd nctdmrcdsm 780
ddnctdndtn mncatrhshr thatbndbds acrsncrtar gtrdctndrn dsacrsncrn 840
trnacntrcr dcttacssac rsncntrnac ntrctargt 879
Claims (52)
1.一种组合物，所述组合物包含：
i)第一正向模板，所述第一正向模板包含核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS2基因反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；以及
ii)第一反向模板，所述第一反向模板包含核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与RSV非结构NS2基因有义链的3'末端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；或者
iii)第二正向模板，所述第二正向模板包含核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；以及
iv)第二反向模板，所述第二反向模板包含核酸序列，所述核酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N有义链的3'末端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中在所述3'端的与所述RSV非结构NS2基因反义链的所述3'端互补的所述识别区的长度为8-30个核苷酸，和/或
其中在所述3'端的与所述RSV核衣壳基因N反义链的所述3'端互补的所述识别区的长度为8-30个核苷酸。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中在所述3'端的与所述RSV非结构NS2基因有义链的所述3'端互补的所述识别区的长度为8-30个核苷酸，和/或
其中在所述3'端的与所述RSV核衣壳基因N有义链的所述3'端互补的所述识别区的长度为8-30个核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中包含i)和ii)的所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与所述RSV非结构NS2基因核苷酸序列互补的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中包含iii)和iv)的所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与所述RSV核衣壳基因N核苷酸序列互补的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中
所述第一正向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:1(CGACTCACACGAGTCGAAAACTTGATGAAAGA)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；并且
所述第一反向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO 2:(AGACTCCACACGGAGTCTAGTTGACCAGGAATG)具有至少80％，至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
7.根据权利要求2-4和6中任一项所述的组合物，其中包含i)和ii)的所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3(ACCAGGAATGTAAATGTGGCCTGGT)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
8.根据权利要求1-3和5中任一项所述的组合物，其中
所述第二正向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:6(GACTCGCACACGAGTCACGTAGTACAGGAGATAA)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；
所述第二反向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO 7:(GACTCCACACGGAGTCGCTTTTGCACATCATAA)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
9.根据权利要求1-3、5和8中任一项所述的组合物，其中包含iii)和iv)的所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:8(TGACACATCATAATTGGGAGTGTCA)具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，所述组合物还包含DNA聚合酶、一种或多种切口酶、dNTP、或dNTP和ddNTP的混合物中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述DNA聚合酶选自由以下组成的组：Geobacillus bogazici DNA聚合酶、Bst(大片段)、外切DNA聚合酶、Manta 1.0DNA聚合酶
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述一种或多种切口酶选自由以下组成的组：Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.Btsl、Nt.Alwl、Nt.BbvCi、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BpulOI、Nt.BpulOI和N.BspD61。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冻干的。
14.根据权利要求4、5、7或9中任一项所述的组合物，其中所述探针缀合至可检测标记。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述可检测标记选自由以下组成的组：荧光团、酶、猝灭剂、酶抑制剂、放射性标记、结合对的成员，以及它们的组合。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述第一正向模板、所述第一反向模板、所述第二正向模板或所述第二反向模板中的一者或多者包括一个或多个经修饰的核苷酸、间隔区、或封端基团。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中至少一个经修饰的核苷酸包括2'修饰。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中至少一个经修饰的核苷酸包含2'-0-甲基。
19.一种检测生物样品中是否存在RSV的方法，其中所述方法包括：
使所述生物样品与包含以下物质的组合物接触
i)第一正向模板，所述第一正向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV非结构NS2基因反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；
ii)第一反向模板，所述第一反向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV非结构NS2基因有义链的3'末端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区；
iii)至少一种切口酶；以及
iv)DNA聚合酶；
在核酸扩增反应中扩增所述靶核苷酸序列以提供扩增产物；以及
检测所述扩增产物是否存在。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种切口酶包括
第一切口酶，所述第一切口酶能够在所述第一正向模板的所述切口产生位点处产生切口，并且不在所述RSV非结构NS2基因反义链中产生切口，和/或
第二切口酶，所述第二切口酶能够在所述第一反向模板的所述切口产生位点处产生切口，并且不在所述RSV非结构NS2基因有义链内产生切口，其中所述第一切口酶和所述第二切口酶可以相同或不同。
21.根据权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与所述RSV非结构NS2基因核苷酸序列互补的核苷酸序列。
22.一种检测生物样品中是否存在RSV的方法，其中所述方法包括：
使所述生物样品与包含以下物质的组合物接触
i)第二正向模板，所述第二正向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N反义链的3'端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区，
ii)第二反向模板，所述第二反向模板包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括在3'端的与RSV核衣壳基因N有义链的3'末端互补的识别区；在所述识别区上游的切口酶结合位点和切口产生位点；以及在所述切口产生位点上游的稳定化区，
iii)至少一种切口酶；以及
iv)DNA聚合酶；
在核酸扩增反应中扩增所述靶核苷酸序列以提供扩增产物；以及
检测所述扩增产物是否存在。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种切口酶包括
第一切口酶，所述第一切口酶能够在所述第二正向模板的所述切口产生位点处产生切口，并且不在所述RSV核衣壳基因N反义链中产生切口，和/或
第二切口酶，所述第二切口酶能够在所述第二反向模板的所述切口产生位点处产生切口，并且不在所述核衣壳基因N有义链内产生切口，
其中所述第一切口酶和所述第二切口酶可以相同或不同。
24.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与所述RSV核衣壳基因N核苷酸序列互补的核苷酸序列。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中在基本上等温的条件下执行扩增。
26.根据权利要求19-21和25中任一项所述的方法，其中
所述第一正向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；并且
所述第一反向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
27.根据权利要求19-21、26中任一项所述的方法，其中所述探针寡核苷酸包含与SEQID NO:3具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
28.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中
所述第二正向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；并且
所述第二反向模板的所述核酸序列包含与SEQ ID NO 7具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
29.根据权利要求22-24和28中任一项所述的方法，其中所述探针寡核苷酸包含与SEQID NO:8具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
30.根据权利要求19-29中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含dNTP，或dNTP和ddNTP的混合物。
31.根据权利要求19-30中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶选自由以下组成的组：Geobacillus bogazici DNA聚合酶、Bst(大片段)、外切DNA聚合酶、Manta 1.0DNA聚合酶
32.根据权利要求19-31中任一项所述的方法，其中所述第一正向模板和所述第一反向模板、所述第二正向模板和所述第二反向模板包含被相同的至少一种切口酶识别的切口酶结合位点。
33.根据权利要求19-32中任一项所述的方法，其中所述至少一种切口酶选自由以下组成的组：Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.Bsml、Nb.BsrDI、Nb.Btsl、Nt.Alwl、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BpulOI、Nt.BpulOI和N.SBspD61。
34.根据权利要求21、24、27或29中任一项所述的方法，其中所述探针缀合至可检测标记。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述可检测标记选自由以下组成的组：荧光团、酶、猝灭剂、酶抑制剂、放射性标记、结合对的成员，以及它们的组合。
36.根据权利要求19-35中任一项所述的方法，其中所述至少一种切口酶在所述切口酶结合位点的下游产生切口。
37.根据权利要求19-36中任一项所述的方法，所述方法任选地包括在扩增之前从所述生物样品中提取/分离核酸。
38.根据权利要求19-37中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自粪便、口腔/咽喉拭子、唾液、脓液、痰、血液和尿液，或其中生物样品来自受感染或未受感染的组织。
39.根据权利要求19-38中任一项所述的方法，其中所述第一正向模板、所述第一反向模板、所述第二正向模板或所述第二反向模板中的一者或多者包括一个或多个经修饰的核苷酸、间隔区、或封端基团。
40.根据权利要求39所述的方法，其中至少一个经修饰的核苷酸包括2'修饰。
41.根据权利要求40所述的方法，其中至少一个经修饰的核苷酸包含2'-0-甲基。
42.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
模板寡核苷酸，所述模板寡核苷酸选自由以下组成的组：
(a)第一正向模板，所述第一正向模板包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；以及
第一反向模板，所述第一反向模板包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或者
(b)第二正向模板，所述第二正向模板包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列；以及
第二反向，所述第二反向包含与SEQ ID NO 7具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述试剂盒(a)还包括探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
44.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述试剂盒(b)还包括探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。
45.根据权利要求42所述的试剂盒，所述试剂盒还包括拭子。
46.根据权利要求42所述的试剂盒，所述试剂盒还包括使用所述试剂盒的使用说明。
47.根据权利要求42所述的试剂盒，所述试剂盒还包括dNTP、或dNTP和ddNTP的混合物中的一种或多种。
48.根据权利要求42所述的试剂盒，所述试剂盒任选地包括用于从生物样品中提取/分离核酸的试剂。
49.根据权利要求42-48中任一项所述的试剂盒，其中所述模板寡核苷酸包括一种或多种经修饰的核苷酸、间隔区、或封端基团。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中至少一个经修饰的核苷酸包括2'修饰。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中至少一个经修饰的核苷酸包含2'-0-甲基。
52.根据权利要求42所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶。
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