CN111398453A - 一种同时检测当归中有效成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测当归中有效成分含量的方法，所述有效成分包括有机酸类、苯酞类、氨基酸类、香豆素类；该方法包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和样品检测。本发明建立的方法，首次对当归中有机酸类、苯酞类、氨基酸类、香豆素类的指标性成分进行同时检测，实现对当归药材质量进行更加全面的评价和控制。本发明选择的检测指标均为当归药材中含量较高，且具有药理活性的成分。能够为当归药材临床应用的安全性及有效性提供依据。节约了检测时间和成本，不仅准确且简单易行。本发明稳定性好，重复性好，回收率高，具有较强的专属性。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时检测有效成分含量的方法，具体涉及一种同时检测当归中有效成分含量的方法，属于中药材质量检测领域。
背景技术
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，主产于甘肃，在云南、四川、湖北等省也有种植，近年来，随着当归市场需求量的增加，除道地产区甘肃当归以外，由于云当归的优良品质，也逐渐成为了当归市场的重要组成部分，种植面积在不断扩大。目前市场上除“岷归”外，大多销售的为“云当归”。当归作为一种药食两用的药材，用药历史悠久，临床应用广泛，具有补气止血、行血、养血、和血之功。
当归的化学成分主要包括有机酸类、苯酞类、香豆素类等，还有一些氨基酸类成分。其中阿魏酸是当归有机酸的主要活性成分，具有抗炎、抗老年痴呆、补血活血等多种功效；绿原酸具有保肝、利胆、抗肿瘤、抗病毒等广泛的药理活性。苯酚酞类化合物包括藁本内酯、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I、丁烯基苯酞等，是当归挥发油的主要成分，其中藁本内酯的含量最高，该类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抑制血管生成、消炎解痛等多种药理作用。香豆素类化合物包括蛇床子素、补骨脂素、异欧前胡素、香柑内酯、欧前胡素等，该类化合物具有抗肿瘤、抗高血压、抗心肌缺血、抗炎、止痛等多种药理活性。色氨酸是一种人体必需的氨基酸，人体自身无法合成。
当归化学成分丰富，现有的标准以单一的成分阿魏酸作为检测指标，比较单一，不能全面的反映当归药材的质量，不利于当归药材的质量控制以及当归使用的安全性和稳定性。目前关于当归多成分的含量测定方法已有文献报道，HPLC的检测方法做到了阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z－藁本内酯、亚油酸5成分的同测，UPLC的检测方法做到了9种酚酸(酯)类及苯酞类成分的同测。但是当归药材的活性成分不只有酚酸酯类和苯酞类。
因此，在已有研究基础上，建立一种快速、全面、针对性强的当归药材的质量检测方法具有重要的意义。
发明内容
为了全面的对当归药材质量进行控制，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中当归药材检测指标单一，不利于当归药材的质量控制，进而提供一种快速、全面、针对性强的当归药材的检测方法。本发明技术方案具体如下：
一种同时检测当归中有效成分含量的方法，所述有效成分包括有机酸类、苯酞类、氨基酸类、香豆素类；该方法包括以下步骤：
步骤(1)、供试品溶液的制备：
取本品粉末，精密称定，精密加入甲醇，密塞，称定重量，超声或回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.4μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得到供试品溶液；
步骤(2)、对照品溶液的制备：
精密称取待检测成分的对照品适量，加50％～100％甲醇配制成对照品溶液；步骤(3)、样品检测：
色谱条件如下：
色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，流速为0.5～2mL/min，柱温为20℃～40℃；检测波长为260nm～316nm中的一个或两个波长；进样量5～20μl；流动相为甲醇或乙腈与甲酸水溶液或磷酸水溶液组成的混合溶剂；甲酸或磷酸水溶液含甲酸或磷酸的浓度为0.01％～0.5％；按下表进行梯度洗脱；
分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定。
进一步地，所述有效成分为当归药材中色氨酸(Tryptophan)、绿原酸(Chlorogenic Acid)、阿魏酸(Ferulic Acid)、洋川芎内酯I(Senkyunolide I)、洋川芎内酯H(Senkyunolide H)、欧前胡素(Imperatorin)、Z-藁本内酯(Z-Ligustilide)和丁烯基苯酞(Butylidenephthalide)。
进一步地，步骤(1)中，将本品粉末过三号筛，取0.2～5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％～100％甲醇20～50mL，密塞，称定重量，超声或回流30～60分钟，放冷，再称定重量，用70％～100％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。
进一步地，步骤(2)中，每1mL对照品溶液含色氨酸4.22～84.40μg、绿原酸6.02～120.40μg、阿魏酸4.60～92.00μg、洋川芎内酯I1.27～25.30μg、洋川芎内酯H0.44～8.72μg、欧前胡素16.08～321.60μg、Z-藁本内酯44.00～880.00μg、丁烯基苯酞4.11～82.26μg的溶液。
进一步地，步骤(2)中，每1mL对照品溶液含色氨酸50μg、绿原酸70μg、阿魏酸55μg、洋川芎内酯I16μg、洋川芎内酯H5μg、欧前胡素190μg、Z-藁本内酯500μg、丁烯基苯酞50μg的溶液，即得。
进一步地，步骤(3)中，色谱条件：流速1.0mL/min，柱温30℃；检测波长280nm；进样量10μl；流动相为：A-乙腈，B-0.085％甲酸或磷酸水溶液；按下表进行梯度洗脱。
通过以下实验研究对本发明进行进一步说明。
(1)色谱柱的选择：根据本发明建立的HPLC检测方法所选的检测指标包括大极性、中等极性及小极性的成分，且均为脂溶性化合物，所以选择反相C18色谱柱。
(2)检测波长的选择：对色氨酸等8个成分进行全波长扫描，结果色氨酸在227nm、280nm处；绿原酸在327nm、296nm处；阿魏酸在320nm、280nm处；洋川芎内酯I在212nm、280nm处；洋川芎内酯H在214nm、280nm处；欧前胡素在248nm、301nm处、Z-藁本内酯在280nm、320nm处、丁烯基苯酞在226nm、260nm处有最大吸收，综合上述各成分的最大吸收波长，同时兼顾含量较低的成分，最终决定选用260～316nm中的一个或两个波长作为检测波长。
(3)流动相***的选择：以乙腈(A)-磷酸(B)溶液、乙腈-甲酸(B)溶液的流动相***为因素进行考察，结果发现，使用不同流动相***，对各有效成分的峰形及分离度影响不同，两个流动相***下各成分分离度、拖尾因子、理论塔板数均较好，其中乙腈(A)-磷酸(B)溶液流动相***下各成分分离度、拖尾因子、理论塔板数均更佳，可采用上述流动相***。
(4)供试品的处理方式选择：由于所选检测指标大极性、中等极性、小极性的成分均有，其中还包括热不稳定性成分，综合考虑各成分的化学性质，初步选定对50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇三种溶剂，超声和回流提取两种方式进行考察。结果发现50％～100％甲醇为溶剂，均能将所检测成分提取完全，故选用50％～100％甲醇作为提取溶剂。
(5)色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.085％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温30℃。
(6)专属性实验：在相同试验条件下，采用混合对照品溶液和当归供试品溶液作对照，以70％甲醇溶液作阴性对照。参照步骤(5)所述方法进行测定。结果混合对照品溶液各成分的峰出现在含有当归原药材的供试品溶液中，而在阴性对照溶液中不出现，表明该实验方法具有专属性，混合对照品溶液结果如图1所示，当归供试品溶液结果如图2所示，阴性对照溶液结果如图3所示。
(7)线性关系：取各对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇溶解，配制成每1mL含色氨酸84.40μg、绿原酸120.40μg、阿魏酸92.00μg、洋川芎内酯I25.30μg、洋川芎内酯H8.72μg、欧前胡素321.60μg、Z-藁本内酯880.00μg、丁烯基苯酞82.26μg的溶液，作为对照品储备液。
分别精密吸取0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10mL混合对照品储备液置10mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取各混合对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，参照步骤(5)所述方法测定，结果色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞分别在4.22～84.40μg/mL、6.02～120.40μg/mL、4.60～92.00μg/mL、1.27～25.30μg/mL、0.44～8.72μg/mL、16.08～321.60μg/mL、44.00～880.00μg/mL、4.11～82.26μg/mL范围内具有良好的线性关系；结果见表1。
表1线性关系考察结果
(8)精密度考察：精密量取专属性考察项下混合对照品溶液10μl，参照(5)所述方法注入液相色谱仪，连续进样6次测定。结果表明各成分的RSD％在0.43～2.04之间。表明仪器精密度好，结果见表2。
表2精密度实验结果表
(9)重复性考察：制备6份平行供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，参照(5)所述方法测定。结果表明：各成分RSD％在1.18～1.99之间，重复性好。结果见表3。
表3重复性实验结果表
(10)稳定性考察：制备供试品溶液，分别于0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h精密吸取上述溶液10μl，注入液相色谱仪。按(5)所述方法测定，结果表明供试品溶液在室温放置12h内稳定，RSD％在0.98～2.08之间。结果见表4。
表4稳定性实验结果表
(11)加样回收率试验：精密称取当归药材粉末(过三号筛)(色氨酸含量0.0832％、绿原酸含量0.0410％、阿魏酸含量0.1286％、洋川芎内酯I含量0.0354％、洋川芎内酯H含量0.0054％、欧前胡素含量0.1339％、Z-藁本内酯含量1.7182％、丁烯基苯酞含量0.0481％)6份，每份约0.5g，精密称定，加入混合对照品储备液2mL(1mL含色氨酸208.4μg、绿原酸101.2μg、阿魏酸323.2μg、洋川芎内酯I88.0μg、洋川芎内酯H13.08μg、欧前胡素336.0μg、Z-藁本内酯4300.00μg、丁烯基苯酞122.4μg)，置250mL具塞锥形瓶中，加70％甲醇18mL，称定重量，密塞，加热回流30min，放冷，再次称定重量，70％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。取6份供试品溶液，根据步骤(5)所述条件测定色氨酸等8个成分的峰面积，计算各成分的含量、回收率。结果各成分平均回收率在97.60％～101.22％，RSD％在0.89～2.51之间。表明加入的对照品能准确地回收，测定方法准确可靠。试验结果见表5。
表5加样回收结果表
(12)耐用性实验：制备供试品溶液3份，精密吸取供试品溶液10μl，分别在不同变动因素：设备、色谱柱、柱温下分别进样，记录色氨酸等8个成分的峰面积，计算含量，考察色谱条件的耐用性。结果各条件下，各成分含量的RSD％值均小于3％，表明该色谱条件耐用性良好。结果见表6。
表6耐用性实验结果表
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明建立的当归药材的HPLC含量测定方法，首次对当归中有机酸类、苯酞类、氨基酸类、香豆素类的指标性成分进行同时检测，实现对当归药材质量进行更加全面的评价和控制。本发明操作简便，适用性好，能稳定的用于当归药材的含量测定。且本发明选择的检测指标均为当归药材中含量较高，且具有药理活性的成分。能够为当归药材临床应用的安全性及有效性提供依据。
(2)本发明选择的检测指标色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞，它们既是当归药材中有机酸类、苯酞类、香豆素类、氨基酸类的代表性化学成分，也是主要的药理活性成分。本发明首次通过高效液相色谱法同时检测阿魏酸等8个成分的含量，节约了检测时间和成本，不仅准确且简单易行。实现了对当归药材质量的全面评价和控制，从而为当归药材临床用药的有效性、安全性提供了保障。本发明稳定性好，重复性好，回收率高，具有较强的专属性。
附图说明
图1为专属性实验中混合对照品溶液的液相色谱图；
图2为专属性实验中当归药材样品溶液的液相色谱图；
图3为专属性实验中阴性对照溶液的液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的同时检测当归中有效成分含量的方法，通过HPLC测定云南维西当归药材中的色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞含量。具体包括如下步骤：
步骤(1)对照品溶液的制备：
精密称取色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞对照品适量，加70％甲醇配制成每1mL含色氨酸50μg、绿原酸70μg、阿魏酸55μg、洋川芎内酯I16μg、洋川芎内酯H5μg、欧前胡素190μg、Z-藁本内酯500μg、丁烯基苯酞50μg的溶液，即得。
步骤(2)供试品溶液的制备：
取不同产地试验样品，取本品粉末(过三号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.4μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤(3)样品检测：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0mL/min，以乙腈为流动相A，以0.085％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温30℃。
分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本实施例的当归样品产地及含量测定结果见表7。
表7当归样品含量测定结果
根据含量检测结果来看，该法可稳定用于当归药材含量检测。
实施例2
本实施例的同时检测当归中有效成分含量的方法，通过HPLC测定维西当归药材中的色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞含量。具体包括如下步骤：
步骤(1)对照品溶液的制备：
精密称取色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞对照品适量，加100％甲醇配制成每1mL含色氨酸4.22μg、绿原酸6.02μg、阿魏酸4.60μg、洋川芎内酯I1.27μg、洋川芎内酯H0.44μg、欧前胡素16.8μg、Z-藁本内酯44.0μg、丁烯基苯酞4.11μg的溶液，即得。步骤(2)供试品溶液的制备：
取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入100％甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定重量，用100％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.4μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤(3)样品检测
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速2.0mL/min，以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm；柱温20℃。
分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本实施例的当归样品产地及含量测定结果见表8。
表8当归样品含量测定结果表
根据含量检测结果来看，该法可稳定用于当归药材含量检测。
实施例3
本实施例的同时检测当归中有效成分含量的方法，通过HPLC测定甘肃，云南丽江、瑞丽、大理当归药材中的色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞含量。包括如下步骤：
步骤(1)对照品溶液的制备：
精密称取色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞对照品适量，加50％甲醇配制成每1mL含色氨酸84.40μg、绿原酸120.40μg、阿魏酸92.00μg、洋川芎内酯I25.30μg、洋川芎内酯H8.72μg、欧前胡素321.60μg、Z-藁本内酯880μg、丁烯基苯酞82.26μg的溶液，即得。
步骤(2)供试品溶液的制备：
取不同产地试验样品，取本品粉末(过三号筛)约5.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇30mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.4μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤(3)样品检测：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速0.5mL/min，以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm、316nm；柱温40℃。
(4)测定法：分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
(5)结果：当归样品产地及含量测定结果见表9。
表9当归样品含量测定结果
根据含量检测结果来看，该法可稳定用于当归药材含量检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种同时检测当归中有效成分含量的方法，其特征在于：所述有效成分包括有机酸类、苯酞类、氨基酸类、香豆素类；该方法包括以下步骤：
步骤（1）、供试品溶液的制备：
取本品粉末，精密称定，精密加入甲醇，密塞，称定重量，超声或回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.4μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
步骤（2）、对照品溶液的制备：
精密称取待检测成分的对照品适量，加50%~100%甲醇配制成对照品溶液；
步骤（3）、样品检测：
色谱条件如下：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.5~2mL/min，柱温为20℃~40℃；检测波长为260nm~316nm中的一个或两个波长；进样量5~20μl；流动相为甲醇或乙腈与甲酸水溶液或磷酸水溶液组成的混合溶剂；甲酸或磷酸水溶液含甲酸或磷酸的浓度为0.01%~0.5%；按下表进行梯度洗脱；
分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5~20μL，注入液相色谱仪，测定。
2.根据权利要求1所述的同时检测当归中有效成分含量的方法，其特征在于：所述有效成分为当归药材中色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z-藁本内酯和丁烯基苯酞。
3.根据权利要求1所述的同时检测当归中有效成分含量的方法，其特征在于：
步骤（1）中，将本品粉末过三号筛，取0.2~5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%~100%甲醇20~50mL，密塞，称定重量，超声或回流提取30~60分钟，放冷，再称定重量，用50%~100%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.4μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求2所述的同时检测当归中有效成分含量的方法，其特征在于：步骤（2）中，每1mL对照品溶液含色氨酸4.22~84.40μg、绿原酸6.02~120.40μg、阿魏酸4.60~92.00μg、洋川芎内酯I1.27~25.30μg、洋川芎内酯H0.44~8.72μg、欧前胡素16.08~321.60μg、Z-藁本内酯44.00~880.00μg、丁烯基苯酞4.11~82.26μg的溶液。
5.根据权利要求4所述的同时检测当归中有效成分含量的方法，其特征在于：步骤（2）中，每1mL对照品溶液含色氨酸50 μg、绿原酸70 μg、阿魏酸55 μg、洋川芎内酯I16 μg、洋川芎内酯H5 μg、欧前胡素190 μg、Z-藁本内酯500 μg、丁烯基苯酞50 μg的溶液，即得。
6.根据权利要求4所述的同时检测当归中有效成分含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，色谱条件：流速1.0mL/min，柱温30℃；检测波长280nm；进样量10μl；流动相为：A-乙腈，B-0.085%甲酸或磷酸水溶液；按下表进行梯度洗脱
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20200710 |
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