CN111394400B

CN111394400B - Sct1基因在长链二元酸生产中的应用

Info

Publication number: CN111394400B
Application number: CN201910005770.8A
Authority: CN
Inventors: 刘文波; 周豪宏; 徐敏; 杨晨; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2019-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2039-01-03
Also published as: CN111394400A

Abstract

本发明提供SCT1基因在长链二元酸生产中的应用，所述应用包括通过基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的SCT1基因或其同源基因，并利用改造后的工程菌进行长链二元酸的发酵生产。改造后的工程菌与改造前的长链二元酸生产菌株相比，发酵结束后的发酵液中酰基甘油酯的杂质的质量比率显著降低。低酰基甘油酯的杂质含量的长链二元酸在很大程度上降低了二元酸后期的提取纯化、废水处理工艺的难度，简化工艺并节约了能耗；同时，有利于提高下游产品的质量。

Description

SCT1基因在长链二元酸生产中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及SCT1基因在长链二元酸生产中的应用。

背景技术

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。其作为一种重要的单体原料，广泛用于合成尼龙、树脂、热熔胶、粉末涂料、防腐剂、香料、润滑剂、塑化剂等。

微生物发酵法生产长链二元酸，因其产生的污染低、对环境友好，能够合成化学合成方法难以合成的产物如12碳以上的长链二元酸，产物纯度相对较高以及由此带来的提取纯化成本的降低等特点，近年来已经逐渐取代化学合成法，成为长链二元酸生产的主要途径。

采用基因工程的手段可以对菌株进行有针对性的遗传改造，从而获得产率更高的优良菌株。长链二元酸微生物发酵法生产方法主要为烷烃经ω-氧化生成。继而又可以经过β-氧化途径而被降解。以往的研究多集中于敲除酰基辅酶A氧化酶以及敲除酰基辅酶A氧化酶POX基因以阻断β-氧化途径使产物得以积累及过量表达P450氧化酶和CPR细胞色素氧化还原酶基因以提高ω-氧化效率(Mol.Cell.Biol.,11(9),4333-4339,1991)。

尽管微生物发酵法生产长链二元酸较传统化学法产生的二元酸纯度高，但发酵过程中仍然会由于中间代谢产物的氧化速率以及运输和积累的协调性导致代谢副产物的过度积累，如脂肪酸过度积累可能会产生的二酰基甘油酯(DAG)和三酰基甘油酯(TAG)等。DAG和TAG是由甘油和两分子或三分子脂肪酸酯化而成，是细胞内中性脂肪的主要存在形式；通常在能量过剩时产生，作为能量物质储存。这类杂质的存在会给后续的提取纯化工艺带来诸多挑战，导致成本提高和以及由纯化步骤带来的产率降低。同时长链二元酸产品或粗品因存在杂质而造成的产品质量问题给下游工艺造成了巨大困扰，在一定程度上影响了生物法长链二元酸产业的发展。

目前，采用基因工程的手段改造二元酸生产菌株以降低酰基甘油含量的研究尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供SCT1基因在长链二元酸生产中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供SCT1基因在长链二元酸生产中的应用，所述应用包括通过基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的SCT1基因或其同源基因，并利用改造后的工程菌进行长链二元酸的发酵生产。

其中，所述基因工程手段包括但不限于同源重组的方式。

在酵母细胞中，DAG与TAG合成组装的第一步由3-磷酸-甘油酰基转移酶SCT1(EC2.3.1.15)催化，是三磷酸甘油进入酰基甘油合成的关键步骤。

不同微生物物种来源的3-磷酸-甘油酰基转移酶的氨基酸序列比对结果见图2。

第二方面，本发明提供产长链二元酸的工程菌是改造后的工程菌，所述改造后的工程菌是利用基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的SCT1基因或其同源基因得到的。

本发明所述长链二元酸生产菌株选自棒状杆菌属(Corynebacterium)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyce)、耶氏酵母属(Yarrowia)中的菌种；优选假丝酵母属菌种；更优选热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

所述长链二元酸选自C9～C22长链二元酸，优选C9～C18长链二元酸，包括癸二酸或称为十碳二元酸(DC10)、十一碳二元酸(DC11)、十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)、十四碳二元酸(DC14)、十五碳二元酸(DC15)、十六碳二元酸(DC16)、十七碳二元酸(DC17)、十八碳二元酸(DC18)中的至少一种。

在本发明的一个具体实施方式中，发酵使用的菌株为一株产长链二元酸的工程菌630，所述工程菌630是通过同源重组方法敲除保藏号为CCTCC NO：M 2011192的热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145基因组内一个拷贝的SCT1基因而得到。所述热带假丝酵母CAT N145已于2011年6月9日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)。

在本发明的另一个具体实施方式中，发酵使用的菌株为一株产长链二元酸的工程菌631，所述工程菌631是通过同源重组方法敲除保藏号为CCTCC NO：M 203052的热带假丝酵母(Candida tropicalis)基因组内一个拷贝的SCT1基因而得到。所述保藏号为CCTCCNO：M 203052的热带假丝酵母已于2003年6月6日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)。

保藏号为CCTCC M 2011192的热带假丝酵母可参见CN201110168672.X。保藏号为CCTCC NO：M 203052的热带假丝酵母可参见CN200710170899.1。保藏号为CCTCC NO：M2011192或CCTCC NO：M 203052的热带假丝酵母(Candida tropicalis)可通过中国典型培养物保藏中心(CCTCC)获得。

保藏号为CCTCC NO：M 2011192的热带假丝酵母，其SCT1基因部分CDS序列如SEQID NO:16所示。

本发明的二元酸生产菌株的制备方法包括步骤：(1)制备同源重组模板，包括靶位点上、下游重组模板和抗性筛选标记基因HYG(潮霉素抗性基因)，然后通过PCR重叠延伸的方法得到完整的重组模板；(2)将完整的重组模板转化至感受态细胞，在含有潮霉素的抗性培养基上筛选得到含有抗性标记的菌株。

第三方面，本发明提供一种降低长链二元酸发酵生产中酰基甘油酯含量的方法，利用上述工程菌进行长链二元酸的发酵生产，所得长链二元酸中酰基甘油酯(中性脂肪)的杂质含量少。

其中，所述酰基甘油酯包括二酰基甘油酯(即DAG)和三酰基甘油酯(即TAG)。所述二酰基甘油酯是由一分子甘油与二分子脂肪酸组成的化合物，三酰基甘油酯是由一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物。

优选地，所述二酰基甘油酯为C₃₉H₇₂O₅，所述三酰基甘油酯为C₅₇H₁₀₄O₆。

优选地，所述脂肪酸为油酸。

进一步地，利用所述工程菌发酵生产长链二元酸，发酵结束后的发酵液中含有的二酰基甘油酯和三酰基甘油酯杂质含量相对于SCT1基因未被敲除的微生物(即改造前的长链二元酸生产菌株)降低至少10％，优选降低至少20％，更优选降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。

更进一步地，所得长链二元酸中二酰基甘油酯和三酰基甘油酯的总含量为0.3ppm以下。

优选地，当发酵生产的长链二元酸是十二碳长链二元酸时，所得长链二元酸中二酰基甘油酯和三酰基甘油酯的总含量为0.3ppm以下；其中，DAG杂质的含量低于0.1ppm，TAG杂质的含量低于0.2ppm。

优选地，当所述二酰基甘油酯为C₃₉H₇₂O₅，所述三酰基甘油酯为C₅₇H₁₀₄O₆时，所述C₃₉H₇₂O₅和C₅₇H₁₀₄O₆的总含量为0.3ppm以下，优选在0.25ppm以下。

用于发酵转化的原料包括长链烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或它们的混合物。

优选地，本发明的发酵底物包括长链烷烃，长链烷烃属于饱和链烃，是碳氢化合物下的一种饱和烃，其整体构造大多仅由碳、氢、碳碳单键与碳氢单键所构成，其包括化学式CH₃(CH₂)_nCH₃的烷烃，其中n≥7。优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，即C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17或C18的正烷烃。适用于本发明工程菌630的发酵底物包括正十烷、正十一烷、正十二烷、正十三烷、正十四烷、正十六烷、正十七烷或正十八烷。

前述方法包括在适于所述产长链二元酸的微生物生长的条件下培养所述产长链二元酸的微生物的步骤。发酵时控制发酵底物的浓度在0.1％～17％，优选0.1％～15％，更优选0.5％～15％，可通过发酵过程中调整发酵底物的添加速度进行控制。控制发酵底物的浓度在优选的范围内，有助于微生物充分利用发酵底物发酵生产长链二元酸，进一步减少二酰基甘油酯和三酰基甘油酯的杂质含量。

第四方面，本发明提供按照上述方法获得的DAG和TAG杂质含量显著降低的长链二元酸产品。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

改造后的工程菌与改造前的长链二元酸生产菌株相比，最终获得的长链二元酸产品中DAG和TAG杂质的质量比率显著降低，DAG和TAG杂质的总含量可以降低至0.3ppm以下。而且在发酵过程中，优选控制发酵底物浓度在0.1％～17％。DAG和TAG杂质含量的降低，进一步提高了发酵产物长链二元酸的纯度，使二元酸产品作为工程塑料、合成香料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶等产品的重要原料，更有利于下游产品的生产制造，提高下游产品的质量。更重要的是，低DAG和TAG杂质含量的长链二元酸在很大程度上降低了二元酸后期的提取纯化、废水处理工艺的难度，简化工艺并节约了能耗。

附图说明

图1为本发明实施例2中通过同源重组的方式敲除一个拷贝的SCT1的流程示意图。

图2为不同微生物物种来源的3-磷酸-甘油酰基转移酶的氨基酸序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中，所述二元酸、烷烃及杂质含量的测试方法可以采用液相色谱-质谱联用技术。

同源基因是指序列相似性达70％的两条或多条基因序列，其包括直向同源基因(又称为垂直同源基因、正同源基因或定向进化同源基因)、横向同源基因(又称为旁系同源基因、并系同源基因或平行进化同源基因)和/或异源同源基因。本发明中所指的SCT1的同源基因既可以是SCT1基因的直向同源基因，也可以是其横向同源基因或异源同源基因。

序列同一性是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸变体与本发明所述的多核苷酸具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的多核苷酸或多肽同源性。

PCR重叠延伸又称SOE(gene splicing by overlap extension)PCR，是指通过设计具有互补末端的引物，通过PCR扩增将不同DNA片段拼接到一起的方法。

同源重组是指依赖于序列相似性的DNA分子之间的重组，最常见于细胞内用于修复有丝***期间产生的突变。同源重组技术已广泛应用于基因组编辑，包括基因敲除、基因修复以及向特定位点引入新的基因等。以酿酒酵母为代表的一类微生物，其细胞内发生同源重组的几率非常高，不依赖于序列特异性，在基因组编辑方面具有明显的优势。而位点特异性重组，依赖于特异性位点和位点特异性重组酶参与，重组仅发生于特异的位点之间，如Cre/loxP、FLP/FRT等。本发明使用的同源重组技术不属于位点特异性重组，重组依赖于细胞内的DNA修复***。

抗性标记是指选择性标记的一种，其往往携带有赋予转化子在抗生素存在的条件下得以生存的能力。所述抗性标记基因包括NPT、HYG、BLA及CAT等，分别可以抗卡那霉素、潮霉素、氨苄/羧苄青霉素以及氯霉素等。优选地，所述抗性标记基因是潮霉素抗性基因HYG。

长链二元酸发酵生产过程中，所述发酵培养基中至少包括碳源、氮源和无机盐，任选营养盐。按照发酵领域常识，发酵培养基的原料添加量的百分比为质量体积比，即w/v；％表示g/100mL。

可选地，所述碳源包括选自葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或所述碳源的添加量为1％～10％(w/v)，如1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％。

可选地，所述氮源包括选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；和/或所述氮源的总添加量为0.1％～3％(w/v)，如0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％、2.5％。

可选地，所述无机盐包括选自磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；和/或所述无机盐的总添加量为0.1％～1.5％(w/v)，如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％。

可选地，所述营养因子包括选自维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；和/或所述营养因子的总添加量为0～1％(w/v)，如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％。

本发明所述的OD值为菌体光密度，以下实施方式或实施例中未特殊说明的均为稀释30倍时测定的值。

本发明的长链二元酸的生产方法包括菌体生长期和发酵转化期(产酸期)。

本发明提供一种发酵生产长链二元酸的方法，优选以长链烷烃为底物时，在以下条件下进行：发酵的温度为28～32℃，风量为0.3～0.7vvm，压力为0.05～0.14MPa，菌体生长期的pH为3.5～6.5，转化期的pH为5.0～8.0。

在本发明的一个优选实施方式中，发酵转化过程中溶氧(DO)不低于15％。

在本发明的一个优选实施方式中，当发酵生产长链二元酸时，控制发酵底物的浓度在0.1％～17％，优选0.1％～15％。优选将发酵底物浓度的范围控制在0.1％～0.5％、0.5～1％、0.5～2％、1％～3％、2％～4％、3％～5％、4％～6％、5％～7％、6％～8％、7％～9％、8％～10％、9％～11％、10％～12％、11％～13％、12％～14％、13％～15％、14％～16％或15％～17％中的任意一个范围内，或这些范围的端点值任意组合构成的其他浓度范围内，如1％和10％端点值构成的1％～10％的浓度范围，或2％和12％端点值构成的2％～12％的浓度范围。所述底物浓度指发酵底物在发酵液中的体积浓度。控制底物浓度指控制发酵底物在整个发酵过程中发酵液中的体积浓度。所述底物的浓度可通过调整发酵过程中发酵底物的添加速度进行控制并通过气质联用进行检测。

在本发明的一个优选实施方式中，发酵底物的添加方式可以是批次添加或连续流加。

在本发明的一个优选实施方式中，长链二元酸的生产过程可包含以下工艺过程：

种子瓶培养工艺：

取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD液体培养基的种子瓶中，pH自然，28～32℃下，200～250rpm摇床培养1～2天。

YPD培养基，配方(w/v)为：1～3％蛋白胨，1～3％葡萄糖和1～3％酵母提取物。

种子罐培养工艺：

取种子瓶获得的种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％～30％(v/v，相对种子培养的起始体积)，接种后发酵体系的起始pH值为6.0～6.8，温度28～32℃，通风量0.3～0.7vvm，罐压0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的溶氧不低于10％，培养至种子成熟时结束，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD₆₂₀≥0.5，OD₆₂₀可以为0.5～1.0，可以为0.8左右。

种子培养基的配方(w/v)优选为：蔗糖10～20g/L，酵母膏3～8g/L，工业发酵用玉米浆2～4g/L，KH₂PO₄ 4～12g/L，尿素0.5～4g/L(优选在115℃，20min单独灭菌)。

在本发明的一些优选实施方式中，可以在初始种子培养基中添加发酵底物，所述发酵底物优选为正构烷烃，包括正十烷～正十九烷中的任意一种。

发酵罐发酵工艺：

将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵过程控制温度28～32℃，通风量约为0.3～0.7vvm，罐压(表压)约为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。控制菌体生长期的pH为3.5～6.5，待菌体光密度OD₆₂₀＞0.5时，控制转化期的pH为5.0～8.0，直至发酵结束。当发酵10～20h，开始加入发酵底物，控制发酵底物在整个发酵过程中发酵液中的浓度为0.1％～17％，总发酵底物添加量为300～500mL/L(v/v，相对发酵起始体积)，发酵底物检测到0时即为发酵结束。发酵过程中，用1N HCl和1NNaOH调节pH值至5.0～8.0。

发酵培养基的配方(w/v)优选为：蔗糖10～40g/L，玉米浆1～5g/L，酵母膏4～12g/L，NaCl 0～3g/L，KNO₃ 4～12g/L，KH₂PO₄ 4～12g/L，尿素0.5～3g/L(优选在115℃，20min单独灭菌)。

在本发明的一个优选实施方式中，可以在发酵培养基中添加发酵底物，所述发酵底物优选为正构烷烃，包括正十烷～正十九烷中的任意一种。也可以在发酵过程中加入发酵底物。

在本发明的一些优选实施方式中，菌株的接种量可以为3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％、29％。

长链二元酸的提取：对发酵后获得的发酵液进行分离、提取以获得长链二元酸成品。所述提取的步骤包括将发酵液或发酵处理液酸化，分离，得长链二元酸。

所述发酵处理液可以是对发酵液进行碱化、脱色、固液分离等步骤处理后获得的混合溶液。所述发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。

所述酸化即对发酵液或发酵处理液进行酸化处理，调节发酵液或发酵处理液pH值为2-6.5，酸化时优选使用无机酸，如硫酸、盐酸、硝酸、或其混合酸。优选酸化的终点pH低于5。

在本发明一些具体实施方式中，所述提取步骤包括在酸化前通过加碱调节发酵结束后长链二元酸发酵液的pH值为7以上，获得含有长链二元酸盐的碱溶液或称为发酵处理液，再进行固液分离。所述固液分离包括过滤和/或离心分离，可以使用常用的固液分离设备。碱化处理时可以使用氢氧化钠、氨水或氢氧化钾。

在本发明一些具体实施方式中，使用离心设备对含有长链二元酸盐的碱溶液进行离心处理，优选地，离心后再使用过滤膜继续分离包含菌体的杂质。或者，直接使用过滤膜处理含有长链二元酸盐的碱溶液，将残余菌体和大蛋白等杂质分离与溶液。所述过滤膜优选为陶瓷膜。使用陶瓷膜进行膜过滤时，优选膜前压力为0.2-0.4MPa；优选过滤膜膜芯孔径为0.05-0.2微米。

优选地，所述提取纯化的步骤还包括对含有长链二元酸盐的发酵液或发酵处理液进行脱色，向含有长链二元酸盐的发酵液或膜清液中加入活性炭进行脱色处理，脱色处理后再过滤除去活性炭，脱色步骤可以进一步脱除长链二元酸溶液中的杂质。优选地，活性炭的加量为0.1-10wt％，优选1-8wt％(相对于溶液中含有的长链二元酸的量)。使用活性炭脱色时，脱色的温度为60～100℃，脱色的时间为15～165min。

优选地，对获得的长链二元酸沉淀进行进一步纯化处理，即将长链二元酸沉淀溶解于有机溶剂中，并通过冷却\蒸发\溶析使长链二元酸结晶，再分离晶体，获得纯化后长链二元酸。所述有机溶剂包括醇、酸、酮和酯的一种或多种；其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇中的一种或多种；所述酸包括乙酸或甲酸；所述酮包括丙酮；所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯。优选地，纯化条件为：70～100℃保温30-180分钟，冷却结晶，然后进行固液分离。

在本发明的优选实施方式中，可参考CN 101985416A实施例1中的精制工艺对本发明获得的长链二元酸产品继续进行提取处理。

实施例1培养基、培养发酵方法及长链二元酸检测方法

1、YPD培养基，配方(w/v)为：2％蛋白胨，2％葡萄糖和1％酵母提取物(OXOID,LP0021)。

2、种子培养基，配方(w/v)为：蔗糖10g/L，酵母膏(总氮含量6.5wt％，下同)3g/L，工业发酵用玉米浆(简称玉米浆，总氮含量2.5wt％)2g/L，KH₂PO₄ 4g/L，尿素0.5g/L(115℃，20min单独灭菌)。

3、发酵培养基，配方(w/v)为：蔗糖10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏4g/L，KNO₃ 4g/L，KH₂PO₄ 4g/L，尿素0.5g/L(115℃，20min单独灭菌)。

4、长链二元酸的提取：

(1)先用质量浓度30％的氢氧化钠溶液调节发酵液的pH为8.5，加水调节到长链二元酸浓度为8.5wt％，加热至50℃，用0.1微米孔径的陶瓷膜对发酵液进行过滤。使用的陶瓷膜膜面积为0.84m²，膜前压力设定0.3MPa，收集膜清液。(2)向收集的膜清液中加入7wt％的粉末活性炭于60℃脱色1h，过滤得到澄清液体。(3)再向所述澄清液体中加入硫酸，调pH至3.5，降至室温后过滤得到湿固体，用3倍于湿固体重量的纯净水洗涤滤饼，过滤后烘干，获得对应长链二元酸初品。(4)向对应长链二元酸产品加入浓度为95％的乙酸，加热溶解，加入1wt％大孔粉末活性炭脱色，在85℃下脱色1h，过滤得到清液，降温到30℃，水洗涤湿固体，烘干后即得长链二元酸成品。

5、液相色谱-质谱联用技术检测DAG(C₃₉H₇₂O₅)和TAG(C₅₇H₁₀₄O₆)杂质含量、产酸量的方法

液相色谱仪：Agilent 1290 Infinity II LC(货号54983)

色谱柱：Agilent Elipse Plus-C18(2.1×50mm,1.8μM)

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃，保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

根据内标法进行二元酸产量计算，根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算杂质含量。

质谱参数如下：离子模式为APCI,Negative，气体温度325℃，干燥气体流量10L/min，雾化气体40psig，鞘气温度350℃，鞘气流量12L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压150V，扫描模式：3次/s。

根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算产物纯度和杂质含量。

实施例2 SCT1基因的克隆

1、总RNA提取与转录组测序

将CCTCC NO：M 2011192热带假丝酵母的单菌落接种于含有1ml实施例1所述YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2ml离心管中，30℃下，250rpm摇床培养1天。取上述菌液接入含有30ml实施例1种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的500mL摇瓶中，接种量为3％，250rpm、30℃培养至OD₆₂₀达到0.8时。将种子液接入装有15ml实施例1所述发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％。继续250rpm、30℃培养36h后发酵结束，5000rpm离心5min(Jouan BR4i，转子为AB50.10A)收集菌液。发酵培养基中发酵底物为400mL/L正十二烷。培养过程中通过间歇补1N HCl和1N NaOH的方式调节pH值至7.5～7.6。

RNA提取采用TRNzol universal Reagent(Tiangen)试剂盒，并辅以液氮研磨破碎细胞。转录组测序采用Miseq(Illumina)平台，采用双端测序方法，得到20M长度为2×251bp的Reads。测得的Read去除接头并用CutAadpt(v1.1.6)过滤低质量的碱基和Reads后，用Trinity软件(http://trinityrnaseq.sf.net)组装得到Unigene，并用NCBI的Non-Redundant蛋白质数据库进行功能注释。

2、生物信息学分析

采用本地Blast(Blast+2.7.1)的方法对所得到的Unigene建库并用已知来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis MYA3404)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)以及白色念珠菌(Candida albicans)的甘油三磷酸酰基转移酶基因做query，通过tblastn搜索比对候选基因。最终通过分析筛选到一个候选CtSCT1基因，其部分CDS序列如SEQ ID NO:16所示。不同微生物中甘油-3-磷酸酰基转移酶基因在Genbank中的登录号分别为Saccharomyces cerevisiae(EWG87580)、Candidatropicalis MYA3404(XP_002548333)、Yarrowia lipolytica(XP_501275)以及Candidaalbicans(KGU30921)。

实施例3同源重组模板的制备

本实施例中所有DNA片段均使用Takara公司

HS高保真DNA聚合酶(Takara,R040A)扩增得到。1％琼脂糖凝胶电泳后用Axygen凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250G)回收纯化DNA片段。

1、SCT1基因上、下游同源臂的扩增

酵母(菌种保藏号：CCTCC NO：M 2011192)基因组DNA提取采用Ezup酵母基因组DNA快速提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号518257)，并辅以液氮研磨的方法提高破壁效率。每50μL反应体系加入1μg基因组作为模板进行PCR扩增。上游同源臂扩增所用引物为：

SCT_UP-F：

5’-GAGCGACCAAAGCGATTCAG-3’(SEQ ID NO:1)

SCT_UP-R:

5’-TTTGCCATCGTTCCAACAGC-3’(SEQ ID NO:2)

下游同源臂扩增所用引物为：

SCT_DOWN-F：

5’-ATGAGTGACGGGGTCTCCTT-3’(SEQ ID NO:3)

SCT_DOWN-R:

5’-ATGAGTGACGGGGTCTCCTT-3’(SEQ ID NO:4)

PCR反应条件如下：98℃30s；98℃10s,55℃10s,72℃30s,30个循环；72℃5min。

获得的产物扩增为SCT_UP和SCT_DOWN经测序证实无误，其序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

2、抗性筛选标记(HYG，即潮霉素抗性基因)的扩增，扩增模板为载体pCIB2(SEQ IDNO:7)，引物序列和PCR反应条件如下如下：

SCT_HYG-F：

5’-GCTGTTGGAACGATGGCAAAGCATGCGAACCCGAAAATGG-3’(SEQ ID NO:8)

SCT_HYG-R：

5’-AAGGAGACCCCGTCACTCATGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3’(SEQ ID NO:9)

PCR反应条件如下：98℃30s；98℃10s,55℃10s,72℃1min 50s,5个循环；98℃10s,72℃2min,25个循环；72℃5min。

获得的扩增产物称为HYG，经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO:10所示。

3、PCR重叠延伸得到完整的重组模板

将上述SEQ ID NO:5、6和10共3条回收纯化的PCR片段进行重叠延伸，得到同源重组模板，并回收纯化。具体方法如下：

加入等摩尔量的SCT_UP、SCT_DOWN和HYG片段作为模板，引物为SCT_UP-F和SCT_Down-R，用

HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸，PCR反应条件如下：98℃30s；98℃10s,55℃10s,72℃2min 30s,20个循环；72℃8min。

凝胶电泳后进行回收纯化大小约为2.2Kb的重组片段，其序列如SEQ ID NO:11示。

图1为通过同源重组的方式敲除一个拷贝的SCT1的流程示意图。

实施例4重组转化子的转化

1、酵母电转化感受态细胞的制备

将30℃，250rpm摇床过夜培养的酵母细胞CCTCC NO：M 2011192接种到实施例1的100mL YPD培养基中，至OD₆₂₀为0.1。相同条件下培养至OD₆₂₀至1.3时，3000g、4℃离心收集细胞。用冰冷的无菌水洗涤细胞两次并收集后将细胞重悬于10ml冰上预冷的1M的山梨醇溶液，4℃、1500g离心收集细胞后重悬于1ml上述山梨醇溶液，分装100μL细胞悬液用于遗传转化。

2、酵母感受态电击转化

上述感受态细胞中加入1μg回收纯化的DNA片段SEQ ID NO:11，冰上放置5min后迅速转移至0.2cm电击杯，电击转化(BioRad，MicropulserTM Electroporator，转化程序SC2，1.5kV，25uFD，200ohms)。迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃，200rpm培养2h后，收集菌液后涂布含有100mg/L潮霉素B的YPD培养基平板，30℃静置培养2～3天，至长出单菌落。

实施例5重组转化子的筛选

挑取实施例3中获取的单菌落接种于含有1ml实施例1的YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2ml离心管中，250rpm、30℃培养过夜。次日进行菌落PCR鉴定，所用引物序列和PCR反应条件如下：

鉴定SCT1基因的引物序列如下：

SCT-1F:5’-AAGATCCCCAGAGAGGGTCC-3’(SEQ ID NO:12)

SCT-1R:5’-ATGCACCCATCATCAGCCAA-3’(SEQ ID NO:13)

鉴定同源重组的引物序列如下：

HYG-2F:5’-TGTGCTACCCACGCTTACT-3’(SEQ ID NO:14)

SCT1-Down-2R:5’-ACTGACTGTCCATTCTGTTCTCTC-3’(SEQ ID NO:15)

PCR反应条件如下：98℃30s；98℃10s,55℃10s,72℃40s,30个循环；72℃5min。

上述两组PCR引物扩增分别得到大小约为500bp和600bp片段的菌株即为一个拷贝的SCT1基因被敲除的菌株，命名为630。

实施例6重组菌株摇瓶发酵生产十二碳长链二元酸(DC12)

挑取菌株630的单菌落接种于含有1ml实施例1所述YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2ml离心管中，30℃下，250rpm摇床培养1天。取上述菌液接入含有30ml实施例1所述种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的500mL摇瓶中，接种量为3％，250rpm、30℃摇床培养至OD₆₂₀达到0.8时。将种子液接入装有15ml实施例1所述发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，继续250rpm、30℃摇床培养至发酵结束。发酵培养基中发酵底物为400mL/L正十二烷。培养过程中通过间歇补1N HCl和1N NaOH的方式调节pH值至7.5～7.6。

同时以菌株CCTCC NO：M 2011192作为对照组：除培养基不含潮霉素B外，培养和发酵方法外与上述相同。发酵液中DC12产酸量结果如表1所示。

发酵结束后二元酸产品的提取方法如实施例1步骤4所述。二元酸成品中杂质DAG与TAG含量的检测方法如实施例步骤5所述，结果如表1所示。

表1

由表1可知，与对照组相比，敲除一个拷贝的SCT1基因的菌株中杂质DAG与TAG的总量降低约18.5％，产酸量略有上升。

实施例7菌株630摇瓶发酵生产十一碳长链二元酸(DC11)

除发酵培养基中发酵底物为300mL/L正十一烷外，其余发酵条件、提取纯化以及DAG与TAG含量的检测方法均与实施例5完全相同。

发酵液中DC11产酸量以及二元酸成品中杂质DAG与TAG含量的检测结果如表2所示。

表2

由表2可知，与对照组相比，敲除一个拷贝的SCT1基因的菌株中杂质DAG与TAG的总量降低约18.0％，产酸量略有上升。

实施例8菌株630摇瓶发酵生产十六碳长链二元酸(DC16)

除发酵培养基中发酵底物为500mL/L正十六烷外，其余发酵条件、提取纯化以及DAG与TAG含量的检测方法均与实施例5完全相同。

发酵液中DC16产酸量以及二元酸成品中杂质DAG与TAG含量的检测结果如表3所示。

表3

由表3可知，与对照组相比，敲除一个拷贝的SCT1基因的菌株中杂质DAG与TAG的总量降低约19.4％，产酸量略有上升。

从上述针对不同的发酵底物发酵生产长链二元酸的实施例6、7、8在摇瓶阶段培养的实验结果可以看出，针对不同的发酵底物如正十二烷烃、正十一烷烃、正十六烷烃，在相同发酵条件下，产酸量略有升高，而且提取二元酸成品后，产品中的杂质DAG与TAG的含量与亲代菌株相比，降低至少18％。

实施例9菌株630在10L罐规模下发酵生产十二碳二元酸(DC12)

取菌株630的甘油管菌种接种于装有实施例1所述YPD液体培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，200rpm摇床培养1天。

取摇瓶种子接入装有实施例1所述种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的种子罐中，接种量为10％，接种后发酵体系的起始pH值为6.0，28℃下，通风量0.3vvm，罐压0.14MPa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的溶氧不低于10％，培养15h后至种子成熟，稀释30倍后OD₆₂₀为0.8。

将在种子罐培养所得的种子液接种到含有实施例1所述发酵培养基的发酵罐中，接种后发酵起始体积为4L，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加30ml(v/v，相对发酵起始体积)的正十二烷烃，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。控制菌体生长期发酵体系的pH为4.4～4.6，待菌体光密度OD₆₂₀＞0.5，控制转化期发酵体系的pH为7.5～7.6，直至发酵结束。当发酵至15h开始批次加入正十二烷烃，控制正十二烷烃在整个发酵过程中发酵液中的体积浓度为0.1～0.5％，1～3％，8～10％，15～17％四个浓度范围，总烷烃加量400mL/L，烷烃检测到0时发酵结束。发酵液中DC12产酸量结果如表4所示。

发酵结束后产品的提取方法如实施例1步骤4所述。二元酸成品中杂质DAG与TAG含量的检测方法如实施例1步骤5所述，结果如表4所示。

表4

底物浓度(％)	0.1～0.5	1～3	8～10	15～17
					发酵液中的DC12产酸量(mg/g)	145.5	157.8	158.0	125.6
DAG含量(C<sub>39</sub>H<sub>72</sub>O<sub>5</sub>，ppm)	0.053	0.079	0.088	0.109
					TAG含量(C<sub>57</sub>H<sub>104</sub>O<sub>6</sub>，ppm)	0.084	0.118	0.135	0.184
总(DAG+TAG，ppm)	0.137	0.197	0.223	0.293
					发酵时间(h)	188	164	167	177

由表4可知，控制发酵底物的浓度越低，杂质DAG与TAG含量越低。

实施例10菌株630在10L规模下发酵生产十一碳二元酸(DC11)

取菌株630的甘油管菌种接种于装有实施例1所述YPD液体培养基的种子瓶中，pH自然，30℃下，220rpm摇床培养2天。

取摇瓶种子接入装有实施例1所述种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的种子罐中，接种量为30％，接种后发酵体系的起始pH值为6.5，30℃下，通风量0.3vvm，罐压0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO不低于10％，培养20h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD₆₂₀为1.0。

将在种子罐培养所得的种子液接种到含有实施例1所述发酵培养基的发酵罐中，接种后发酵起始体积为5L，接种量20％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。控制菌体生长期发酵体系的pH为5.5，待菌体光密度OD₆₂₀＞0.5时，控制转化期发酵体系的pH为7.4～7.5，直至发酵结束。当发酵至10h开始加入正十一烷烃，控制正十一烷烃在整个发酵过程中发酵液中的体积浓度为0.1～0.5％，1～3％，8～10％，15～17％四个浓度范围，总烷烃加量300mL/L，烷烃检测到0时发酵结束。发酵液中DC11产酸量结果如表5所示。

发酵结束后产品的提取方法如实施例1步骤4所述。二元酸成品中杂质DAG与TAG含量的检测方法如实施例1步骤5所述，结果如表5所示。

表5

由表5可知，控制发酵底物的浓度越低，杂质DAG与TAG含量越低。

实施例11菌株630在10L规模下发酵生产十六碳二元酸(DC16)

取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD液体培养基的种子瓶中，pH自然，32℃下，250rpm摇床培养2天。

取摇瓶种子接入装有实施例1所述种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的种子罐中，接种量为30％，接种后发酵体系的起始pH值为6.5，32℃下，通风量0.7vvm，罐压0.1MPa，保持一定的搅拌速度以控制种子培养过程的溶氧不低于10％，培养30h后至种子成熟，稀释30倍后OD₆₂₀为0.9。

将在种子罐培养所得的种子液接种到含有实施例1所述发酵培养基的发酵罐中，接种后发酵起始体积为6L，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加10％(v/v，相对发酵起始体积)的正十六烷烃，发酵过程控制温度32℃，通风量约为0.7vvm，罐压(表压)约为0.05MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。控制菌体生长期发酵体系的pH为6.4～6.5，待菌体光密度OD₆₂₀＞0.5时，控制转化期发酵体系的pH为7.5～7.6，直至发酵结束。当发酵至20h开始加入正十六烷烃，控制正十六烷烃在整个发酵过程中发酵液中的体积浓度为0.1～0.5％，1～3％，8～10％，15～17％四个浓度范围，总烷烃加量500mL/L，烷烃检测到0时发酵结束。发酵液中DC16产酸量结果如表6所示。

发酵结束后产品的提取方法如实施例1步骤4所述。二元酸成品中杂质DAG与TAG含量的检测方法如实施例1步骤5所述，结果如表6所示。

表6

底物浓度(％)	0.1～0.5	1～3	8～10	15～17
					发酵液中的DC16产酸量(mg/g)	129.7	141.5	143.0	129.5
DAG杂质含量(C<sub>39</sub>H<sub>72</sub>O<sub>5</sub>，ppm)	0.045	0.077	0.084	0.108
					TAG杂质含量(C<sub>57</sub>H<sub>104</sub>O<sub>6</sub>，ppm)	0.085	0.113	0.124	0.169
总(DAG+TAG，ppm)	0.130	0.190	0.208	0.277
					发酵时间(h)	190	168	170	178

由表6可知，控制发酵底物的浓度越低，杂质DAG与TAG含量越低。

由表4-表6的实验结果可知，控制发酵底物的浓度过低时如0.1％～0.5％，杂质的含量较少，但是在总烷烃加量相同的条件下，发酵时间相对较长，降低了发酵效率；当控制发酵底物的浓度在0.5％～15％范围内，降低杂质含量、保证发酵效率和产酸量方面效果均较佳；而发酵底物浓度控制在15％～17％范围内时，产酸量降低，可能是浓度过高，如高于15％会抑制细胞产酸。

实施例12其它重组菌株的构建及摇瓶发酵生产十二碳长链二元酸(DC12)

将实施例3中所述2.2Kb的重组DNA片段(SEQ ID NO:11)利用同源重组方法构建至热带假丝酵母(CCTCC：M203052)中，具体方法同实施例3。转化和筛选重组子的方法同实施例4和实施例5，所筛选得到的重组子命名为631。

重组菌株631摇瓶发酵生产十二碳长链二元酸(DC12)的方法同实施例6，对照菌株为CCTCC NO：M 203052。结果表明，菌株631与亲代菌株相比，二元酸成品中杂质DAG和TAG含量的检测方法如实施例1步骤5所述，结果如表7所示。与对照组相比，DAG和TAG杂质的总含量降低约23.6％。

表7

菌株	CCTCC NO：M 203052	631
			发酵液中的DC12产酸量(mg/g)	136.4	137.7
DAG含量(C<sub>39</sub>H<sub>72</sub>O<sub>5</sub>，ppm)	0.118	0.091
			TAG含量(C<sub>57</sub>H<sub>104</sub>O<sub>6</sub>，ppm)	0.187	0.142
总(DAG+TAG，ppm)	0.305	0.233

实施例12表明通过同源重组方法敲除其他热带假丝酵母(Candida tropicalis)基因组内一个拷贝的SCT1基因而得到的改造后的工程菌，与改造前的长链二元酸生产菌株相比，可以使发酵结束后的发酵液中DAG和TAG杂质的质量比率显著降低。

实施例13改造前菌株在10L罐规模下发酵生产十二碳二元酸

取改造前原始菌株(CCTCC NO：M 2011192)的甘油管菌种接种于装有实施例1所述YPD液体培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，200rpm摇床培养1天。

种子罐和发酵罐的培养方法同实施例9。在发酵过程中，当发酵至15h开始批次加入正十二烷烃，控制正十二烷烃在整个发酵过程中发酵液中的体积浓度为0.1～0.5％，1～3％，8～10％，15～17％四个浓度范围，总烷烃加量400mL/L，烷烃检测到0时发酵结束。发酵液中DC12产酸量结果如表8所示。

发酵结束后产品的提取方法如实施例1步骤4所述。二元酸成品中杂质DAG与TAG含量的检测方法如实施例1步骤5所述，结果如表8所示。

表8

底物浓度(％)	0.1～0.5	1～3	8～10	15～17
					发酵液中的DC12产酸量(mg/g)	141.3	154.8	155.0	123.3
DAG含量(C<sub>39</sub>H<sub>72</sub>O<sub>5</sub>，ppm)	0.064	0.099	0.112	0.124
					TAG含量(C<sub>57</sub>H<sub>104</sub>O<sub>6</sub>，ppm)	0.099	0.136	0.183	0.215
总(DAG+TAG，ppm)	0.163	0.235	0.295	0.339
					发酵时间(h)	190	168	170	179

由表8可知，控制发酵底物的浓度越低，杂质DAG与TAG含量越低，但是发酵时间相对较长，而控制发酵底物的浓度在0.5％～15％，在降低杂质含量和保证发酵效率、产酸量方面效果相对更佳。将实施例13与实施例9的结果进行比较可知改造后的菌株获得的杂质含量更低。杂质含量的减少一方面降低了后期的提取纯化工艺的难度和生产成本，另一方面也更有利于下游尼龙、塑料、聚酰胺热熔胶等产品的生产制造，提高产品质量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

凯赛生物产业有限公司

<120> SCT1基因在长链二元酸生产中的应用

<130> KHP181116613.8

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagcgaccaa agcgattcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttgccatcg ttccaacagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagtgacg gggtctcctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagtgacg gggtctcctt 20

<210> 5

<211> 271

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)

<400> 5

gagcgaccaa agcgattcag gttggtcatt tacgactgct tgctctggct cttgtcagtg 60

atatttgatt gttttttcag agagatcaga ccgagagggg cgtttaagat ccccagagag 120

ggtccggtga tctttgttgc cgccccccat cataatcagt ttgttgatcc catcgtgttg 180

atgaaccagg tgaaaagaga agcaaaccga agaatatcat tcttgattgc ggccaagtca 240

tatcaattga aagctgttgg aacgatggca a 271

<210> 6

<211> 267

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)

<400> 6

atgagtgacg gggtctcctt attaaactca gataattctt tgacaaatct cccaatgttt 60

tcggattacg tgttgcacaa gaacgcaaag aacccggact tggagcttga tccccaatct 120

ttggcggcat cgagagtcaa ttcgatggtc aacatacctc atgcttctca tggcgttaat 180

acgccatcac cgtcaacttc aagacgccca ccattgaccg aaaccgcctc gtcggagcat 240

atggaattga actttgggtc tggagcc 267

<210> 7

<211> 5873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcggtct 240

agtatgattg tcaataatga tgggtcatcg tttcctgatt cgacgttccc tgtggtgtcg 300

ttaaatagcc tgtctgaaat ctcctccatg attgtgttgg tgtgtgttgt ttgactttcc 360

caattgctta catttttttc ttcaaggatt cgctccaaaa tagacagaaa ttatcgcgac 420

aagtcagacg aacgtcgcac gaggcgaacc aaattcttta gaagcatacg aaaactcact 480

ttatttccat tagaagtatt aaattaacaa atatataata tacaggatac aaagtaaaag 540

cacgcttaag caaccaaagc ggaagcggta gcggattcgt atttccagtt aggtggcaag 600

acagcgacgg ttctgtagta tctggccaat ctgtggattc tagattcaat caaaatcaat 660

ctgaacttgg agtccttgtc ctttctgttt ctttccaagt gctttctgac agagacagcc 720

ttcttgatca agtagtacaa gtcttctggg atttctggag ccaaaccgtt ggatttcaag 780

attctcaaga tcttgttacc agtgacaacc ttggcttggg aaacaccgtg agcatctctc 840

aagataacac caatttgaga tggagtcaaa ccctttctgg cgtacttgat gacttgttca 900

acaacttcgt cagaagacaa cttgaaccaa gatggagcgt ttcttgagta tggaagagcg 960

gaggaggaaa tacctttacc ctaaaataac aagagctaat gttagtaatt tgaaaaaaaa 1020

gacgttgagc acgcacaccc catccacccc acaggtgaaa cacatcaaac gtagcaagaa 1080

caatagttgg ccctcccgtc aagggggcag gtaattgtcc aagtacttta gaaaagtatg 1140

tttttaccca taagatgaac acacacaaac cagcaaaagt atcaccttct gcttttcttg 1200

gttgaggttc aaattatgtt tggcaataat gcagcgacaa tttcaagtac ctaaagcgta 1260

tatagtaaca attctaggtc tgtatagtcg accgtaggtg aatcgtttac tttaggcaag 1320

accttgtccc tgataaagcc aggttgtact ttctattcat tgagtgtcgt ggtggtggta 1380

gtggtggttg attgggctgt tgtggtagta gtagtggttg tgatttggaa catacagatg 1440

aatgcatacg acccatgatg actgatttgt ttctttattg agttgatggt aagaaagaga 1500

agaagaggag gtaaaaaggt ggtagagtga aaaatttttt tctcttaaaa gtgagagaga 1560

gaaagagaaa aatttcactg cgaaacaaat ggttggggac acgacttttt tcaggaattt 1620

ttactcgaag cgtatatgca ggaaagttgt tgttagggaa tatggagcca caagagagct 1680

gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgaacccg 1740

aaaatggagc aatcttcccc ggggcctcca aataccaact cacccgagag agagaaagag 1800

acaccaccca ccacgagacg gagtatatcc accaaggtaa gtaactcagg gttaatgata 1860

caggtgtaca cagctccttc cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta 1920

caaccacgtt tagtagttat tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg 1980

ggtgcgtcta ctgattcccc tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc 2040

tgaatgatat aaattcacct tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca 2100

cccaattgaa ttttcttttt ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta 2160

agtttatcaa ttgcctattc agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 2220

agtttctcat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag 2280

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct 2340

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 2400

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc 2460

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc 2520

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 2580

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 2640

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 2700

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc 2760

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag 2820

cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct 2880

tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc 2940

atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc 3000

aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat 3060

gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa 3120

gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc 3180

ccagcactcg tccgagggca aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta 3240

ttaacatcag aaatatttat tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa 3300

aaaaaaaaga aacgattttt tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca 3360

atgtttattc cgttaaacaa aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc 3420

tagtgtacac attctcccaa aatagtgaaa tccagctgct agcgtgtaag cttggcactg 3480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3720

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3780

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3840

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctgttggaa cgatggcaaa gcatgcgaac ccgaaaatgg 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggagaccc cgtcactcat gctagcagct ggatttcact 40

<210> 10

<211> 1776

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgttggaa cgatggcaaa gcatgcgaac ccgaaaatgg agcaatcttc cccggggcct 60

ccaaatacca actcacccga gagagataaa gagacaccac ccaccacgag acggagtata 120

tccaccaagg taagtaactc agagttaatg atacaggtgt acacagctcc ttccctagcc 180

attgagtggg tatcacatga cactggtagg ttacaaccac gtttagtagt tattttgtgc 240

aattccatgg ggatcaggaa gtttggtttg gtgggtgcgt ctactgattc ccctttgtct 300

ctgaaaatct tttccctagt ggaacacttt ggctgaatga tataaattca ccttgattcc 360

caccctccct tctttctctc tctctctgtt acacccaatt gaattttctt ttttttttta 420

ctttccctcc ttctttatca tcaaagataa gtaagtttat caattgccta ttcagaatga 480

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct catcgaaaag ttcgacagcg 540

tctccgacct catgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 600

gagggcgtgg atatgtcctc cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 660

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 720

aattcagcga gagcctcacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 780

acctccctga aaccgaactc cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga 840

tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg 900

gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 960

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctca 1020

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 1080

acaatgtcct cacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 1140

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 1200

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc 1260

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 1320

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 1380

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 1440

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat 1500

agtgtgctac ccacgcttac tccaccagag ctattaacat cagaaatatt tattctaata 1560

aataggatgc aaaaaaaaaa ccccccttaa taaaaaaaaa agaaacgatt ttttatctaa 1620

tgaagtctat gtatctaaca aatgtatgta tcaatgttta ttccgttaaa caaaaatcag 1680

tctgtaaaaa aggttctaaa taaatattct gtctagtgta cacattctcc caaaatagtg 1740

aaatccagct gctagcatga gtgacggggt ctcctt 1776

<210> 11

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagcgaccaa agcgattcag gttggtcatt tacgactgct tgctctggct cttgtcagtg 60

atatttgatt gttttttcag agagatcaga ccgagagggg cgtttaagat ccccagagag 120

ggtccggtga tctttgttgc cgccccccat cataatcagt ttgttgatcc catcgtgttg 180

atgaaccagg tgaaaagaga agcaaaccga agaatatcat tcttgattgc ggccaagtca 240

tatcaattga aagctgttgg aacgatggca agcatgcgaa cccgaaaatg gagcaatctt 300

ccccggggcc tccaaatacc aactcacccg agagagataa agagacacca cccaccacga 360

gacggagtat atccaccaag gtaagtaact cagagttaat gatacaggtg tacacagctc 420

cttccctagc cattgagtgg gtatcacatg acactggtag gttacaacca cgtttagtag 480

ttattttgtg caattccatg gggatcagga agtttggttt ggtgggtgcg tctactgatt 540

cccctttgtc tctgaaaatc ttttccctag tggaacactt tggctgaatg atataaattc 600

accttgattc ccaccctccc ttctttctct ctctctctgt tacacccaat tgaattttct 660

tttttttttt actttccctc cttctttatc atcaaagata agtaagttta tcaattgcct 720

attcagaatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tcatcgaaaa 780

gttcgacagc gtctccgacc tcatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag 840

cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct ccgggtaaat agctgcgccg atggtttcta 900

caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct 960

tgacattggg gaattcagcg agagcctcac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt 1020

cacgttgcaa gacctccctg aaaccgaact ccccgctgtt ctccagccgg tcgcggaggc 1080

catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc 1140

gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca 1200

tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct 1260

cgatgagctc atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga 1320

tttcggctcc aacaatgtcc tcacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag 1380

cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg 1440

gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg 1500

atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt 1560

ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg 1620

atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac 1680

cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag 1740

ggcaaaggaa tagtgtgcta cccacgctta ctccaccaga gctattaaca tcagaaatat 1800

ttattctaat aaataggatg caaaaaaaaa acccccctta ataaaaaaaa aagaaacgat 1860

tttttatcta atgaagtcta tgtatctaac aaatgtatgt atcaatgttt attccgttaa 1920

acaaaaatca gtctgtaaaa aaggttctaa ataaatattc tgtctagtgt acacattctc 1980

ccaaaatagt gaaatccagc tgctagcatg agtgacgggg tctccttatt aaactcagat 2040

aattctttga caaatctccc aatgttttcg gattacgtgt tgcacaagaa cgcaaagaac 2100

ccggacttgg agcttgatcc ccaatctttg gcggcatcga gagtcaattc gatggtcaac 2160

atacctcatg cttctcatgg cgttaatacg ccatcaccgt caacttcaag acgcccacca 2220

ttgaccgaaa ccgcctcgtc ggagcatatg gaattgaact ttgggtctgg agcc 2274

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagatcccca gagagggtcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgcacccat catcagccaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtgtgctacc cacgcttact 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actgactgtc cattctgttc tctc 24

<210> 16

<211> 2217

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)

<400> 16

cttaagtacg agcgaccaaa gcgattcagg ttggtcattt acgactgctt gctctggctc 60

ttgtcagtga tatttgattg ttttttcaga gagatcagac cgagaggggc gtttaagatc 120

cccagagagg gtccggtgat ctttgttgcc gccccccatc ataatcagtt tgttgatccc 180

atcgtgttga tgaaccaggt gaaaagagaa gcaaaccgaa gaatatcatt cttgattgcg 240

gccaagtcat atcaattgaa agctgttgga acgatggcaa aatgtcagtt gtcaattcct 300

gttatccgcc cacaagactg tttgaccaaa ggtagtggta agatatttgt ggactttgac 360

aaagatccgt taaaagttat cggcaagaat accaaattca cgaccgaatg tatggtcaag 420

ggcttaattg cattgccaca atctttgggt gcctctgagg tggctgaaat cgtctcggat 480

accgagttgc ttatccgtaa agagttcaaa cccctggaga aagttaagga attgttgagc 540

caaggaacct ccttcaagcg tgctgataag gtcgaccaaa agcaagtcta tcaaatggtc 600

tttgaccact tggctgatga tgggtgcatt gggatctttc ccgaaggcgg gtctcacgat 660

cggccagact tattgccctt gaaagcaggc gttgctgtga tggctcttgg cgccatggac 720

aaaaatccaa attgcaatat caagattgtt ccatgtggta tgaactattt cagtgctcac 780

aagtttagaa gcagagccgt tgttgagttt ggcgatccaa ttgaaattcc aaaggagcta 840

gtgaagaaat acgcgaaccc ggagaccaac cgtgaagcgg ttaaggattt actagacacc 900

atcactactg gtttgaaagc agttaccgtt acctgcgagg actacgagac gttaatgtta 960

atacaggcgg caagacgttt gtatgctggt aacttcgcac agcaattgcc cttgccgttg 1020

attgtggaaa tgaacaggag attggtcatc ggctacgaac acttcaaaaa cgtgccaaaa 1080

gtgcaagagc tcaaggaaaa agtgttggcg tataatgagt ttctcaaaac tttgcattta 1140

ccagatcacc acgtcgagag ttgcaacgac aagacacaca agatagcttt gattccaaca 1200

tttttcataa gactttttga ggttatcttt ttgtttattt tggctttgcc aggagctgtg 1260

ttgttttcgc ccgtctttat ttcaagcaaa ttgatatccc gcaggaaggc aaaggaagcg 1320

ttagcgaact ccgtagtcaa gatccaagca aacgatgtga tcgcgacgtg gaaaatatta 1380

gttgctatgg gtatcgcgcc ggtcgtttat tctttctatg caagtattgg aacgtattac 1440

tgttctgcac ataaatattt cctgcattgg cgattgtttt gggtttgggt gtttttgtac 1500

atctgtgggg tcttggttac ttattcggca ttggtgactg gggaacaagg catggacttg 1560

ttgaaatcga ttcggccgtt gtacttgtcc atcacttcag ggtcgtcgat taaggagttg 1620

aagcgaatgc gagcggagct tagtgaagaa attaccgact tggtcaacac atatggccca 1680

cagttgtatc caaaagactt taatttgtta gagttgcaaa aatcgttgaa catcaatggc 1740

gatgttaatt atgttgacag tgacgaggaa gaagaattga aaaccgagga gttgcgtcaa 1800

agacgtttgg caaggcgcag ggcagagaag aaggccaccg atgcagatga cgaatctgaa 1860

ttgaaacatt catcttctat gagtgacggg gtctccttat taaactcaga taattctttg 1920

acaaatctcc caatgttttc ggattacgtg ttgcacaaga acgcaaagaa cccggacttg 1980

gagcttgatc cccaatcttt ggcggcatcg agagtcaatt cgatggtcaa catacctcat 2040

gcttctcatg gcgttaatac gccatcaccg tcaacttcaa gacgcccacc attgaccgaa 2100

accgcctcgt cggagcatat ggaattgaac tttgggtctg gagccaggac aaggaaatcg 2160

aatttgaggg acaaaatcaa actgaaactc agagagaaca gaatggacag tcagtct 2217

Claims

1.SCT1基因在长链二元酸生产中的应用，其特征在于，所述应用包括通过基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的SCT1基因，并利用改造后的工程菌进行长链二元酸的发酵生产；

所述长链二元酸生产菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。

2.产长链二元酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌是利用基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的SCT1基因得到的；

所述长链二元酸生产菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述长链二元酸选自碳链长度为C9～C22的长链二元酸中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述长链二元酸包括十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸或十八碳二元酸中的任意一种或几种的组合。

5.产长链二元酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过同源重组方法敲除保藏号为CCTCC NO：M 2011192或CCTCC NO：M 203052的热带假丝酵母(Candida tropicalis)基因组内一个拷贝的SCT1基因而得到。

6.降低长链二元酸发酵生产中酰基甘油酯含量的方法，其特征在于，利用权利要求2-5任一项所述工程菌进行长链二元酸的发酵生产，所得长链二元酸中酰基甘油酯的杂质含量少；

其中，所述酰基甘油酯包括二酰基甘油酯和三酰基甘油酯；

所述发酵的原料包括长链烷烃、脂肪酸、脂肪酸衍生物或其混合物；

发酵时控制发酵液中发酵底物的浓度在0.1％～10％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述二酰基甘油酯为C₃₉H₇₂O₅，所述三酰基甘油酯为C₅₇H₁₀₄O₆。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所得长链二元酸中二酰基甘油酯和三酰基甘油酯的总含量为0.3ppm以下。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当所述二酰基甘油酯为C₃₉H₇₂O₅，所述三酰基甘油酯为C₅₇H₁₀₄O₆时，所述C₃₉H₇₂O₅和C₅₇H₁₀₄O₆的总含量为0.3ppm以下。