CN107739728A - 一种高效生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将E.coli MG1655来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS和S.cerevisiae BY4741来源的氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1在宿主E.coli MG1655中成功表达，在此基础之上，弱化乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子基因nagE和甘露糖磷酸转运子基因manX的表达强度使获得的基因工程菌株在5L发酵罐发酵44h，氨基葡萄糖的产量达到了131.5g/L，转化率达到了35.1％，在1000L发酵罐发酵44h，氨基葡萄糖的产量达到了137g/L，葡萄糖转化率为37.7％。

Description

一种高效生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种高效生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)又称氨基葡糖或葡糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，易溶于水及亲水性溶剂，其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)经酸解可得到GlcN。GlcN几乎存在于所有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，同时也是壳聚糖和甲壳素的主要组成成分。GlcN具有多种生物活性和药用价值，在临床上被大量用于骨关节炎的治疗，能够抑制白血病癌症细胞等，此外，GlcN在食品保健领域也有着广泛的应用，被视作天然无害的食品及保健品配料。
目前，GlcN工业化生产的方法可以分为三种，酸水解法、酶解法以及微生物发酵法。酸水解法以及酶解法的生产原料为虾蟹的外骨骼，主要是从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或者酶解获得目标产物GlcN。但是酸水解法以及酶解法自身存在诸多问题，如原材料来源限制，水解过程的酸会污染环境、生产效率低下等，严重制约了氨基葡萄糖产业的发展。因此，国内外学者不断探索寻求利用微生物发酵法高效生产GlcN的方法。
近年来，国内外研究人员从生化工程和代谢工程两个方面对微生物生产氨基葡萄糖进行了***性地研究。生产菌株主要集中在真菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌上。其中，Aspergillus sp.BCRC31742通过发酵优化GlcN最高产量达到了14.37g/L；Deng以大肠杆菌为表达宿主，对glmS进行定向进化，阻断GlcN的分解代谢途径以及异源表达gna1，GlcNAc的产量达到了110g/L；刘延峰以枯草芽孢杆菌为出发菌株，采用理性代谢工程手段以及模块路径工程策略优化使得GlcNAc的产量达到了31.65g/L。然而以上野生型菌株和经过改造后的工程菌株的产量均不是很高，且发酵过程所需的葡萄糖多，工业化成本高。因此，降低生产成本并进一步提高葡萄糖胺的产量成为亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是过表达了氨基葡萄糖合成酶和氨基葡萄糖乙酰化酶，弱化表达乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子和甘露糖磷酸转运子。
在本发明的一种实施方式中，所述弱化是将编码所述乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子和甘露糖磷酸转运子的基因序列的起始密码子替换为TTG。
在本发明的一种实施方式中，所述弱化在基因组上进行。
在本发明的一种实施方式中，所述来自E.coli MG1655的氨基葡萄糖合成酶基因glmS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1来自Saccharomyces cerevisiae BY4741，序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS是通过质粒pTrcHisA进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1是通过质粒pTrcHisA进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1串联表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，弱化起始密码子后的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子的基因nagE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，弱化起始密码子后的甘露糖磷酸转运子基因manX的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌MG1655。
本发明的第二个目的是提供一种所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤为：
(1)获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1的氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基酸序列如SEQ ID NO.2的氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1；
(2)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.3的基因表达载体pTrcHisA-glmS-gna1；
(3)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子基因nagE起始密码子基因编辑片段；
(4)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的甘露糖磷酸转运子基因manX起始密码子基因编辑片段；
(5)将步骤(2)得到的重组质粒转化到E.coli MG1655中，得到大肠杆菌重组菌。
本发明的第三个目的是提供所述大肠杆菌在生产氨基葡萄糖中的应用，所述应用发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸三钠1g/L，KH2PO4 3.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4.7H2O 12.8g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.6g/L，CaCl2 0.05g/L，金属离子液10mL/L；金属离子液配方为：CoCl2.6H2O 0.01mg/L，H3BO3 0.01mg/L，CoSO4.5H2O0.01mg/L，FeSO4.7H2O 0.5mg/L，MnSO4.H2O 0.033mg/L，ZnSO4.7H2O 0.38mg/L，NaMoO4.2H2O0.01mg/L；补料培养基：葡萄糖800g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是按5％的接种量接种至发酵罐中，OD600为20-30时添加0.4mmol/L IPTG进行诱导，终浓度为0.4mmol，诱导温度为30℃。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是在发酵过程中，当溶氧陡然上升，开始进行补料，补料策略为恒速补料，补料速率为8L/h。
本发明还要求保护所述基因工程菌在制备含氨基葡萄糖的产品中的应用。
有益效果：本发明采用串联表达氨基葡萄糖合成酶和氨基葡萄糖乙酰化酶，实现了基因的高效表达；本发明弱化乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子基因nagE和甘露糖磷酸转运子基因manX的表达强度，克服了由于质粒的不稳定性，导致的质粒容易丢失而且添加抗生素会对菌体生长有不利影响的缺陷。最终得到的工程菌株E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT发酵44h氨基葡萄糖产量达到了137g/L。本发明方法成本低，产量高，在工业上用于提高氨基葡萄糖的产量具有潜在且非常广泛的价值。
附图说明
图1所示为表达氨基葡萄糖合成酶和氨基葡萄糖乙酰化酶重组载体的结构图；
图2所示为乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子基因nagE起始密码子基因组编辑片段构建示意图；
图3所示为甘露糖磷酸转运子基因manX起始密码子基因组编辑片段构建示意图；
图4所示为工程菌株E.coli MG1655-glmS-gna1、E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT5L罐补料分批发酵结果。
图5所示为工程菌株E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT 1000L罐补料分批发酵结果。
具体实施方式
序列表中未相关核苷酸序列信息：
(1)SEQ ID NO.1序列信息为E.coli MG1655来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.2序列信息为S.cerevisiae BY4741来源的氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO.3序列信息为表达载体pTrcHisA-glmS-gna1的基因序列；
(4)SEQ ID NO.4序列信息为乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子基因nagE起始密码子基因编辑片段的基因序列；
(5)SEQ ID NO.5序列信息为甘露糖磷酸转运子基因manX起始密码子基因编辑片段的基因序列；
GlcN和GlcNAc通过高效液相色谱法测定。高效液相色谱条件：色谱柱为HPX-87H(Bio-Rad Hercules)，柱温35℃；检测器为示差折光检测器；流动相为5mM H2SO4，流速为0.6mL/min。发酵上清液通过0.22μm微孔过滤除去杂质后直接用于GlcN和GlcNAc。胞内GlcN和GlcNAc测定时，先采用超声破碎，然后离心取上清液检测。
葡萄糖转化率的计算方法：氨糖总量/总耗糖量×100％。
实施例1：表达载体pTrcHisA-glmS的构建
本发明所用的氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于E.coli MG1655，E.coli MG1655为商业化菌株。采用pTrcHisA为表达载体。pTrcHisA含trc启动子，可以使目的基因在大肠杆菌MG1655中正常表达，而常用的pET系列的质粒是由T7启动子组成，无法在大肠杆菌MG1655中表达目的基因，因此选择pTrcHisA质粒。
将E.coli MG1655接种于25mL LB液体培养基，在37℃，200rpm培养12h，收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌菌株的基因组DNA。
根据已公布的基因组信息序列，分别设计序列如SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7引物对glmS-S/glmS-A，以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取glmS基因。
glmS-S(SEQ ID NO.6):GGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCG
glmS-A(SEQ ID NO.7):CCGCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTG
PCR扩增获取的glmS，采用琼脂糖凝胶核酸电泳切胶回收，回收产物与表达载体pTrcHisA分别利用限制性内切酶BamH I和XhoI进行双酶切3h，酶切产物采用琼脂糖核酸电泳凝胶回收，DNA和线性化质粒大小分别为3183、4405bp，然后采用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化至JM109感受态细胞中，挑取单菌落PCR验证，阳性转化子进行测序，比对正确，证明表达载体构建成功，质粒命名为pTrcHisA-glmS。
实施例2：表达载体pTrcHisA-glmS-gna1的构建
本发明所用的氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1来源于S.cerevisiae BY4741，将S.cerevisiae BY4741接种于25mLYeast Extract Peptone Dextrose Medium(YPD)液体培养基，在30℃，200rpm培养12h，收集菌体，采用真菌基因组提取试剂盒提取酵母菌株的基因组DNA。
根据已公布的基因组信息序列，分别设计序列如SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9引物对gna1-S/gna1-A，以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取gna1基因。
gna1-S(SEQ ID NO.8):ACTCGAGATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAG
gna1-A(SEQ ID NO.9):AAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGC
PCR扩增获取的gna1，采用琼脂糖凝胶核酸电泳切胶回收，回收产物与表达载体pTrcHisA-glmS分别利用限制性。内切酶XhoI和Hind III进行双酶切3h，酶切产物采用琼脂糖核酸电泳凝胶回收，DNA和线性化质粒大小分别为480、4370bp，然后采用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化至JM109感受态细胞中，挑取单菌落PCR验证，阳性转化子进行测序，比对正确，证明表达载体构建成功，质粒命名为pTrcHisA-glmS-gna1。
实施例3：弱化乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子的基因nagE基因组编辑片段的构建
为了实现对乙酰氨基葡萄糖转运子基因nagE的翻译，起始密码子ATG采用TTG替换优化，借助Red同源重组技术构建基因组编辑片段。基因编辑片段包括上下游同源臂区域、抗性筛选盒。以E.coli MG1655基因组为模板，设计序列如SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11引物对nagE-S1/nagE-A1扩增nagE基因，以质粒pKD4为模板，设计序列如SEQ ID NO.12/SEQID NO.13引物对nagE-S2/nagE-A2扩增抗性筛选基因Kan，然后对以上PCR产物采用琼脂糖核酸凝胶电泳切胶回收，以回收得到的nagE基因和Kan作为模板，nagE-S1/nagE-A2为引物对进行融合PCR得到含有起始密码子为TTG的nagE基因编辑片段。
将pKD46质粒转化进入表达宿主E.coli MG1655感受态细胞中，通过菌落PCR筛选得到重组菌株E.coli MG1655-pKD46，然后将纯化得到的nagE基因编辑片段采用电转的方法转入重组菌株E.coli MG1655-pKD46感受态细胞中，采用50μg/mL的Kan抗性平板筛选得到阳性转化子。最后借助温敏型质粒pCP20热诱导FLP重组酶表达消除nagE-Kan表达盒中的Kan抗性基因，成功得到了弱化表达乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子基因nagE的重组菌株E.coli MG1655-nagET。
引物序列信息：5’→3’方向
nagE-S1(SEQ ID NO.10):GAATAAGTTGAATATTTTAGGTTTTTTCCAG
nagE-A1(SEQ ID NO.11):GAAGCAGCTCCAGCCTACACATTACTTTTTGATTTCATAC AGCGG
nagE-S2(SEQ ID NO.12):CCGCTGTATGAAATCAAAAAGTAATGTGTAGGCTGGAGC TGCTTC
nagE-A2(SEQ ID NO.13):ATTGTTGGATGCGACGCTCAAGCGTCGCATCAGGCATAAAGCAGACATATGAATATCCTCCTTAG
实施例4：弱化甘露糖磷酸转运子的基因manX基因组编辑片段的构建
为了实现对乙酰氨基葡萄糖转运子基因manX的翻译起始密码子ATG采用TTG替换优化，借助Red同源重组技术构建基因组编辑片段。基因编辑片段包括上下游同源臂区域、抗性筛选盒。以E.coli MG1655基因组为模板，设计序列如SEQ ID NO.14/SEQ ID NO.15引物对manX-S1/nagE-A1扩增manX基因，以质粒pKD4为模板，设计序列如SEQ ID NO.16/SEQID NO.17引物对manX-S2/manX-A2扩增抗性筛选基因Kan，然后对以上PCR产物采用琼脂糖核酸凝胶电泳切胶回收，以回收得到的manX基因和Kan作为模板，manX-S1/manX-A2为引物对进行融合PCR得到含有起始密码子为TTG的manX基因编辑片段。
将pKD46质粒转化进入经过实施案例4中的重组菌株感受态细胞E.coli MG1655-nagET中，通过菌落PCR筛选得到重组菌株E.coli MG1655-nagET-pKD46，然后将纯化得到的manX基因编辑片段采用电转的方法转入重组菌株E.coli MG1655-nagET-pKD46感受态细胞中，采用50μg/mL的Kan抗性平板筛选得到阳性转化子。最后借助温敏型质粒pCP20热诱导FLP重组酶表达消除manX-Kan表达盒中的Kan抗性基因，成功得到了弱化表达乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子基因manX的重组菌株E.coli MG1655-nagET-manXT。
引物序列信息：5’→3’方向
manX-S1(SEQ ID NO.14):GCAATTGACCATTGCTATTG
manX-A1(SEQ ID NO.15):GAAGCAGCTCCAGCCTACACATTACTTATCGATTTTGC TGATCAG
manX-S2(SEQ ID NO.16):CTGATCAGCAAAATCGATAAGTAATGTGTAGGCTGGAG CTGCTTC
manX-A2(SEQ ID NO.17):CGTAAGACTTAAGTGTGAAAACTGAGTGATAATCAACACAATACGCATATGAATATCCTCCTTAG
实施例5：重组菌株E.coli MG1655-glmS-gna1的构建
将实施例2中构建完成的质粒pTrcHisA-glmS-gna1通过电转化的方法转入出发菌株E.coli MG1655中，通过氨苄青霉素筛选得到阳性菌株E.coli MG1655-glmS-gna1。
实施例6：重组菌株E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT的构建
将实施例2中构建完成的质粒pTrcHisA-glmS-gna1通过电转化的方法转入实施例4中得到的重组菌株E.coli MG1655-nagET-manXT中，通过氨苄青霉素筛选得到阳性菌株E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT。
实施例7重组菌株E.coli MG1655-glmS-gna1、E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT 5L发酵罐进行分批发酵
5L罐上发酵培养基如下：
发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸三钠1g/L，KH2PO4 3.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4.7H2O 12.8g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.6g/L，CaCl2 0.05g/L，金属离子液10mL/L；金属离子液配方为：CoCl2.6H2O 0.01mg/L，H3BO30.01mg/L，CoSO4.5H2O 0.01mg/L，FeSO4.7H2O 0.5mg/L，MnSO4.H2O 0.033mg/L，ZnSO4.7H2O0.38mg/L，NaMoO4.2H2O 0.01mg/L；补料培养基：葡萄糖800g/L。
分别挑取E.coli MG1655-glmS-gna1、E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT重组菌株进行5L罐发酵。单克隆接种于50mL(500mL摇瓶)的LB培养基种子液，并且加入浓度为100mg/mL的Amp 50μL，置于37℃200rpm的条件下培养10h。发酵罐的初始装液量为2.5L，种子接种量为5％，初始发酵条件为：培养温度为37℃，pH为7.0，后期采用NH4OH进行调控pH，搅拌速度为300rpm，通气量为1.5vvm，整个发酵过程中溶氧控制在20％的水平，补料速率为8L/h。当菌体OD600为20-30时，采用IPTG进行诱导，终浓度为0.4mM，诱导温度为30℃。
根据氨基葡萄糖的产量测定，结果如图4所示，发酵44h，重组菌株E.coli MG1655-glmS-gna1、E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT生产GlcN和GlcNAc的总量均达到了最大值，分别为56.7g/L、131.5g/L，后者葡萄糖转化率为35.1％。
实施例8重组菌株E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT 1000L发酵罐进行分批补料发酵
1000L罐上发酵培养基如下：发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸三钠1g/L，KH2PO4 3.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4.7H2O 12.8g/L，NaCl0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.6g/L，CaCl2 0.05g/L，金属离子液10mL/L；金属离子液配方为：CoCl2.6H2O 0.01mg/L，H3BO3 0.01mg/L，CoSO4.5H2O 0.01mg/L，FeSO4.7H2O 0.5mg/L，MnSO4.H2O 0.033mg/L，ZnSO4.7H2O 0.38mg/L，NaMoO4.2H2O 0.01mg/L；补料培养基：葡萄糖800g/L。
挑取E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT重组菌株进行1000L罐发酵。单克隆接种于50mL(500mL摇瓶)的LB培养基作为一级种子液，并且加入浓度为100mg/mL的Amp50μL，置于37℃200rpm的条件下培养10h。发酵罐的初始装液量为450L，种子接种量为5％，初始发酵条件为：培养温度为37℃，pH为7.0，后期采用NH4OH进行调控pH，搅拌速度为300rpm，通气量为1.5vvm，整个发酵过程中溶氧控制在20％的水平，补料速率为8L/h。当菌体OD600为20-30时，采用IPTG进行诱导，终浓度为0.4mM，诱导温度为30℃。
根据氨基葡萄糖的产量测定，结果如图5所示，发酵44h，重组菌株E.coli MG1655-glmS-gna1-nagET-manXT生产GlcN和GlcNAc的总量达到了最大值，为137g/L，葡萄糖转化率为37.7％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高效生产氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 159
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp
1 5 10 15
Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr
20 25 30
Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala
35 40 45
Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro
50 55 60
Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn
65 70 75 80
Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His
85 90 95
Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly
100 105 110
Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys
115 120 125
Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu
130 135 140
Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys
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<210> 2
<211> 159
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
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85 90 95
Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly
100 105 110
Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys
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Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu
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<210> 3
<211> 6692
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180
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caatttatca gacaatctgt gtgggcactc gaccggaatt atcgattaac tttattatta 360
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ggaaaaacta aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt ggcggtcagt tgtatgtctt 2160
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ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc 6000
cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg 6060
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<210> 4
<211> 3477
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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cgcggtgctg ccggtggcgg cactgttgct gcgattcggt cagccagatt tacttaacgt 120
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gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 3300
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gatattcata tgtctgcttt atgcctgatg cgacgcttga gcgtcgcatc caacaat 3477
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcaattgacc attgctattg ttataggcac acatggttgg gctgcagagc agttgcttaa 60
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cattgtcgtc gacaaagagc attatgaagt cattgcaggc gttaacattc caatgctcgt 300
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cgactacatg gttattggcc ttgcgcgtat cgacgaccgt ctgattcacg gtcaggtcgc 540
cacccgctgg accaaagaaa ccaatgtctc ccgtattatt gttgttagtg atgaagtggc 600
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cgtagttgat gttgccaaaa tgattcgcgt ctacaacaac ccgaaatatg ctggcgaacg 720
cgtaatgctg ttatttacca acccaacaga tgtagagcgt ctcgttgaag gcggcgtgaa 780
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tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc 2340
ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccagcttca aaagcgctct gaagttccta 2400
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggatccatg tgtggaattg ttggcg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgctcgagt tactcaaccg taaccgattt tg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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actcgagatg agcttacccg atggatttta tataag 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagcttctat tttctaattt gcatttccac gc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaataagttg aatattttag gttttttcca g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaagcagctc cagcctacac attacttttt gatttcatac agcgg 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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attgttggat gcgacgctca agcgtcgcat caggcataaa gcagacatat gaatatcctc 60
cttag 65
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ctgatcagca aaatcgataa gtaatgtgta ggctggagct gcttc 45
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<213> 人工序列
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cgtaagactt aagtgtgaaa actgagtgat aatcaacaca atacgcatat gaatatcctc 60
cttag 65

Claims (10)

1.一种生产氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，过表达氨基葡萄糖合成酶和氨基葡萄糖乙酰化酶，弱化表达乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子和甘露糖磷酸转运子。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述弱化是将编码所述乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子和甘露糖磷酸转运子的基因序列的起始密码子替换为TTG。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述弱化表达在基因组上进行。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是重组大肠杆菌。
5.根据权利要求1或4所述的基因工程菌，其特征在于，弱化起始密码子后的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子的基因nagE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；弱化起始密码子后的甘露糖磷酸转运子基因manX的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基葡萄糖乙酰化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种构建权利要求4所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，以pTrcHisA为表达载体，以大肠杆菌MG1655为宿主。
8.一种氨基葡萄糖的生产方法，其特征在于，将权利要求1-2,4,6任一所述的基因工程菌接种至发酵培养基中，培养至，OD600为20-30时添加终浓度为0.3～0.6mmol/L IPTG进行诱导，诱导温度为28～30℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵过程中，当溶氧降至最低并开始反弹，恒速补料葡萄糖。
10.权利要求1-2,4,6任一所述的基因工程菌在制备含有氨基葡萄糖的产品中的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410783A (zh) * 2018-05-29 2018-08-17 成都本则生科技有限公司 一种高密度培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法
CN110387345A (zh) * 2019-07-12 2019-10-29 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用
CN110734926A (zh) * 2019-10-24 2020-01-31 江苏大学 一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用
CN112342230A (zh) * 2019-08-06 2021-02-09 中国科学院微生物研究所 产n-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用
CN112877272A (zh) * 2021-04-28 2021-06-01 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071164A (zh) * 2010-12-08 2011-05-25 江南大学 一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其应用
CN102268399A (zh) * 2011-06-27 2011-12-07 江南大学 一种通过同源重组敲除nagE的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法
CN102286420A (zh) * 2011-06-27 2011-12-21 江南大学 一种通过同源重组敲除manX的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法
CN102947460A (zh) * 2010-03-30 2013-02-27 赢创德固赛有限公司 通过发酵生产l-鸟氨酸的方法
WO2014153253A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Glycosyn LLC Microorganisms and methods for producing sialylated and n-acetylglucosamine-containing oligosaccharides

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102947460A (zh) * 2010-03-30 2013-02-27 赢创德固赛有限公司 通过发酵生产l-鸟氨酸的方法
CN102071164A (zh) * 2010-12-08 2011-05-25 江南大学 一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其应用
CN102268399A (zh) * 2011-06-27 2011-12-07 江南大学 一种通过同源重组敲除nagE的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法
CN102286420A (zh) * 2011-06-27 2011-12-21 江南大学 一种通过同源重组敲除manX的高产氨基葡萄糖工程菌及其构建方法
WO2014153253A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Glycosyn LLC Microorganisms and methods for producing sialylated and n-acetylglucosamine-containing oligosaccharides

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOROTA A. BULIK等: "Chitin Synthesis in Saccharomyces cerevisiae in Response to Supplementation of Growth Medium with Glucosamine and Cell Wall Stress", 《EUKARYOTIC CELL》 *
GOFFEAU,A.等: "glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase [Saccharomyces cerevisiae S288c]", 《GENBANK》 *
MING-DE DENG等: "Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine", 《METABOLIC ENGINEERING》 *
刘佃磊等: "高产氨基葡萄糖基因工程菌的研究进展", 《生物技术通报》 *
夏焕章主编: "《发酵工艺学》", 31 July 2015 *
陈欣等: "Red 同源重组敲除nagE 和manX 对大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的影响", 《生物工程学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410783A (zh) * 2018-05-29 2018-08-17 成都本则生科技有限公司 一种高密度培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法
CN108410783B (zh) * 2018-05-29 2020-11-03 成都本则生科技有限公司 一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法
CN110387345A (zh) * 2019-07-12 2019-10-29 扬州日兴生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用
CN112342230A (zh) * 2019-08-06 2021-02-09 中国科学院微生物研究所 产n-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用
CN110734926A (zh) * 2019-10-24 2020-01-31 江苏大学 一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用
CN112877272A (zh) * 2021-04-28 2021-06-01 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法
CN112877272B (zh) * 2021-04-28 2021-09-21 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法

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