CN111375067A - 一种壳聚糖支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖支架及其制备方法和应用,制备方法包括以下步骤:(1)将壳聚糖溶于酸性溶液中,配制浓度≤10%(w/v)的溶液;(2)去除步骤(1)中的不溶物质,得澄清溶液;(3)将步骤(2)所得澄清溶液直接加入模具中冷冻成形;(4)经冷冻干燥得壳聚糖支架。该制备方法操作简单,无需交联,制备出的产品不包含药物或其它抗菌物质,仅运用壳聚糖支架本身特性实现杀菌抑菌效果,对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有效,且抗菌作用强,生物相容性好,可生物降解。将其作为口香糖成分,可制备得到抗菌口香糖,从而有效预防细菌导致的口腔疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌产品,具体涉及一种壳聚糖支架及其制备方法和应用。
背景技术
近年来,口腔微生态失衡逐步被证明是多种口腔疾病的主要病因,龋病和牙周炎是口腔中最常见的慢性感染性疾病,机会致病菌的增加不仅与其发生、发展密切相关,还可能进一步影响全身健康。口香糖在现代生活中广受欢迎,老少皆宜,在口腔保健方面,适当咀嚼口香糖还可显著改善口腔微环境。但目前口香糖中的抗菌成分仍存在效力不足的情况,为了更好地发挥口香糖潜在的口腔保健作用,针对病因其抗菌效力无疑应该进一步加强。
壳聚糖(chitosan,CS)由甲壳素脱乙酰基后获得,甲壳素广泛存在于虾蟹等甲壳类动物的甲壳、真菌及植物细胞壁中,是自然界中含量仅次于纤维素的一种天然多糖。壳聚糖是一种独特的可再生性聚合物,具有良好的生物相容性、生物降解性和生物粘附性,在药物传递及组织工程领域已有广泛研究。壳聚糖分子结构中存在的大量氨基,质子化后带正电荷,由于细菌表面带负电荷,两者相互作用时,壳聚糖表现出优异的抗菌活性。
目前关于壳聚糖在医药领域的应用研究中,常需加入交联剂,并同时负载药物或其它活性物质,作为载体或支架用于药物传递、组织工程或抗菌,而将不含药物或其它抗菌物质的壳聚糖支架直接作为抗菌活性成分来使用的研究几乎没有。
经文献检索,目前未见有关通过制备不含药物或其它抗菌物质的壳聚糖支架来消灭和抑制口腔常见致龋菌及牙周病原菌的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明提供一种壳聚糖支架及其制备方法和应用,本发明中的壳聚糖支架不含药物或其它抗菌物质,可以用其制备抗菌口香糖,能够有效解决现有技术中口香糖无抗菌效果或抗菌效果差,咀嚼口香糖无法有效预防细菌性口腔疾病的问题。
为了达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:提供一种壳聚糖支架的制备方法,包括以下步骤:
S1:将脱乙酰度超过70%的壳聚糖溶于酸性溶液中,配制成质量浓度≤10%的壳聚糖溶液;
S2:将壳聚糖溶液转移至模具中,于-45~-90℃下冷冻20~25h,至壳聚糖溶液完全凝固成型;
S3:对S2所得样品进行冷冻干燥处理,得壳聚糖支架。
本发明采用脱乙酰度超过70%的壳聚糖为原料,壳聚糖的脱乙酰度与壳聚糖的游离氨基数量和正电性成正相关,脱乙酰度越高,正电性就越强,而壳聚糖的抗菌活性主要来源于壳聚糖的正电性,因此,需要具有一定脱乙酰度的壳聚糖才具有抗菌活性,而70%以下脱乙酰度的壳聚糖具有较弱的抗菌活性。壳聚糖分子中的氨基被质子化后带正电,与细菌表面带负电的生物大分子具有很强的相互作用,从而破坏细菌细胞壁并干扰细菌代谢,最终导致细菌死亡。
本发明在配制壳聚糖溶液时,将浓度控制在10%以下,粘度适中,方便操作,而且最终得到的支架具有丰富的多孔蜂窝状结构,便于捕捉细菌,有利于细菌的灭杀,抑菌效果良好。
本发明在-45~-90℃下进行冷冻,温度处于较低范围,有利于转移样品至冻干机的过程中保持低温,最终支架的形态也越好。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
进一步,壳聚糖的脱乙酰度为80%~95%。
本发明中优选脱乙酰度为80%~95%的将壳聚糖,在此脱乙酰度范围内,壳聚糖不仅带有较高的正电性,能够保证得到的支架具有良好的抑菌效果,而且游离氨基相互排斥,在后续冷冻过程中形成更加丰富且稳定的蜂窝状结构,抑菌效果更好。
进一步,酸性溶液的体积浓度为0.03~3%,其溶质为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、牛磺酸、脂肪酸、己二酸、柠檬酸、苹果酸、葡萄糖酸、乳酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸和抗坏血酸中的至少一种。
进一步,壳聚糖溶液的质量浓度为1%~2%。
进一步,S2中壳聚糖溶液的冷冻温度为-80℃,冷冻时间为24h。
进一步,S3中冷冻干燥温度为-85℃,时间为24h。
进一步,壳聚糖溶液冷冻前还经过除杂处理,除杂方法为离心、过滤、抽滤或超滤。
本发明中的壳聚糖支架制备方法简单,无需通过交联等方式负载抗菌物质即可得到一种具有抑菌、抗菌的壳聚糖支架。
制备得到壳聚糖支架后,因该产品本身具有很强的抗菌作用,因此,在抗菌方面具有广泛的应用价值,例如可将其作为口香糖成分制备得到抗菌口香糖,从而有效预防细菌导致的口腔疾病。
本发明的有益效果是:本发明中壳聚糖支架制备方法简单易操作,无需交联,制备出的产品不包含药物或其它抗菌物质,仅运用壳聚糖支架本身特性实现杀菌抑菌效果,对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有效,且抗菌作用强,生物相容性好,可生物降解,解决了现有技术中的空白壳聚糖支架本身不能直接作为抗菌活性成分来使用的问题。
附图说明
图1为壳聚糖支架外观图;
图2为壳聚糖支架(0.5mg/个)微观结构图;
图3为壳聚糖支架(1mg/个)微观结构图;
图4为壳聚糖支架及交联壳聚糖支架抗变异链球菌的效果图;
图5为壳聚糖支架及交联壳聚糖支架抗牙龈卟啉单胞菌的效果图;
图6为壳聚糖支架在细菌培养基中的物理稳定性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例一
一种壳聚糖支架的制备方法,包括以下步骤:
S1:将脱乙酰度为80%的壳聚糖粉末加入浓度为2%(v/v)的丁酸溶液中,搅拌溶解,配制浓度为1%(w/v)的壳聚糖溶液;
S2:对S1所得的壳聚糖溶液进行离心处理,离心转速为20000RPM,离心时间为10min,去除不溶物等杂质;
S3:将S2所得的壳聚糖溶液加入96孔细胞培养板中,在-45℃条件下冷冻24h,使溶液完全凝固成形;
S4:对S3所得在96孔板中的冷冻样品进行冷冻干燥处理,冷冻干燥温度为-50℃,时间为24h;获得质量为0.5mg/个的壳聚糖支架产品。
分别取上述冷冻成形前的壳聚糖溶液和冷冻干燥后的壳聚糖支架拍照,结果见图1。取上述壳聚糖支架行扫描电子显微镜检查,结果见图2。
由图1可知,壳聚糖溶液为澄明溶液,壳聚糖支架为白色固体。由图2可知,壳聚糖支架在微观上为多孔蜂窝状结构。
实施例二
一种壳聚糖支架制备方法,包括以下步骤:
S1:将脱乙酰度为85%的壳聚糖粉末加入到0.01M的盐酸溶液中,搅拌溶解,得到浓度为2%(w/v)的壳聚糖溶液;
S2:对S1所得的壳聚糖溶液进行离心处理,离心转速为20000RPM,离心时间为10min,去除不溶物等杂质;
S3:将S2所得的壳聚糖溶液加入96孔细胞培养板中,在-80℃条件下冷冻24h,使溶液完全凝固成形;
S4:对S3所得在96孔板中的冷冻样品进行冷冻干燥处理,冷冻干燥温度为-85℃,时间为24h;获得质量为1mg/个的壳聚糖支架产品。
取上述壳聚糖支架,行扫描电子显微镜检查,结果见图3。
由图3可知,1mg/个的壳聚糖支架在微观上依然是多孔性蜂窝状结构,说明壳聚糖在支架中的含量不会影响其微观结构。
实施例三
一种壳聚糖支架制备方法,包括以下步骤:
S1:将脱乙酰度为95%的壳聚糖粉末加入浓度为2%(v/v)的乙酸溶液中,搅拌溶解,得到浓度分别为1%和2%(w/v)的壳聚糖溶液;
S2:对S1所得的壳聚糖溶液进行离心处理,离心转速为20000RPM,离心时间为10min,去除不溶物等杂质;
S3:将S2所得的壳聚糖溶液加入96孔细胞培养板中,在-80℃条件下冷冻24h,使溶液完全凝固成形;
S4:对S3所得在96孔板中的冷冻样品进行冷冻干燥处理,冷冻干燥温度为-85℃,时间为24h;获得质量分别为0.5mg/个和1mg/个的壳聚糖支架产品。
将革兰阳性菌变异链球菌(UA159)及革兰阴性菌牙龈卟啉单胞菌(W83)接入无菌脑心浸出液肉汤(Brain heart infusion,BHI)培养基进行传代培养,待菌株浓度适中、活力较强时,分别吸取菌液加入96孔板(Costar 3599;CorningInc.,NY),再分别加入上述0.5mg/个和1mg/个的壳聚糖支架,于37℃条件下厌氧(10%H2,10%CO2,80%N2)培养2h和6h,然后取出96孔板,分别吸取各孔内菌液100μl,梯度稀释至适当浓度后,均匀涂布在BHI琼脂固体培养基平板上,于37℃条件下培养24~48h,然后计数平板上的菌落形成数量(CFU)来观测细菌浓度,进而定量分析壳聚糖支架对细菌的杀灭效果。对变异链球菌的杀灭效果见图4,对牙龈卟啉单胞菌的杀灭效果见图5。
由图4可见,通过本发明方法制备的0.5mg/个壳聚糖支架,在2h时可显著抑制致龋菌变异链球菌的生长,在6h时具有显著的杀菌作用,可杀灭80%的细菌;另外,通过本发明方法制备的1mg/个壳聚糖支架,在2h时即具有一定的杀灭致龋菌变异链球菌的作用,可杀灭32%的细菌,在6h时则可100%杀灭细菌。
由图5可见,通过本发明方法制备的0.5mg/个壳聚糖支架,在2h时即可显著杀灭牙周病原菌牙龈卟啉单胞菌,可杀灭53%的细菌,在6h时则可杀灭94%的细菌;另外,通过本发明方法制备的1mg/个壳聚糖支架,在2h时即具有很强的杀灭牙周病原菌牙龈卟啉单胞菌的作用,可杀灭87%的细菌,在6h时则可100%杀灭细菌。
实施例四
一种壳聚糖支架制备方法,包括以下步骤:
S1:将脱乙酰度为95%的壳聚糖粉末加入到浓度为2%(v/v)的乙酸溶液中,搅拌溶解,得到浓度为1%(w/v)的壳聚糖溶液;
S2:对S1所得的壳聚糖溶液进行离心处理,离心转速为20000RPM,离心时间为10min,去除不溶物等杂质;
S3:将S2所得的壳聚糖溶液加入96孔细胞培养板中,在-80℃条件下冷冻24h,使溶液完全凝固成形;
S4:对S3所得在96孔板中的冷冻样品进行冷冻干燥处理,冷冻干燥温度为-85℃,时间为24h;获得质量为0.5mg/个的壳聚糖支架产品。
将上述壳聚糖支架与细菌培养基BHI于37℃条件下孵育7天,在不同时间点将壳聚糖支架取出,使用PBS冲洗三次,然后用2.5%戊二醛固定,4℃条件下过夜,用乙醇梯度脱水、干燥后行扫描电子显微镜检测,观察壳聚糖支架在细菌培养基中的物理稳定性,结果见图6。
由图6可知,通过本发明方法制备的壳聚糖支架在细菌培养基中孵育1天后才开始出现轻微的降解,形成少量空洞,但直到第7天仍为出现明显结构破坏,依然保持完整形态,说明其具有很好的物理稳定性。
实施例五
一种壳聚糖支架制备方法,包括以下步骤:
S1:将脱乙酰度为95%的壳聚糖粉末加入浓度为2%(v/v)乙酸溶液中,搅拌溶解,得到浓度为2%(w/v)的壳聚糖溶液;
S2:对S1所得的壳聚糖溶液进行离心处理,离心转速为20000RPM,离心时间为10min,去除不溶物等杂质;
S3:在磁力搅拌下向S2所得的壳聚糖溶液加入6%甘油磷酸钠交联壳聚糖分子,并将交联壳聚糖加入96孔细胞培养板中,在-80℃条件下冷冻24h,使溶液完全凝固成形;
S4:对S3所得在96孔板中的冷冻样品进行冷冻干燥处理,冷冻干燥温度为-85℃,时间为24h;获得质量为1mg/个的交联壳聚糖支架产品。
将革兰阳性菌变异链球菌(UA159)及革兰阴性菌牙龈卟啉单胞菌(W83)接入无菌脑心浸出液肉汤(Brain heart infusion,BHI)培养基进行传代培养,待菌株浓度适中,活力较强时,分别吸取菌液加入96孔板(Costar 3599;CorningInc.,NY),再分别加入上述1mg/个的交联壳聚糖支架,于37℃条件下厌氧(10%H2,10%CO2,80%N2)培养2h和6h,然后取出96孔板,分别吸取各孔内菌液100ul,梯度稀释至适当浓度后,均匀涂布在BHI琼脂固体培养基平板上,于37℃条件下培养24~48h,然后计数平板上的菌落形成数量(CFU)来观测细菌浓度,进而定量分析壳聚糖支架对细菌的杀灭效果。对变异链球菌的杀灭效果见图4,对牙龈卟啉单胞菌的杀灭效果见图5。
由图4可见,1mg/个交联壳聚糖支架在2h和6h时对致龋菌变异链球菌既无杀菌作用也无抑菌作用。
由图5可见,1mg/个交联壳聚糖支架在2h和6h时对牙周病原菌牙龈卟啉单胞菌既无杀菌作用也无抑菌作用。
通过上述实施例,可证明本发明所得到的壳聚糖支架具有良好的杀菌和抑菌效果,同时具有良好的物理稳定性,可以作为抑菌剂添加至口香糖中,对口腔疾病具有良好的防治效果。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述,但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内,本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.一种壳聚糖支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将脱乙酰度超过70%的壳聚糖溶于酸性溶液中,配制成质量浓度≤10%的壳聚糖溶液;
S2:将壳聚糖溶液转移至模具中,于-45~-90℃下冷冻20~25h,至壳聚糖溶液完全凝固成型;
S3:对S2所得样品进行冷冻干燥处理,得壳聚糖支架。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖支架的制备方法,其特征在于:所述壳聚糖的脱乙酰度为80%~95%。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖支架的制备方法,其特征在于:所述酸性溶液的体积浓度为0.03~3%,其溶质为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、牛磺酸、脂肪酸、己二酸、柠檬酸、苹果酸、葡萄糖酸、乳酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸和抗坏血酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖支架的制备方法,其特征在于:所述壳聚糖溶液的质量浓度为1%~2%。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖支架的制备方法,其特征在于:S2中壳聚糖溶液的冷冻温度为-80℃,冷冻时间为24h。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖支架的制备方法,其特征在于:S3中冷冻干燥温度为-85℃,时间为24h。
7.根据权利要求1所述的壳聚糖支架的制备方法,其特征在于:壳聚糖溶液冷冻前还经过除杂处理,除杂方法为离心、过滤、抽滤或超滤。
8.采用权利要求1~7任一项所述的壳聚糖支架的制备方法制备得到的壳聚糖支架。
9.如权利要求8所述的壳聚糖支架在制备抗菌口香糖中的应用。
10.一种抗菌口香糖,其特征在于:包括权利要求8所述的壳聚糖支架。
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