CN105154496A - 一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖的方法，该方法以脱乙酰度高于80%的壳聚糖为原料，溶胀后经专一性酶水解、控制反应终点、水解液浓缩、冷冻干燥等过程制备出特定分子量的水溶性壳聚糖。该方法通过控制酶添加量、反应时间和溶液粘度，可获得含量高、水溶性好、特定分子量的壳聚糖，且具有工艺简单、反应速度快、专一性强、成本低、安全环保等优点。

Description

一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖的方法。

背景技术

壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是自然界中唯一的碱性多糖，来源广泛。壳聚糖具有很多优良性能和生物活性，如生物相容性、生物可降解性、缓释和控释作用、成纤性、可纺丝性、抗癌性、止血性、抗菌性等等，因此，在医药、农业、环保、食品、化妆品等诸多领域具有很大的应用价值，尤其在医学领域可以作为医用敷料、药物载体、牙科材料等，市场潜力巨大。但是，普通的壳聚糖分子量多为几十万甚至上百万，具有较强的氢键和较高的结晶性，难溶于水和一般的有机溶剂，进而导致其研究及推广应用受到了很大的限制。研究表明，当壳聚糖分子量降到一定程度时，其许多特殊功能才表现出来。因此，水溶性壳聚糖乃至不同分子量、不同功能的壳聚糖成为近年来研究的热点。

据文献报道，水溶性壳聚糖的制备方法可归纳为三种：一是通过控制甲壳素的脱乙酰度及脱乙酰条件，获得较高分子量的水溶性壳聚糖；二是在壳聚糖分子链上引入亲水性基团或进行接枝，获得不同结构的水溶性壳聚糖；三是在适当条件下，将壳聚糖解聚，获得分子量较低的水溶性壳聚糖。目前，前两种方法的应用居多，但存在过程复杂、试剂消耗量大、分子量不可控等缺点。第三种方法是将壳聚糖降解，获得水溶性壳聚糖。壳聚糖降解的方法主要有化学法、物理法和酶法，其中化学降解法是一类广泛应用于大规模生产的方法，主要有酸降解法和氧化降解法，但此法同样存在较多缺点，如试剂消耗量大，水解程度不易控制，产物分子量不集中，产物不易溶解，易造成环境污染等。相比而言，酶法具有明显的优势，如工艺简单，对设备要求不高，反应条件温和，反应速度快、专一性强，水解程度及水解产物相对分子质量易于控制，产品纯度高、水溶性好，安全环保等，但是现有技术中相应酶法解聚壳聚糖的报道还很少，如何开发出更好且更利于控制的酶法来解聚壳聚糖成为亟待解决的问题之一。

目前，市场上有酶法制备的壳寡糖产品、化学法制备的水溶性壳聚糖或壳聚糖衍生物产品(也称水溶性壳聚糖)。从产品特性来看，它们都存在不同程度的缺陷或不足，或水溶性好、生物活性不高、应用效果不显著，或水溶性较差、应用范围有限等等。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖的方法，该方法以脱乙酰度高于80％的壳聚糖为原料，溶胀后经专一性酶水解、控制反应终点、水解液浓缩、冷冻干燥等过程制备出特定分子量的水溶性壳聚糖。该方法通过控制酶添加量、反应时间和溶液粘度，可获得含量高、水溶性好、特定分子量的壳聚糖，且具有工艺简单、反应速度快、专一性强、成本低、安全环保等优点。

本发明的具体技术方案是：

以脱乙酰度高于80％的壳聚糖为原料，利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖，具体步骤如下：

(1)粘均分子量曲线的获得

先配制w/v2％的壳聚糖溶液，之后利用已知酶和技术将其水解制备成一系列特定分子量的壳聚糖，测定反应液粘度和粘均分子量，以反应液粘度和粘均分子量绘制曲线；

(2)溶胀：取壳聚糖原料于反应容器中，用水配制成w/v2％～8％的壳聚糖溶液，加酸调节溶液的pH为4～6，不断搅拌，于40℃～60℃水浴中溶胀60～120分钟；

(3)水解：按照壳聚糖质量以0.1U/g～6U/g的比例在反应容器中加入酶，开始反应，至理论酶解完全时间之前10～15分钟，开始每间隔5分钟取样一次，取样稀释至反应液浓度为w/v2％，测定其溶液粘度，至预定粘度后水解过程结束，之后利用沸水浴灭酶10-30分钟，结束反应，即得特定分子量的壳聚糖溶液；上述水解过程控制在60～150分钟；

(4)干燥：将上述壳聚糖溶液冷却，经4000r/min～12000r/min离心机离心或滤布过滤，获得的壳聚糖澄清溶液直接喷雾干燥，或经旋转蒸发器浓缩至1/2～1/4体积后冷冻干燥，即得固体水溶性壳聚糖；

最终获得的固体水溶性壳聚糖，其含量为91.5-98.5％(w/w)；

在上述溶胀过程中，配制的壳聚糖溶液浓度应根据制备的目标水溶性壳聚糖的粘均分子量而定。若制备5kDa～150kDa的目标产物，配制的壳聚糖溶液浓度应为w/v6％～8％；若制备150kDa～350kDa的目标产物，配制的壳聚糖溶液浓度应为w/v2％～4％。

在上述壳聚糖的水解过程中，可采用液体酶，也可采用固定化酶，均能达到高效降解壳聚糖的目的，若制备5kDa～150kDa的目标产物，按照壳聚糖质量以0.5U/g～6U/g的比例加入酶；若制备150kDa～350kDa的目标产物，按照壳聚糖质量以0.1U/g～0.5U/g的比例加入酶。所述的酶一般选自固体发酵壳聚糖酶粗酶粉、液体发酵壳聚糖酶粗酶、含有壳聚糖酶粗酶的发酵液、吸附树脂固定化壳聚糖酶、壳聚糖内切酶等可从市场上直接购得的壳聚糖酶。

在上述反应过程控制中，加酶量和反应时间的控制：酶的用量越大反应时间越短，对于制备特定分子量的壳聚糖(尤其是大分子量的壳聚糖)来说，反应越不易控制。因此，水解反应时间最好控制在60～150分钟，根据反应时间和酶活，按以上所述加入酶；

溶液粘度的控制：先配制一定浓度的壳聚糖溶液，制备一系列特定分子量的壳聚糖，测定该浓度下反应液粘度和粘均分子量，以反应液粘度和粘均分子量绘制曲线，再根据反应液粘度可制备任意特定分子量的壳聚糖。

在具体测定实时粘度时，壳聚糖原料溶液的浓度应该与测定曲线时壳聚糖溶液的浓度相同，不同时则需要对其进行调整。

上述制备的5kDa～350kDa特定粘均分子量的壳聚糖与市场上水溶性壳聚糖(实为壳聚糖衍生物，且分子量和应用范围有限)的不同之处在于，其均溶于水，且水溶性好(溶解性见表1)，为真正意义上的水溶性壳聚糖，产品分子量不同，功能也不同，可满足各种应用需求。同时，与专利CN201210300863中的壳寡糖相比，反应过程加酶量要缩小2.4-40倍，且反应时间短，能耗和成本低，生物活性好，产品多样，应用广泛。

且与现有技术相比，本发明所采用的酶均为市场上常规可以购得的常用酶，发明人主要是利用长期研究的成果，利用对酶解条件的控制，将酶解的最终产物从壳寡糖控制为了壳聚糖，获得了真正意义上的水溶性壳聚糖，且可以根据需要随机控制水溶性壳聚糖的分子量。

综上所述，本发明提供的方法通过控制酶添加量、反应时间和溶液粘度，可获得含量高、水溶性好、特定分子量的壳聚糖，且具有工艺简单、反应速度快、专一性强、成本低、安全环保等优点。

附图说明

图1为分子量＞50kDa的壳聚糖粘均分子量与溶液粘度曲线；

图2为分子量≤50kDa的壳聚糖粘均分子量与溶液粘度曲线。

具体实施方式

实施例1

首先配制w/v为2％的壳聚糖溶液，之后利用固定化壳聚糖酶和技术将其水解制备成一系列特定分子量的壳聚糖，测定反应液粘度和粘均分子量，以反应液粘度和粘均分子量绘制曲线，所述曲线如图2所示；

将壳聚糖30g(脱乙酰度93％)加入反应容器中，用水配制成1.5Lw/v为2％的壳聚糖溶液，加醋酸调节溶液的pH值为4.5，于40℃～60℃水浴中保温60min进行溶胀；

溶胀充分后，加入6U/g壳聚糖质量的固定化壳聚糖酶，40℃～60℃条件下开始反应，以粘度为控制点，至溶液粘度为3.1mPa·s时停止反应，水解时间为125min，沸水浴灭酶10min，60℃减压浓缩、冷冻干燥，获得壳聚糖26g，根据反应液粘度和粘均分子量曲线推算壳聚糖粘均分子量为10kDa。称取此壳聚糖0.2g，加水1mL即溶，可见所获得的即为水溶性壳聚糖。

实施例2

首先配制w/v为2％的壳聚糖溶液，之后利用固定化壳聚糖酶和技术将其水解制备成一系列特定分子量的壳聚糖，测定反应液粘度和粘均分子量，以反应液粘度和粘均分子量绘制曲线，所述曲线如图2所示；

将壳聚糖30g(脱乙酰度93％)加入反应容器中，用水配制成1.5L2％的壳聚糖溶液，加醋酸调节溶液的pH值为4.5，于40℃～60℃水浴中保温60min进行溶胀；

溶胀充分后，加入4U/g壳聚糖质量的固定化壳聚糖酶，40℃～60℃条件下开始反应，以粘度为控制点，至溶液粘度为10.6mPa·s时停止反应，水解时间为116min，沸水浴灭酶10min，60℃减压浓缩、冷冻干燥，获得壳聚糖25g，根据反应液粘度和粘均分子量曲线推算壳聚糖粘均分子量为50kDa。称取此壳聚糖0.2g，加水1mL即溶，可见所获得的即为水溶性壳聚糖。

实施例3

首先配制w/v为2％的壳聚糖溶液，之后利用固定化壳聚糖酶和技术将其水解制备成一系列特定分子量的壳聚糖，测定反应液粘度和粘均分子量，以反应液粘度和粘均分子量绘制曲线，所述曲线如图1所示；

将壳聚糖30g(脱乙酰度93％)加入反应容器中，用水配制成1.5L2％的壳聚糖溶液，加醋酸调节溶液的pH值为4.5，于40℃～60℃水浴中保温60min进行溶胀；

溶胀充分后，加入1U/g壳聚糖质量的固定化壳聚糖酶，40℃～60℃条件下开始反应，以粘度为控制点，至溶液粘度为196mPa·s时停止反应，水解时间为108min，沸水浴灭酶10min，60℃减压浓缩、冷冻干燥，获得壳聚糖25g，根据反应液粘度和粘均分子量曲线推算壳聚糖粘均分子量为100kDa。称取此壳聚糖0.2g，加水2mL即溶，可见所获得的即为水溶性壳聚糖。

表1壳聚糖水溶性比较

由上表可见本发明制备的水溶液壳聚糖溶解度与现有技术持平，但是溶解时间明显短于现有技术，可获得含量高、水溶性好、特定分子量的壳聚糖，且具有工艺简单、反应速度快、专一性强、成本低、安全环保等优点。

Claims (4)

1.一种利用酶法制备特定分子量水溶性壳聚糖的方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)粘均分子量曲线的获得

先配制w/v2％的壳聚糖溶液，之后利用已知酶和技术将其水解制备成一系列特定分子量的壳聚糖，测定反应液粘度和粘均分子量，以反应液粘度和粘均分子量绘制曲线；

(2)溶胀：取壳聚糖原料于反应容器中，用水配制成w/v2％～8％的壳聚糖溶液，加酸调节溶液的pH为4～6，不断搅拌，于40℃～60℃水浴中溶胀60～120分钟；

(3)水解：按照壳聚糖质量以0.1U/g～6U/g的比例在反应容器中加入酶，开始反应，至理论酶解完全时间之前10～15分钟，开始每间隔5分钟取样一次，取样稀释至反应液浓度为w/v2％，测定其溶液粘度，至预定粘度后水解过程结束，之后利用沸水浴灭酶10-30分钟，结束反应，即得特定分子量的壳聚糖溶液；上述水解过程控制在60～150分钟；

(4)干燥：将上述壳聚糖溶液冷却，经4000r/min～12000r/min离心机离心或滤布过滤，获得的壳聚糖澄清溶液直接喷雾干燥，或经旋转蒸发器浓缩至1/2～1/4体积后冷冻干燥，即得固体水溶性壳聚糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的壳聚糖原料为脱乙酰度大于80％的壳聚糖。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶胀过程所述调节pH的酸为盐酸或乙酸或硝酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)水解过程所述酶为壳聚糖酶或甲壳素酶或甲壳素脱乙酰酶其中的一种或两种。