CN111374936A - 多元液体体系制备雪莲细胞提取物的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多元液体体系制备雪莲细胞提取物的方法，主要采用水、丁二醇、丙二醇多元液体体系对天山雪莲细胞中有效成分进行提取，所述的丁二醇特指的是1,3‑丁二醇，丙二醇指的是1,3‑丙二醇；在多元液体体系中，丁二醇的浓度范围为0‑70%，丙二醇的含量为0‑70%，水的含量为20‑90%。该方法避免了完全水提和乙醇提取产生的不利因素，增加了产品的稳定性，提高了产品质量，同时由于丁二醇、丙二醇本身的护肤功效，使得天山雪莲细胞在化妆品中护肤功效更为突出。
Description
技术领域
本发明属于植物提取生物技术领域，涉及一种多元液体体系制备雪莲细胞提取物的方法及其用途。
背景技术
天山雪莲分布于中国新疆天山南北山坡、阿尔泰山及昆仑山，海拔为4000―5000米高的地带。是一种优良的中药材，对于***、牙痛、风湿性关节炎、阳痿、白带异常、血崩等疾病均有疗效。雪莲种子在摄氏零度时发芽，3－5°C时生长，幼苗可经受−21°C的严寒。其虽然要生长5年才能开花，但实际上主要生长时期仅有8个月。近几年由于滥采滥挖，雪莲数量大幅减少，为国家濒危二级保护植物。
野生天山雪莲价格昂贵，其使用受到限制。通过植物细胞培养技术培养的天山雪莲具有使用成本低，功效含量高的特点。本发明是建立在天山雪莲细胞的基础上进行雪莲细胞功效成分的提取及其应用。
现有专利多以天山雪莲细胞多采用水提或乙醇提取的方式进行功效活性成分的提取，但是水提工艺易导致提取液颜色变深，同时水提物中含有大量糖类，在使用到化妆品制作的过程中，易受多元醇的影响，生成沉淀；而乙醇提取物，由于乙醇本身的刺激性，在化妆品制作过程中，使用受限，通常乙醇试剂中带有甲醇，在使用之前要进行甲醇含量测试，增加了产品的使用成本。
发明内容
本发明采用水、丁二醇、1,3-丙二醇多元液体体系对天山雪莲细胞中有效成分进行提取，避免了完全水提和乙醇提取产生的不利因素，增加了产品的稳定性，提高了产品质量，同时由于丁二醇、丙二醇本身的护肤功效，使得天山雪莲细胞在化妆品中护肤功效更为突出。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种多元液体体系制备雪莲细胞提取物的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）准确称取10g的雪莲细胞鲜细胞，分别加入不同浓度的多元溶剂进行提取，提取温度为70-100℃，提取时间1-3h或常温浸提放置24h，然后进行6500rpm 进行离心10-15min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物；
（2）对不同浓度比例的多元溶剂提取的提取物进行成分分析检测；
所述的提取方法包括高温提取、浸提和超声提取；
所述的不同浓度的多元溶剂指的是：在多元体系中，丁二醇所占浓度比例为0-70%，丙二醇所占浓度比例为0-70%，水所占浓度比例为20-90%。
所述的丁二醇特指的是1,3-丁二醇，丙二醇指的是1,3-丙二醇。
本发明所述的方法，其中提取使用的天山雪莲细胞为干燥后的天山雪莲细胞或含有水分的天山雪莲鲜细胞。
本发明进一步公开了采用所述方法制备的雪莲细胞提取物在提高雪莲细胞抗氧化抗炎保湿效果方面的应用，实验结果显示雪莲细胞提取物具有明显的抗氧化、抗炎和保湿功效。
对比试验：
结论：采用本发明制备的雪莲细胞提取物本身具有防腐效果和较强的稳定性，并且是含糖含量与水相比降低了很多，同时避免了乙醇提取物中乙醇带来的刺激性和甲醇的含量检测。
本发明主要解决了目前市场主要以水或乙醇为主要提取溶剂制备雪莲提取物，重点考察了在雪莲细胞提取物制备过程中，多元溶剂中的丁二醇、丙二醇和水的不同浓度比例，主要的难点在于多元溶剂中三者溶剂的比例研究。
本发明更加详细的描述如下：
1、准确称取10g的雪莲细胞鲜细胞，分别加入50mL的水、乙醇、丁二醇、丙二醇、多元溶剂（水:丁二醇:丙二醇=5:2:3（m:m:m））不同溶剂进行提取，提取温度为100℃（其中乙醇为沸腾76℃），提取时间1h，之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物，对不同溶剂提取的提取物进行成分分析检测，平行检测3次，其检测方法和检测结果如下：
总黄酮检测方法：
1）绘制标准曲线：准确称取10mg芦丁对照品，甲醇溶解，定容100mL, 配制0.2mg/mL的芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5与6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加4%氢氧化钠试液10 mL，加纯水定容至25mL，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照分光光度法，在500 nm的波长处测定吸收度。
2）样品总黄酮含量测定：对不同溶剂天山雪莲细胞提取物采用如上方法进行总黄酮含量检测，计算总黄酮含量。
总酚酸检测方法：
1）绘制标准曲线：准确称取绿原酸2.7mg，无水乙醇溶解，定容10mL，精密吸取对照品溶液200、300、400、500、600、700与800uL，分别置于25 mL量瓶中，各加无水乙醇至5mL；加入0.3%十二烷基硫酸钠溶液2mL，摇匀，加入0.9%铁***，0.6%三氯化铁溶液混合液1mL，摇匀，暗处放置5分钟，加入0.1mol/L盐酸溶液至刻度线，摇匀，在暗处放置20min。以加入无水乙醇5mL体积的溶液为空白，在760nm的波长处测定吸收度，以吸收度与其对应的质量计算线性回归方程，Y=kx+b。
2）样品总酚酸含量测定：对不同溶剂天山雪莲细胞提取物采用如上方法进行总酚酸含量检测，计算总酚酸含量。
总糖检测方法：
1）绘制标准曲线：精密称取无水葡萄糖100mg，加水溶解，定容100mL。精密量取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6和0.8mL，置于10 mL具塞试管中，蒸馏水补足至1.0 mL，之后加入4.0 mL的蒽酮硫酸溶液，将具塞试管置于沸水浴中反应10min，立刻冷却，室温放置10min，对反应后的样品进行吸光度检测，检测波长620nm。以葡萄糖质量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，以吸收度与其对应的质量计算线性回归方程，Y=kx+b。
2）样品总糖含量测定：对不同溶剂天山雪莲细胞提取物采用如上方法进行总糖含量检测，计算总糖含量。
表1 不同溶剂提取对天山雪莲细胞提取物中成分的影响（UV检测）
表2 不同溶剂提取对天山雪莲细胞提取物中成分的影响（UPLC检测）
2、准确称取10g的雪莲细胞鲜细胞，分别加入不同浓度比例的多元溶剂进行提取，其比例分别为：① 水:丁二醇:丙二醇=1:1:0；② 水:丁二醇:丙二醇=1:0:1；③ 水:丁二醇:丙二醇=0:1:1，常温浸提放置24h后，进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物，对不同浓度比例的多元溶剂提取的提取物进行成分分析检测，平行检测3次，其检测结果如下：
表3 不同溶剂提取对天山雪莲细胞提取物中成分的影响（UV检测）
表4 不同溶剂提取对天山雪莲细胞提取物中成分的影响（UPLC检测）
3、准确称取10g的雪莲细胞鲜细胞，分别加入不同浓度比例的多元溶剂进行提取，其比例分别为：① 水:丁二醇:丙二醇=1:1:1；② 水:丁二醇:丙二醇=2:1:1；③ 水:丁二醇:丙二醇=5:2:3，提取温度为100℃，提取时间1h，之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物，对不同浓度比例的多元溶剂提取的提取物进行成分分析检测，平行检测3次，其检测结果如下：
表5不同溶剂提取对天山雪莲细胞提取物中成分的影响（UV检测）
表6 不同溶剂提取对天山雪莲细胞提取物中成分的影响（UPLC检测）
1、抗氧化功效实验
样品制备：准确称取1g的雪莲细胞干细胞，加入30倍体积的多元溶剂进行提取，其中水:丁二醇:丙二=5:2:3（m:m:m），提取温度为100℃，提取时间1h，之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物，对其进行氧自由基清除实验。
DPPH氧自由基清除实验
DPPH乙醇溶液的配制：准确称取3.94mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成0.1mM的DPPH溶液，低温（0-4℃）避光保存。量取不同体积的天山雪莲细胞提取物加入到3mL DPPH溶液中，混合均匀，之后加水补足至4mL，517nm下测其吸光度，计算其清除率，计算公式如下：
其中A对照为不加样品溶液，只加入1.0mL纯化水的吸光度；A样品为不同体积样品溶液的吸光度。
实验结果如图1所示，天山雪莲细胞提取物对DPPH自由基具有较强的氧自由基清除能力。
ABTS自由基清除功效实验
所需溶液配制:7.4 mM ABTS溶液：准确称取0.0384 g ABTS 置于 10 mL 棕色容量瓶中，纯化水定容；2.6 mM 过硫酸钾溶液：准确称取0.0066 g 过硫酸钾置于10 mL 容量瓶中，纯化水定容；ABTS 工作液：7.4 mM ABTS溶液与 2.6 mM 过硫酸钾溶液以体积比1:1混合，室温条件下避光静置12 h备用，使用前用80%乙醇溶液稀释至吸光度为0.7±0.02。
样品对ABTS氧自由基的清除实验，准确量取不同体积的天山雪莲细胞提取物，加入到3.4mL的ABTS工作液中，之后加水定容至4.0mL,混合均匀，室温静置30 min，之后在734nm 下进行分光光度检测，通过吸光度变化计算其清除率，计算公式如下：
其中A对照为不加样品溶液，只加入1.0mL纯化水的吸光度；A样品为不同体积样品溶液的吸光度。
实验结果如图2所示，结果表明天山雪莲细胞提取物对ABTS的氧自由基具有很好的清除率，同时表明天山雪莲细胞提取物具有显著的自由基清除能力。
2、抗炎功效实验
样品制备：准确称取1g的雪莲细胞干细胞，加入30倍体积的多元溶剂进行提取，其中水:丁二醇:丙二醇=5:2:3（m:m:m），提取温度为100℃，提取时间1h，之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物，对其进行抗炎功效实验。
细胞培养：RAW 264.7小鼠巨噬细胞培养于高糖DMEM培养基中，培养基中添加10%胎牛血清、1%的双抗，培养环境为37℃，5%CO2。根据细胞生长状态进行传代或换液。
NO和IL-6含量测定：收集对数生长期细胞，并调整浓度为4×105个细胞/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μl，培养过夜。弃去培养液，分为3个组：空白组、LPS模型组和天山雪莲细胞提取物实验组。LPS模型组和EWH提取物实验组加入180μl含有1μg/mLLPS的含血清的DMEM培养液，培养1h。之后天山雪莲细胞提取物实验组分别加入20μl的不同浓度的天山雪莲细胞提取物，空白组和LPS实验组加入不含血清的DMEM培养基20μl。每组各做5个平行孔，刺激维持24 h后，吸取96孔板中的培养上清液50μl，按照ELISA试剂盒的方法测定上清液中的NO和IL-6的含量。
实验如图3和4表示，结果表明：天山雪莲细胞提取物可以明显降低LPS诱导的巨噬细胞中的NO和IL-6的含量，具有抑制炎症发生的作用
3、保湿功效实验
样品制备：准确称取10g的雪莲细胞干细胞，加入30倍体积的多元溶剂进行提取，其中水:丁二醇:丙二醇=8:1:1（m:m:m），提取温度为100℃，提取时间1h，之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物，对上清液进行干燥，获得干燥粉末。上清液进行保湿实验，干燥粉末进行吸湿实验。
保湿功效实验
准确量取5.0g的水、天山雪莲细胞提取物、20%甘油，分别放入装有变色硅胶的干燥器和装有饱和碳酸钠溶液的干燥器中，每隔一段时间称重。
保湿率（%）=M2/M1*100，其中，M2：放置后重量，M1：放置前重量。
结果如表7所示，实验结果表明，与水相比，天山雪莲细胞提取物能够降低水分的挥发量，具有一定的保湿功效
表7 天山雪莲细胞提取物保湿实验
吸湿功效实验：准确称取1.0g的天山雪莲细胞提取物干燥粉末3份，放到烘箱中烘干，然后将干燥后样品放入到装有饱和碳酸钠溶液的干燥器中，每隔一段时间后称重。
吸湿率=（M1-M0）/m0 *100%，其中 M1为吸湿后样品质量，M0为吸湿前样品质量
实验结果如表8所示，结果表明，天山雪莲在24h时吸湿达到饱和，吸湿率为16.08%，具有一定的吸湿效果。
表8 天山雪莲细胞提取物不同时间的吸湿率
本发明公开的多元液体体系制备雪莲细胞提取物的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明采用含有不同浓度丁二醇和丙二醇的水溶液作为溶剂对其进行提取， 在多元液体体系下制备的天山雪莲细胞提取物主要用于具有清除氧自由基、保湿、抗炎的化妆品产品中。
（2）本发明避开了水提带来含糖量高、提取液颜色不稳定，和乙醇提取带来的刺激性等不利因素，采用水、丁二醇、丙二醇多元液体体系对天山雪莲细胞中有效成分进行提取，避免了完全水提和乙醇提取产生的不利因素，增加了产品的稳定性，提高了产品质量。同时，含有丁二醇、丙二醇的水溶液多元体系，既含有水极性溶剂，又含有丁二醇、丙二醇这样的弱极性溶剂，使其在提取时，既能提取出极性的功效成分，又能增强弱极性的功效成分的提取率(紫丁香苷)，使其成分浓度发生变化。
附图说明
图1 DPPH氧自由基清除实验；
图2 ABTS自由基清除实验；
图3 天山雪莲细胞提取物对巨噬细胞中NO含量的影响；
图4 天山雪莲细胞提取物对巨噬细胞中IL-6含量的影响；
图5多元液体体系制备雪莲细胞提取物的工艺路线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
多元液体体系制备雪莲细胞提取物的方法：
准确称取10g的雪莲细胞鲜细胞，分别加入50mL的水、乙醇、丁二醇、丙二醇、多元溶剂水:丁二醇:丙二醇=5:2:3（m:m:m）不同溶剂进行提取，提取温度为100℃（其中乙醇为沸腾76℃），提取时间1h，之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物。
实施例2
准确称取10g的雪莲细胞鲜细胞，分别加入30 mL的多元溶剂进行提取，其质量比分别为水:丁二醇:丙二醇=1:1:1（m:m:m），进行提取，提取温度为100℃（其中乙醇为沸腾76℃），提取时间1h，之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物
实施例3
准确称取10g的雪莲干细胞，分别加入60mL的多元溶剂进行提取，多元溶剂的质量比分别为水:丁二醇:丙二醇=1:2:3（m:m:m），常温浸提24h, 之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物。
实施例4
准确称取10g的雪莲鲜细胞，分别加入50mL的多元溶剂进行提取，多元溶剂的质量比分别为水:丁二醇:丙二醇=1:2:3（m:m:m），超声提取30min，超声温度为60℃， 之后进行6500rpm 进行离心10min，保留上清液，即为天山雪莲细胞提取物。
实施例5
准确称取山嵛醇30g，聚甘油-10五硬脂酸酯 20g，单硬脂酸甘油酯 20g，蜂蜡 50g，鲸蜡硬脂醇50g, 牛油果树果脂60g，甘油40g，丁二醇20g，卡波姆5g，羟苯甲酯5g，尿囊素2g，雪莲细胞提取物30g，纯化水670g，制备雪莲细胞提取物保湿霜。将制备的雪莲细胞提取物保湿霜给女性志愿者使用，使其根据使用后效果进行评价， 女性志愿者表示产品的保湿效果很好，滋润度比较好，同时能够浅化眼角皱纹。
Claims (3)
1.一种多元液体体系制备雪莲细胞提取物的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）准确称取一定质量的雪莲细胞，加入不同浓度的多元溶剂进行提取，之后进行离心或抽滤，获得清澈透明液体，即为天山雪莲细胞提取物；
（2）对不同浓度的多元溶剂提取的提取物进行成分分析检测；所述的提取方法包括高温提取、浸提和超声提取；所述的不同浓度多元溶剂指的是：在多元体系中，丁二醇所占浓度比例为0-70%，丙二醇所占浓度比例为0-70%，水所占浓度比例为20-90%；所述的丁二醇特指的是1,3-丁二醇，丙二醇指的是1,3-丙二醇。
2.权利要求1所述的方法，其中提取使用的天山雪莲细胞为干燥后的天山雪莲细胞或含有水分的天山雪莲鲜细胞。
3.采用权利要求1所述方法制备的雪莲细胞提取物用于具有抗氧化、抗炎和保湿功效的化妆品中。
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