CN117838579A - 角质形成细胞丝聚蛋白基因flg的表达促进剂 - Google Patents

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CN117838579A CN202311867755.7A CN202311867755A CN117838579A CN 117838579 A CN117838579 A CN 117838579A CN 202311867755 A CN202311867755 A CN 202311867755A CN 117838579 A CN117838579 A CN 117838579A
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Abstract

本发明提供了一种角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂，其中，所述表达促进剂是卷柏水提物，所述卷柏水提物采用水作为提取溶剂，通过回流法萃取，减压浓缩后获得卷柏水提物。本发明还涉及角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂的制备方法及其在皮肤外用剂中的应用。

Description

角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂
技术领域
本发明涉及化妆品原料功效研究领域，具体涉及一种来源于中药卷柏的具有上调皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG表达的水提物，可以作为化妆品活性物原料和皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG表达的促进剂。
背景技术
皮肤位于人身体的最外侧，不仅防御者外界物质侵入体内，也防止身体内营养物质和水分的流失，因此维持皮肤的正常生理功能至关重要。皮肤的表皮不是静止状态的，而是处于不断增殖、分化和死亡脱落的动态的过程，周期一般为28天左右。
皮肤表皮主要是角质形成细胞组成，约占表皮细胞的90％。不同分化程度的角质形成细胞和死亡的角化细胞按照分化阶段和形态可以分为4层，从表皮底部到顶部(外侧)依次为基底层、棘层、颗粒层和角质层。
角质形成细胞的分化过程，实际上是一个受到基因调控的终末分化过程，在分化过程中有上百个基因参与和调控板层小体形成、角化包膜的形成、脂质合成等过程。例如，与表皮角质形成细胞角化包膜形成相关的丝聚蛋白基因FLG、兜甲蛋白基因LOR等，与脂质合成相关的HMGCoA还原酶基因HMGCR、脂肪酸合酶基因FASN等，与细胞间紧密连接相关的闭锁小带蛋白-1基因ZO-1、水闸蛋白1基因CLDN1、闭锁蛋白基因OCLN等。
丝聚蛋白(Filaggrin，FLG)是存在于人表皮角质形成细胞内的一种易溶于水的酸/中性蛋白，分子量大小约为37000，是构成真核细胞骨架细胞细丝间的基质蛋白。丝聚蛋白FLG与其它几种蛋白一起交联成一个机械坚固的角化包膜，为细胞外脂质基质提供支架。因此，丝聚蛋白FLG对于角质层的结构和机械完整性非常重要。丝聚蛋白的前体是丝聚蛋白原(Profilaggrin)，后者不溶于水，在表皮颗粒层细胞内合成后参与形成透明角质颗粒。当细胞从颗粒层到角质层后，丝聚蛋白原迅速去磷酸化，最终成为可溶性的丝聚蛋白，随着角质细胞成熟脱水，丝聚蛋白分解并在其他酶类的作用下产生大量的天然保湿因子，这对皮肤的水合作用和低通透性功能的维持至关重要。
闭锁小带蛋白-1(Zona occludens-1，ZO-1)于1986年首次被鉴定，属于闭锁小带(ZO)家族，该家族还包括另外两个成员ZO-2和ZO-3。ZO-1蛋白是一种支架蛋白，为细胞间连接的细胞质表面组装多蛋白复合物提供了结构基础，可以将完整的膜蛋白与丝状细胞骨架连接起来，使细胞间紧密连接形成网状结构。ZO-1与紧密连接的其他蛋白密切相关，如果ZO-1受到破坏，紧密连接的功能就会发生改变，影响各种组织的通透性功能。除此之外，ZO-1蛋白还参与调节细胞物质转运、维持上皮极性等重要过程。
这些蛋白在皮肤表皮结构和功能中具有重要作用，因此研究和开发能够调控表皮细胞分化相关基因表达的活性物/成分，提升相关蛋白在皮肤表皮内的表达，对于促进损伤皮肤表皮功能的重建和恢复皮肤表皮正常生理功能具有积极的意义和重要的应用价值。
卷柏属(Selaginella)植物隶属蕨类植物门石松纲(Lycopsida)卷柏科(Selaginellaceae)，在全世界分布约有700余种，我国约有70余种，广泛分布于全国各地。卷柏(Selaginella tamariscina)和垫状卷柏(Selaginella pulvinata)为2020年版中国药典收载品种。卷柏，拳拳如鸡足，但生命力极强，遇水而荣，故又名九死还魂草、还魂草、复活草、长生草、回阳草、见水还阳草。
卷柏的研究价值得利于其顽强的生命力和富含的化学成分，现代药理研究表明卷柏属植物具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗炎、抗衰老、降血糖等多种药理活性，但关于卷柏在皮肤表皮功能重建及恢复皮肤表皮正常生理功能方面的研究和专利还较少。
在研究卷柏水提物的功能和活性作用过程中，意外地发现，卷柏水提物有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用，具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
发明内容
一方面，本发明提供了一种角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂，其中，所述表达促进剂是卷柏水提物，所述卷柏水提物采用水作为提取溶剂，通过回流法萃取，减压浓缩后获得卷柏水提物。
在优选的实施方式中，所述卷柏水提物采用干燥全草提取。
在优选的实施方式中，所述卷柏水提物中总糖含量≥32wt％，总多酚含量≥2.34wt％，和/或总黄酮含量≥1.76wt％。
在优选的实施方式中，所述卷柏水提物中穗花杉双黄酮的含量至少为0.4wt％。在一个具体的实施方式中，所述卷柏水提物中穗花杉双黄酮的含量为0.4482wt％。
在优选的实施方式中，所述卷柏水提物的促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的相对表达量≥150％，优选地150-209％。
在优选的实施方式中，所述卷柏水提物的HPLC分析图谱的主要峰的保留时间(峰面积％)为：UV＝250nm：峰1：1.294(0.3166)；峰2：1.781(0.9466)；峰3：2.272(7.8658)；峰4：2.513(0.4031)；峰5：2.666(3.4483)；峰6：3.136(1.8813)；峰7：3.539(3.2933)；峰8：4.637(1.9662)；峰9：4.927(3.3443)；峰10：8.832(1.7380)；峰11：9.985(5.1095)；峰12：10.227(1.0910)；峰13：10.462(0.4211)；峰14：10.817(4.2998)；峰15：11.265(2.5141)；峰16：11.688(0.3587)；峰17：11.908(0.6187)；峰18：12.193(0.3443)；峰19：12.451(0.2847)；峰20：12.758(0.5144)；峰21：12.928(0.9179)；峰22：13.105(1.6252)；峰23：13.272(0.2161)；峰24：13.451(0.7592)；峰25：13.630(1.0120)；峰26：13.856(0.3543)；峰27：14.018(0.2768)；峰28：14.599(0.5120)；峰29：14.846(0.8212)；峰30：15.797(1.0628)；峰31：19.133(2.4363)；峰32：22.017(27.7223)；峰33：25.234(1.4764)；峰34：38.200(2.8180)；峰35：49.971(1.9913)；峰36：53.693(3.2685)；峰37：54.129(3.0708)；峰38：54.800(3.7379)；峰39：55.776(0.8058)；峰40：56.045(4.3554)。
在优选的实施方式中，所述卷柏水提物的分散浓度为0.1％时的电导率为96.2μS/cm，优选地分散浓度为1％时的电导率为813.0μS/cm。
在优选的实施方式中，所述表达促进剂的使用浓度至少为0.125mg/ml，优选地0.125-1.0mg/mL。
另一方面，本发明提供了所述表达促进剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)提供卷柏，粉碎，过筛，烘干；
(b)用水浸泡；
(c)回流法萃取；
(d)过滤至浓缩罐，减压浓缩，得到卷柏水提物。
在优选的实施方式中，所述步骤(a)采用100目筛实现过筛。
在优选的实施方式中，所述步骤(b)采用的料液比为1kg卷柏:10L水。
又一方面，本发明还涉及所述表达促进剂在皮肤外用剂中的应用，用于促进角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达。
在优选的实施方式中，所述皮肤外用剂选自：面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾清洁泡、喷雾、沐浴露、或洗面奶。
附图说明
图1显示了卷柏水提物浸膏实物图。
图2显示了穗花杉双黄酮标准品HPLC分析图谱c＝0.50000mg/mL。
图3显示了穗花杉双黄酮标准品HPLC分析图谱c＝0.25000mg/mL。
图4显示了穗花杉双黄酮标准品HPLC分析图谱c＝0.12500mg/mL。
图5显示了穗花杉双黄酮标准品HPLC分析图谱c＝0.06250mg/mL。
图6显示了穗花杉双黄酮标准品HPLC分析图谱c＝0.03125mg/mL。
图7显示了穗花杉双黄酮标准品标准曲线。
图8显示了卷柏水提物浸膏的HPLC分析图谱。
图9显示了卷柏水提物浸膏的HPLC分析图谱峰面积百分比。
发明详述
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但本文描述的是优选的方法和材料。对于本发明的目的，下面定义了以下术语。
本文所用术语“约”指与参比品的数量、水平、数值、维度、大小或用量相比，差异可高达30％、20％或10％的数量、水平、数值、维度、大小或用量。本文所使用的百分含量，除非另有说明，均以重量计。
在全篇说明书和权利要求书中，除非另有要求，以下词语“包含”和其变体“含有”和“包括”应理解为意指包括所述的整体或步骤，或一组整体或步骤，但不排除任何其它整体或步骤，或其它一组整体或步骤。
本发明是基于以下意外发现：卷柏水提物有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用，具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
本发明的有益效果在于，发现一种中药卷柏的水提物，可以作为角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的促进剂，卷柏水提物易获得、成本低，具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效，具有重要的应用价值，可应用于多种化妆品产品的开发和应用，赋予化妆品产品具有皮肤表皮功能重建及恢复皮肤表皮正常生理功能的功效和作用。
卷柏水提物
本发明所述卷柏水提物，也可描述为卷柏水提物浸膏。
本发明意外地发现，卷柏水提物具有上调皮肤表皮细胞丝聚蛋白基因FLG表达的作用。因此，卷柏水提物可以作为皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂应用于多种化妆品产品的开发和应用，赋予化妆品产品具有皮肤表皮功能重建及恢复皮肤表皮正常生理功能的功效和作用。
本申请首次研究发现，卷柏水提物具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效，可以用作一种角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂。而且，该丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂易获得、成本低，具有重要的应用价值。
本发明采用双蒸水回流法萃取卷柏的有效成分，并通过减压浓缩获得卷柏水提物。
在一些实施方式中，卷柏水提取的制备过程包括以下步骤：
(a)提供卷柏，粉碎，过筛，烘干；
(b)用双蒸水浸泡；
(c)双蒸水回流法萃取；
(d)过滤至浓缩罐，减压浓缩除去溶剂，得到卷柏水提物浸膏。
本发明中采用的生药卷柏于2023年5月购买于四川荷花池中药材市场兴智药行，其为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring的干燥全草。
在优选的实施方式中，步骤(a)采用100目筛实现过筛。在优选的实施方式中，步骤(b)采用的料液比为一千克卷柏:10升溶剂。在优选的实施方式中，步骤(c)的萃取温度为75-85℃，例如80℃。在优选的实施方式中，步骤(c)的萃取时间为30分钟至8小时，例如30分钟至6小时，30分钟至4小时，30分钟至2小时，30分钟至1小时。本发明的卷柏水提物浸膏为棕褐色膏状物质。
在优选的实施方式中，卷柏水提物中总糖含量≥32wt％，总多酚含量≥2.34wt％，和/或总黄酮含量≥1.76wt％。
在一些实施方式中，丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂的使用浓度至少为0.125mg/ml，例如0.125-1mg/ml。
在一些实施方式中，丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂的使用浓度优选小于1.8mg/ml。
皮肤外用剂
在一些实施方式中，卷柏水提物可用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，包括但不限于面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾(清洁泡)、喷雾、沐浴露和洗面奶等剂型的产品。
卷柏水提物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.05％-3％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-2％(w/w)。
在具体的实施方式中，卷柏水提物可用于个人护理清洁类产品的制备。所述个人清洁护理品优选为洗去型清洁产品组合物，包括但不限于婴幼儿的沐浴露、洗发露、洗发沐浴露、儿童洗手液及成人的沐浴露、洗发露、洗手液以及洁面乳等剂型的产品的制备。如果在产品形态改变，如做成粉体、块状、糊状、条状、片状等，或者中间体等，也纳入本申请的植物提取物的应用范畴之内。
卷柏水提物在个人清洁护理品中的重量百分比为0.01％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.02％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.05％-2％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-2％(w/w)。
皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆品组合物。所述化妆品组合物中可以是基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品、头发护理用化妆品等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。所述化妆品组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
包含卷柏水提物的皮肤外用剂可局部施用至人皮肤和/或毛发。该皮肤外用剂还可包含美容上可接受的局部用载体，该局部用载体可为皮肤外用剂的约50重量％至约99.99重量％(如皮肤外用剂的约80重量％至约99重量％)。在本发明的一个优选的实施例中，美容上可接受的局部用载体包括水。美容上可接受的局部用载体可包括一种或多种选自润湿剂、润肤剂、油脂、湿润剂以及相似物质。在一个实施例中，美容上可接受的局部用载体包括诸如无纺布或膜材料之类的基材。
可将皮肤外用剂制备成多种产品类型，包括但不限于洗剂、霜剂、凝胶剂、棒剂、喷雾剂、油膏剂、清洁液体洗剂和固体皂剂、洗发剂和毛发调理剂、毛发固定剂、糊剂、泡沫剂、粉末剂、摩丝、剃须膏、擦拭物、贴剂、水凝胶、成膜产品、面膜和皮肤膜剂、膜剂和化妆品如粉底以及睫毛膏。这些产品类型可含有几种类型的美容上可接受的局部用载体，包括但不限于溶液、悬浮液、乳液(例如微乳液和纳米乳液)、凝胶、固体和脂质体。
包含卷柏水提物的皮肤外用剂可配制成溶液剂。溶液剂通常包含水性溶剂或有机溶剂(例如，约50％至约99.99％或约90％至约99％的美容上可接受的水性溶剂或有机溶剂)。合适的有机溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、1,2,4-丁三醇、山梨醇酯、1,2,6-己三醇、乙醇以及它们的混合物。
皮肤外用剂可配制成包含润肤剂的溶液。此类皮肤外用剂优选包含约2％至约50％的一种或多种润肤剂。如本发明所用，“润肤剂”指用于预防或减轻干燥，例如通过防止皮肤水分经皮肤损失的物质。润肤剂的例子包括但不限于植物油、矿物油、脂族酯等。
洗剂可由这种溶液制备。洗剂通常含有约1％至约20％(例如，约5％至约10％)的一种或多种润肤剂和约50％至约90％(例如，约60％至约80％)的水分。
可以由溶液配制的另一类型的产品是霜剂。霜剂通常含有约5％至约50％(例如，约10％至约20％)的一种或多种润肤剂和约45％至约85％(例如，约50％至约75％)的水分。
尽管优选的是包含卷柏水提物的皮肤外用剂包含水，但作为另一种选择该皮肤外用剂可以是无水的或为不包含水而是有机和/或有机硅溶剂、油脂、类脂和蜡的油膏剂。油膏剂可含有动物或植物油或半固体烃的简单基料。油膏剂可含有约2％至约10％的一种或多种润肤剂和约0.1％至约2％的一种或多种增稠剂。
可将该皮肤外用剂配制为乳剂。如果局部用载体是乳液，则约1％至约10％(如约2％至约5％)的该局部用载体含有一种或多种乳化剂。乳化剂可以为非离子型、阴离子型或阳离子型。合适的乳化剂的例子包括个人护理和化妆品配方领域中通常鉴定为合适乳化剂的那些。
洗剂和霜剂可配制成乳剂。通常这类洗剂含有0.5％至约5％的一种或多种乳化剂。这种霜剂通常含有约1％至约20％(如约5％至约10％)的一种或多种润肤剂；约20％至约80％(如30％至约70％)的水；以及约1％至约10％(如约2％至约5％)的一种或多种乳化剂。
水包油和油包水型单乳液护肤制剂，例如洗剂和霜剂是化妆品领域所熟知的，并且可用于本发明。多相乳状液皮肤外用剂(例如水包油包水型和油包水包油型)也可用于本发明。通常，此类单相乳状液或多相乳状液含有水分、润肤剂和乳化剂作为其基本成分。
包含卷柏水提物的皮肤外用剂还可配制成凝胶剂(例如，使用合适的胶凝剂的水性凝胶、醇类凝胶、醇/水型凝胶或油性凝胶)。用于水性凝胶和/或醇类凝胶的适当胶凝剂包括但不限于天然树胶、丙烯酸和丙烯酸酯聚合物和共聚物以及纤维素衍生物(例如羟甲基纤维素和羟丙基纤维素)。用于油(例如矿物油)的适当胶凝剂包括但不限于氢化丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物和氢化乙烯/丙烯/苯乙烯共聚物。这种凝胶剂通常含有约0.1重量％和5重量％之间的这类胶凝剂。
包含卷柏水提物的皮肤外用剂也可配制成固体制剂(例如蜡基棒剂、条皂、粉剂或含有粉剂的擦拭物)。
除了上述组分外，可用于本发明的皮肤外用剂还可含有多种在常规上以其技术领域确定的水平用于在皮肤和毛发上使用的皮肤外用剂中的其他油溶性物质和/或水溶性物质。
本发明的皮肤外用剂可以包含在皮肤护理组合物中通常能找到的附加组分，例如润肤剂、皮肤调节剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、螯合剂等，只要它们与皮肤外用剂中其他的组分在物理上和化学上相容、且不影响本发明的卷柏水提物的效果即可。
在本发明的皮肤外用剂的一些实施方式中，可使用一种或多种防腐剂。适宜的防腐剂包括对羟基苯乙酮、C1-C4对羟基苯甲酸烷基酯和苯氧基乙醇。基于组合物总重量，防腐剂的用量为大约0.5至大约2重量％，优选大约0.5至1重量％。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种抗氧化剂。适宜的抗氧化剂包括丁化羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸棕榈酸酯(BHA)、丁羟茴醚、苯基-α-萘基胺、氢醌、没食子丙酯、去甲二氢愈创木酸、维生素E或维生素E的衍生物、维生素C及其衍生物、泛酸钙、绿茶提取物和混合的多酚，以及上面所述的物质的混合物。所使用的抗氧化剂是组合物总重量的大约0.02至0.5重量％，更最优选的是从大约0.002至0.1重量％的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种润肤剂，通过其保持在皮肤表面上或在角质层中的能力，起到润滑剂的作用，以减少剥落，改善皮肤的外观。典型的润肤剂包括脂肪酯、脂肪醇、矿物油、聚醚硅氧烷共聚物等等。适宜的润肤剂的例子非限定地包括，聚丙二醇(“PPG”)-15十八烷基醚，PPG-10十六烷基醚，Steareth-10，Oleth-8，PPG－4十二烷基醚，维生素E醋酸酯，羊毛脂，鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯，羟基硬脂酸辛脂，二甲基聚硅氧烷，以及它们的组合。鲸蜡醇，鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯，十六十八醇，甘油硬脂酸酯以及它们的组合是优选的。使用时，润肤剂是基于组合物总重量的大约0.1至大约30重量％，优选大约1至大约30重量％的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种保湿剂。保湿剂也称为湿润剂，其有助于提高润肤剂的效果，减少剥落，刺激组成的鳞皮的去除和提高皮肤触感。可使用多元醇作为保湿剂，包括但并不限于，甘油，聚亚烷基二醇，亚烷基多元醇及其衍生物，包含丁二醇、丙二醇、双丙二醇，聚丙三醇，聚乙二醇及其衍生物，山梨醇，羟丙基山梨醇，己二醇，1,3－二丁二醇，1,2,6-己三醇，乙氧基化甘油，丙氧基化甘油，以及它们的组合。使用时，基于组合物的总重量，保湿剂的用量为大约0.1至大约20重量％，优选是大约1至大约15重量％。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种乳化剂。乳化剂可在有效稳定量的范围内使用。优选地，在组合物总重量的基础上，以大约1.0至大约10.0重量％，更优选的是大约3.0至大约6.0重量％的用量来使用乳化剂。可以使用任何与组合物中的组分相容的乳化剂。适宜的乳化剂包括硬脂酸，鲸蜡醇，甘油硬脂酸酯，卵磷脂，十八烷醇，Steareth-2，Steareth-20，丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，以及它们的组合。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中，可使用一种或多种pH调节剂。本发明的皮肤外用剂中有益的pH调节剂包括氨丁三醇。使用时，基于组合物的总重量pH调节剂的用量为大约0.1至大约2重量％，优选是大约0.1至大约1重量％。
在本发明的一个具体实施方式中，皮肤外用剂包含丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、甘油、对羟基苯乙酮、甘油硬脂酸酯和卵磷脂、十六/十八醇、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、氨丁三醇或它们的组合。
具体实施方式
下面结合具体的实施例和比较例进一步阐述本发明。但是，这些实施例和比较例仅用于说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。下列实施例和比较例中未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按照重量计。
实施例1：卷柏水提物浸膏制备
本发明采用双蒸水加热回流法萃取卷柏的有效成分，并通过减压浓缩获得卷柏水提物浸膏。
1.药材与仪器
药材：生药卷柏于2023年5月购买于四川荷花池中药材市场兴智药行，其为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring的干燥全草。
实验仪器：450型粉碎机购自山东摩克立粉体技术设备有限公司，200L提取浓缩设备Y-TN-200L购自上海宇砚机械设备有限公司。
2.卷柏水提物浸膏制备
1)卷柏全草晒干后，用粉碎机进行机械粉碎，并过100目筛和烘干。
2)准确称取9.5kg粉末样品置提取罐中，以料液比为1∶10(1kg药材10L溶剂)加入双蒸水，摇匀并浸泡充分。
3)在回流提取浓缩设备中进行加热回流萃取1h，温度为80℃，提取1次。
4)在提取罐口添加纱布过滤药渣至浓缩罐，减压浓缩除去溶剂，得到卷柏水提物浸膏。
5)进行分装并称量，共计得到水提物浸膏1.88kg(见表1)，卷柏水提物浸膏为棕褐色膏状物质(实物见图1)。
表1：卷柏水提物浸膏提取的生药投入量、得量和提取得率
实施例2：卷柏水提物浸膏电导率测试
本发明对实施例1制备的卷柏水提物浸膏样品的水溶液进行电导率测试。
电导率是以数字表示溶液传导电流的能力。纯水的电导率很小，当水中含有无机酸、碱、盐或有机带电胶体时，电导率就增加。电导率常用于间接推测水中带电荷物质的总浓度。水溶液的电导率取决于带电荷物质的性质和浓度、溶液的温度和粘度等。
1.仪器与试剂
仪器：电导率仪(SevenExcellence型)、电导电极(InLab 731-ISM)购自瑞士梅特勒公司，电子天平(SQP)购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
试剂：超纯水(18kΩ·cm)。
2.测试方法
1)样品待测液制备：
0.1％样品待测液：烧杯中称取0.1-0.2g样品(称准至0.001g)，加入999倍克重超纯水，放置在超声波清洗器内边震荡边用玻棒搅拌，使样品尽可能分散均匀，形成质量分数为0.1％的样品待测液。
1％样品待测液：烧杯中称取样品1-2g(称准至0.001g)，加入99倍克重超纯水，放置在超声波清洗器内边震荡边用玻棒搅拌，使样品尽可能分散均匀，形成质量分数为1％的样品待测液。
3.测定电导率
将经过校准的电导电极直接***样品水溶液，按读数，待读数稳定后即为测定结果，同时记录测试温度。
4.测试结果
采用电导仪对卷柏水提物浸膏的两种分散浓度的待测液进行测试，结果见表2。测试结果显示分散浓度为0.1％卷柏水提物浸膏待测液电导率为96.2μS/cm，分散浓度为1％的卷柏水提物浸膏待测液电导率为813.0μS/cm。
表2：卷柏水提物浸膏水溶液电导率
实施例3：卷柏水提物浸膏HPLC分析
本发明采用HPLC方法对实施例1制备的卷柏水提物浸膏样品进行化学成分表征。
高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是以液体为流动相，采用高压输液***，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。HPLC具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、稳定性和重现性好、流动相选择性广、色谱柱可反复使用等特点，而且不受样品挥发度和热稳定性的限制，适用范围广，随着高效液相色谱仪的普及，应用越来越广泛，目前己成为植物成分分析的常用方法。
1.仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪(Agilent 1260)购自美国Agilent公司，电子天平(SQP)购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
试剂：穗花杉双黄酮标准品(CAS号：1617-53-4，纯度98％)购自南京源植生物科技有限公司，甲醇(色谱纯)购自上海星可高纯溶剂有限公司。
2.测定方法
1)穗花杉双黄酮标准品溶液的制备
精密称取穗花杉双黄酮标准品2.5mg于5mL容量瓶用甲醇定容并摇匀，配置成0.5mg/mL的溶液，作为标准品备用溶液。
2)样品溶液的制备：精密称取卷柏水提物浸膏10mg，加入甲醇定容至1mL，超声，补足失重，摇匀，配置成10mg/mL的溶液，用0.45μm滤膜过滤。
3)色谱条件：
色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18，250*4.6mm，5μm；
流动相：A:水；B:甲醇；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：250nm；
进样体积：10μL；
溶剂：甲醇(色谱级)；
梯度：0-5min，10％ B；5-10min，10-60％ B；10-20min，60-70％ B；20-30min，保持70％ B；30-45min，70-80％ B；45-50min，80-100％ B；50-53min，保持100％ B。
4)穗花杉双黄酮标准曲线的建立
精密吸取不同体积的穗花杉双黄酮标准品贮备溶液，配置成0.50000mg/mL、0.25000mg/mL、0.12500mg/mL、0.06250mg/mL、0.03125mg/mL，按照3)项中的色谱条件依次进样，绘制标准曲线。
3.测试结果
1)穗花杉双黄酮标准曲线
不同浓度(0.50000mg/mL、0.25000mg/mL、0.12500mg/mL、0.06250mg/mL、0.03125mg/mL)穗花杉双黄酮标准品溶液对应的HPLC图谱见图2-6，峰面积见表3。对以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行线性回归，得回归方程:Y＝29983X-369.62(R2＝0.9988)。结果表明，在0.03125～0.50000mg/mL范围内，穗花杉双黄酮峰面积与进样浓度具有良好的线性关系，见图7。
表3：不同浓度穗花杉双黄酮标准品HPLC图谱峰面积
2)实施例1制备的卷柏水提物浸膏的HPLC分析图谱结果见图8-9。HPLC分析图谱主要峰用相对保留时间(峰总面积％)来表示，保留时间以分钟计算。卷柏水提物浸膏的HPLC分析图谱的主要峰的保留时间(峰总面积％)为：UV＝250nm：峰1：1.294(0.3166)；峰2：1.781(0.9466)；峰3：2.272(7.8658)；峰4：2.513(0.4031)；峰5：2.666(3.4483)；峰6：3.136(1.8813)；峰7：3.539(3.2933)；峰8：4.637(1.9662)；峰9：4.927(3.3443)；峰10：8.832(1.7380)；峰11：9.985(5.1095)；峰12：10.227(1.0910)；峰13：10.462(0.4211)；峰14：10.817(4.2998)；峰15：11.265(2.5141)；峰16：11.688(0.3587)；峰17：11.908(0.6187)；峰18：12.193(0.3443)；峰19：12.451(0.2847)；峰20：12.758(0.5144)；峰21：12.928(0.9179)；峰22：13.105(1.6252)；峰23：13.272(0.2161)；峰24：13.451(0.7592)；峰25：13.630(1.0120)；峰26：13.856(0.3543)；峰27：14.018(0.2768)；峰28：14.599(0.5120)；峰29：14.846(0.8212)；峰30：15.797(1.0628)；峰31：19.133(2.4363)；峰32：22.017(27.7223)；峰33：25.234(1.4764)；峰34：38.200(2.8180)；峰35：49.971(1.9913)；峰36：53.693(3.2685)；峰37：54.129(3.0708)；峰38：54.800(3.7379)；峰39：55.776(0.8058)；峰40：56.045(4.3554)。
3)根据穗花杉双黄酮标准品标准曲线回归方程Y＝29983X-369.62和卷柏水提物浸膏中穗花杉双黄酮峰面积974.27094mAU*s(图9中峰32)，计算得到卷柏水提物浸膏中穗花杉双黄酮的浓度为0.044821764mg/mL；卷柏水提物浸膏甲醇溶液配制浓度10mg/mL，则卷柏水提物浸膏中穗花杉双黄酮的质量分数含量为0.4482％。
实施例4：卷柏水提物浸膏成分分析
本发明主要对实施例1制备的卷柏水提物浸膏的总糖、总多酚和总黄酮的含量进行分析。
植物提取物中所含的成分种类繁多，其所含化合物分为许多不同的类型，如糖类、酚类、黄酮类、萜类化合物、生物碱等等。通过对植物中不同化学成分的研究，可以初步了解其潜在的应用价值。
1.总糖含量分析
总糖含量的测定(苯酚-硫酸法)参考《GB/T 15672-2009食用菌中总糖含量的测定》。
1.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：葡萄糖标准品购自美国Fluka公司，苯酚、浓硫酸(分析纯)购自国药集团药业股份有限公司。
5％苯酚溶液：称取5g苯酚，用水溶解于100mL容量瓶中，定容后摇匀，转至棕色瓶，置4℃冰箱中避光贮存。
1.2测定方法及计算分析
1)葡萄糖储备液的制备：精确称取10mg葡萄糖于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，即得100mg/L的葡萄糖储备溶液。
2)葡萄糖标准液的制备：精确移取葡萄糖储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分别置于5支具塞试管中，用蒸馏水补至1mL。配制成的溶液浓度分别为20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液1mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的葡萄糖标准液及样品溶液中分别加入5％苯酚溶液1mL，盖上塞子摇匀，同时将试管置于冰浴中冷却，并立即缓慢滴加浓硫酸5mL，摇匀后置于冰浴中冷却10min。然后置于沸水浴中加热15min，取出后用流动水冷却至室温。同时作一空白参比，即另以1mL蒸馏水重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中，在489nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以葡萄糖标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总糖含量，每个样品平行测定二次。
1.3结果计算
式中：
c──待测样品中总糖含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
2总多酚含量分析
总多酚含量的测定(福林酚法)参考《T/AHFIA 005-2018植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》。
2.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：没食子酸标准品(CAS号：149-91-7)购自美国Sigma公司，福林酚试剂购自上海麦克林生化科技股份有限公司、碳酸钠购自国药集团药业股份有限公司。
15％碳酸钠溶液：精确称取15g无水碳酸钠，用水溶解定容至100mL。
0.25N福林酚试剂：取25mL福林酚试剂，用水定容至100mL。
2.2测定方法及计算分析
1)没食子酸储备液的制备：精确称取20mg没食子酸于1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容到1000mL，即得20mg/L的没食子酸储备溶液。
2)没食子酸标准液的制备：精确移取没食子酸储备液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL分别置于5支具塞试管中，用蒸馏水补至2.5ml。配制成的溶液浓度分别为4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液2.5mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的没食子酸标准液及样品溶液中分别加入0.25N福林酚试剂2.5mL，盖上塞子摇匀，再加入15％碳酸钠溶液2.5mL，摇匀后置于40℃水浴中放置60min，取出恢复至室温。同时作一空白参比，即另以2.5mL蒸馏水重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中，在756nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以没食子酸标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总多酚含量，每个样品平行测定二次。
2.3结果计算
式中：
c──待测样品中总多酚含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
3总黄酮含量分析
总黄酮含量的测定(硝酸铝法)参考《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则(2020年版)》中《十五、保健食品中总黄酮的测定》的第二法。
3.1仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计(Cary 100Conc)购自美国VARIAN公司，电热恒温水槽(DK-8AX)购自上海一恒科学仪器有限公司。
试剂：芦丁标准品购自上海源叶生物科技有限公司，亚硝酸钠、九水硝酸铝、氢氧化钠购自国药集团药业股份有限公司。
5％亚硝酸钠溶液：称取5.0g亚硝酸钠，加水溶解成100mL。
10％硝酸铝溶液：称取硝酸铝17.6g，加水溶解成100mL。
1mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4.0g，加水溶解成100mL。
3.2测定方法及计算分析
1)芦丁储备液的制备：精确称取10mg芦丁于50mL容量瓶中，用甲醇定容到50mL，即得200mg/L的芦丁储备溶液。
2)芦丁标准液的制备：精确移取芦丁储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分别置于5支具塞试管中，用甲醇补至1mL。配制成的溶液浓度分别为40μg/mL，80μg/mL，120μg/mL，160μg/mL，200μg/mL。
3)样品溶液的制备：精确称取待测样品0.1-1.0g于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。若样品含有不溶物时，需进行超声促溶，并过滤去除不溶物。精确移取该样品溶液1mL(若浓度超出测量范围，可再稀释一定倍数)于具塞试管中，待测。
4)标准曲线的制作及样品的测定：在上述配制的芦丁标准液及样品溶液中分别加入5％亚硝酸钠溶液0.2mL，盖上塞子摇匀，室温放置6min；再加入10％硝酸铝溶液0.2mL，摇匀后室温放置6min；再加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL，摇匀；加水补至5mL，摇匀，室温放置15min。同时作一空白参比，即另以1mL甲醇重复上述操作。将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中(必要时样品溶液可过滤后使用)，在500nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以芦丁标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的总黄酮含量，每个样品平行测定二次。
3.3结果计算
式中：
c──待测样品中总黄酮含量(μg/mL)；
V0──样品初始定容体积(mL)；
n──样品溶解定容后的稀释倍数；
m0──样品初始称取质量(g)。
4卷柏水提物浸膏成分含量测试结果
采用3.1、3.2、3.3中的方法进行测试，结果显示实施例1制备的卷柏水提物浸膏中总糖含量为32％；总多酚含量为23379mg/kg，质量分数约为2.34％；总黄酮含量为17559mg/kg，质量分数约为1.76％。结果汇总见表4。
表4：卷柏水提取物浸膏成分分析结果汇总
实施例5：细胞毒性测试
本发明采用MTT方法对实施例1制备的卷柏水提物浸膏进行细胞毒性测试，分析卷柏水提物浸膏在角质形成细胞培养体系中的最大无毒剂量。
细胞毒性检测，是指利用细胞培养技术，采用细胞毒性试验评价测试样品引起的细胞死亡、细胞生长抑制或者细胞方面其他的影响。在本发明中，通过细胞毒性测试分析计算出样品在测试细胞体系中的最大无毒剂量，为样品在进行其它功效测试时的浓度提供指导，保证后续测试的可行性和数据的有效性。本发明中细胞毒性测试采用的是MTT方法。
MTT方法是常用的一种测试样品细胞毒性和细胞存活和增殖的方法。MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。其主要原理为利用细胞线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐进行转化，然后通过酶标仪进行检测。具体的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，沉积在细胞中，而死细胞没有此功能。二甲基亚砜(DMSO)能够将沉积在细胞中的甲瓒溶解，形成紫色溶液，然后在酶联免疫检测仪中检测570nm波长处的OD值(也可用490nm)，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
1.细胞、仪器与试剂
细胞：角质形成细胞来源于广东博溪生物科技有限公司。
主要仪器：CO2培养箱(150I)购自美国Thermo公司，超净工作台(SW-CJ-1F)购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，酶标仪(Epoch)购自美国BioTek公司、倒置显微镜(CKX53)日本Olympus公司。
主要试剂：KcGrowth培养液(货号：08030021)购自广东博溪生物科技有限公司，MTT(货号：M5655)购自美国Sigma公司，DMSO(货号：D4540-1L)购自美国Sigma公司，PBS(货号：P1010)购自北京索莱宝科技有限公司。
2.测试方法
1)细胞接种：复苏细胞后，待铺板率达到60％左右时，接种细胞至96孔板，CO2培养箱(37℃、5％ CO2)中孵育过夜。
2)试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
3)配液：按测试浓度设定表(表5)配制不同浓度的样品工作液。若样品不溶于水时，需用DMSO配置相应浓度的100倍母液，再用培养基进行稀释至所需浓度。
表5：卷柏水提物浸膏配置浓度情况
4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在CO2培养箱(37℃、5％ CO2)中培养24h。
5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。
3.计算分析
1)细胞相对活力计算：根据公式计算，
2)样品最大无毒剂量计算：根据公式计算，/>
式中：
AL──细胞活力值高于70％的最大样品浓度对应的细胞活力值(％)；
AH──细胞活力值低于70％的最小样品浓度对应的细胞活力值(％)；
CH──细胞活力值低于70％的最小样品浓度(mg/mL)；
CL──细胞活力值高于70％的最大样品浓度(mg/mL)。
4细胞毒性测试结果
细胞毒性测试结果见表6。
按照细胞活力值为70％时为最大无毒剂量进行计算分析，卷柏水提物浸膏在角质形成细胞处理中的最大无毒剂量为1.855mg/mL。
表6：卷柏水提物浸膏细胞毒性测试结果
实施例6：卷柏水提物浸膏调控FLG基因测试
本发明采用基因表达定量检测方法分析实施例1制备的卷柏水提物浸膏对角质形成细胞FLG基因的调控情况。
HaCaT细胞是由角质形成细胞培育而来的人类永生化表皮细胞，是非肿瘤来源的人正常皮肤永生化角质形成细胞株，与正常人角质形成细胞分化特性相似。HaCaT细胞系常用于研究皮肤表皮的增殖、迁移和分化机制，以及研究活性物对角质形成细胞的影响。本研究通过将含有多个浓度样品的培养液处理HaCaT细胞24小时，然后收集细胞总核糖核酸(RNA)，采用RNA反转录技术和基因表达定量检测方法对丝聚蛋白基因FLG相对表达量进行检测，进而评估样品是否具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
1.细胞、试剂耗材与仪器
主要细胞株：人永生化角质形成细胞株HaCaT来源于广东博溪生物科技有限公司。
主要试剂耗材：胎牛血清、细胞培养基高糖DMEM、抗生素混合物(PSN)、0.25％胰酶-EDTA购自美国ThermoFisher公司；总RNA抽提试剂TRIzol购自美国ThermoFisher公司；反转录试剂盒iScript cDNA Synthesis Kit、荧光实时定量PCR试剂iTaqTMUniversalGreen Supermix购自美国Bio-rad公司；六孔板购自美国Corning公司。
主要仪器：超微量紫外分光光度NanoDrop ONE购自美国ThermoFisher公司，基因扩增仪C1000 Touch、实时定量PCR仪CFX Connect购自美国Bio-rad公司。
2.测试方法
1)细胞接种：将HaCaT细胞接种在六孔板中，每孔接种3-5×105个细胞，放入CO2培养箱(37℃、5％ CO2)中继续培养24h。
2)样品配置：用细胞培养基配置不同浓度的样品工作液，配置浓度小于最大无毒剂量。若样品不溶于培养基时，需用DMSO配置相应浓度的100倍母液，再用培养基进行稀释至所需浓度。
3)给药孵育：吸去旧培养液，在空白对照孔中加入2mL培养液，样品组每孔加入2mL含有相应浓度样品的培养液，给药完成后，将六孔板放入CO2培养箱(37℃、5％ CO2)中继续培养24h。
4)提取总RNA：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，吸去缓冲液；加入1mL TRIzol试剂，吹打裂解，转移到1.5mL无RNA酶离心管；在离心管中加入0.2mL氯仿，剧烈振荡，静置10min后，低温高速离心15min；用无RNA酶的移液器吸嘴取上层水相500μL，然后加入等体积的预冷异丙醇颠倒混匀，低温高速离心10min，离心后的RNA在离心管底部形成白色片状沉淀；用75％乙醇漂洗两次，用离心机和吸嘴去掉残留乙醇，开盖室温晾干至透明状；用40μL无RNA酶的H2O溶解，并用微量分光光度计测RNA浓度。
5)反转录：取1μg总RNA进行反转录，采用反转录试剂盒iScript cDNA SynthesisKit反转录得到cDNA，反转录体系见表7。
表7：反转录体系
反转录程序如下：25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min。
6)基因表达定量检测：用荧光实时定量聚合酶链式反应(PCR)试剂iTaqTMUniversalGreen Supermix进行基因表达定量检测，分析检测基因表达变化情况。荧光实时定量聚合酶链式反应体系见表8，定量检测所用引物见表9。
表8：荧光实时定量聚合酶链式反应体系
反应程序如下：95℃，30s；95℃，15s，60℃，30s，40个循环；65-95℃，每次降低0.5℃(熔解曲线)。
表9：基因表达定量检测所用引物序列
3.统计分析
以肌动蛋白ACTB基因为内参，采用2-△△Ct法分析样品组中丝聚蛋白基因FLG相对于空白对照组的相对表达变化情况。分析结果表示为平均值Mean±标准差SD，各组间比较采用t-test统计分析，统计分析均为双尾，p值<0.05认为具有显著差异，p值<0.01认为具有极显著差异。
4.测试结果
实施例1制备的样品卷柏水提物浸膏对皮肤表皮角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG表达有上调作用，基因测试结果见表10。
测试结果具体情况如下：与空白对照组相比，卷柏水提物浸膏-0.0625
mg/mL组中FLG基因相对表达量为105±3％，p值＝0.7770，差异不具有显著性，卷柏水提物浸膏-0.0625mg/mL不具有上调FLG基因表达的作用；与空白对照组相比，卷柏水提物浸膏-0.125mg/mL组中FLG基因相对表达量为150±1％，p值＜0.01，差异具有极显著性，卷柏水提物浸膏-0.125mg/mL具有上调FLG基因表达的作用；卷柏水提物浸膏-0.25mg/mL组中FLG基因相对表达量为168±2％，p值＜0.01，差异具有极显著性，卷柏水提物浸膏-0.25mg/mL具有上调FLG基因表达的作用；卷柏水提物浸膏-0.5mg/mL组中FLG基因相对表达量为266±10％，p值＜0.01，差异具有极显著性，卷柏水提物浸膏-0.5mg/mL具有上调FLG基因表达的作用；卷柏水提物浸膏-1.0mg/mL组中FLG基因相对表达量为209±2％，p值＜0.01，差异具有极显著性，卷柏水提物浸膏-1.0mg/mL具有上调FLG基因表达的作用。
综上，基因表达定量测试结果显示实施例1制备的卷柏水提物浸膏在0.125-1.0mg/mL范围内具有上调角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG表达的作用，具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
表10：基因表达定量测试结果
对比例1：卷柏水提物浸膏调控ZO-1基因测试
本发明采用基因表达定量检测方法分析实施例1制备的卷柏水提物浸膏对角质形成细胞ZO-1基因的调控情况。
HaCaT细胞是由角质形成细胞培育而来的人类永生化表皮细胞，是非肿瘤来源的人正常皮肤永生化角质形成细胞株，与正常人角质形成细胞分化特性相似。HaCaT细胞系常用于研究皮肤表皮的增殖、迁移和分化机制，以及研究活性物对角质形成细胞的影响。本研究通过将含有多个浓度样品的培养液处理HaCaT细胞24小时，然后收集细胞总核糖核酸(RNA)，采用RNA反转录技术和基因表达定量检测方法对闭锁小带蛋白1基因ZO-1相对表达量进行检测，进而评估样品是否具有促进表皮角质形成细胞分化和提升表皮功能的功效。
1.细胞、试剂耗材与仪器
主要细胞株：人永生化角质形成细胞株HaCaT来源于广东博溪生物科技有限公司。
主要试剂耗材：胎牛血清、细胞培养基高糖DMEM、抗生素混合物(PSN)、0.25％胰酶-EDTA购自美国ThermoFisher公司；总RNA抽提试剂TRIzol购自美国ThermoFisher公司；反转录试剂盒iScript cDNA Synthesis Kit、荧光实时定量PCR试剂iTaqTMUniversalGreen Supermix购自美国Bio-rad公司；六孔板购自美国Corning公司。
主要仪器：超微量紫外分光光度NanoDrop ONE购自美国ThermoFisher公司，基因扩增仪C1000 Touch、实时定量PCR仪CFX Connect购自美国Bio-rad公司。
2.测试方法
1)细胞接种：将HaCaT细胞接种在六孔板中，每孔接种3-5×105个细胞，放入CO2培养箱(37℃、5％ CO2)中继续培养24h。
2)样品配置：用细胞培养基配置不同浓度的样品工作液，配置浓度小于最大无毒剂量。若样品不溶于培养基时，需用DMSO配置相应浓度的100倍母液，再用培养基进行稀释至所需浓度。
3)给药孵育：吸去旧培养液，在空白对照孔中加入2mL培养液，样品组每孔加入2mL含有相应浓度样品的培养液，给药完成后，将六孔板放入CO2培养箱(37℃、5％ CO2)中继续培养24h。
4)提取总RNA：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，吸去缓冲液；加入1mL TRIzol试剂，吹打裂解，转移到1.5mL无RNA酶离心管；在离心管中加入0.2mL氯仿，剧烈振荡，静置10min后，低温高速离心15min；用无RNA酶的移液器吸嘴取上层水相500μL，然后加入等体积的预冷异丙醇颠倒混匀，低温高速离心10min，离心后的RNA在离心管底部形成白色片状沉淀；用75％乙醇漂洗两次，用离心机和吸嘴去掉残留乙醇，开盖室温晾干至透明状；用40μL无RNA酶的H2O溶解，并用微量分光光度计测RNA浓度。
5)反转录：取1μg总RNA进行反转录，采用反转录试剂盒iScript cDNA SynthesisKit反转录得到cDNA，反转录体系见表11。
表11：反转录体系
反转录程序如下：25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min。
6)基因表达定量检测：用荧光实时定量聚合酶链式反应(PCR)试剂iTaqTMUniversalGreen Supermix进行基因表达定量检测，分析检测基因表达变化情况。荧光实时定量聚合酶链式反应体系见表12，定量检测所用引物见表13。
表12：荧光实时定量聚合酶链式反应体系
反应程序如下：95℃，30s；95℃，15s，60℃，30s，40个循环；65-95℃，每次降低0.5℃(熔解曲线)。
表13：基因表达定量检测所用引物序列
3.统计分析
以肌动蛋白ACTB基因为内参，采用2-△△Ct法分析样品组中闭锁小带蛋白1基因ZO-1相对于空白对照组的相对表达变化情况。分析结果表示为平均值Mean±标准差SD，各组间比较采用t-test统计分析，统计分析均为双尾，p值<0.05认为具有显著差异，p值<0.01认为具有极显著差异。
4.测试结果
实施例1制备的样品卷柏水提物浸膏对皮肤角质形成细胞闭锁小带蛋白1基因ZO-1表达无上调作用，基因测试结果见表14。
测试结果具体情况如下：与空白对照组相比，卷柏水提物浸膏-0.0625mg/mL组中ZO-1基因相对表达量为93±13％，p值＝0.3927，差异不具有显著性，卷柏水提物浸膏-0.0625mg/mL不具有上调ZO-1基因表达的作用；与空白对照组相比，卷柏水提物浸膏-0.125mg/mL组中ZO-1基因相对表达量为89±4％，p值＝0.1856，差异不具有显著性，卷柏水提物浸膏-0.125mg/mL不具有上调ZO-1基因表达的作用；卷柏水提物浸膏-0.25mg/mL组中ZO-1基因相对表达量为88±3％，p值＝0.1678，差异不具有显著性，卷柏水提物浸膏-0.25mg/mL不具有上调ZO-1基因表达的作用；卷柏水提物浸膏-0.5mg/mL组中ZO-1基因相对表达量为102±8％，p值＝0.8919，差异不具有显著性，卷柏水提物浸膏-0.5mg/mL不具有上调ZO-1基因表达的作用；卷柏水提物浸膏-1.0mg/mL组中ZO-1基因相对表达量为93±3％，p值＝0.3988，差异不具有显著性，卷柏水提物浸膏-1.0mg/mL不具有上调ZO-1基因表达的作用。
综上，基因表达定量测试结果显示实施例1制备的卷柏水提物浸膏在0.0625-1.0mg/mL范围内不具有上调皮肤表皮角质形成细胞中闭锁小带蛋白1基因ZO-1表达的作用。
表14：基因表达定量测试结果
应用例
本发明所述实施例1制备的卷柏水提物可以作为活性物用于皮肤外用剂的制备，所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、面霜、乳液、眼霜、面膜、精华液等。
所述实施例1制备的卷柏水提物，在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.05％-3％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-2％(w/w)。
实施例1制备的卷柏水提物在皮肤外用剂中的具体应用，以及这些剂型的配方和制备方法，见应用例1-3。
本发明所述实施例1制备的卷柏水提物还可以作为活性物用于个人护理清洁类产品，所述个人清洁护理品优选为洗去型清洁产品组合物，包括但不限于婴幼儿的沐浴露、洗发露、洗发沐浴露、儿童洗手液及成人的沐浴露、洗发露、洗手液以及洁面乳等剂型的产品的制备。如果在产品形态改变，如做成粉体、块状、糊状、条状、片状等，或者中间体等，也纳入本专利的植物提取物的应用范畴之内。
所述实施例1制备的卷柏水提物，在个人清洁护理品中的重量百分比为0.01％-10％(w/w)，优选的重量百分比为0.02％-5％(w/w)，更优选的重量百分比为0.05％-2％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-2％(w/w)。
实施例1制备的卷柏水提物在个人清洁护理品中的具体应用，以及这些剂型的配方和制备方法，见应用例4-12。
具体应用例如下：
应用例1：化妆水的制备
应用例2：面霜的制备
应用例3：乳液的制备
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应用例4：沐浴露的制备
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应用例5：洁面乳的制备
应用例6：婴童沐浴露的制备
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应用例7：婴童洗发水的制备
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应用例8：婴童洗发沐浴露的制备
应用例9：洗发水的制备
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应用例10：洗手液的制备
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应用例11：头皮护理精华液的制备
应用例12：气雾(清洁泡)的制备
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Claims (16)

1.一种角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达促进剂，其中，所述表达促进剂是卷柏水提物，所述卷柏水提物采用水作为提取溶剂，通过回流法萃取，减压浓缩后获得卷柏水提物。
2.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物采用干燥全草提取。
3.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物中总糖含量≥32wt％，总多酚含量≥2.34wt％，和/或总黄酮含量≥1.76wt％。
4.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物中穗花杉双黄酮的含量至少为0.4wt％。
5.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物的促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的相对表达量≥150％。
6.如权利要求5所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物的促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG的相对表达量为150-209％。
7.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物的HPLC分析图谱的主要峰的保留时间和峰面积％包括：UV＝250nm：峰1：1.294，0.3166；峰2：1.781，0.9466；峰3：2.272，7.8658；峰4：2.513，0.4031；峰5：2.666，3.4483；峰6：3.136，1.8813；峰7：3.539，3.2933；峰8：4.637，1.9662；峰9：4.927，3.3443；峰10：8.832，1.7380；峰11：9.985，5.1095；峰12：10.227，1.0910；峰13：10.462，0.4211；峰14：10.817，4.2998；峰15：11.265，2.5141；峰16：11.688，0.3587；峰17：11.908，0.6187；峰18：12.193，0.3443；峰19：12.451，0.2847；峰20：12.758，0.5144；峰21：12.928，0.9179；峰22：13.105，1.6252；峰23：13.272，0.2161；峰24：13.451，0.7592；峰25：13.630，1.0120；峰26：13.856，0.3543；峰27：14.018，0.2768；峰28：14.599，0.5120；峰29：14.846，0.8212；峰30：15.797，1.0628；峰31：19.133，2.4363；峰32：22.017，27.7223；峰33：25.234，1.4764；峰34：38.200，2.8180；峰35：49.971，1.9913；峰36：53.693，3.2685；峰37：54.129，3.0708；峰38：54.800，3.7379；峰39：55.776，0.8058；峰40：56.045，4.3554。
8.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物的分散浓度为0.1％时的电导率为96.2μS/cm。
9.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述卷柏水提物的分散浓度为1％时的电导率为813.0μS/cm。
10.如权利要求1所述的表达促进剂，其中，所述表达促进剂的使用浓度至少为0.125mg/ml。
11.如权利要求10所述的表达促进剂，其中，所述表达促进剂的使用浓度为0.125-1.0mg/mL。
12.一种制备如权利要求1-11中任一项所述的表达促进剂的方法，包括以下步骤：
(a)提供卷柏，粉碎，过筛，烘干；
(b)用水浸泡；
(c)回流法萃取；
(d)过滤至浓缩罐，减压浓缩，得到卷柏水提物。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述步骤(a)采用100目筛实现过筛。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述步骤(b)采用的料液比为1kg卷柏:10L水。
15.如权利要求1-11中任一项所述的表达促进剂在皮肤外用剂中的应用，用于促进角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达。
16.如权利要求15所述的应用，其中，所述皮肤外用剂选自：面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾清洁泡、喷雾、沐浴露、或洗面奶。
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