CN111363686A - 一种酿制增香葡萄酒的酵母菌及用途和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酿制增香葡萄酒的酵母菌菌株及用途和方法。所述酵母菌菌株为葡萄牙棒孢酵母lys225(Clavispora lusitaniae lys225)，保藏号为CGMCC No.18933。可用于制备果酒发酵剂和酿酒。

Description

一种酿制增香葡萄酒的酵母菌及用途和方法
技术领域
本发属于葡萄酒酿造的食品生物技术领域，具体涉及一种酿制增香葡萄酒的酵母菌菌株及用途和方法。
背景技术
按照我国葡萄酒标准GB15037-2006规定，葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，酒精度不低于7.0％的酒精饮品；每升葡萄酒中的甲醇含量必须在400毫克以下，如果葡萄酒中的甲醇过高，会对神经和眼睛产生危害，会导致失明。
葡萄酒按色泽分类，通常分红葡萄酒、白葡萄酒、桃红葡萄酒三种；按含糖量分为干葡萄酒，含糖量低于4g/L；半干葡萄酒，含糖量在4-12g/L；半甜葡萄酒，含糖量在12-45g/L；甜葡萄酒，含糖量大于45g/L；按二氧化碳含否分为静酒和起泡酒，不含有自身发酵或人工添加CO2的葡萄酒叫静酒，即静态葡萄酒；起泡酒和汽酒含有一定量CO2气体的葡萄酒，所含CO2是用葡萄酒加糖再发酵产生的起泡酒，人工的方法将CO2添加到葡萄酒中叫汽酒，因CO2作用使酒更具有清新、愉快、爽怡的味感。
刺葡萄(Vitis davidii Foëx)是葡萄科葡萄科属多年生落叶木质藤本植物，原产于我国，主要分布在湖南、江西、福建、浙江、安徽、云南、广东等省，广泛分布东亚种群的一种野生种质资源；因其耐高温、高湿、低光照和高抗病性，故在南方已有多年的栽培历史；目前，湖南刺葡萄种植面积已达6800hm2，资源非常丰富，尤其在雪峰山一带分布广泛；刺葡萄其产量高，果实中总糖含量为15.53％，总酸含量为0.33％，糖酸比高，单宁含量低，果粒小，种子多，果皮厚，肉囊与籽较难分离，可食用率偏低，鲜食市场价格低。
邓洁红研究结果表明，刺葡萄皮花色苷含量丰富，其色价是赤霞珠葡萄皮的2.43倍，红提葡萄皮的2.87倍，巨峰葡萄皮的21.75倍；花色昔含量达到2.52mg/gFW(以3'甲花翠素-3-葡萄糖苷计)。
蒋辉研究刺葡萄花青素结果表明，刺葡萄汁中原花青素的含量达3147μg/mL，远远高于其他葡萄汁，Welch’s紫葡萄汁中原花青素含量达2476μg/mL，也显著高于其它葡萄汁含量，但是Welch’s白葡萄汁的含量极低，检测不到。可见刺葡萄是一株适宜红葡萄酒酿造的原料。
根据中国农业科学院郑州果树研究孙磊的研究结果表明，中国野生葡萄果皮中花色苷的总量明显高于欧亚种，欧亚种葡萄品种主要以单糖花色苷为主，双糖花色苷含量很少，并且主要以二甲基花翠素(Mv)类花色苷为主，花葵素(Pg)类花色苷含量很少；多数中国野生葡萄中双糖花色苷含量较高，并且检测到较高含量的Pg类花色苷；在会同刺葡萄、湖南刺葡萄和洪江刺葡萄中，Pg类花色苷含量最高，分别占花色苷总量的81％、95％和 87％，而这3个株系中花色苷的组分以双糖花色苷为主。
发明内容
本发明旨在根据湖南省刺葡萄的生产现状，用从具有酒香的草莓烂果中筛选出得到的增香酵母，即，提供了一种酿制增香葡萄酒的酵母菌菌株及用途和方法，促进生产实践应用。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供一株能发酵刺葡萄酒并形成特有香型风味的微生物菌株，该菌株从具有酒香的草莓烂果中筛选得到，酵母菌菌株为葡萄牙棒孢酵母lys225(Clavisporalusitaniae lys225)，已于2019年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会葡萄微生物中心，保藏号为CGMCC No.18933；可用于制备果酒发酵剂。
所述的葡萄牙棒孢酵母lys225(Clavispora lusitaniae lys225)的生理生化特征为：
(1)菌株在麦芽汁培养基上，菌落形态为乳白色，表面平滑湿润，无凸起，边缘整齐，光学显微镜下为椭圆形或椭棒状，出牙繁殖，大小3-6μm×5-15μm，在培养皿中呈现愉快香气；
(2)菌株在葡萄细菌培养基、霉菌培养基和酵母培养基上生长良好；在15-38℃条件下均能较好生长，最适合温度为30-35℃；在pH 3.8-7.0均能生长，最适pH 4.5-6.2；在酵母膏葡萄糖液体培养基(YPD)中，繁殖速度快，8-12小时进入对数生长期，活菌数达到 1.2-1.8×109CFU/mL；菌株能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、***糖、木糖、麦芽糖、山梨糖等多种单糖和双糖发酵产气，不能直接利用淀粉；
(3)菌株能利用葡萄、草莓、猕猴桃、蓝莓、柑橘、桑葚、苹果、杨梅等水果的果汁或果酱发酵产果酒，很适合浆果发酵果酒；
(4)菌株能耐受11.0-14.5的酒精度，超过14.5度的果酒醪中不能存活；
(5)菌株对青霉素、链霉素不敏感。
本发明提供了果酒发酵剂的制备方法，所述方法是将上述酵母菌菌株制备成葡萄牙棒孢活性酵母泥或葡萄牙棒孢活性酵母粉剂，即为果酒发酵剂。
具体而言，葡萄牙棒孢活性酵母泥的制备方法如下：
(1)配制揺瓶种子培养基：所述揺瓶种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为 0.3％-0.6％；121℃灭菌20-30min，冷却后接种酵母菌菌株的新鲜斜面菌种；在28-34℃，转速150-250转/min的摇床中震荡培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵摇瓶种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(2)液体种子制备：制备发酵罐种子培养基，所述发酵罐种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌25-30min，冷却后接种液体发酵摇瓶种子，接种时所述液体发酵摇瓶种子与发酵罐种子培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250 转/min的发酵罐中机械搅拌培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵罐下一级种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(3)葡萄牙棒孢酵母发酵生产：制备生产罐培养基，所述生产罐培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌30-40min，冷却后接种步骤(2)所得的发酵罐种子，接种时所述发酵罐种子与生产罐培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250 转/min的发酵罐中机械搅拌培养18-24h，活菌数大于1.0×109CFU/mL时，得到用于制备酵母泥的发酵液；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(4)葡萄牙棒孢酵母发酵液的浓缩生产：发酵液体积≤10L时，采用高速离心机直接离心得到酵母泥；10L＜发酵液体积≤100L时，采用管式高速离心机直接离心得到酵母泥；发酵液体积＞500L时，采用碟式高速离心机直接离心得到酵母泥；酵母泥的活菌数大于5.0×1010CFU/g。制备的酵母泥发酵剂，活性极高，马上可投入果酒发酵使用，酵母泥保质期7-10d。
所述葡萄牙棒孢活性酵母粉剂的制备方法如下：
(1)配制揺瓶种子培养基：所述揺瓶种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为 0.3％-0.6％；121℃灭菌20-30min，冷却后接种酵母菌菌株的新鲜斜面菌种；在28-34℃，转速150-250转/min的摇床中震荡培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵摇瓶种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(2)液体种子制备：制备发酵罐种子培养基，所述发酵罐种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌25-30min，冷却后接种液体发酵摇瓶种子，接种时所述液体发酵摇瓶种子与发酵罐种子培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250 转/min的发酵罐中机械搅拌培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵罐一级种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(3)葡萄牙棒孢酵母二级种子制备：制备二级种子罐培养基，所述二级种子罐培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌30-40min，冷却后接种发酵罐一级种子，接种时所述发酵罐一级种子与二级种子罐培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250转/min的发酵罐中机械搅拌培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵罐下一级种子；
(4)葡萄牙棒孢酵母发酵生产：制备生产罐培养基，所述生产罐培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌30-40min，冷却后接种步骤(3)所得的液体发酵罐种子，接种时所述液体发酵罐种子与生产罐培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250转/min的发酵罐中机械搅拌培养18-24h，活菌数大于1.0×109CFU/mL 时，得到用于制备酵母粉剂的发酵液；
(5)葡萄牙棒孢酵母发酵液的浓缩生产：发酵液体积＞1000L时，采用陶瓷膜微滤浓缩酵母菌体，浓缩比为(40-50):1,得到活菌数≥5.0×1010CFU/mL高密度酵母菌浆；
(6)将所述的高密度酵母菌浆与糊精按重量比1:(1.2-1.5)混合，搅拌制成酵母菌泥，控制含水量为40％-45％；然后将酵母菌泥投入酵母泥压丝成型机，控制酵母丝直径1.0-1.5 mm；将酵母丝投入沸腾干燥机干燥，控制进风温度≤65℃，出风温度≤34℃，控制酵母粉剂的含水量5％-6％，控制活菌数≥2.0×1010CFU/g，即得葡萄牙棒孢活性酵母粉剂。可按100g，150g，500g，1000g等不同规格包装。
在果酒发酵过程中，添加发酵剂使发酵快速启动，增加果酒的特有香气，显著提高果酒的酸度，减少发酵过程中的杂菌污染，提高无硫发酵的成功率，显著抑制葡萄酒中甲醇的产生。因此，本发明还提供了一种葡萄酒的制备方法，所述方法是采用本发明所述的酵母菌菌株进行发酵制备葡萄酒。所述葡萄是刺葡萄。
具体而言，所述葡萄酒的制备方法包括：
A方法：干型天然刺葡萄酒的酿制：将成熟的刺葡萄去梗、破碎，将葡萄加入到本发明方法制备的酵母泥中，或将葡萄加入到本发明方法制备的酵母粉剂中；所述酵母泥在葡萄中的质量百分比含量为0.5‰-1.0‰，所述酵母粉剂在葡萄中的质量百分比含量为0.2‰-0.4‰；无任何其它添加物(无二氧化硫、无糖的添加)，搅拌混匀后用呼吸器密封，保证气体只出不进，在气温15-25℃条件下自然发酵30-40d，自然发酵期间不断将葡萄皮压入酒醪中，经皮渣分离、澄清过滤得到干型刺葡萄酒；所酿的干型天然刺葡萄酒，色泽紫红，香气令人舒适、馥郁、和谐，酸度较高但爽利清新，较醇厚；所述干型刺葡萄酒酒精度为 10.0-11.5度，含糖量≤3.0g/L，甲醇含量60.0-150mg/L，远低于国标的400mg/L；
B方法：半干型、半甜型、甜型刺葡萄酒的酿制：将成熟的刺葡萄去梗、破碎，将葡萄加入到以本发明方法制备的酵母泥中，或将葡萄加入到以本发明方法制备的酵母粉剂中；所述酵母泥在葡萄中的质量百分比含量为0.5‰-1.0‰，所述酵母粉剂在葡萄中的质量百分比含量为0.2‰-0.4‰；搅拌混匀后用呼吸器密封发酵罐，保证气体只出不进，在气温15-25℃条件下自然发酵30-40d，自然发酵期间不断将葡萄皮压入酒醪中，经皮渣分离、澄清过滤得到干型刺葡萄酒；所酿的半干型、半甜型、甜型刺葡萄酒，色泽紫红，香气令人愉快、馥郁、纯正、和谐，酸度适中但爽利清新，口感醇厚、流畅、滑润，但涩味较低，显著增加酒精度；所述干型刺葡萄酒酒精度为12.5-16.5度，含糖量≥6.0g/L，甲醇含量 50.0-100mg/L，远低于国标的400mg/L。
优选地，所述B方法中，发酵时还添加蔗糖，所述蔗糖在葡萄中的质量百分比为5％-15％。
与未添加酵母发酵剂的对照相比，本发明所述酵母菌菌株发酵的果酒香气中，异戊醇增加3.5-5.0倍，乙酸乙酯增加6.5-8.0倍，乙酸增加2.0-3.5倍，感官上总体呈现温和愉快甜香。
更具体的，葡萄酒的酿造过程如下：
(1)刺葡萄分选：人工将成熟的刺葡萄中霉果、烂果、不成熟果剔除，清除果叶、葡萄小枝、渣滓等杂物(勿洗果)；
(2)去梗、破碎：将人工刺葡萄投入破碎除梗机，进行除梗破葡萄皮(果肉挤出果皮即可)，并用螺杆泵将加工好的葡萄送入发酵罐，按葡萄0.5‰-1.0‰的比例添加新鲜活性酵母泥(或0.2‰-0.4‰活性干酵母粉)；
(3)加糖：根据葡萄酒类型(干型、半干型、半甜型、甜型)和最终酒精度的需要，测定并计算新鲜葡萄的含糖量，添加0-15％蔗糖，搅拌溶解蔗糖，然后密封配有呼吸器的发酵罐；
(4)前发酵：发酵开始，每天观察葡萄酒的发酵状态和温度，产气后，不断将葡萄皮压入酒醪中，罐体温度15-25℃为宜，否则，通过夹套加热或降温控制，保持刺葡萄酒在气温15-25℃条件下自然发酵30-40天，期间，发酵罐有大量持续的酒香、果香散出，直到皮渣下沉。
(5)压榨、过滤：葡萄皮下沉后，通过筛网过滤获得自留酒，剩余皮渣经螺杆压榨机制备压榨酒，亦可不分自留酒和压榨酒，汇总葡萄酒滤液。
(6)硅藻过滤除渣、除菌：经压榨过滤的葡萄酒，按200-250:1添加食品级硅藻土搅拌预涂，经硅藻土过滤机进行第一次过滤，感官品尝过滤后的葡萄酒，测定酒精度、总酸度、总糖、甲醇含量。
(7)后发酵：将符合质量要求的硅藻土过滤葡萄酒，再次输送至发酵罐，根据需要添加0.1％-0.2％的乳酸杆菌，或添加0.5％-0.8％的橡木片，控制罐温20-25℃条件下厌氧发酵2-4天，然后自然静置10-20天。
(8)硅藻土粗滤、精滤除菌：经后发酵的葡萄酒，按150-200:1添加食品级硅藻土搅拌预涂，经硅藻土过滤机进行第二次粗过滤，第三次精滤，酒体中微粒、菌体及残渣，感官品尝精滤后的葡萄酒，测定酒精度、总酸度、总糖、甲醇含量，确保葡萄酒各项指标达到GB15037-2006的规定。
(9)陈酿、稳定酒体：将精滤的葡萄酒输送至储酒罐或橡木桶，确保酒体稳定、饱满，时间≥30天。
(10)微滤、灭菌：使用CIP在线灭菌***对储酒罐，不锈钢输送管道、酒瓶、灌装机进行在线清晰、灭菌，温度121℃，30min；微滤过滤机设置0.45μm，0.22μm,0.1μm的两级或三级串联微滤膜，使用卫生级304不锈钢离心泵压滤，扬程≥30m，离心泵后续的微滤管道使用前述的CIP灭菌***灭菌；微滤后的葡萄酒输送入无菌储酒罐中，储酒罐配置有折叠式无菌过滤呼吸器，保持压力平衡，隔绝外界杂菌污染，此时，刺葡萄酒，泽紫红，香气令人馥郁、和谐，口感爽利清新、醇厚；软木塞采用80-100℃条件下消毒60-90min。
(11)包装、入库：根据需求，葡萄酒在无菌间采用无菌包装机将灌装、压塞，然后再送入后续热缩酒封、贴标工序，完成包装，酒瓶平放入库。
本发明利用葡萄牙棒孢酵母作为发酵菌种，与现有刺葡萄表面的野生酵母自然发酵相比，具有显著优势和进步：
(1)添加稳定的酵母发酵剂，葡萄酒发酵启动快，易于控制葡萄酒品质，有效地抑制杂菌生长，甲醇含量得到有效控制，显著提高葡萄酒酿制成功率，葡萄酒更安全；
(2)采用无硫添加的发酵技术，通过酸度控制杂菌生长，降低污染率、失败率，葡萄酒更安全；
(3)通过添加优质酵母菌，增加特有香气，提高葡萄酒品质，形成独有的葡萄酒风格、特色；
(4)菌种制备环节采用陶瓷膜浓缩技术，工艺简单、安全、快速、高效，亦可增加CIP在线清洗、灭菌操作，技术先进；葡萄酒酿造环节采用无硫、低温发酵技术，工艺环保安全，过滤环节，采用硅藻土过滤除渣除菌、CIP在线清洗在线灭菌、2-3级膜过滤彻底除菌，避免高温破坏葡萄酒中花青素，工艺安全卫生，有力于延长葡萄酒的保质期。
具体实施方式
实施例1增香型酵母菌株的获得：
(1)平板初筛：从稍有腐烂且有酒香的葡萄、苹果、梨、香蕉、芒果、菠萝、草莓、橘子、凤梨等水果中取样，按十倍稀释法，稀释涂布麦芽汁琼脂平板，30℃培养箱培养2-4 天，挑选类似酵母菌的乳白色单菌落接至斜面培养、保存菌种，共获得单菌落斜面508株。
(2)揺瓶复筛：将初筛菌株，逐一接种至150mL复筛培养基中(蔗糖4.0％，酵母膏0.5％)，硅胶塞和羊皮纸简约密封，于30℃摇床130转/min培养36h，然后再于30℃培养箱静置培养48h，然后用闻香法感官筛选香气优良菌株27株，进一步采用蒸馏法测定蔗糖酒精转化率，选取转化率高于40％的菌株6株，最后将中国株优良菌株进行葡萄酒酿制实验，获得产酒增香优良菌株2株，其中1株经分子生物学和形态学鉴定为葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae lys225)，该菌株2019年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会葡萄微生物中心，保藏号，CGMCC No.18933，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
实施例2葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae lys225)的形态特征：
将菌株葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae lys225)在麦芽汁培养基培养3-4天，菌株在麦芽汁培养基上，菌落形态为乳白色，表面平滑湿润，无凸起，边缘整齐，光学显微镜下为椭圆形或椭棒状，出牙繁殖，大小3-6μm×5-15μm，在培养皿中呈现愉快香气。
实施例3葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae lys225)的生理生化特征：
将菌株葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae lys225)在菌株在不同培养基上培养、观察、检测，该菌株在15-38℃条件下均能生长，最适合温度为30-35℃；在pH 3.8-7.0均能生长，最适pH 4.5-6.2；在酵母膏胨葡萄糖液体培养基(YPD)，繁殖速度快，8-12小时进入对数生长期，活菌数达到1.2-1.8×109CFU/mL；菌株能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、***糖、木糖、麦芽糖、山梨糖等多种单糖和双糖发酵产气，不能直接利用淀粉；菌株能利用葡萄、草莓、猕猴桃、蓝莓、柑橘、桑葚、苹果、杨梅等水果的果汁或果酱发酵产果酒，很适合浆果发酵果酒；菌株能耐受11.0-14.5的酒精度，超过14.5度的果酒醪中不能存活；菌株对青霉素、链霉素不敏感。
实施例4葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae lys225)接种新鲜刺葡萄的增香效果：
按配方酵母膏0.5％，蔗糖2.0％，配制培养基100mL，121℃灭菌30min，冷却后接种葡萄牙棒孢酵母CGMCC No.18933新鲜斜面菌种；在30℃，转速150转/min的摇床中震荡培养12-18h，活菌数3.0×108CFU/mL，用无菌离心瓶离心获得酵母泥4.5g，所得酵母泥添加至3.5kg刺葡萄的5L玻璃缸辅助厌氧发酵，产气后将皮渣不断压入酒体中，35 天后过滤葡萄酒，感官品尝并检测相关指标，所酿的干型天然刺葡萄酒，色泽紫红，香气令人舒适、馥郁、和谐，呈现特有的温和、饱满的甜香；酸度较高但爽利清新，较醇厚，酒精度10.8度，含糖量2.9g/L，甲醇含量65.0mg/L，质量符合要求。
实施例5半甜型葡萄酒的酿制及增香效果：
按配方酵母膏0.5％，蔗糖5.0％，配制培养基100mL，121℃灭菌30min，冷却后接种葡萄牙棒孢酵母CGMCC No.18933新鲜斜面菌种；在30℃，转速150转/min的摇床中震荡培养12-18h，活菌数3.5×108CFU/mL，用无菌离心瓶离心获得酵母泥4.8g，所得酵母泥添加至盛有刺葡萄3.5kg、蔗糖200g的5L玻璃缸辅助厌氧发酵，产气后将皮渣不断压入酒体中，40天后过滤葡萄酒，感官品尝并检测相关指标，所酿得半甜型天然刺葡萄酒，色泽紫红，香气令人馥郁、持久，呈现特有的温和、饱满的甜香；酸度始终但爽利清新，较醇厚，酒精度14.7度，含糖量36.5g/L，甲醇含量71.0mg/L，质量符合要求。
实施例6刺葡萄发酵剂活性酵母泥的制备：
(1)按配方源酵母膏0.5％，蔗糖4.0％，氯化钠0.3％配制揺瓶种子培养基400mL，121℃灭菌30min，冷却后接种葡萄牙棒孢酵母CGMCC No.18933新鲜斜面菌种；在30℃，转速250转/min的摇床中震荡培养18h；
(2)按配方源酵母膏0.5％，蔗糖4.0％，氯化钠0.3％配制发酵培养基8000mL，121℃灭菌30min，冷却后接种所述的液体摇瓶种子400mL，在32℃，转速200转/min的发酵罐中机械搅拌培养18h，得到活菌数4.0×108CFU/mL的对数期酵母菌7.5L；
(3)葡萄牙棒孢酵母发酵液的浓缩生产，高速离心机直接离心得到酵母泥；活菌数为6.0×1010CFU/g(湿菌体)，制备的酵母泥发酵剂，活性极高，可马上投入果酒发酵使用，酵母泥保质期7-10天。
实施例7刺葡萄发酵剂活性酵母粉剂的制备：
(1)揺瓶种子制备：按配方源酵母膏0.5％，蔗糖4.0％，氯化钠0.3％配制揺瓶种子培养基500mL，121℃灭菌30min，冷却后接种葡萄牙棒孢酵母CGMCC No.18933新鲜斜面菌种；在30℃，转速250转/min的摇床中震荡培养18h；
(2)一级发酵罐种子：按配方源酵母膏0.5％，蔗糖4.0％，氯化钠0.3％配制发酵培养基8.0L于10L发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却后接种所述的液体摇瓶种子500mL，在32℃，转速250转/min的发酵罐中机械搅拌培养18h，得到对数期酵母菌一级种子8.0L；
(3)二级发酵罐种子：按配方源酵母膏0.5％，蔗糖4.0％，氯化钠0.3％配制发酵培养基80.0L于100L发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却后采用无菌空气压入所述的8.0L 二级种子，在32℃，转速150转/min的发酵罐中机械搅拌培养12h，得到对数期酵母菌80.0 L；
(3)按配方源酵母膏0.5％，蔗糖50％，氯化钠0.4％配制发酵培养基1600.0L于1000 L发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却后采用无菌空气压入所述的80.0L二级种子，在32℃，转速100转/min的发酵罐中机械搅拌培养14h，得到对数期酵母菌1600.0L，活菌数达3.0×109CFU/mL；
(4)菌体浓缩：采用陶瓷膜微滤设备循环浓缩酵母菌体，浓缩得到50.0L，菌体密度达8.5×1010CFU/mL的高密度酵母菌浆，用于进一步制备的酵母粉剂；
(5)酵母菌浆的吸附、压丝：将所述的50.0L高密度酵母菌浆，加入60.0kg糊精吸附，搅拌制成酵母菌泥，含水量为42.5％，然后将酵母菌泥投入酵母泥压丝成型机，酵母丝直径1.5mm；
(6)干燥、包装：进一步将酵母丝投入沸腾干燥机干燥，进风温度≤65℃，出风温度≤34℃，获得活性干酵母粉68kg，酵母粉剂的含水量5.5％，活菌数5.2×1010CFU/g，按500g规格包装成葡萄牙棒孢酵母活性干酵母粉剂。
实施例8半干型刺葡萄酒的酿造：
(1)刺葡萄分选：人工将2600kg成熟的刺葡萄中霉果、烂果、不成熟果剔除，清除果叶、葡萄小枝、渣滓等杂物；
(2)去梗、破碎：将人工刺葡萄投入破碎除梗机，并用螺杆泵将加工好的葡萄送入3000L发酵罐，加入1kg葡萄牙棒孢酵母活性菌粉，加入蔗糖130kg，用葡萄汁溶解蔗糖，搅拌混匀，然后密封配有呼吸器的发酵罐；
(3)前发酵：发酵开始，每天观察葡萄酒的发酵状态和温度，罐体温度15-25℃，产气后，不断将葡萄皮压入酒醪中，通过夹套控温，发酵40天，其间，发酵罐有大量持续的酒香、果香散出，直到皮渣下沉。
(4)压榨、过滤：葡萄皮下沉后，通过筛网过滤获得自留酒，剩余皮渣经螺杆压榨机制备压榨酒，汇总葡萄酒滤液1600L；滤液添加6.5kg食品级硅藻土，经搅拌预涂、硅藻土过滤机进行第一次过滤；感官品尝过滤后的葡萄酒，经测定酒精度13.5度、总糖9.1 g/L、甲醇含量≤71m g/L，安全。
(5)后发酵：将符合质量要求的硅藻土过滤葡萄酒，再次输送至发酵罐，根据需要添加200g的乳酸杆菌粉剂，添加500g的橡木片，控制罐温20-25℃条件下厌氧发酵4天，然后自然静置20天。
(6)硅藻土粗滤、精滤除菌：经后发酵的葡萄酒，添加8kg食品级硅藻土搅拌预涂，经硅藻土过滤机进行第二次粗过滤，第三次精滤，清除酒体中微粒、菌体及残渣，感官品尝精滤后的葡萄酒，测定酒精度、总酸度、总糖、甲醇含量，确保葡萄酒各项指标达到GB15037-2006规定。
(7)陈酿、稳定酒体：将精滤的葡萄酒输送至储酒罐或橡木桶保存30天，确保酒体稳定、饱满。
(8)微滤、灭菌：使用CIP在线灭菌***对储酒罐，不锈钢输送管道、酒瓶、灌装机进行在线清晰、灭菌，温度121℃，30min；采用0.45μm，0.22μm,0.1μm微滤过滤机三级串联微滤，经扬程达30m的卫生级304不锈钢离心泵压滤，离心泵后续的微滤管道使用前述的CIP灭菌***灭菌；微滤后的葡萄酒输送入无菌储酒罐中，储酒罐配置有折叠式无菌过滤呼吸器，保持压力平衡，隔绝外界杂菌污染，此时，刺葡萄酒，泽紫红，香气令人馥郁、和谐，口感爽利清新、醇厚；软木塞采用80℃条件下消毒90min。
(9)包装、入库：葡萄酒在无菌间采用无菌包装机灌装750mL波尔多红酒瓶、压塞，然后再送入后续热缩酒封、贴标工序，完成包装，酒瓶平放入库。

Claims (10)

1.一种酿制增香葡萄酒的酵母菌菌株，其特征在于，所述酵母菌菌株为葡萄牙棒孢酵母lys225(Clavispora lusitaniae lys225)，保藏号为CGMCC No.18933。
2.如权利要求1所述的酵母菌菌株在制备果酒发酵剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酵母菌菌株以葡萄牙棒孢活性酵母泥的形式制备成果酒发酵剂，或者以葡萄牙棒孢活性酵母粉剂的形式制备成果酒发酵剂。
4.一种果酒发酵剂的制备方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述的酵母菌菌株制备成葡萄牙棒孢活性酵母泥或葡萄牙棒孢活性酵母粉剂，即为果酒发酵剂。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述葡萄牙棒孢活性酵母泥的制备方法如下：
(1)配制揺瓶种子培养基：所述揺瓶种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌20-30min，冷却后接种酵母菌菌株的新鲜斜面菌种；在28-34℃，转速150-250转/min的摇床中震荡培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵摇瓶种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(2)液体种子制备：制备发酵罐种子培养基，所述发酵罐种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌25-30min，冷却后接种液体发酵摇瓶种子，接种时所述液体发酵摇瓶种子与发酵罐种子培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250转/min的发酵罐中机械搅拌培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵罐下一级种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(3)葡萄牙棒孢酵母发酵生产：制备生产罐培养基，所述生产罐培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌30-40min，冷却后接种步骤(2)所得的发酵罐种子，接种时所述发酵罐种子与生产罐培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250转/min的发酵罐中机械搅拌培养18-24h，活菌数大于1.0×109CFU/mL时，得到用于制备酵母泥的发酵液；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(4)葡萄牙棒孢酵母发酵液的浓缩生产：发酵液体积≤10L时，采用高速离心机直接离心得到酵母泥；10L＜发酵液体积≤100L时，采用管式高速离心机直接离心得到酵母泥；发酵液体积＞500L时，采用碟式高速离心机直接离心得到酵母泥；酵母泥的活菌数大于5.0×1010CFU/g。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述葡萄牙棒孢活性酵母粉剂的制备方法如下：
(1)配制揺瓶种子培养基：所述揺瓶种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌20-30min，冷却后接种酵母菌菌株的新鲜斜面菌种；在28-34℃，转速150-250转/min的摇床中震荡培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵摇瓶种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(2)液体种子制备：制备发酵罐种子培养基，所述发酵罐种子培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌25-30min，冷却后接种液体发酵摇瓶种子，接种时所述液体发酵摇瓶种子与发酵罐种子培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250转/min的发酵罐中机械搅拌培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵罐一级种子；其中，氮源为酵母膏、蛋白质、牛肉膏中的至少一种，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖中的至少一种；
(3)葡萄牙棒孢酵母二级种子制备：制备二级种子罐培养基，所述二级种子罐培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌30-40min，冷却后接种发酵罐一级种子，接种时所述发酵罐一级种子与二级种子罐培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250转/min的发酵罐中机械搅拌培养12-18h，活菌数大于2.0×108CFU/mL，作为液体发酵罐下一级种子；
(4)葡萄牙棒孢酵母发酵生产：制备生产罐培养基，所述生产罐培养基中氮源的质量百分比含量为0.5％-1.5％、碳源的质量百分比含量为2.0％-4.0％、氯化钠的质量百分比含量为0.3％-0.6％；121℃灭菌30-40min，冷却后接种步骤(3)所得的液体发酵罐种子，接种时所述液体发酵罐种子与生产罐培养基的体积比为1:(10-20)，在28-32℃，转速150-250转/min的发酵罐中机械搅拌培养18-24h，活菌数大于1.0×109CFU/mL时，得到用于制备酵母粉剂的发酵液；
(5)葡萄牙棒孢酵母发酵液的浓缩生产：发酵液体积＞1000L时，采用陶瓷膜微滤浓缩酵母菌体，浓缩比为(40-50):1,得到活菌数≥5.0×1010CFU/mL高密度酵母菌浆；
(6)将所述的高密度酵母菌浆与糊精按重量比1:(1.2-1.5)混合，搅拌制成酵母菌泥，控制含水量为40％-45％；然后将酵母菌泥投入酵母泥压丝成型机，控制酵母丝直径1.0-1.5mm；将酵母丝投入沸腾干燥机干燥，控制进风温度≤65℃，出风温度≤34℃，控制酵母粉剂的含水量5％-6％，控制活菌数≥2.0×1010CFU/g，即得葡萄牙棒孢活性酵母粉剂。
7.一种葡萄酒的制备方法，其特征在于，所述方法是采用权利要求1所述的酵母菌菌株进行发酵制备葡萄酒。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述葡萄是刺葡萄。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
A方法：干型天然刺葡萄酒的酿制：将成熟的刺葡萄去梗、破碎，将葡萄加入到以权利要求5所述方法制备的酵母泥中，或将葡萄加入到以权利要求6所述方法制备的酵母粉剂中；所述酵母泥在葡萄中的质量百分比含量为0.5‰-1.0‰，所述酵母粉剂在葡萄中的质量百分比含量为0.2‰-0.4‰；无任何其它添加物，搅拌混匀后用呼吸器密封，保证气体只出不进，在气温15-25℃条件下自然发酵30-40d，自然发酵期间不断将葡萄皮压入酒醪中，经皮渣分离、澄清过滤得到干型刺葡萄酒；所述干型刺葡萄酒酒精度为10.0-11.5度，含糖量≤3.0g/L，甲醇含量60.0-150mg/L；
B方法：半干型、半甜型、甜型刺葡萄酒的酿制：将成熟的刺葡萄去梗、破碎，将葡萄加入到以权利要求5所述方法制备的酵母泥中，或将葡萄加入到以权利要求6所述方法制备的酵母粉剂中；所述酵母泥在葡萄中的质量百分比含量为0.5‰-1.0‰，所述酵母粉剂在葡萄中的质量百分比含量为0.2‰-0.4‰；搅拌混匀后用呼吸器密封发酵罐，保证气体只出不进，在气温15-25℃条件下自然发酵30-40d，自然发酵期间不断将葡萄皮压入酒醪中，经皮渣分离、澄清过滤得到干型刺葡萄酒；所述干型刺葡萄酒酒精度为12.5-16.5度，含糖量≥6.0g/L，甲醇含量50.0-100mg/L。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述B方法中，发酵时还添加蔗糖，所述蔗糖在葡萄中的质量百分比为5％-15％。
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