CN111362736B - 一种肥料用葡萄废果酵素的制备方法、制备的葡萄废果酵素及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肥料用葡萄废果酵素的制备方法、制备的葡萄废果酵素及其应用。所述制备方法包括如下步骤：将葡萄废果、糖和复合微生物菌剂混合，在厌氧条件下发酵，得到所述葡萄废果酵素。所述复合微生物菌剂用于发酵葡萄废果，促进了葡萄废果中的养分在发酵过程中的分解释放，显著提高了发酵产品的利用价值，所得葡萄废果酵素能够作为营养丰富的有机肥料重新施入土壤中。所述制备方法为葡萄园坏果、烂果的处置提供了一种经济、环保的方式，所述制备方法反应条件温和、不苛刻，易于推广，能够实现农业废弃物资源化循环利用。

Description

一种肥料用葡萄废果酵素的制备方法、制备的葡萄废果酵素 及其应用

技术领域

本发明属于农业废弃物资源化循环利用领域，具体涉及一种酵素的制备方法、制备的产品及应用，尤其涉及一种肥料用葡萄废果酵素的制备方法、制备的葡萄废果酵素及其应用。

背景技术

葡萄(Vitis vinifer)为葡萄科葡萄属木质藤本植物，成熟的葡萄浆果中含糖量高达10％-30％，以葡萄糖为主。葡萄中的多种果酸有助于消化，适当多吃些葡萄，能健脾胃。葡萄中含有矿物质钙、钾、磷、铁以及多种维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、维生素C和维生素P等，还含有多种人体所需的氨基酸，常食葡萄对神经衰弱、疲劳过度大有裨益。葡萄皮中的白藜芦醇能够帮助人体降低血脂，增强免疫力；鞣酸能够抗过敏、延缓衰老，还具有增强免疫和预防心脑血管疾病的功效；花青素能强抗氧化性、抗突变、保护心血管等。

因此，对于葡萄果肉和葡萄皮中的有效成分进行发酵提取的方法已有较多记载。例如，CN110250454A公开了一种生产葡萄皮酵素的方法，该生产技术是以两种主要联合酶制剂耦合微生物发酵生产葡萄皮酵素为代谢基础，采用优化的条件和合理的工艺，使得葡萄皮的细胞壁解离、转化，有效成分充分释放，耦合微生物发酵，产生高活性的酵素和特定的生理活性物质，特别是改善了葡萄皮的口味、口感和易吸收性，形成高品质的葡萄皮酵素。该技术发明获得的液体葡萄皮酵素可以用于食品、饮料、调味品及化妆品和烟、酒用料的添加。

然而，葡萄废果不同于完整的葡萄果实或果渣葡萄皮，其是葡萄种植和销售过程中必然会产生的副产物，其中可能混杂着葡萄坏果、未成熟的葡萄废果，甚至还可能包含葡萄园内的土壤、枯木等。目前对于葡萄废果并没有良好的方式进行处置。然而，葡萄废果的随意堆积和弃置不仅是资源的浪费，同时也会对环境造成一定影响。

CN107903141A公开了一种利用废弃水果制备有机肥的方法，解决了现有技术中废弃水果无法利用的问题。此发明的有机肥由废弃水果、秸秆粉、污泥、活性炭和有机肥发酵剂按一定的重量比制成。其制备方法包括以下步骤：收集废弃水果，挑选杂质，破碎后，匀浆，配料，混合，发酵，将发酵后的混合物与活性炭混合均匀，制成颗粒即得。此发明组方科学，配比合理，能提供农作物所需的营养成分，但是所述方法对于废弃水果中所含有的有效成分分解不完全，且步骤较为复杂，不适宜推广使用。

因此，提供一种简单、易行、易推广的葡萄废果处理方法是本领域急需解决的问题，从而使葡萄废果中的有效成分能够充分释放，解决资源浪费，实现农业废弃物资源化循环利用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种肥料用葡萄废果酵素的制备方法、制备的葡萄废果酵素及其应用。利用该方法制得的酵素产品中含有丰富的养分，可作为肥料在农业生产中进行应用，是一种高效、环保、易推广的农业废弃物资源化循环利用技术。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种肥料用葡萄废果酵素的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将葡萄废果、糖和复合微生物菌剂混合，在厌氧条件下发酵，得到所述葡萄废果酵素。

本发明中，通过复合微生物菌剂的添加，大大缩短了发酵周期，提高了发酵产品的品质，且所述制备方法操作简单，且对于反应条件的要求不苛刻，能够在室温下进行反应，便于果园等场所实地采用，便于推广使用。同时，所述制备方法不仅能够用于制备葡萄废果酵素，也可以处理其他水果的废果，例如桃等，但是所述制备方法针对葡萄进行设计，因此对于葡萄废果的处理效果较好，所得葡萄废果酵素的有效含量也较高。

作为本发明优选的技术方案，所述复合微生物菌剂包括干酪乳杆菌、酵母菌或曲霉菌中的至少两种，所述组合典型但非限制性的实例有：干酪乳杆菌和酵母菌，干酪乳杆菌和曲霉菌，酵母菌和曲霉菌，干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌；优选为干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌三者的组合。

本发明中，所述复合微生物菌剂用于发酵葡萄废果，当所述复合微生物菌剂为干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌三者时，发酵效果最好，其发酵产物中有效成分的含量高于单一菌种发酵，同时也高于干酪乳杆菌和酵母菌、干酪乳杆菌和曲霉菌；酵母菌和曲霉菌共同发酵，说明干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌之间存在协同配合作用。且复合微生物菌剂中的菌种也不可替换为其他菌种，例如，若将干酪乳杆菌替换为枯草芽孢杆菌或植物乳酸杆菌，其发酵效果也不理想。因此，所述制备方法中，干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌大大促进了葡萄废果中的养分在发酵过程中的分解释放，显著提高了发酵产品的利用价值。

优选地，所述复合微生物菌剂中干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为：(1～3):(0.5～2):(0.5～1.5)。例如可以是1:0.5:0.5、1:1:0.5、1:2:0.5、1:1:1.5、1:1:1、1:2:1.5、2:0.5:0.5、3:0.5:0.5、2:1:0.5、3:2:0.5、2:1:1、3:1:1.5或3:2:1.5等。

作为本发明优选的技术方案，所述发酵的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、21.5℃、22℃、23℃、23.5℃、24℃、24.5℃或25℃等。

优选地，所述发酵的时间为60～100天，例如可以是60天、62天、64天、66天、68天、70天、72天、75天、78天、80天、82天、85天、88天、90天、92天、94天、95天、96天、98天或100天等。

优选地，所述发酵的pH为4.0～6.0，例如可以是4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8或6.0等。所述pH值属于偏酸性，在发酵过程中发酵液本身便为酸性，在制备时无需特意调节pH，能够简化发酵过程。

作为本发明优选的技术方案，所述复合微生物菌剂存在于活菌培养液中和/或制备得到的葡萄废果酵素中。

优选地，使用存在于活菌培养液中的复合微生物菌剂进行接种时，接种量为发酵液总体积的0.5～2.0％，例如可以是0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.5％、1.6％、1.8％或2.0％等。

所述活菌培养液的制备方法为：将体积比为(1～3):(0.5～2):(0.5～1.5)(例如可以是1:0.5:0.5、1:1:0.5、1:2:0.5、1:1:1.5、1:1:1、1:2:1.5、2:0.5:0.5、3:0.5:0.5、2:1:0.5、3:2:0.5、2:1:1、3:1:1.5或3:2:1.5等)的干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的接种至培养基中进行培养，得到所述活菌培养液，所述培养基为本领域常规使用的培养基。

优选地，所述复合微生物菌剂存在于制备得到的葡萄废果酵素中进行接种时，适当提高接种量至5％～10％，例如可以是5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％等。

接种的复合微生物菌剂为活菌培养液为佳，也可使用发酵好的废果酵素作为接种液，此时应适当提高接种量。葡萄废果酵素的初始pH偏酸性，在使用前应进行前处理，如调酸碱或稀释等。

作为本发明优选的技术方案，所述糖包括黑糖、红糖、麦芽糖或糖蜜中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述糖用于提供碳源，若初始时不加入糖，会导致微生物生长繁殖较慢，影响发酵效率。

优选地，所述葡萄废果与糖的质量比为(4～10):(1～6)，例如可以是4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、4:2、4:3、4:4、4:5、4:6、5:2、6:3、7:4、8:5、9:5或10:6等。

作为本发明优选的技术方案，所述将葡萄废果、糖和复合微生物菌剂混合的具体操作为：将葡萄废果、糖和无菌水依次加入发酵容器中，再加入复合微生物菌剂并搅拌混合。

优选地，所述葡萄废果、糖和无菌水的质量比为(4～10):(1～6):(16～24)，例如可以是4:1:16、5:1:16、6:1:16、8:1:16、10:1:16、4:2:16、4:3:16、4:4:16、4:5:16、4:6:16、4:1:16、4:1:18、4:1:20、4:1:22、4:1:24、5:2:18、8:3:20或10:6:24等。

作为本发明优选的技术方案，所述将葡萄废果、糖和复合微生物菌剂混合前，还包括将葡萄废果用无菌水洗净、磨碎、灭菌的操作，所述葡萄废果在磨碎时可以是机械磨碎或人工磨碎。

作为本发明优选的技术方案，所述发酵的过程中，保持所述发酵容器密闭或单向排气。所述发酵容器可以是一般密闭的塑料桶，或者是顶盖带有单向排气阀的容器。

优选地，所述发酵进行的第1～3周内每日搅拌1～2次。初始发酵时，所述微生物生长繁殖以及发酵过程中会产生大量的废气，导致密闭容器内气压较高，因此需要多次排气搅拌，防止发酵容器膨胀以及发酵液喷溅。

优选地，所述发酵进行的第4周以后每周搅拌1～2次，直至发酵过程不再排气。在发酵后期，发酵容器内微生物活动不再如起始发酵阶段一般剧烈频繁，因此只需隔一段时间开盖搅拌排气即可。若所述发酵容器带有单向排气阀，发酵后期便无需开盖搅拌。

作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：

将葡萄废果用无菌水洗净、磨碎、灭菌，再将所述葡萄废果、糖和无菌水依次加入发酵容器中，所述葡萄废果、糖和无菌水的质量比为(4～10):(1～6):(16～24)；

再将干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌组成的复合微生物菌剂加入至所述发酵容器中，所述复合微生物菌剂中干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为(1～3):(0.5～2):(0.5～1.5)；

在厌氧条件下发酵，所述发酵的过程中，保持发酵容器密闭，且所述发酵容器的顶盖单向排气，发酵的温度为20～25℃，pH为4.0～6.0，时间为60～100天，发酵结束后得到所述葡萄废果酵素。

第二方面，如第一方面所述的制备方法制备得到的葡萄废果酵素。

利用本发明所述的制备方法，制备得到的葡萄废果酵素产品中，总有效氮含量≥90mg/L，NH₄ ⁺离子含量≥10mg/L，NO₃ ^-离子含量≥20mg/L，PO₄ ^3-离子含量≥100mg/L，K⁺离子含量≥800mg/L，Ca²⁺离子含量≥100mg/L，Mg²⁺离子含量≥40mg/L。

第三方面，如第二方面的葡萄废果酵素在制备施入土壤或喷施叶面的肥料中的应用。

本发明提供的葡萄废果酵素能够用于制备肥料，也能直接作为肥料使用。因为土壤具有良好的缓冲性，因此，本发明所得到的葡萄废果酵素可直接土施，或稀释10～20倍后土施；所述葡萄废果酵素也可进行叶面喷施，此时，推荐稀释50～100倍后施用。

需要说明的是，本发明中所述的葡萄废果为：葡萄生长过程中自然脱落的残次果、采摘不及时过度成熟的裂果、以及销售过程中品相较差达不到销售标准的坏果和烂果等。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的一种葡萄废果酵素的制备方法，通过复合微生物菌剂的添加，大大促进了葡萄废果中的养分在发酵过程中的分解释放，显著提高了发酵产品的利用价值；所得到的酵素产品中氮磷钾的含量较高，其中总有效氮含量≥90mg/L，NH₄ ⁺离子含量≥10mg/L，NO₃ ^-离子含量≥20mg/L，PO₄ ^3-离子含量≥100mg/L，K⁺离子含量≥800mg/L，钙、镁含量也较高，Ca²⁺离子含量≥100mg/L，Mg²⁺离子含量≥40mg/L，因此，所得葡萄废果酵素能够作为营养丰富的有机肥料重新施入土壤中；

(2)本发明提供的方法为葡萄园坏果、烂果的处置提供了一种经济、环保的方式，所述制备方法反应条件温和、不苛刻，发酵产品可作为肥料重新施入果园，既减少了化学肥料的使用量，又降低了生产经营成本，易于推广，符合生态循环农业的理念。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例中，所用干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌均可从常规渠道和厂商购得；所述发酵容器为普通塑料桶或带有单向排气阀的发酵桶；

以下实施例中，所述葡萄废果来自于上海市马陆葡萄主题公园，收集葡萄生长过程中自然脱落的残次果、采摘不及时过度成熟的裂果、以及销售过程中品相较差达不到销售标准的坏果和烂果；

以下实施例中，总有效氮含量的测量标准为LY/T 1229-1999，离子含量的测量使用离子色谱仪*ICS-5000+/900，来自上海交通大学分析测试中心。

实施例1

本实施例提供一种使用复合菌剂制备葡萄废果酵素的方法，具体步骤为：

(1)用无菌水清洗葡萄废果后磨碎灭菌；

(2)将3kg葡萄废果、1kg红糖、8kg无菌水加入发酵容器中混合均匀；

(3)添加1％体积比的复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂为干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的活化培养液，所述活化培养液起始时三种菌的体积比为1份、1份和1份；

(4)在厌氧条件下进行发酵，并控制发酵温度为20℃，发酵pH为4.5；

发酵过程中保持发酵容器顶盖单向排气和轻微搅拌排气，前2周每日搅拌1次，2周后每周搅拌1次；发酵3个月后制得所述葡萄废果酵素产品。

所得发酵所得葡萄废果酵素产品中，总有效氮含量为124.2mg/L，NH₄ ⁺离子含量17.5mg/L，NO₃ ^-离子含量29.6mg/L，PO₄ ^3-离子含量195.1mg/L，K⁺离子含量1186.1mg/L，Ca²⁺离子含量107.6mg/L，Mg²⁺离子含量52.8mg/L。

实施例2

本实施例提供一种使用复合菌剂制备葡萄废果酵素的方法，具体步骤为：

(1)用无菌水清洗葡萄废果后磨碎灭菌；

(2)将5kg葡萄废果、2kg黑糖、10kg无菌水加入发酵容器中混合均匀；

(3)添加2％体积比的复合微生物菌剂，其中，干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为：2份、0.5份和0.5份；

(4)在厌氧条件下进行发酵，发酵温度25℃，发酵pH 5.0；

发酵过程中保持发酵容器顶盖单向排气和轻微搅拌排气，前期每日搅拌1次，后期每周搅拌1次；发酵2个月后制得所述葡萄废果酵素产品。

发酵所得葡萄废果酵素产品中含总有效氮159.5mg/L，NH₄ ⁺离子含量33.1mg/L，NO₃ ^-离子含量56.2mg/L，PO₄ ^3-离子含量336.6mg/L，K⁺离子含量1577.4mg/L，Ca²⁺离子含量128.0mg/L，Mg²⁺离子含量65.8mg/L。

实施例3

本实施例提供一种使用复合菌剂制备葡萄废果酵素的方法，具体步骤为：

(1)用无菌水清洗葡萄废果后磨碎灭菌；

(2)将4kg葡萄废果、2kg糖蜜、8kg无菌水加入发酵容器中混合均匀；

(3)添加1％体积比的复合微生物菌剂，其中，干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为：1份、1份和0.5份；

(4)在厌氧条件下进行发酵，发酵温度25℃，发酵pH 6.0；

发酵过程中保持发酵容器顶盖单向排气和轻微搅拌排气，前期每日搅拌1次，后期每周搅拌1次；发酵2个月后制得所述葡萄废果酵素产品。

发酵所得葡萄废果酵素产品中含总有效氮119.0mg/L，NH₄ ⁺离子含量20.4mg/L，NO₃ ^-离子含量23.2mg/L，PO₄ ^3-离子含量194.8mg/L，K⁺离子含量1250.7mg/L，Ca²⁺离子含量113.3mg/L，Mg²⁺离子含量55.6mg/L。

实施例4

本实施例提供一种使用复合菌剂制备葡萄废果酵素的方法，具体步骤为：

(1)用无菌水清洗葡萄废果后磨碎灭菌；

(2)将2kg葡萄废果、1kg麦芽糖、7kg无菌水加入发酵容器中混合均匀；

(3)添加0.5％体积比的复合微生物菌剂，其中，干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为：1份、0.5份和0.5份；

(4)在厌氧条件下进行发酵，发酵温度20℃，发酵pH 5.5；

发酵过程中保持发酵容器顶盖单向排气和轻微搅拌排气，前期每日搅拌1次，后期每周搅拌1次；发酵3个月后制得所述葡萄废果酵素产品。

发酵所得葡萄废果酵素产品中含总有效氮94.5mg/L，NH₄ ⁺离子含量12.9mg/L，NO₃ ^-离子含量26.3mg/L，PO₄ ^3-离子含量109.4mg/L，K⁺离子含量869.4mg/L，Ca²⁺离子含量107.5mg/L，Mg²⁺离子含量45.6mg/L。

实施例5

本实施例提供一种使用复合菌剂制备葡萄废果酵素的方法，具体步骤为：

(1)用无菌水清洗葡萄废果后磨碎灭菌；

(2)将3kg葡萄废果、1.5kg红糖、9kg无菌水加入发酵容器中混合均匀；

(3)添加1％体积比的复合微生物菌剂，其中，干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为：1份、0.5份和1份；

(4)在厌氧条件下进行发酵，发酵温度为25℃，发酵pH 5.0；

发酵过程中保持发酵容器顶盖单向排气和轻微搅拌排气，前期每日搅拌1次，后期每周搅拌1次；发酵2个月后制得所述葡萄废果酵素产品。

发酵所得葡萄废果酵素产品中含总有效氮112.0mg/L，NH₄ ⁺离子含量10.7mg/L，NO₃ ^-离子含量24.3mg/L，PO₄ ^3-离子含量165.4mg/L，K⁺离子含量1083.3mg/L，Ca²⁺离子含量114.9mg/L，Mg²⁺离子含量53.3mg/L。

实施例6

与实施例1的区别在于，以实施例1中制备得到的葡萄废果酵素替代复合微生物菌剂，接种量体积比为8％，其余条件及制备方法同实施例1。

实施例7

与实施例1的区别在于，所述复合微生物菌剂中仅包含干酪乳杆菌和酵母菌，干酪乳杆菌和酵母菌的体积比为1.5份和1.5份；其余条件与实施例1相同。

实施例8

与实施例1的区别在于，所述复合微生物菌剂中仅包含酵母菌和曲霉菌，含酵母菌和曲霉菌的体积比为1.5份和1.5份；其余条件与实施例1相同。

对比例1

与实施例1的区别在于，所述制备方法中不添加糖，其余条件与实施例1相同。

对比例2

与实施例1的区别在于，用于发酵的微生物仅为酵母菌，其余条件与实施例1相同。

将实施例1～8和对比例1～2所得到的葡萄废果酵素中的各元素含量汇总至表1：

表1

由上表数据可知，本发明提供的葡萄废果酵素的制备方法能够利用葡萄废果进行发酵，所得酵素中总氮含量为94.5～159.5mg/L，NH₄ ⁺的含量为10.7～33.1mg/L，NO₃ ^-的含量为23.2～56.2mg/L，PO₄ ^3-的含量为109.4～336.6mg/L，K⁺的含量为869.4～1577.4mg/L，Ca²⁺的含量为107.5～128.0mg/L，Mg²⁺的含量为45.6～65.8mg/L。

由实施例1、实施例7、8、对比例1和2比较可知，所述复合微生物菌剂为干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌时，所得酵素中氮、钾和镁离子的含量明显高于干酪乳杆菌和酵母菌同时使用、酵母菌和曲霉菌同时使用以及酵母菌单独使用。本发明利用干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌三种发酵微生物之间的协同作用，相互配合，促进葡萄废果中的营养物质的分解和释放。

综上所述，本发明提供的制备方法为葡萄园坏果、烂果的处置提供了一种经济、环保的方式，发酵产品可作为肥料重新施入果园，既减少了化学肥料的使用量，又降低了生产经营成本，符合生态循环农业的理念。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种肥料用葡萄废果酵素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将葡萄废果、糖和复合微生物菌剂混合，在厌氧条件下发酵，得到所述葡萄废果酵素；

所述复合微生物菌剂为干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌三者的组合；

所述干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为：(1~3):(0.5~2):(0.5~1.5)。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为20~25℃；

所述发酵的时间为60~100天；

所述发酵的pH为4.0~6.0。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述复合微生物菌剂存在于活菌培养液中和/或制备得到的葡萄废果酵素中；

使用存在于活菌培养液中的复合微生物菌剂进行接种时，接种量为发酵液总体积的0.5~2.0%；

使用存在于制备得到的葡萄废果酵素中的复合微生物菌剂进行接种时，接种量为发酵液总体积的5.0%~10.0%。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述糖包括黑糖、红糖、麦芽糖或糖蜜中的任意一种或至少两种的组合；

所述葡萄废果与糖的质量比为(4~10):(1~6)；

所述将葡萄废果、糖和复合微生物菌剂混合的具体操作为：将所述葡萄废果、糖和无菌水依次加入发酵容器中，再加入所述复合微生物菌剂，搅拌混合；

所述葡萄废果、糖和无菌水的质量比为(4~10):(1~6):(16~24)。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述将葡萄废果、糖和复合微生物菌剂混合前，还包括将葡萄废果用无菌水洗净、磨碎和灭菌的操作。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的过程中，保持发酵容器密闭或单向排气；

所述发酵进行的第1~3周内每日搅拌1~2次；

所述发酵进行的第4周以后每周搅拌1~2次，直至所述发酵过程不再排气。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

将葡萄废果用无菌水洗净、磨碎、灭菌，再将所述葡萄废果、糖和无菌水依次加入发酵容器中，所述葡萄废果、糖和无菌水的质量比为(4~10):(1~6):(16~24)；

再将干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌组成的复合微生物菌剂加入至所述发酵容器中，所述复合微生物菌剂中干酪乳杆菌、酵母菌和曲霉菌的体积比为(1~3):(0.5~2) : (0.5~1.5)；

在厌氧条件下发酵，所述发酵的过程中，保持发酵容器密闭，且所述发酵容器的顶盖单向排气，发酵的温度为20~25℃，pH为4.0~6.0，时间为2~3个月，发酵结束后得到所述葡萄废果酵素。

8.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的葡萄废果酵素。

9.如权利要求8所述的葡萄废果酵素在制备施入土壤或喷施叶面的肥料中的应用。