CN111345425A - 一种生态型生物保鲜剂及其制备方法 - Google Patents

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CN111345425A CN202010275913.XA CN202010275913A CN111345425A CN 111345425 A CN111345425 A CN 111345425A CN 202010275913 A CN202010275913 A CN 202010275913A CN 111345425 A CN111345425 A CN 111345425A
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Abstract

本发明涉及保鲜剂的加工技术领域，特别涉及一种生态型生物保鲜剂及其制备方法，保鲜剂主要活性成分是由微生物发酵而得的蛋白多糖成分；该成分经巴氏灭菌法灭酶杀菌后仍拥有特殊的等温吸湿曲线而具有良好的保鲜效果，同时不会造成保鲜剂成分对产品的污染，是一种生态型的生物保鲜剂；发明还针对微生物发酵生产蛋白多糖的特点制定相应的加工路线，利用中药培养基特殊的底物促使微生物生产高质量的蛋白多糖，使该保鲜剂成分在对食品、蔬果与海产品的保鲜上有突出的效果，具有良好的乳化保水效果，抗氧化功能及抑菌防腐作用，能有效提高保鲜食品的水分含量，降低水活性，起到良好的保水、保鲜目的。

Description

一种生态型生物保鲜剂及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及保鲜剂加工技术领域，特别涉及一种生态型生物保鲜剂及其制备方法。
【背景技术】
海产品由于其富含人体必需的微量元素，具有很高的营养价值而备受人们推崇，海产品味道鲜美，产品价格普遍高于其他养殖产品；但是，由于产品特性，其鲜品较普通肉质产品来说更易变质，保鲜期更短。目前，海产品的保鲜主流的保鲜方法是气调保鲜和冷冻保鲜，两种保鲜方法都有设备复杂、工序复杂的缺陷，而目前也有一些保鲜剂应用于海产品的保鲜，但是这些保鲜成分参差不齐，有些保鲜方法仅能保存海产品不受微生物侵害，并不能达到有效保水，提高水份含量，降低水活性的效果，这就导致了保鲜剂的保鲜能力大打折扣。
生物保鲜剂是一类新兴的保鲜剂，大体分为：植物类提取成分保鲜剂、生物类提取成分保鲜剂，也有较少的微生物类提取成分保鲜剂；由于微生物代谢的复杂性，往往其代谢产物会有较多的不确定性，用来制备保鲜剂存在技术手段复杂、活性成分复杂等技术缺陷，在一定程度上阻碍了微生物类保鲜剂发展。
蛋白质与多糖以共价和非共价键相连构成多种巨大分子称为蛋白多糖(proteoglycans，PG)，大量蛋白多糖聚合物可形成许多微小空隙的分子筛，使基质成为限制细菌、肿瘤细胞、寄生虫等有害大分子物质扩散的防御屏障。某些能产生透明质酸酶的细菌、癌细胞等，可通过破坏基质的防御屏障而得到扩散。因此，蛋白多糖具有一定的限制细菌扩散的作用；但是目前，蛋白多糖的提取方法多采用提取、合成方法获得，而鲜少有利用微生物发酵代谢生成的相关报道，这是因为目前微生物发酵产生蛋白多糖的路径复杂，产量低、发酵条件未知、发酵的底物也未知；但微生物可因外物刺激产生多酚氧化酶促进蛋白质胺基与多糖基以共价键结合产生蛋白多糖；而目前申请人还未发现利用中药浓缩液成分可刺激微生物发酵生产蛋白多糖的相关报道，因此，有必要以此为突破口，研究一种可高效产蛋白多糖，并能应用于海产品保鲜的方法，与其在食品、蔬果深加工产品保鲜等应用，例如百香果汁凉茶，火龙果汁凉茶，酸奶仙草冻及果汁仙草冻等。再者，目前较为有效的保鲜剂，大都为化学性的防腐剂，长期食用有害人体健康，因此，开发高效的生态型生物保鲜剂具有迫切的技术性与应用性需求。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种生态型生物保鲜剂的制备方法，该方法能制备的保鲜剂具有良好的抗氧化效果和保鲜功效，可以应用于食品保鲜，同时还能提高此等产品的水份含量，降低水活性。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种生态型生物保鲜剂，所述保鲜剂为微生物的发酵产物，其发酵方法为：微生物经活化培养基和中药强化培养基培养后得到强化乳酸菌，然后将强化乳酸菌接种至发酵培养基中制得发酵产物。
进一步的，所述微生物为嗜热乳酸杆菌(Lactobacillus thermophilus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和/或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。其中，嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的有效活菌数均为2.0×109cfu/g。
进一步的，所述活化培养基制备方法为：取26g的MRS培养基和7.2g的NB培养基混合后溶于蒸馏水中，并补水至1L制得；pH为5.5-7.0。
进一步的，所述中药强化培养基制备方法为：将淀粉组合物溶液和NB培养基按照体积比为1:1制成基础培养基；再添加3mL/L-6mL/L的中药混合浓缩液混匀后，将培养基的pH调整为5.5-7.0；所述发酵培养基制备方法为：将淀粉组合物溶液和NB培养基按照体积比为1:1制成基础培养基；再添加体积百分数为2％-4％的中药混合浓缩液混匀后，将培养基的pH调整为5.5-7.0。
进一步的，所述中药强化培养基与发酵培养基的中药混合浓缩液相同，制备方法为：将黄柏、黄苓和芦荟的单味中药与蒸馏水按照质量比为2:200-300混合，煮沸，并保持沸腾状态30-40min，然后浓缩至原液的1/2，浓缩后进行冷却、在5000r/min条件下离心10-15min，收集离心液得到中药浓缩液I；将离心沉淀物再与蒸馏水再次混合，并重复中药浓缩液I的制备方法提取中药浓缩液II，将中药浓缩液I和中药浓缩液II合并得到相应的黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液；之后将黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液按照等体积比混合得到所述中药混合浓缩液。
进一步的，所述淀粉组合物溶液的制备方法为：将米粉、玉米粉、面粉各自以2：200-300熬煮20-30min后，在5000-6000r/min转速下离心15-20min、过滤、取滤液以体积比为1:1:1混合而成。
一种制备生态型生物保鲜剂的方法，所述方法为将微生物分别接种到活化培养基中活化后，再分别接种到中药强化培养基中进行强化培养发酵；发酵结束后按照等体积比将强化培养后的菌液进行混合，得到复合乳酸菌；再将复合乳酸菌接种到发酵培养基中，在40-42℃下密封培养8-12h后将发酵液经过提取得到生物保鲜剂；所述发酵培养基的复合乳酸菌接种量为10％-14％。
进一步的，所述发酵液提取方法为：在5000-6000r/min转速下离心15-20min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5000-6000r/min转速下离心15-20min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉。
进一步的，所述发酵液提取还包括将离心沉淀物进行二次循环分子量(18-20kD)透析纯化处理。
进一步的，所述保鲜剂最后还经巴氏灭菌法灭酶杀菌保存。
一种生态型生物保鲜剂在食品保鲜上的应用。
进一步的，所述食品为可食用的饮料、蔬菜、水果和/或海产品。
进一步的，所述海产品为罗非鱼、牡蛎、对虾、蛤蜊和/或青蟹。
本发明具有如下有益效果：
1、本申请的保鲜剂主要活性成分是由微生物发酵而得的蛋白多糖成分；该成分具有良好的抑菌功效，同时还不会造成保鲜剂成分对产品的污染，是一种生态型的生物保鲜剂；发明人在研究过程中发现，对微生物培养基进行改进有助于提高蛋白多糖的含量，特别是向培养基中增加中药浓缩液成分，能有效促使乳酸菌等微生物代谢产生蛋白多糖的生成；蛋白多糖具有良好的乳化性能，作为保鲜剂可有效附着在海产品表面，能提高对海产品的保鲜能力。用蛋白多糖保鲜果汁凉茶除了具有良好的保鲜效果外，还具有高效乳化水果纤维、提高粒径的均匀分布效果，能达到保鲜、乳化的双重效果能降低果汁凉茶的沉淀产生。同时，采用蛋白多糖对酸奶仙草冻与果汁仙草冻进行保鲜，能有效乳化仙草胶、提高仙草多糖的质地达到口感细腻的效果，能改善仙草冻的品质。申请人研究发现，本申请的保鲜剂对大部分食品的保鲜效果均能达到12个月；其原因除了中药能增加胞外多糖分泌，也促进乳酸菌发酵产生蛋白多糖，更加强化稳定与乳化作用、降低水活性与提高保水性并使保鲜剂具有较强抗氧化性外，中药本身对细菌的抑制作用对保鲜剂的效果也产生了协同、增强的作用。
2、本申请的针对微生物发酵生产蛋白多糖的特点制定相应的加工路线，由于中药培养基中，加入中药其成分复杂，会对微生物的生长有一定的抑制作用，甚至还会抑制微生物分泌蛋白多糖，经发明人不断研究发现：黄柏、黄苓和芦荟的中药混合浓缩液能有效提高微生物对蛋白多糖的分泌能力，分泌足够多的蛋白多糖才能达到对海产品的保鲜效果，而且，从该保鲜剂的等温吸湿曲线表明：该保鲜剂具有高水分含量与低水活性转折点的等温吸湿曲线，这表明该保鲜剂具有优良的保水与保鲜效果。能有效提高海产品的保水能力和抗菌性；水活性是指自由水是产品保质的一个重要指标；本申请保鲜剂保鲜处理后，海产品的水活性达到0.75以下，说明能抑制多数细菌、酵母菌、霉菌、嗜盐细菌的生长，具有很好的抑菌效果。
【附图说明】
图1是本发明单因素实验中药添加量对蛋白多糖产量的影响图；
图2是本发明单因素实验发酵时间对蛋白多糖产量的影响图；
图3是本发明单因素实验菌种添加量对蛋白多糖产量的影响图；
图4是本发明实施例蛋白多糖乳化作用能力图；
图5是本发明实施例蛋白多糖的等温吸湿曲线图。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1：
本实施例的生态型保鲜剂制备方法包括如下步骤：
1、制备复合乳酸菌菌液：
①制备中药混合浓缩液：将黄柏、黄苓和芦荟的单味中药分别与蒸馏水按照质量比为2:200混合，煮沸，并保持沸腾状态30min，然后浓缩至原液的1/2，浓缩后进行冷却、在5000r/min条件下离心10min，收集离心液得到中药浓缩液I；将离心沉淀物再与蒸馏水再次混合，并重复中药浓缩液I的制备方法提取中药浓缩液II，将中药浓缩液I和中药浓缩液II合并得到相应的黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液；之后将黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液按照等体积比混合得到所述中药混合浓缩液；
②制备淀粉组合物溶液：将米粉、玉米粉、面粉各自以2：200熬煮20min后，在6000r/min转速下离心15min、过滤、取滤液以体积比为1:1:1混合而成。
③制备活化培养基：取26g的MRS培养基和7.2g的NB培养基混合后溶于蒸馏水中，并补水至1L；pH5.5；
④制备强化培养基：将NB培养基和步骤②的淀粉组合物溶液按照体积比为1:1混合，然后再加入6mL/L的步骤1)中药混合浓缩液；混匀后将pH值调整为5.5；
⑤将活菌数均为2.0×109cfu/g的嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌分别按照1mg/L的接种量分别接种到步骤③的活化培养基中，在40℃、兼性厌氧条件下静置培养24h；
⑥然后取步骤⑤活化后的菌液3ml分别接种于步骤④的强化培养基中混匀，培养48h得到相应的嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌强化菌液，最后将上述强化菌液按照等体积比混合得到复合乳酸菌菌液。
2、接种复合乳酸菌发酵制备生物保鲜剂：
(1)按照如下体积百分数量取各原料：10％的步骤⑥的复合乳酸菌菌液、2％的步骤①的中药浓缩液，余量为基础培养基，混匀后将pH值调整为5.5；其中，基础培养基制备方法为：将NB培养基中和步骤②的淀粉组合物溶液按照体积比为1:1混合制得；
(2)将步骤(1)的培养基混合后，在40℃条件下培养12h得到发酵产物，然后将发酵产物进行过滤、收集滤液在5000r/min转速下离心20min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5000r/min转速下离心20min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉；得到粗品生物保鲜剂。
实施例2：
本实施例的生态型保鲜剂制备方法包括如下步骤：
1、制备复合乳酸菌菌液：
①制备中药混合浓缩液：将黄柏、黄苓和芦荟的单味中药分别与蒸馏水按照质量比为2:300混合，煮沸，并保持沸腾状态40min，然后浓缩至原液的1/2，浓缩后进行冷却、在5000r/min条件下离心15min，收集离心液得到中药浓缩液I；将离心沉淀物再与蒸馏水再次混合，并重复中药浓缩液I的制备方法提取中药浓缩液II，将中药浓缩液I和中药浓缩液II合并得到相应的黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液；之后将黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液按照等体积比混合得到所述中药混合浓缩液；
②制备淀粉组合物溶液：将米粉、玉米粉、面粉各自以2：300熬煮30min后，在5000r/min转速下离心20min、过滤、取滤液以1:1:1混合而成。
③制备活化培养基：取26g的MRS培养基和7.2g的NB培养基混合后溶于蒸馏水中，并补水至1L；pH7.0；
④制备强化培养基：将NB培养基中和步骤②的淀粉组合物溶液按照体积比为1:1混合，然后再加入3mL/L的步骤①中药混合浓缩液；混匀后将pH值调整为7.0；
⑤将活菌数均为2.0×109cfu/g的嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌分别按照1mg/L的接种量分别接种到步骤③的活化培养基中，在40℃、兼性厌氧条件下静置培养24h；
⑥然后取步骤⑤活化后的菌液接种于步骤④的强化培养基中混匀，培养48h得到相应的嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌强化菌液，最后将上述强化菌液按照等体积比混合得到复合乳酸菌菌液。
2、接种复合乳酸菌发酵制备生物保鲜剂：
(1)按照如下体积百分数量取各原料：12％的步骤⑥的复合乳酸菌菌液、3％的步骤①的中药浓缩液，余量为基础培养基，混匀后将pH值调整为7.0；其中，基础培养基制备方法为：将NB培养基中和步骤②的淀粉组合物溶液按照体积比为1:1混合制得；
(2)将步骤(1)的培养基混合后，在41℃条件下培养10h得到发酵产物，然后将发酵产物进行过滤、收集滤液在6000r/min转速下离心15min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于6000r/min转速下离心15min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉；得到粗品生物保鲜剂。
实施例3：
本实施例的生态型保鲜剂制备方法包括如下步骤：
1、制备复合乳酸菌菌液：
①制备中药混合浓缩液：将黄柏、黄苓和芦荟的单味中药分别与蒸馏水按照质量比为2:250混合，煮沸，并保持沸腾状态35min，然后浓缩至原液的1/2，浓缩后进行冷却、在5000r/min条件下离心12min，收集离心液得到中药浓缩液I；将离心沉淀物再与蒸馏水再次混合，并重复中药浓缩液I的制备方法提取中药浓缩液II，将中药浓缩液I和中药浓缩液II合并得到相应的黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液；之后将黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液按照等体积比混合得到所述中药混合浓缩液；
②制备淀粉组合物溶液：将米粉、玉米粉、面粉各自以2：250熬煮20-30min后，在5500r/min转速下离心18min、过滤、取滤液以1:1:1混合而成。
③制备活化培养基：取26g的MRS培养基和7.2g的NB培养基混合后溶于蒸馏水中，并补水至1L；pH6.0；
④制备强化培养基：将NB培养基和步骤②的淀粉组合物溶液按照体积比为1:1混合，然后再加入4mL/L的步骤①中药混合浓缩液；混匀后将pH值调整为6.0；
⑤将活菌数均为2.0×109cfu/g的嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌分别按照1mg/L的接种量分别接种到步骤③的活化培养基中，在40℃、兼性厌氧条件下静置培养24h；
⑥然后取步骤⑤活化后的菌液3ml分别接种于步骤④的强化培养基中混匀，培养48h得到相应的嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌强化菌液，最后将上述强化菌液按照等体积比混合得到复合乳酸菌菌液。
2、接种复合乳酸菌发酵制备生物保鲜剂：
(1)按照如下体积百分数量取各原料：14％的步骤⑥的复合乳酸菌菌液、4％的步骤①的中药浓缩液，余量为基础培养基，混匀后将pH值调整为6.0；其中，基础培养基制备方法为：将NB培养基中和步骤②的淀粉组合物溶液按照体积比为1:1混合制得；
(2)将步骤(1)的培养基混合后，在42℃条件下培养8h得到发酵产物，然后将发酵产物进行过滤、收集滤液在5500r/min转速下离心18min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5500r/min转速下离心18min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉；得到粗品生物保鲜剂。
特别说明：上述实施例1-3为避免污染施用对象,将保鲜剂再进一步进行巴氏灭菌法灭酶杀菌处理，处理条件为65℃,30min。申请人研究发现，该成分经巴氏灭菌法灭酶杀菌后仍拥有特殊的等温吸湿曲线而具有良好的乳化保水效果，抗氧化功能及抑菌防腐作用等，保鲜功能效果良好。
一、重点参数步骤探索：
设置中药添加量、发酵时间、菌种添加量的单因素实验；按照实施例1的方法生产蛋白多糖，测定蛋白多糖产量，
其中，中药添加量是指：中药添加到发酵培养基中的量；
菌种添加量是指：菌种经活化、强化培养基培养制备得到复合乳酸菌，复合乳酸菌再接种到发酵培养基中的量；
发酵时间是指：复合乳酸菌接种到发酵培养基中，在发酵培养基中的反应时间。
结果见图1-3所示：
中药添加量对蛋白多糖生产的影响结果如图1所示。随着中药添加量的增加，蛋白多糖的产量呈先上升后下降的趋势。中药添加量的变化，主要是影响乳酸菌的发酵作用，提供发酵生产蛋白多糖的刺激因子，强化乳酸菌的生长并激发酶类的生化反应。当添加量为3％时，蛋白多糖的产量最高，此时乳酸菌的生长达最稳定，发酵作用最为旺盛，最适合蛋白多糖的生产。
发酵时间对蛋白多糖生产的影响结果如图2所示。随着发酵时间的增加，蛋白多糖生产呈上升后趋平现象。蛋白多糖生产发酵时间从4-12h时，乳酸菌快速生长，菌体生长量增加，从而蛋白多糖也随之增加，当发酵时间达10h时，蛋白多糖生产量达最大后趋稳定，因此蛋白多糖最适生产的发酵时间为10h-12h。
菌种添加量对蛋白多糖生产的影响结果如图3所示。菌种添加量对蛋白多糖生产是呈先上升后下降的趋势。菌种添加量于6％-12％时约与蛋白多糖产量成正相关，菌种添加量于12％时约为6％时的2倍，菌种添加量增加有利于蛋白多糖的生产；但添加至14％则过多而消化了蛋白多糖使之产量减少，由于微生物量增多竞争食物而减少蛋白多糖的生产。故最适菌种添加量为12％左右。
根据单因素实验结果设计正交实验，具体如下：
根据单因素试验结果，选取中药添加量、菌种添加量和发酵时间等因素进行三因素三水平的L9(33)正交优化试验，试验因素水平如表3所示，正交试验结果及极差分析结果如表4所示，各因素对蛋白多糖生产影响的主次顺序为A>C>B，即中药添加量对蛋白多糖生产影响最大，其次为发酵时间，菌种添加量的影响则最小。最优组合为A2B2C3，即中药添加量3％，菌种添加量12％，发酵时间12h。适当的菌种添加量可稍微促进蛋白多糖生产，充足的发酵时间比菌种添加量可较为促进产生蛋白多糖，而适当的中药添加量则可大为强化促进蛋白多糖的生产，但过量的中药则会限制蛋白多糖的生产。
表1蛋白多糖生产正交实验因素水平
Figure BDA0002444768730000091
表2正交试验结果及极差分析结果
Figure BDA0002444768730000092
Figure BDA0002444768730000101
经发明人研究发现，本申请的保鲜剂其蛋白多糖含量比常规组高，因此，针对蛋白多糖产率发明人做了如下实验：
二、蛋白多糖产率测试：
实验1：中药培养基成分对蛋白多糖产率的影响：
实验组：按照“重点参数步骤探索”正交实验的最佳条件，即(中药添加量3％，菌种添加量12％，发酵时间12h)制备蛋白多糖；制备过程的其他方法：即制备复合乳酸菌菌液、提取、纯化蛋白多糖的方法与实施例1完全一致。
对照组1：仅采用MRS培养基生产蛋白多糖，即制备方法为：将微生物菌种按照说明书直接接种到MRS培养基中，在40℃条件下培养12h得到发酵产物，然后将发酵产物进行过滤、收集滤液在5000r/min转速下离心20min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5000r/min转速下离心20min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉；得到粗品生物保鲜剂。
对照组2：中药浓缩液的中药成分仅有黄柏和黄苓，其它技术参数及制备方法与实验组1完全相同。
控制组：纯新鲜蚝汁。
将实验组和对照组1-2的微生物发酵后中药发酵液放入冰箱上层静置3小时后，再分装至离心管中进行离心6000r/min，15min，离心后提取沉淀物至称量瓶内，放入105℃的烘箱中进行72h烘干，称量恒重得细胞干重。上清液加入3倍等体积的95％酒精，放入冰箱上层静置24h后进行萃取，再用真空冷冻干燥法析出沉淀物，进行称量得蛋白多糖产量，蛋白多糖干重与菌体干重的比值即为蛋白多糖的产率。
测试结果见表3：
表3中药培养基成分对蛋白多糖的影响产率
组别 细胞干重(mg/L) 蛋白多糖产量(mg/L) 蛋白多糖产率(％)
实验组 2423 1215 50.14a
对照组1 1236 451 36.49c
对照组2 2062 906 43.94b
控制组 1069 259 24.23d
注：表中a，b，c，d表示同一列比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。
由表3可知，实验组的蛋白多糖产率明显大于对照组1-2和控制组。说明添加中药浓缩液可有效提高微生物的蛋白多糖产量；且多种中药组合的中药液其对蛋白多糖的含量增加有促进作用。
实验2：中药乳酸菌配方对蛋白多糖产率的影响：
申请人在进行中药强化培养基和发酵乳酸菌的摸索过程中进行了大量的实验，最终发现，采用本申请公开的中药培养基配方和乳酸菌配方能有效提高蛋白多糖产率，具体如下(申请人做了很多组，这里仅列具有代表性的3组)：
组1：采用黄柏，伏苓和芦荟的中药混合浓缩液强化培养嗜热乳酸杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，并按照实施例1的方案制备蛋白多糖；即为实施例1的方案；
组2：采用枸杞子、红景天和红曲的中药混合浓缩液强化培养嗜酸乳杆菌、青春双岐杆菌和副干酪乳杆菌；其他技术参数和制备方法按照实施例1进行，最终制备得到蛋白多糖产品；
组3：采用黄苓，山药和绿藻的中药混合浓缩液强化培养植物乳杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌；其他技术参数和制备方法按照实施例1进行，最终制备得到蛋白多糖产品；
具体实验方法为：
将组1-3的微生物发酵后中药发酵液放入冰箱上层静置3小时后，再分装至离心管中进行离心6000r/min，15min，离心后提取沉淀物至称量瓶内，放入105℃的烘箱中进行72h烘干，称量恒重得细胞干重。上清液加入3倍等体积的95％酒精，放入冰箱上层静置24h后进行萃取，再用真空冷冻干燥法析出沉淀物，进行称量得蛋白多糖产量，蛋白多糖干重与菌体干重的比值即为蛋白多糖的产率。测试结果见表4：
表4中药乳酸菌配方对蛋白多糖产率的影响
Figure BDA0002444768730000111
Figure BDA0002444768730000121
注：表中a，b表示同一列比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。
从表4可看出，组1的蛋白多糖产率显著高于组2-3(P<0.05)，说明本申请的中药配合与乳酸菌配合使用能有效提高蛋白多糖产率。
实验3：粗蛋白多糖的纯化及纯蛋白多糖中蛋白质与多糖含量测定：
本申请的实施例以及实验1和实验2制备得到的均为粗蛋白多糖(仅经过1次透析处理)；为了进一步对蛋白多糖进行纯化，并分析纯化后蛋白多糖的主要组成成分，申请人还对组1-3的粗蛋白多糖再进行二次循环纯化:取所得粗品蛋白多糖经分子量(18-20kD)透析，透析液经真空冷冻干燥、磨粉后以蒸馏水清洗过滤。再将蒸馏水清洗滤液经分子量(18-20kD)透析，真空冷冻干燥、磨粉得纯化约90％的纯蛋白多糖。再利用酸水解纯蛋白多糖并分别测定水解前后蛋白质和多糖含量及纯蛋白多糖质量，其中，纯蛋白多糖中蛋白质和多糖总和的回收率约90.3％-91.2％，具体见表5。本实验蛋白质测定采用GB 5009.5-2010的凯氏定氮法，多糖测定采用总糖苯酚硫酸法测定。
其中，纯蛋白多糖的纯化回收率的计算方法为：(纯蛋白多糖/粗蛋白多糖)×100％；
蛋白质和多糖的总回收率的计算方法为：[(蛋白质+多糖)/纯蛋白多糖]×100％。
表5纯蛋白多糖中蛋白质与多糖含量
组别 蛋白质(mg/L) 多糖(mg/L) 纯蛋白多糖(mg/L)
控制组 18c 25c 1098a
组1 142a 875a 1115a
组2 117b 732b 936b
组3 112b 726b 928b
注：表中a，b，c表示同一列比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。控制组为未经酸水解的纯蛋白多糖。
从表5可知，本申请的保鲜剂主要为蛋白质与多糖组成，其中组1的蛋白质含量、多糖含量、纯蛋白多糖含量显著高于组2-3(P<0.05)；而组2-3的蛋白质含量、多糖含量、纯蛋白多糖含量之间并无显著差异(P＞0.05)；说明，本申请的中药乳酸菌配方较能生产更多的蛋白多糖，效果优于其他中药乳酸菌配方组合。
三、蛋白多糖的乳化效果测试：
实验组：按照“重点参数步骤探索”正交实验的最佳条件，即(中药添加量3％，菌种添加量12％，发酵时间12h)制备蛋白多糖；制备过程的其他方法：即制备复合乳酸菌菌液、提取、纯化蛋白多糖的方法与实施例1完全一致；
控制组：采用MRS培养基生产得到的蛋白多糖；其他提取、纯化蛋白多糖的方法与实施例1完全一致；
对照组：纯新鲜蚝汁10mg/mL。
取新鲜蚝汁与蛋白多糖混合(1:1)然后与实验组(EX)和控制组(CL)进行配置，使各组的蛋白多糖溶液终浓度为10mg/mL，然后将实验组(EX)、控制组(CL)和对照组(BK)分别以体积比2:3与花生油混合，在震荡器上进行震荡2min，静止24h后测量乳化层和总高度。计算乳化指数；其中，乳化指数的计算公式如下：
乳化指数(％)＝(乳化层高度/总溶液高度)×100％
乳化结果见图4：添加中药的实验组(EX)(85.10±2.40％)皆比不添加中药的控制组(CL)(62.1±2.9％)与纯新鲜蚝汁(BK)(36.2±1.5％)具有显着较高的乳化活性(P<0.05)，乳化指数的高低大致呈现实验组(EX)>控制组(CL)>对照组(BK)，其中实验组(EX)比控制组(CL)大约有1.3～1.5倍的效果，比对照组(BK)大约有2.2～2.5倍的效果，此现象显示乳化指数与蛋白多糖浓度呈现密切相关，可说明中草药对乳化效果有促进作用。
四、保鲜剂的抗氧化活性研究:
对照组1：
本对照组活化益生菌时不添加中药浓缩液，其它实施方式与实施例1一致，即强化培养基按照强化培养基成分配置但不含中药混合浓缩液：由淀粉组合物溶液和NB培养基按照质量比为1:1制成基础培养基，将培养基的pH调整为5.5；然后向基础培养基中直接接种益生菌，同等条件下发酵。
对照组2：
本对照组使用MRS培养基来发酵生产蛋白多糖，即制备方法为：将微生物菌种按照说明书直接接种到MRS培养基中，在40℃条件下培养12h得到发酵产物，然后将发酵产物进行过滤、收集滤液在5000r/min转速下离心20min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5000r/min转速下离心20min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉；得到粗品生物保鲜剂。
对照组3：
本对照组仅选用2味中药即黄柏和黄苓制备中药浓缩液，然后利用此中药混合浓缩液制备中药培养基，其他技术参数和制备方法按照实施例1进行，最终制备得到蛋白多糖产品。
对照组4：
纯新鲜蚝汁。
抗氧化实验
氧化保健效果以DPPH自由基清除能力，还原力，亚铁离子螯合作用及亚油酸过氧化的抑制作用等抗氧化指标作为评估依据，并以总酚含量说明抗氧化的效果机理；具体测试实施例1、对照组1-5和阳性对照(维生素C)的DPPH自由基清除能力、还原力、亚铁离子鳌合作用、亚油酸过氧化的抑制作用和总酚含量。测试方式如下：
(1)DPPH自由基清除能力：
配制10mL的各实验组样品溶液，浓度为10mg/mL。用移液管各取2.5mL样品溶液加到3支试管中。称取0.001g DPPH置于50mL小烧杯中，加入酒精进行溶解后，用容量瓶配制50mL DPPH溶液。用移液管各取2.5mL的DPPH溶液加到含有2.5mL的样品溶液试管中，混合均匀。在黑暗中静止20min后将试管放在波长517nm处测定吸光值。另外以蒸馏水同样步骤進行控制组测试。并用抗坏血酸做阳性对照。DPPH清除能力计算方法如下：
DPPH清除能力(％)＝[(OD517控制组-OD517试样)]/(OD517控制组)]×100
式中OD517控制组为控制组吸光值，OD517试样为试样吸光值。
(2)还原力：
取各实验组样品溶液，分别加入1mL巴伯尔(Buffer)溶液和1mL K3Fe(CN)6溶液，再将试管放入调至50℃烘箱中烘焙20分钟取出试管，分别加入2.5mL的蒸馏水和0.5mL的FeCl3，使其反应20min然后测定700nm时的吸光值，分别表征各组样品溶液的还原力。并用抗坏血酸做阳性对照。
(3)亚铁离子螯合作用
根据Dinis等人的研究方法稍加修改，取各实验组的样品溶液分别加入2.775mL通用缓冲液(pH值7.4)和2mmol/L，0.075mL FeCl2溶液。反应开始后加入5mmol/L 0.15mL的ferrozine溶液。10分钟后，在室温下，测定560nm的吸光值。另外以蒸馏水同样步骤进行控制组测试。并用乙二胺四乙酸(EDTA)作为阳性对照。螯合能力计算方法如下：
螯合能力(％)＝[(OD560控制组-OD560样品)(OD560控制组)-1]×100；
式中OD560控制组为控制组吸光值，OD560试样为试样吸光值。
(4)亚油酸过氧化的抑制作用
采用硫氰酸铁法，取实验组的的样品溶液，分别混合2.5mL，0.2mol/L亚油酸在2mL，0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH值为6.6)在试管中放置在黑暗中37℃中加速氧化。24小时后，加入4.7mL的75％酒精，然后加入0.1mL 30％NH4SCN和0.1mL 20mmol/L FeCl2.4H2O，混合3分钟。在500nm吸光值下测定抗氧化活性(AOA)，另外以蒸馏水同样步骤进行控制组测试。并用抗坏血酸做阳性对照。抗氧化活性(AOA)计算方法如下，
AOA(％)＝[(OD500控制组-OD500样品)(OD500控制组)-1]×100；
式中OD500控制组为控制组吸光值，OD500试样为试样吸光值。
(5)总酚含量
取定量的样品溶液，分别加入0.2mL的Folin–Ciocalteu试剂和2mL的纯水。静置五分钟后加入1mL 20％的Na2CO3溶液，震荡后于黑暗环境下静置1h。最后测波长760nm处的吸光值。对比没食子酸标准曲线以求出样品溶液的总酚含量。配制10mg/mL的没食子酸溶液，即取200mg没食子酸加入20mL蒸馏水。然后加入不同蒸馏水量稀释之，使没食子酸的浓度成一定量的梯度分布(如2mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL)，再分别测其吸光值制作标准曲线，以吸光值换算浓度得总酚含量。
实验结果见表6：
表6保鲜剂的抗氧化效果
Figure BDA0002444768730000151
Figure BDA0002444768730000161
注：表中a，b，c，d，e表示同一列比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。
由表6可知，实施例1的DPPH清除能力、还原力、螯合能力、AOA、总酚含量皆大于对照组1-4，由此见，发酵过程添加中药液进行发酵能有效促进本申请的保鲜剂的抗氧化能力。
五、保鲜实验：
实验1：蛋白多糖对海产品保鲜效果
①蛋白多糖对污染菌的抑菌效果
实验组：按照“重点参数步骤探索”正交实验的最佳条件，即(中药添加量3％，菌种添加量12％，发酵时间12h)制备蛋白多糖；
控制组：采用MRS培养基生产得到的蛋白多糖；
对照组：纯新鲜蚝汁。
本抑菌试验对象包含常见海产品的污染菌例如大肠杆菌(E.Coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，志贺菌(Shigella)及沙门氏菌(Salmonella)等。首先以营养培养基(NB)进行24h震荡培养四种污染菌，分别吸取适量菌液均匀涂抹于营养琼脂培养基(NA)。在平板上打4个孔洞后，将蛋白多糖溶液注入孔洞中，静置3min，放入37℃培养箱中过夜，次日测量抑菌圈直径并记录。抑菌圈直径>20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径为l0～15mm为中敏，抑菌圈直径<10mm为低敏，无抑菌圈为不敏感。
实验结果如表7所示：
表7蛋白多糖抑菌效果
Figure BDA0002444768730000162
Figure BDA0002444768730000171
注：抑菌圈单位：mm；--，表无抑菌效果。英文a，b表示同一行比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。
由表7可知，实验组抑菌圈对污染菌的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，志贺菌及沙门氏菌分别为18.4±0.5mm为高敏，8.7±0.8mm为低敏，10.8±0.6mm为中敏，13.6±0.4mm为中敏，可知，实验组皆显著比控制组与对照组的抑菌圈大，具有统计学的显着差异(P<0.05)。显示添加中药发酵蛋白多糖的实验组皆显著比控制组与对照组的抑菌效果为大，具有统计学显着差异(P<0.05)。由于大肠杆菌为海产品普遍的污染菌，繁殖力强，对环境的适应力强，因此抑菌效果也相对显著。同样沙门氏菌引起的食物中毒常列为榜首，中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。但由于沙门氏菌在水中不易繁殖，因此对沙门氏菌的抑菌效果也较为显着。金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。由于金黄色葡萄球菌的细胞壁含90％的肽聚糖和10％的磷壁酸，具有较强的对抗抑菌效果，因此不论实验组或控制组皆显示抑菌能力与效果最小。志贺菌一般对营养要求不高，因此也极易生长成为污染菌，相对抑菌效果也显著，故蛋白多糖对四种海产品污染菌的抑菌能力依次为大肠杆菌>沙门氏菌>志贺菌>金黄色葡萄球菌。
②蛋白多糖的等温吸湿曲线
如图5，本申请蛋白多糖的等温吸湿曲线显示，该保鲜剂具有高水分含量与低水活性转折点的等温吸湿曲线，这表明该蛋白多糖具有高保水性，低水活性特质，可保鲜兼防腐效果，在等温吸湿曲线的转折点上，保水含量可达7.0％，而水活性仅为0.65，可防止细菌，酵母菌，霉菌等微生物污染。
③对海产品的保鲜研究
按如下组别设计实验组：
实验组(OPT组)：按照“重点参数步骤探索”正交实验的最佳条件，即(中药添加量3％，菌种添加量12％，发酵时间12h)的生产方法生产得到的保鲜剂；
对照组(MRS组)：采用MRS培养基生产得到的保鲜剂；
空白组：蒸馏水。
将实验组与对照组的保鲜剂配成10mg/mL的保鲜剂溶液；
罗非鱼保鲜：将新鲜罗非鱼切片绞碎后分别浸泡到实验组、对照组和空白组的溶液中，常温放置10min；
牡蛎保鲜：将新鲜牡蛎去壳后洗净、绞碎，浸泡到实验组、对照组和空白组的溶液中，常温放置10min；
对虾保鲜：将新鲜对虾去壳后洗净、绞碎，浸泡到实验组、对照组和空白组的溶液中，常温放置10min；
蛤蜊保鲜：将新鲜蛤蜊去壳后洗净、绞碎，浸泡到实验组、对照组和空白组的溶液中，常温放置10min；
青蟹保鲜：将新鲜青蟹去壳后洗净、绞碎，浸泡到实验组、对照组和空白组的溶液中，常温放置10min。
水分测定：使用HE53/02水分测定仪直接测定其水份含量；
水活度测定：使用水分活度测定仪直接测定其水分活度。测定结果如表8所示：
表8海产品的水份含量和水活性
Figure BDA0002444768730000181
注：表中a、b、c表示在实验组OPT，对照组MRS及空白组中差异具有统计学意义(P<0.05)。
从表8可以看出，实验组(OPT)的水份含量均显著高于对照组(MRS)与空白组(P<0.05)；实验组(OPT)的水份含量均显著低于对照组(MRS)与空白组(P<0.05)；实验组的保水能力优于对照组的水份含量，能更好地保存罗非鱼的鲜度，也说明了最优组合中药培养基可促进乳酸菌发酵粗蛋白多糖对海产品的保水能力。
实验2：蛋白多糖果汁的保鲜效果
①总菌落数试验
实验组：按照“重点参数步骤探索”正交实验的最佳条件，即(中药添加量3％、菌种添加量12％、发酵时间12h)制备蛋白多糖采用实施例1制备的蛋白多糖保鲜剂。
控制组：采用MRS培养基生产得到的保鲜剂，即制备方法为：将微生物菌种按照说明书直接接种到MRS培养基中，在40℃条件下培养12h得到发酵产物，然后将发酵产物进行过滤、收集滤液在5000r/min转速下离心20min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5000r/min转速下离心20min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉；得到粗品生物保鲜剂。
对照组：纯新鲜果汁。
将保鲜剂按照10mg/mL的添加量添加到实验组和控制组的果汁；实验组、控制组和对照组的果汁相同，均选用百香果汁，即百香果榨汁后按实验组与控制组各添加相应的保鲜剂，对照组不添加保鲜剂，然后三组皆经过巴氏灭菌、热封罐包装，将3组果汁在常温下保藏，到第12个月，以平板计数法统计并观察的污染菌总菌落数与大肠杆菌数，具体情况见表9：
表9果汁凉茶保藏期限达12个月的总菌落数与大肠杆菌数
卫生指标菌 实验组 控制组 对照组
大肠杆菌(cfu/mL) 1a 3.3×10<sup>3</sup>b 2.6×10<sup>6</sup>c
总菌落数(cfu/mL) 5a 8.2×10<sup>5</sup>b 3.7×10<sup>8</sup>c
注：英文a，b，c表示同一行比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。
由表9可见，12个月后实验组的菌落数低于控制组和对照组，具有显著差异(P<0.05)，本申请的保鲜剂具有很好的保鲜效果。
实验3：蛋白多糖对果冻的保鲜效果
①总菌落数试验
实验组：按照“重点参数步骤探索”正交实验的最佳条件，即(中药添加量3％、菌种添加量12％、发酵时间12h)制备蛋白多糖采用实施例1制备的蛋白多糖保鲜剂。
控制组：采用MRS培养基生产得到的保鲜剂，即制备方法为：将微生物菌种按照说明书直接接种到MRS培养基中，在40℃条件下培养12h得到发酵产物，然后将发酵产物进行过滤、收集滤液在5000r/min转速下离心20min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5000r/min转速下离心20min，取沉淀物经透析纯化，再将透析液真空冷冻干燥、磨粉；得到粗品生物保鲜剂。
对照组：纯酸奶仙草冻。
将保鲜剂按照10mg/mL的添加量添加到实验组和控制组的果冻中，实验组、控制组和对照组的果冻相同，主料为奶粉和琼脂，实验组和控制组按照要求添加相应的保鲜剂，对照组不添加，制备完成后三组皆经过巴氏灭菌、无菌包装；将3组酸奶仙草冻在常温下保藏12个月，以平板计数法统计并观察在保藏期限达12个月的污染菌总菌落数与大肠杆菌数。具体见表10：
表10酸奶仙草冻保藏期限达12个月的总菌落数与大肠杆菌数
卫生指标菌 实验组 控制组 对照组
大肠杆菌(cfu/mL) 1a 2.5×10<sup>3</sup>b 3.5×10<sup>6</sup>c
总菌落数(cfu/mL) 3a 6.3×10<sup>5</sup>b 8.4×10<sup>8</sup>c
注：英文a，b，c表示同一行比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。
由表10可见，12个月后实验组的菌落数低于控制组和对照组，具有显著差异(P<0.05)，本申请的保鲜剂具有很好的保鲜效果。
综上所述，使用本申请的方法生产的保鲜剂，其起到活性保鲜成分的是蛋白多糖，该成分具有良好的抗氧化功能和抑菌效果，同时还具有良好的保水效果，应用广泛，同时还能起到保水效果，能提高食品的新鲜度。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种生态型生物保鲜剂，其特征在于，所述保鲜剂为微生物的发酵产物，其发酵方法为：微生物经活化培养基和中药强化培养基培养后得到强化乳酸菌，然后将强化乳酸菌接种至发酵培养基中制得发酵产物。
2.根据权利要求1所述的生态型生物保鲜剂，其特征在于，所述微生物为嗜热乳酸杆菌(Lactobacillus thermophilus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和/或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
3.根据权利要求1所述的生态型生物保鲜剂，其特征在于，所述活化培养基制备方法为：取26g的MRS培养基和7.2g的NB培养基混合后溶于蒸馏水中，并补水至1L制得；pH为5.5-7.0。
4.根据权利要求1所述的生态型生物保鲜剂，其特征在于，所述中药强化培养基制备方法为：将淀粉组合物溶液和NB培养基按照体积比为1:1制成基础培养基；再添加3mL/L-6mL/L的中药混合浓缩液混匀后，将培养基的pH调整为5.5-7.0；所述发酵培养基制备方法为：将淀粉组合物溶液和NB培养基按照体积比为1:1制成基础培养基；再添加体积百分数为2％-4％的中药混合浓缩液混匀后，将培养基的pH调整为5.5-7.0。
5.根据权利要求4所述的生态型生物保鲜剂，其特征在于，所述中药强化培养基与发酵培养基的中药混合浓缩液相同，制备方法为：将黄柏、黄苓和芦荟的单味中药与蒸馏水按照质量比为2:200-300混合，煮沸，并保持沸腾状态30-40min，然后浓缩至原液的1/2，浓缩后进行冷却、在5000r/min条件下离心10-15min，收集离心液得到中药浓缩液I；将离心沉淀物再与蒸馏水再次混合，并重复中药浓缩液I的制备方法提取中药浓缩液II，将中药浓缩液I和中药浓缩液II合并得到相应的黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液；之后将黄柏、黄苓和芦荟中药浓缩液按照等体积比混合得到所述中药混合浓缩液。
6.根据权利要求4所述的生态型生物保鲜剂，其特征在于，所述淀粉组合物溶液的制备方法为：将米粉、玉米粉、面粉各自以2：200-300熬煮20-30min后，在5000-6000r/min转速下离心15-20min、过滤、取滤液以体积比为1:1:1混合而成。
7.一种制备权利要求1-6任意一项生态型生物保鲜剂的方法，其特征在于，所述方法为将微生物分别接种到活化培养基中活化后，再分别接种到中药强化培养基中进行强化培养；之后按照等体积比将强化培养后的菌液进行混合，得到复合乳酸菌；再将复合乳酸菌接种到发酵培养基中，在40-42℃下密封培养8-12h后将发酵液经过提取得到生物保鲜剂；所述发酵培养基的复合乳酸菌接种量为10％-14％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵液提取方法为：在5000-6000r/min转速下离心15-20min，收集上清液，用减压浓缩机将上清液浓缩至原体积的1/3后，向浓缩液中加入等体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，于4℃下静置24h至沉淀析出，于5000-6000r/min转速下离心15-20min，取沉淀物真空冷冻干燥、磨粉。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵液提取方法还包括，将沉淀物进行透析纯化后再进行真空冷冻干燥、磨粉。
10.一种如权利要求1-6任意一项生态型生物保鲜剂和权利要求7-8制备方法制备得到的生态型生物保鲜剂在食品保鲜上的应用。
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