CN111337668A - 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法，包括SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白抗原胶体金。该试剂盒操作简单，能够快速诊断出患者是否感染SARS‑CoV‑2，利于疫情的有效控制。本发明还公开一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法。

Description

一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及疾病检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其 制备方法。
背景技术
人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严 重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状 病毒所致疾病没有特异治疗方法。因此对于疾病的预防和早期诊断对于控制新型冠状病毒疫 情蔓延尤为重要。
发明内容
为了提高新型冠状病毒的早期诊断效率，本发明公开一种新型冠状病毒抗原胶体金快速 诊断试剂盒，该试剂盒操作简单，能够快速诊断出患者是否感染SARS-CoV-2，利于疫情的有 效控制。
本发明还公开一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒，包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金。
一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将SARS-CoV-2核衣壳蛋白进行表达和纯化；
(2)制备SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金。
SARS-CoV-2核衣壳蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
其中，步骤(1)中，SARS-CoV-2核衣壳蛋白的表达，包括如下步骤：
(11)以SARS-CoV-2核衣壳蛋白的氨基酸序列所对应的核苷酸序列为模板，设计核苷酸 序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5 所示的反向引物；
(12)经过PCR扩增、双酶切PCR产物及载体，将SARS-CoV-2核衣壳蛋白对应的核苷酸 序列克隆至质粒载体中；
(13)利用步骤(12)所得载体转化大肠杆菌，再进行诱导培养；
(14)对培养后的大肠杆菌进行离心，获取SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白。
进一步的，步骤(12)中，所述质粒载体为pET28a、pET22b、pET21b、pET32a、pET40、pGex-6P-1和pMal-c2x中的任意一种。
进一步的，步骤(13)中，大肠杆菌采用E.coli BL21或者Rossetta菌株，诱导培养方法 为：将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄青霉素或卡那霉素的平板中，于37℃孵育，然后挑 取单菌落接种于液体培养基中培养2-5h，最后加入IPTG进行诱导，培养3-18h。
进一步的，步骤(14)中，SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白的获取方法为：收集离心后的大 肠杆菌菌体，加入缓冲液破碎菌体后离心获取上清液，经过层析进行纯化，获得SARS-CoV-2 核衣壳重组蛋白。
步骤(1)中，SARS-CoV-2核衣壳蛋白纯化后，利用抗N蛋白的抗体进行验证。
进一步的，步骤(2)中，制备SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金的具体步骤如下：
(21)以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料配制胶体金溶液；
(22)将SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白溶液转入透析袋中，透析过夜；
(23)将透析处理之后的SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白加入等体积的胶体金溶液中，静置， 然后加入BSA溶液，充分混匀后离心，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解，即制得SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金。
步骤(22)中，透析方法为：将SARS-CoV-2核衣壳蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入 透析袋中，2-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒，该试剂盒操作简单，能够快速诊 断出患者是否感染SARS-CoV-2，利于疫情的有效控制。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不 构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明N蛋白的SDS-page和Western blot验证结果图：B图为N抗原稀释成不同 浓度后进行WB验证，negative为正常人阴性血清对照。
图2为本发明样本测试显色图：其中左侧为N抗原检测血清中IgG抗体，右侧为N抗原 检测血清中IgM抗体。
图3为本发明样本OD值：左侧为N抗原检测血清中IgG抗体，右侧为N抗原检测血清中IgM抗体。
图4为本发明实施例2样本OD值统计图。
图5为本发明实施例3样本OD值统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明 作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本 发明的限定。
实施例1
本发明一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒，通过以下步骤制备：
1、SARS-CoV-2核衣壳蛋白的表达和纯化
以SARS-CoV-2核衣壳蛋白的氨基酸序列所对应的核苷酸序列为模板，设计核苷酸序列如 SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5所示 的反向引物；经过PCR扩增、双酶切PCR产物及载体、克隆至pET/pGex/pMal系列载体中， 载体包括但不限于pET28a/pET22b/pET21b/pET32a/pET40/pGex-6P-1/pMal-c2x。
将包含SARS-CoV-2核衣壳蛋白核苷酸序列的重组质粒转化至E.coli BL21或者Rossetta菌 株中，涂布于含有氨苄青霉素或者卡那霉素的平板中，于37℃孵育16小时后，挑取单菌落 接种液体培养基中，培养2-5小时，加入的IPTG进行诱导；3-18小时后，离心、收集菌体； 加入缓冲溶液破碎菌体后离心获取上清，经过层析纯化后获得SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白。
其中，各引物核苷酸序列如下：
SEQ ID NO:2
CGCGGATCCATGTCTGATAATGGACCCCA
SEQ ID NO:3
CCGGAATTCATGTCTGATAATGGACCCCA
SEQ ID NO:4
ATAAGAATGCGGCCGCTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGC
SEQ ID NO:5
CCGCTCGAGTTA GGCCTGAGTTGAGTCAGC
2、纯化N蛋白(SARS-CoV-2核衣壳蛋白)的验证
用抗N蛋白的抗体进行western blot验证，验证结果如图1所示，目的蛋白为49KD，符 合预期。
3、SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金的制备
3.1胶体金溶液的制备
取质量浓度为0.01％氯金酸水溶液并加热至沸腾，滴加1％柠檬酸三钠水溶液并不断搅 拌，在氯金酸水溶液由金黄色变为***后继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复至原体积， 2-8℃保存待用。
3.2将新冠病毒核衣壳重组蛋白溶液浓度至1mg/mL后转入透析袋中，2-8℃下用浓度为 20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜；
3.3将透析处理之后的SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白中加入等体积的胶体金溶液中，2-8℃ 静置，使新冠病毒核衣壳抗原充分与胶体金结合，然后按每10mL胶体金加2mL质量浓度为 5％BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混匀后离心0.5-1.5h，弃上清液，胶体金沉淀用保护液 再溶解，即制得新冠病毒核衣壳抗原免疫胶体金。
实施例2
检测IgG抗体的临床样本验证
前期收集新型冠状病毒肺炎的临床确诊病例17例、疑似样本22例(最终核酸阴性排除) 和正常人样本23例，以ELISA方法验证纯化得到的N蛋白能否检测出血清中抗SARS-CoV-2IgG 抗体，操作步骤如下：
1.以N抗原包被96孔板，包被浓度0.2μg/孔，100μl/孔。4℃，过夜。包被时设置阴性对照孔。
2.次日取出96孔板，室温复温半小时后，PBS洗板4次，每次1分钟。
3. 1％BSA封闭96孔板，100μl/孔，37℃孵育30分钟。
4.PBS洗板4次，每次1分钟。
5.加样：血清稀释五倍后每孔加样100μl。37℃孵育60分钟。
6.PBS洗板4次，每次1分钟。
7.加HRP标记的二抗(抗人IgG抗体)：原液按1：2000稀释后每孔加入100μl，37℃孵育30分钟。
8.PBS洗板4次，每次1分钟。
9.显色：每孔先加入A液50μl，再加入B液50μl。室温静置15分钟。
10.终止：每孔加入终止液100μl。10分钟之内酶标仪比色。
酶标仪检测结果如图2(左侧)、3(左侧)所示。17例临床确诊阳性患者的OD450均值为1.282(0.800～2.471),而正常对照组的OD450均值为0.075(0.003～0.171)，两者差异存在统计学意义(t＝15.31，P<0.0001)。疑似标本的OD450均值为0.092(0.002～0.219)，与阳性患者差异显著(t＝14.64，P<0.0001)。疑似患者与正常人不存在统计学差异(t＝0.932,P＝0.36)， 如图4所示。
实施例3
检测IgM抗体的临床样本的验证
前期收集新型冠状病毒肺炎的临床确诊病例17例、疑似样本22例(最终核酸阴性排除) 和正常人样本23例，以ELISA方法验证纯化得到的N蛋白能否检测出血清中抗SARS-CoV-2IgM 抗体，操作步骤如下：
2.以N抗原包被96孔板，包被浓度0.2μg/孔，100μl/孔。4℃，过夜。包被时设置阴性对照孔。
3. 2.次日取出96孔板，室温复温半小时后，PBS洗板4次，每次1分钟。
4. 3.1％BSA封闭96孔板，100μl/孔，37℃孵育30分钟。
5. 4.PBS洗板4次，每次1分钟。
6. 5.加样：15μl血清加15μlPBS，再加入IgG吸附剂150μl。10000rpm离心10分钟后取 上清100μl检测。37℃孵育60分钟。
7. 6.PBS洗板4次，每次1分钟。
8. 7.加HRP标记的二抗(抗人IgM抗体)：原液按1：2000稀释后每孔加入100μl，37℃ 孵育30分钟。
9.PBS洗板4次，每次1分钟。
10.显色：每孔先加入A液50μl，再加入B液50μl。室温静置15分钟。
11.终止：每孔加入终止液100μl。10分钟之内酶标仪比色。
12.酶标仪检测结果如图2(右侧)、3(右侧)所示。17例临床确诊阳性患者的OD450均值为0.474(0.020～1.225),而正常对照组的OD450均值为0.076(0.014～0.188)，两者差异存在统计学意义(t＝3.705，P＝0.0009)。疑似标本的OD450均值为0.117(0.003～0.253)，与阳性患者差异显著(t＝2.850，P＝0.0084)。疑似患者与正常人不存在统计学差异(t＝1.520， P＝0.1406),如图5所示。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川省人民医院
<120> 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列(1)
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(2)
<400> 2
cgcggatcca tgtctgataa tggacccca 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(3)
<400> 3
ccggaattca tgtctgataa tggacccca 29
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(4)
<400> 4
ataagaatgc ggccgcttag gcctgagttg agtcagc 37
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(5)
<400> 5
ccgctcgagt taggcctgag ttgagtcagc 30

Claims (9)

1.一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒，其特征在于，包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将SARS-CoV-2核衣壳蛋白进行表达和纯化；
(2)制备SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金。
3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，SARS-CoV-2核衣壳蛋白的表达，包括如下步骤：
(11)以SARS-CoV-2核衣壳蛋白的氨基酸序列所对应的核苷酸序列为模板，设计核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5所示的反向引物；
(12)经过PCR扩增、双酶切PCR产物及载体，将SARS-CoV-2核衣壳蛋白对应的核苷酸序列克隆至质粒载体中；
(13)利用步骤(12)所得载体转化大肠杆菌，再进行诱导培养；
(14)对培养后的大肠杆菌进行离心，获取SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，步骤(12)中，所述质粒载体为pET28a、pET22b、pET21b、pET32a、pET40、pGex-6P-1和pMal-c2x中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(13)中，大肠杆菌采用E.coli BL21或者Rossetta菌株，诱导培养方法为：将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄青霉素或卡那霉素的平板中，于37℃孵育，然后挑取单菌落接种于液体培养基中培养2-5h，最后加入IPTG进行诱导，培养3-18h。
6.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(14)中，SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白的获取方法为：收集离心后的大肠杆菌菌体，加入缓冲液破碎菌体后离心获取上清液，经过层析进行纯化，获得SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白。
7.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，SARS-CoV-2核衣壳蛋白纯化后，利用抗N蛋白的抗体进行验证。
8.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，制备SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金的具体步骤如下：
(21)以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料配制胶体金溶液；
(22)将SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白溶液转入透析袋中，透析过夜；
(23)将透析处理之后的SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白加入等体积的胶体金溶液中，静置，然后加入BSA溶液，充分混匀后离心，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解，即制得SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗原胶体金。
9.根据权利要求8所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(22)中，透析方法为：将SARS-CoV-2核衣壳蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
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