CN115043922B

CN115043922B - 日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57及其应用

Info

Publication number: CN115043922B
Application number: CN202210331273.9A
Authority: CN
Inventors: 侯楠; 陈启军; 刘帅; 朴贤玉
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-03-30
Also published as: CN115043922A

Abstract

本发明提供日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57及其应用。本发明利用日本血吸虫全基因组表达谱芯片筛选到一系列在日本血吸虫童虫中高表达的基因，其中基因SjScP15、SjScP57、SjScP92编码的抗原蛋白，能够被血吸虫病病人血清特异性识别，且呈现较强的阳性反应。ELISA检测表明，这些抗原蛋白检测血吸虫具有高敏感性和特异性，可用于日本血吸虫病诊断试剂的开发。日本血吸虫抗原蛋白SjScP15，SjScP57，SjScP92免疫小鼠攻虫后免疫保护效果显示，SjScP15，SjScP57，SjScP92有望被开发成为血吸虫病疫苗。

Description

日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57及其应用。

背景技术

血吸虫(Schistosoma)，又称裂体吸虫，属于扁形动物门吸虫纲。血吸虫病是由血吸虫寄生于人体引起的地方性寄生虫病。寄生于人体的6种血吸虫中，埃及血吸虫、曼氏血吸虫和日本血吸虫分布最广、危害最严重。其中，日本血吸虫是我国血吸虫流行株。它们对人体健康危害大，有必要对其防治进行深入研究。

诊断是血吸虫病防治领域的中心环节。精确的诊断技术不仅对血吸虫病患者的早发现早治疗具有重要临床意义，还可为血吸虫病流行区等级提供判断标准、为评估流行态势和考核防控效果提供必不可少的信息和科学依据。缺乏高效精确的诊断技术是血吸虫病无法彻底消除的一个重要原因。血吸虫病患者如果不能及时得到确诊和治疗，其***物中所含的虫卵将引起血吸虫病的持续流行传播。因此，研发新的具有高灵敏性和特异性的血吸虫病诊断方法势在必行。目前，血吸虫病的诊断多依赖于寄生虫形态学检测方法，例如世界卫生组织(WHO)推荐的改良加藤法 (Kato-Katz)。这种方法主要通过检查病人粪便或尿液中的血吸虫虫卵来诊断疾病，不但费时费力，而且对轻度血吸虫感染诊断的敏感性较低，不适合用于大规模的血吸虫病现场监测。

相较传统的形态学诊断方法，酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断方法具有操作简便快捷和更高的灵敏性，且可用于大规模现场监测。目前，用于血吸虫病免疫诊断的最常用的抗原是提取血吸虫虫体的成虫抗原组分(Adult worm antigen,AWA)和虫卵抗原组分(Soluble egg antigen,SEA)，由于这两种粗提抗原的成分复杂(由上千种血吸虫蛋白组成)，且与其他寄生虫感染血清存在着较严重的交叉反应，血吸虫病诊断的特异性不高，生产的试剂不宜标准化。因此，有必要提供一种新的检测、诊断方式以解决现有技术的问题。

此外，同其他传染病一样血吸虫病的完全消除依赖于强而有效的疫苗，但目前还未有血吸虫病疫苗面世。血吸虫疫苗的研制需要开发具有保护性功能的抗原，而目前绝大部分的血吸虫蛋白质都是未知的。血吸虫寄生于宿主体外循环中，其表膜蛋白和分泌性蛋白，以及***物中的血吸虫蛋白，均能诱导宿主的体液免疫反应。但当虫体发育成熟后，虫体表膜较为坚韧且虫体体积较大，因而体液免疫反应产生的抗体无法有效清除成年虫体。血吸虫尾蚴钻入人体后经皮肤向肺脏移行，约14天后到达肝门静脉定居，这个时期的虫体称为血吸虫童虫。0-14天的童虫虫体较为娇嫩，是体液免疫攻击的最佳阶段，但由于其释放的抗原诱发体液免疫反应需要10-14天，因而宿主体液免疫无法赶在早期阶段清除童虫。因此，开发血吸虫童虫抗原，针对这些抗原研制血吸虫疫苗，有望帮助宿主在童虫期消灭虫体，是血吸虫疫苗研发的关键所在。

发明内容

本发明的目的是提供日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57及其应用。

本发明构思如下：利用日本血吸虫全基因组表达谱芯片筛选到一系列在日本血吸虫童虫中高表达的基因，童虫是较早接触宿主外周循环的虫体，能够较早地引发宿主体液免疫反应，产生相应的抗体；且发现童虫的抗原是血吸虫疫苗研发的最佳靶标。将其中3个日本血吸虫抗原蛋白基因SjScP15、SjScP57、SjScP92，通过PCR扩增基因亲水区段，并将其在大肠杆菌中重组表达，所得重组蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有高敏感性和/或特异性(ELISA试验表明)，是潜在的诊断抗原候选靶标。将重组蛋白用于日本血吸虫感染小鼠模型试验，发现这三个重组蛋白具有较好的免疫保护性，是潜在的血吸虫病疫苗候选抗原。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供在日本血吸虫童虫中高表达的基因SjScP15、SjScP57或SjScP92；

基因SjScP15为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

基因SjScP15编码的抗原蛋白(SjScP15)包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

基因SjScP57为：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

基因SjScP57编码的抗原蛋白(rSjScP57)包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

基因SjScP92为：

i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

基因SjScP92编码的抗原蛋白(rSjScP92)包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

基因SjScP15、SjScP57、SjScP92编码的抗原蛋白的截短形式或经过修饰的蛋白衍生物或融合蛋白，且具有与SEQ ID NO:4、5、6所示的抗原蛋白相同或近似抗原性的蛋白变体均属于本发明保护范畴。

第二方面，本发明提供所述抗原蛋白的以下任一应用：

1)用于制备日本血吸虫病检测试剂或试剂盒；

2)用于制备日本血吸虫病疫苗；

3)用于制备日本血吸虫病药物；

4)用于日本血吸虫感染的检测；

5)用于诊断日本血吸虫病；

6)用于预防和治疗日本血吸虫病。

具体地，本发明的日本血吸虫抗原蛋白rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92作为特异性血吸虫抗原，在血清学诊断方面的应用；作为免疫原，在制备抗血吸虫疫苗方面的应用；作为潜在的药物作用靶点，在筛选化学和其他种类药物方面的应用；作为日本血吸虫rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92蛋白的编码基因，在基因治疗方面的应用。

第三方面，本发明提供一种日本血吸虫检测试剂，所述检测试剂中含有以下①～③中的至少一种：

①日本血吸虫抗原蛋白rSjScP15，或编码所述抗原蛋白的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；

②日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57，或编码所述抗原蛋白的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；

③日本血吸虫抗原蛋白rSjScP92，或编码所述抗原蛋白的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。

第四方面，本发明提供含有所述日本血吸虫检测试剂的试剂盒。

第五方面，本发明提供日本血吸虫病ELISA免疫诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

1)包被有1-5μg/mL抗原蛋白的微孔反应板；用含0.05％v/v TWEEN20的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(购自Sigma，货号C3041)作为包被缓冲液；

2)洗涤缓冲液：PBST液，即含0.05％v/v TWEEN20的PBS溶液，pH7.4；

3)样本稀释液：5-10％BSA溶液，以PBS缓冲液为溶剂配制；

4)酶标抗体：碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体；

5)底物显色液：pNPP显色液；

pNPP购自Sigma，货号N2640。pNPP显色液的配制方法如下：将15mg pNPP溶于 15mL0.1M的甘氨酸缓冲液中(0.1M甘氨酸，1mM MgCl₂，1mM ZnCl₂，溶于纯净水中，pH10.4)，即得。

6)反应终止液：120g/L NaOH水溶液；

7)阳性对照：以1μg/mL人免疫球蛋白IgG包板。

同时，设置阴性对照：以相应的抗原蛋白包板，酶标抗体替换为样本稀释液。

第六方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含所述的抗原蛋白。

第七方面，本发明提供一种血吸虫疫苗，其包含所述的免疫原性组合物。任选地，疫苗中包含佐剂。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的抗原蛋白检测灵敏度高，对轻度感染的血吸虫病人(EPG ＜100)依然能够检出，敏感度达96％。

(二)本发明提供的检测试剂盒具有高特异性，日本血吸虫病诊断特异性高达100％。

(三)该试剂盒可用于血吸虫感染的早期诊断，在实验动物感染3周后便可检测到血清中抗rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92蛋白抗体的存在。操作简便，结果稳定，重复性高。

(四)日本血吸虫抗原蛋白rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92免疫小鼠，攻虫后能够显著降低染虫率、虫卵负荷率，免疫保护效果显示，rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92 有望被开发成为血吸虫疫苗。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中日本血吸虫SjScP15、SjScP57、SjScP92基因序列的PCR扩增结果示意图。其中，M：DNA分子量标准；1,2,3分别为SjScP15(832bp)、 SjScP57(865bp)、SjScP92(728bp)基因的PCR扩增产物。

图2为本发明较佳实施例中rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92重组蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图。其中，M：蛋白分子量标准(kDa)，1：rSjScP15，2：rSjScP57，3： rSjScP92。

图3～图5分别为本发明较佳实施例中rSjScP15(图3)，rSjScP57(图4)，rSjScP92(图5)，重组蛋白抗原与血吸虫病人血清及不同血吸虫感染动物血清的Western blot 分析结果示意图。其中，M：蛋白分子量标准(kDa)，1：日本血吸虫病人血清，2：感染日本血吸虫42天的小鼠血清，3：感染日本血吸虫42天的兔血清，4：小鼠抗His 标签抗体阳性对照，5：正常小鼠血清阴性对照。

图6为本发明较佳实施例中rSjSP-13-ELISA试剂盒与rSjScP15-ELISA，rSjScP57-ELISA和rSjScP92-ELISA试剂盒用于日本血吸虫病诊断评价比较的结果示意图。其中，A为rSjScP57-ELISA试剂盒结果，B为rSjSP-13-ELISA试剂盒结果，C为 SjScP15-ELISA试剂盒结果，D为SjScP92-ELISA试剂盒的结果。Sj为日本血吸虫病人组，Sj-3M为日本血吸虫病人化疗三个月组，Cs为华支睾吸虫病人组，Healthy为健康对照组。图中横直线为Healthy组均值2.1倍的cutoff值，该线上视为阳性，线下视为阴性。

图7为本发明较佳实施例中日本血吸虫rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92和rSjSP-13重组蛋白免疫小鼠攻虫后免疫效果结果示意图。其中，A为日本血吸虫感染42天后小鼠体内虫体的数量比较图，B为日本血吸虫感染42天后小鼠肝脏虫卵数量比较图。C 为血吸虫感染宿主后依赖摄入宿主外周血供给自身营养，造成宿主营养匮乏和体重下降。图中，PBS组为PBS免疫小鼠对照组，BLANK组为未免疫也未感染日本血吸虫的空白对照组。*代表P＜0.01，**代表P＜0.05，***代表P＜0.0001。

具体实施方式

本发明的总体技术流程如下：

首先用qPCR的方法对芯片筛查的结果进行验证，确认SjScP15、SjScP57、SjScP92基因在童虫中的表达的确显著高于其他时期虫体的表达水平。然后利用SignalP-4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)将相应核酸序列中对应信号肽和疏水区的序列去除。利用NCBI Primer designing tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物设计及引物特异性分析。继而利用Invitrogen-GatewayTechnology with clonaseⅡ试剂盒进行克隆构建。

具体步骤如下，按照说明书要求将引物一端增加attB位点，然后对日本血吸虫SjScP15、SjScP57、SjScP92基因进行PCR扩增，将扩增产物纯化后利用试剂盒中提供的BPClonaseⅡ酶克隆至pDONR221载体上，通过转化筛选，质粒测序鉴定确认后，再利用试剂盒中提供的LR ClonaseⅡ酶将基因序列转移至表达载体pDEST17中，通过转化筛选，质粒测序鉴定确认后，转化至大肠肝菌宿主细胞中进行重组蛋白诱导表达；包涵体蛋白经变性和镍柱亲和层析纯化，最终得到纯化的重组蛋白rSjScP15、rSjScP57、 rSjScP92，完成了SjScP15、SjScP57、SjScP92基因的体外克隆表达及纯化。随后，利用Western blot技术验证了纯化的rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92重组蛋白可被感染日本血吸虫的实验动物血清及血吸虫病人血清识别。进而，以纯化的rSjScP15、rSjScP57、 rSjScP92重组蛋白为诊断抗原进行血吸虫病诊断试剂和试剂盒的制备，通过ELISA技术分析评价了其在血吸虫病免疫诊断中的应用价值并分析了抗rSjScP15、rSjScP57、 rSjScP92抗体在感染动物血清中的变化规律。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1日本血吸虫SjScP15、SjScP57、SjScP92基因的克隆

根据发明人对日本血吸虫基因组进行预测发现的SjScP15、SjScP57和SjScP92基因序列，分别设计引物并引入酶切位点。由于SjScP57编码基因3′端190-400个碱基高度保守，其编码蛋白的氨基酸序列与人和其他哺乳动物酪氨酸羟化酶高度同源，其编码的蛋白质免疫表位诱导的抗体极易造成非特异性反应，一方面可能引起抗体非特异性反应，从而影响诊断的特异性；另一方面用该蛋白区段免疫宿主，其诱导的抗体可能非特异性影响宿主酪氨酸蛋白酶活性，不利于疫苗的研发。因此本发明中选择SjScP57编码基因非保守区段(607-957个碱基)制备重组蛋白用于诊断和疫苗研究。SjScP15和SjScP92基因编码蛋白在常见哺乳动物宿主中未发现同源蛋白，故以全长基因序列为模板设计引物。引物序列如下：

SjScP15：

PF：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGGAAGGTTTCTTACAGCGGA-3’

PR：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATGCCGTTATATCACATCCACCA-3’

SjScP57：

PF：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTCACGCTACTAGAGCATGCAA-3’

PR：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAGGAAGCTCCTAAAGATGC-3’

SjScP92：

PF：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCACACATTTGGAATGCTAGA-3’

PR：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAGGTATGAATTCGATAATGAGCC-3’

PF中下划线部分是根据Invitrogen Gateway Technology with ClonaseⅡ试剂盒说明书设计的attB1位点，用于连接于穿梭载体pDONR221上；PR中下划线部分是根据Invitrogen Gateway Technology with ClonaseⅡ试剂盒说明书设计的attB2位点，用于连接于穿梭载体pDONR221上；特异性引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

以日本血吸虫(Schistosoma japonicum)14天童虫cDNA为模板，进行PCR反应，扩增基因ORF片段，反应体系如下：高保真DNA聚合酶Mix 12.5μl，cDNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH₂O 10.5μl，总体积25μl。PCR扩增程序：95℃ 5min，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸 10min。

用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察是否存在目的条带，结果如图1所示，M：DNA分子量标准，1：SjScP15，2：SjScP57，3：SjScP92。琼脂糖凝胶电泳结果显示，SjScP15、SjScP57、SjScP92分别在1896bp,354bp,636bp处有一条清晰的条带，与预期目的片段的大小相符，表明成功从cDNA中扩增出rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92 基因的ORF片段。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)纯化回收PCR产物。

Invitrogen Gateway Technology with ClonaseⅡ试剂盒构建穿梭载体，反应体系如下：PCR回收DNA产物(溶于ddH₂O)150ng，pDONR221载体(溶于ddH₂O)150ng， BPclonaseⅡ酶2μl，加ddH₂O至总体积10μl。混匀后25℃孵育1h。将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，将转化后的感受态细胞涂至LB培养基平板(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的克隆进一步用Invitrogen Gateway Technology with ClonaseⅡ试剂盒构建表达载体。反应体系如下：PCR鉴定阳性的穿梭载体(溶于 ddH₂O)150ng，pDEST17载体(溶于ddH₂O)150ng，加TE Buffer(pH8.0)至总体积8μl，然后加入LRclonaseⅡ酶2μl。混匀后25℃孵育1h。再加入Protein K(2μg/μl)1μl， 37℃孵育10min去除蛋白质。将上述连接产物转化至大肠杆菌B21DE3感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，将转化后的感受态细胞涂至LB培养基平板(含50μg/ml 氨苄青霉素)，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的克隆送苏州金唯智生物科技有限公司进行DNA测序确认序列是否正确。测序分析结果表明***的外源基因片段序列正确，重组质粒pDEST17-rSjScP15、pDEST17-rSjScP57、 pDEST17-rSjScP92构建成功。基因SjScP15、SjScP57、SjScP92的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO:1-3所示，它们编码的抗原蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。

实施例2日本血吸虫rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92重组蛋白的表达和纯化

将上述PCR鉴定为阳性的克隆接种到LB液体培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)15mL，37℃，200rpm培养过夜，第二天取10mL培养基转接入LB培养基(含50μg/ml 氨苄青霉素)1L，继续培养至OD_600nm值为0.8，再加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，18℃140rpm表达16小时，离心收集菌体，-80℃冻存备用。

分别取少量诱导前和诱导后的菌体重悬于PBS缓冲液中，加入SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后于沸水浴中煮5min使蛋白变性。

每个上样孔中分别加入诱导前和诱导后的样品各10μl，进行SDS-PAGE分析(浓缩胶为5％，分离胶为12％)。

将pDEST17-rSjScP15，pDEST17-rSjScP57，pDEST17-rSjScP92重组质粒分别转化表达感受态细胞，经IPTG诱导表达后较诱导前的菌体出现了明显表达条带。

将诱导后的菌体重悬于40mL细菌裂解液中，超声破碎，4℃，12,000rpm离心30min，分别收集包涵体沉淀和上清液。

将包涵体沉淀和上清液进行SDS-PAGE分析，鉴定重组蛋白的溶解性。结果显示，重组蛋白主要存在于包涵体沉淀中。

将包涵体重悬于含1％Triton-X100的PBS溶液超声洗涤5min，12,000rpm离心15min收集包涵体沉淀；

将包涵体重悬于8M尿素，4℃旋转混匀过夜，充分溶解包涵体，12,000rpm离心30min收集上清液；

将上清液过镍离子螯合胶柱(QIAGEN公司)使带有6个组氨酸标签的rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92重组蛋白结合在胶柱上，用50mM咪唑冲洗杂蛋白，再用250mM 咪唑洗脱重组蛋白，收集洗脱液；

纯化所得重组蛋白经SDS-PAGE分析检测蛋白纯度。电泳结果如图2所示，rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92蛋白分子量分别约为15kDa，14kDa，35kDa，其分子量大小与目的重组蛋白的理论相对分子量相符，表明经镍离子螯合胶柱纯化后获得了纯度较高的重组蛋白。

使用BCA蛋白质定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)测定重组蛋白的浓度，按照说明书进行操作。经测定纯化所得的重组蛋白质浓度为1.0mg/mL。

实施例3日本血吸虫rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92重组蛋白的抗原性检测

SDS-PAGE电泳：取重组蛋白100ng上样，电泳条件为：100V 20min，120V 1h。

转膜：采用湿转法将PAGE胶中的蛋白转移至PVDF膜，电转条件为：冰浴，100V 1h。

封闭：将PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭2h，TBST缓冲液洗涤3次。

加一抗孵育：分别加入感染日本血吸虫42天BALB/c小鼠血清、感染日本血吸虫 42天新西兰大白兔血清及日本血吸虫病人血清，以小鼠抗His-tag抗体(艾比玛特生物医药有限公司)为阳性对照、以健康小鼠血清为阴性对照(用封闭液1:500稀释)， 4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次。

加二抗孵育：分别加入荧光标记的抗小鼠IgG抗体、抗兔IgG抗体以及抗人IgG抗体(用封闭液1:10,000稀释)，37℃避光孵育1h，TBST缓冲液洗涤3次。

扫膜：使用Odyssey红外激光成像***扫描成像。

结果如图3～图5所示，图3为rSjScP15的结果，图4为rSjScP57的结果，图5为rSjScP92的结果，其中，M：蛋白分子量标准(kDa)，1：日本血吸虫病人血清，2：感染日本血吸虫42天的小鼠血清，3：感染日本血吸虫42天的兔血清，4：小鼠抗His 标签抗体阳性对照，5：正常小鼠血清阴性对照。以小鼠抗His-tag抗体为阳性对照， rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92，分别在15kDa，14kDa，35kDa处有一明显的识别条带，以健康小鼠血清为阴性对照，没有明显条带。其中rSjScP15、rSjScP57蛋白可被感染日本血吸虫的BALB/c小鼠血清、新西兰大白兔血清及日本血吸虫病人血清识别， rSjScP92可被人血清识别，在鼠血清也有识别条带。表明重组蛋白rSjScP15、rSjScP57、 rSjScP92具有很好的抗原性。

实施例4制备日本血吸虫病rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92免疫诊断试剂盒

1、试剂盒的主要组分包括：

包被抗原的固相载体：用含0-0.05％v/v TWEEN20的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(购自Sigma，货号C3041)作为包被缓冲液，稀释目的蛋白至1μg/mL，包被于聚苯乙烯反应孔中，100μL/孔。

洗涤缓冲液：PBST液，即含0.05％v/v TWEEN20的PBS溶液，pH7.4。

样本稀释液：10％BSA溶液，以PBS缓冲液为溶剂配制。

酶标抗体：碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体(α,γandμ-chainspecific)抗体(Sigma公司)。

底物显色液：pNPP显色液。

反应终止液：120g/L NaOH水溶液。

阳性对照：以人免疫球蛋白IgG(1μg/mL)包板。

阴性对照：以相应的抗原蛋白包板，酶标抗体替换为样本稀释液。

2、试剂盒的操作程序及检测方法：

封闭：甩干孔内液体，加稀释液200μL/孔，37℃，封闭2h，用PBST洗涤三次， 200μL/孔，2min/次，最后一次拍干。

加待测样品：待检样品血清和稀释液按1:100比例稀释，同时设阳性、阴性和空白对照(仅加样本稀释液)，按100μL/孔加各样品，每个样本平行检测3个复孔，37℃，孵育1h。

洗涤：甩干孔内液体，用PBST缓冲液洗涤四次，200μL/孔，2min/次，最后一次拍干。

加酶标抗体：加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白(α,γandμ-chainspecific) 抗体，100μL/孔，37℃，孵育1h，如上洗涤，拍干。

显色：加入酶底物显色液，100μL/孔，37℃避光孵育30min，加入终止液，25μL/ 孔。

数据读取及处理：用酶标仪读取OD_405nm数值，以阴性对照样品的OD均值的2.1 倍作为判断阴阳性的临界值(cut-off)。

实施例5 rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92-ELISA试剂盒对日本血吸虫病免疫诊断评价

1、试剂盒敏感性

利用改良加藤法(Kato-Katz)收集湖南省粪检虫卵阳性日本血吸虫病人血清35份，评价各试剂盒的敏感性，并与rSjSP-13-ELISA试剂盒(rSjSP-13-ELISA试剂盒的制备方法同实施例4，rSjSP-13抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)进行比较， ELISA实验操作同实施例3。

结果如表1和图6所示，Sj为日本血吸虫病人组，Healthy为健康对照组(来自黑龙江省正常人血清样本35份)。图中贯彻整个坐标系的横直线为Healthy组均值2.1倍的cutoff值，该线上视为阳性，线下视为阴性。20份日本血吸虫病人血清中，18份被 rSjSP-13-ELISA试剂盒诊断为阳性(图6A)，rSjSP-13-ELISA试剂盒诊断日本血吸虫病的敏感度为90.0％(95％置信区间，66.9％-98.3％)，本结果接近文献报道的 rSjSP-13-ELISA试剂盒敏感度90.4％(95％置信区间，75.0％-95.0％)；20份被 rSjScP15-ELISA和rSjScP57-ELISA试剂盒诊断为阳性(图6B和图6C，95％置信区间， 80.0％-100％)。19份被rSjScP92-ELISA试剂盒诊断为阳性(图6D，95％置信区间， 73.1％-99.7％)。rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92-ELISA试剂盒的敏感性均显著高于 rSjSP-13-ELISA试剂盒。结果表明，rSjScP57-ELISA试剂盒的敏感性同 rSjSP-13-ELISA试剂盒相同。

表1 rSjSP-13-ELISA与rSjScP15、rSjScP57、rSjScP92-ELISA试剂盒敏感性的比较分析

*敏感性显著高于rSP13-ELISA试剂盒，p<0.05。

2、试剂盒特异性

以收集的上述Healthy组黑龙江省正常人血清样本20份，广东省华支睾吸虫病病人血清18份，评价各试剂盒在正常人群中的假阳性率，以及与其它寄生虫病人血清的交叉反应情况，并与rSjSP-13-ELISA试剂盒进行比较，ELISA实验操作同实施例3。

结果如表2和图6所示，Cs为华支睾吸虫病人组。20份正常人血清均被 rSjSP-13-ELISA、rSjScP57-ELISA、rSjScP15-ELISA和rSjScP92-ELISA试剂盒诊断为阴性，四种试剂盒的特异度均为100％(95％置信区间，80.0％-100％)。15份华支睾吸虫病人血清均被四种试剂盒诊断为阴性，无交叉反应。

表2 rSjSP-13-ELISA与SjScP15、SjScP57、SjScP92-ELISA试剂盒特异性的比较分析

3、试剂盒在评估日本血吸虫病进展状况方面的价值

上述20例日本血吸虫病人，以常规治疗方式于化疗3个月后再次采集血清，评价本试剂盒在评估日本血吸虫病进展状况方面的价值，并与rSjSP-13-ELISA试剂盒进行比较，ELISA实验操作同实施例3。结果如图6所示，Sj-3M为日本血吸虫病人化疗三个月组。SjScP15-ELISA和rSjSP-13-ELISA试剂盒化疗后病人OD值较现症感染阶段显著下降，SjScP15-ELISA和SjScP92-ELISA试剂盒化疗后病人OD值较现症感染阶段无显著变化。

实施例6日本血吸虫rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92重组蛋白作为抗原免疫小鼠的保护性作用评价

1、抗原免疫小鼠模型的制备

a)免疫

免疫用Balb/c小鼠；免疫之前眼眶取阴性血清。

取60ug免疫原(初免60ug加强30ug)，用生理盐水稀释到200ul，再加入等体积弗氏佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂)；用混匀仪器将溶液和佐剂混匀，形成油包水。

将混匀好的免疫原进行背部、腹部皮下注射免疫，打8-10个点。

b)眼眶取阴性血

单手将小鼠抓牢并使其眼球暴出；另一只手拿一根毛细管***小鼠眼后角，倾斜45°从小鼠眼后角慢慢旋进去。缓慢调节手的力度和姿势使血流入毛细管中，差不多装满后，毛细管立刻放到1.5ml离心管里，取阴性血20ul。

全血在室温静置30min-120min后，5000rpm离心10min，收取血清。

c)ELISA测定效价

试剂配制：

包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6。

PBS缓冲液，pH7.4。

封闭液：2％BSA或含脱脂奶粉的PBS。

洗液：PBST(即含0.05％v/v TWEEN20的PBS溶液)。

显色液：1％A液+10％B液(A液：含1％TMB的DMSO；B液：含0.1％H₂O₂的柠檬酸缓冲液)。

终止液：2M硫酸。

二抗：山羊抗鼠IgG/HRP。

实验步骤：

1)用包被液稀释抗原，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤2 次。

2)封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤1次。

3)多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释(于PBS中稀释)，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释(于PBS中)；均为100ul/孔，37℃孵箱， 1h；后用洗液洗涤3次。

4)加入PBS稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3 次。

5)显色，显色液100ul/孔，显色时间为5-15min。

6)每孔加入50ul终止液终止。

7)双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据，并做图分析。

效价为1/2最大OD值所对应的稀释倍数。

2、免疫保护作用评价

a)攻虫

将阳性钉螺室温饲养一周，之后收集于锥形瓶中，暖光照射2-4小时释放其体内尾蚴。

拔除小鼠腹部毛发，暴露腹部皮肤。

显微镜下用取菌环沾取40只尾蚴/小鼠于盖玻片上。

将此盖玻片贴于小鼠腹壁皮肤5min以促进尾蚴钻入皮肤。

感染小鼠于BSL2实验室常规饲养42天。

b)评价抗原免疫保护作用

饲养42天后称量每只小鼠体重(每组实验5只，共重复3次)。

麻醉小鼠后剪破肝门静脉，心脏穿刺灌注PBS，将虫体冲出体外，计数虫体。

摘取肝脏，剪碎后200目铜网研磨，每1g肝组织加入20ml5％KOH溶液混匀后37℃孵育过夜消化组织，镜检计数肝组织虫卵数量。

以rSjSP-13重组蛋白免疫组和BALNK无蛋白空对照免疫组作为对比。结果显示如表3-表4及图7A所示。

具体地，如表3和图7A所示，rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92免疫组小鼠减虫率较PBS免疫对照组显著升高，分别达到38.1％、34.8％和33.4％，减虫率计算公式为：(1- 成熟虫体总数量/空白对照组成熟虫体总数)×100％。本实施例中感染尾蚴数量为40 只尾蚴/只小鼠，由于尾蚴活性和性别比例以及宿主免疫***影响，感染后每只小鼠体内成活虫体一般小于40，因此成熟虫体总数量以PBS对照组为标准。而rSjSP-13重组蛋白免疫组减虫率仅分别为3.8％。由此可知，本发明rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92 重组蛋白免疫后减虫效果优于rSjSP-13组。

血吸虫病最大的危害为虫体成熟后产卵，虫卵在肝脏沉积导致肝脏纤维化从而引发一系列病理变化。如表4和图7B所示，rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92免疫小鼠肝脏虫卵数较PBS免疫对照组显著下降，减卵率分别达到46.0％、48.9％和62.3％，减卵率计算公式为：(1-虫卵总数/PBS组虫卵总数)×100％。而rSjSP-13重组蛋白免疫组减卵率仅为4.9％。由此可知，本发明rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92重组蛋白免疫后减虫卵效果优于rSjSP-13组。

血吸虫感染宿主后依赖摄入宿主外周血供给自身营养，造成宿主营养匮乏和体重下降。如图7C所示，rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92免疫小鼠体重较PBS免疫对照组显著升高。BLANK组为未免疫也未感染血吸虫的正常空白对照小鼠。rSjSP-13重组蛋白免疫组小鼠体重同PBS免疫对照组相比无显著的统计学差异。由此可知，本发明rSjScP15，rSjScP57，rSjScP92蛋白免疫后提升体重效果优于rSjSP-13组。

小鼠中成熟虫体数量如表3～表4所示，表3数据为三次独立性实验所获得的实验数据的汇总，每次实验5只小鼠，3次试验共15只小鼠。

表3日本血吸虫感染小鼠体内成虫数量(只)统计表

表4日本血吸虫感染小鼠肝脏虫卵数量(个)统计表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57及其应用

<130> KHP221112774.7

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1896

<212> DNA

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 1

atgagtaaca acggaatata tgatgatttc aatgattgcc ttaagatagg aatcctacat 60

attccatctg gaaggtttct tacagcggaa gtattcaaca atgaaattaa tatctcggga 120

acagcattac gtcgacgtca agtgtggaca ttgattactg atcgaaagca tccggatact 180

ttgtttttac aaaattcttt gggtcgattt ttatcagtta ataaagatgg aaaaattagt 240

gcatctttga aatcagattc tgaagaacgt tttcgtttag aatttgcgcc agatggtaca 300

ggtgaatggg cttttaaatc tgatacctac ggtttttatc tcagtggttc agacactcaa 360

gtttcgtgtt tttccaaatc tcctgtttgg tggtcaattc gcttagctac tcaccctcaa 420

gttcatattc gtcaccagtt ccgttcacgt tacttacgtc ttcttaatga tggtcttgaa 480

cttcgagccg atcagtcata tccatggggc ccagaatctg ttatttggat cgaacaacct 540

ggaatggttg tgagtcaaag ttttggtcga agtccaaata ctccacttgt tggcaaagct 600

gctgtttcac gtcttggtcg tgttgctttc agaatgccaa acggaaaata tttaaaacct 660

actggagaaa tgtgtgatga aatggatgac tcaacattat tttcttttga atatcgtcct 720

ggtaatcctg gtatattcgc ttttcgtgat caaaaaggtt actatttaac aacaatagga 780

cctggaacaa ctaaagttaa aacaaataca aatattggca aagaagaact atttctcatt 840

gaacatgctg ccttgcaaat tggtatattg gcgcataatg gcaaatttgc atctgttaaa 900

caaggtattg aaatctctgc aaaccagcat gaattagacg aaacagctat cttccaatta 960

gaatatatcg gtgggacggg tttcaatgca ctggaggctg tagcatcttc cactccaaca 1020

tcagtccaac tgtctggtca agatactggt gctgactcat ctacttccaa tttgtgtttg 1080

ataaatagta accattcgat tactaacggc gtccattcaa cagatatcta ctttctaact 1140

acgggatttt ggcgtctacg ttcacgtagt ggaaagttat ggaaacttac tccgtcatct 1200

ggcgtaaaga atactgcttc tgatggagat caagaaagtc tattcgaaat gttaactgtg 1260

aataagatca gtgataaacg aattcgtcaa atcgtattcc gttcaaatag tggtccatcc 1320

tctagtggac agtctttaac agctcgtaaa cttggcgccg tatcaactag tggtcgtcta 1380

attgatgaga gtcaatcacc atcttctgat gagcttttca atattgtttt aactaacaga 1440

acatctattg tctttctttc ttcattgact ggtggcttct tagttcgtgg gaaacagaat 1500

gtacttgatt caaatggtgt agcttatgaa ccattttata ttcatgtaac taaacgacaa 1560

acttataaat tttttgcacg caatcaaaat tcatcctatt ctctatgggc agctggtatg 1620

gatggctccc tacaattgga acctactcac ctaacacctc ttgatgatgg tgacataatc 1680

aatgaaggtg atgataatat caacgatttg aaatatgaat ttcaacttca ttttcttggt 1740

catggtcgtg ttctaattca atcgttaaat agtcaacgtg attcaatctc cttagtcaaa 1800

tctgaaatta aaggcgatgt gaagttggat gtaccaggag gaggaggtag tagtggtgga 1860

tgtgatataa cggcaaatta tatttgggaa atttaa 1896

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 2

atgaaggaca ttcacgctac tagagcatgc aaagaataca ttgatggatt tcagctatta 60

gaaaaatatt gcaactatac ttctgaaagc ataccacaac ttcaatcagt ctctgaattt 120

atgcatcgta catcaggatt tcgtattcga cctgttgctg gtttagttac accaagagat 180

tttttagcga gtctagcatt tagagtattc caaagtactc aatatatacg tcatcattca 240

cgtcctatgc atacaccaga accagattgc atccatgaac tcattggtca tgtgccgatg 300

ttagtaaaca gagaattcgc tgatttttct caagaactgg gtttagcatc tttaggagct 360

tccgaagaa 369

<210> 3

<211> 654

<212> DNA

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 3

atgtcacaca tttggaatgc tagatttcca tattctaata atttaggaat ctgttcaaat 60

caaacgataa cgaattcaca tgattgtatc aagactgaac catgttttcc tgaagaaatg 120

gaaaggattc ctatgaaaga aatcaataat atagagtcac acatccgaac tgattattct 180

gtacaaagtt atgagtacaa tgtcccttca acaaacatca cttcatattc agataatgct 240

ttacactatc ccgtgaaaag tggttattcc acttgtcagt tgtcaggttg cacatgttgt 300

tatcagagta gcatgacacc aaactattct tacattccac ctaatactta tttttttgga 360

cacagctatt catctgaata tttaattggc aatatccaac atccttccaa ctatcgtcaa 420

acatatgacc atgattcacc gtatttactg accacaaatc aaagatactc cccagatgaa 480

gctgagatga cagacattga gaataaaaag ggaaaccaga caataaaaga tgaaccattg 540

aataaaaagt atagatgtac ttttccaggc tgtgaaaaaa gatatctgaa gtcaagtcat 600

ttaaaggctc attatcgaat tcataccgat tacaatgaag aaatatcttt ctaa 654

<210> 4

<211> 631

<212> PRT

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 4

Met Ser Asn Asn Gly Ile Tyr Asp Asp Phe Asn Asp Cys Leu Lys Ile

1 5 10 15

Gly Ile Leu His Ile Pro Ser Gly Arg Phe Leu Thr Ala Glu Val Phe

20 25 30

Asn Asn Glu Ile Asn Ile Ser Gly Thr Ala Leu Arg Arg Arg Gln Val

35 40 45

Trp Thr Leu Ile Thr Asp Arg Lys His Pro Asp Thr Leu Phe Leu Gln

50 55 60

Asn Ser Leu Gly Arg Phe Leu Ser Val Asn Lys Asp Gly Lys Ile Ser

65 70 75 80

Ala Ser Leu Lys Ser Asp Ser Glu Glu Arg Phe Arg Leu Glu Phe Ala

85 90 95

Pro Asp Gly Thr Gly Glu Trp Ala Phe Lys Ser Asp Thr Tyr Gly Phe

100 105 110

Tyr Leu Ser Gly Ser Asp Thr Gln Val Ser Cys Phe Ser Lys Ser Pro

115 120 125

Val Trp Trp Ser Ile Arg Leu Ala Thr His Pro Gln Val His Ile Arg

130 135 140

His Gln Phe Arg Ser Arg Tyr Leu Arg Leu Leu Asn Asp Gly Leu Glu

145 150 155 160

Leu Arg Ala Asp Gln Ser Tyr Pro Trp Gly Pro Glu Ser Val Ile Trp

165 170 175

Ile Glu Gln Pro Gly Met Val Val Ser Gln Ser Phe Gly Arg Ser Pro

180 185 190

Asn Thr Pro Leu Val Gly Lys Ala Ala Val Ser Arg Leu Gly Arg Val

195 200 205

Ala Phe Arg Met Pro Asn Gly Lys Tyr Leu Lys Pro Thr Gly Glu Met

210 215 220

Cys Asp Glu Met Asp Asp Ser Thr Leu Phe Ser Phe Glu Tyr Arg Pro

225 230 235 240

Gly Asn Pro Gly Ile Phe Ala Phe Arg Asp Gln Lys Gly Tyr Tyr Leu

245 250 255

Thr Thr Ile Gly Pro Gly Thr Thr Lys Val Lys Thr Asn Thr Asn Ile

260 265 270

Gly Lys Glu Glu Leu Phe Leu Ile Glu His Ala Ala Leu Gln Ile Gly

275 280 285

Ile Leu Ala His Asn Gly Lys Phe Ala Ser Val Lys Gln Gly Ile Glu

290 295 300

Ile Ser Ala Asn Gln His Glu Leu Asp Glu Thr Ala Ile Phe Gln Leu

305 310 315 320

Glu Tyr Ile Gly Gly Thr Gly Phe Asn Ala Leu Glu Ala Val Ala Ser

325 330 335

Ser Thr Pro Thr Ser Val Gln Leu Ser Gly Gln Asp Thr Gly Ala Asp

340 345 350

Ser Ser Thr Ser Asn Leu Cys Leu Ile Asn Ser Asn His Ser Ile Thr

355 360 365

Asn Gly Val His Ser Thr Asp Ile Tyr Phe Leu Thr Thr Gly Phe Trp

370 375 380

Arg Leu Arg Ser Arg Ser Gly Lys Leu Trp Lys Leu Thr Pro Ser Ser

385 390 395 400

Gly Val Lys Asn Thr Ala Ser Asp Gly Asp Gln Glu Ser Leu Phe Glu

405 410 415

Met Leu Thr Val Asn Lys Ile Ser Asp Lys Arg Ile Arg Gln Ile Val

420 425 430

Phe Arg Ser Asn Ser Gly Pro Ser Ser Ser Gly Gln Ser Leu Thr Ala

435 440 445

Arg Lys Leu Gly Ala Val Ser Thr Ser Gly Arg Leu Ile Asp Glu Ser

450 455 460

Gln Ser Pro Ser Ser Asp Glu Leu Phe Asn Ile Val Leu Thr Asn Arg

465 470 475 480

Thr Ser Ile Val Phe Leu Ser Ser Leu Thr Gly Gly Phe Leu Val Arg

485 490 495

Gly Lys Gln Asn Val Leu Asp Ser Asn Gly Val Ala Tyr Glu Pro Phe

500 505 510

Tyr Ile His Val Thr Lys Arg Gln Thr Tyr Lys Phe Phe Ala Arg Asn

515 520 525

Gln Asn Ser Ser Tyr Ser Leu Trp Ala Ala Gly Met Asp Gly Ser Leu

530 535 540

Gln Leu Glu Pro Thr His Leu Thr Pro Leu Asp Asp Gly Asp Ile Ile

545 550 555 560

Asn Glu Gly Asp Asp Asn Ile Asn Asp Leu Lys Tyr Glu Phe Gln Leu

565 570 575

His Phe Leu Gly His Gly Arg Val Leu Ile Gln Ser Leu Asn Ser Gln

580 585 590

Arg Asp Ser Ile Ser Leu Val Lys Ser Glu Ile Lys Gly Asp Val Lys

595 600 605

Leu Asp Val Pro Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Cys Asp Ile Thr

610 615 620

Ala Asn Tyr Ile Trp Glu Ile

625 630

<210> 5

<211> 123

<212> PRT

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 5

Met Lys Asp Ile His Ala Thr Arg Ala Cys Lys Glu Tyr Ile Asp Gly

1 5 10 15

Phe Gln Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Asn Tyr Thr Ser Glu Ser Ile Pro

20 25 30

Gln Leu Gln Ser Val Ser Glu Phe Met His Arg Thr Ser Gly Phe Arg

35 40 45

Ile Arg Pro Val Ala Gly Leu Val Thr Pro Arg Asp Phe Leu Ala Ser

50 55 60

Leu Ala Phe Arg Val Phe Gln Ser Thr Gln Tyr Ile Arg His His Ser

65 70 75 80

Arg Pro Met His Thr Pro Glu Pro Asp Cys Ile His Glu Leu Ile Gly

85 90 95

His Val Pro Met Leu Val Asn Arg Glu Phe Ala Asp Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Leu Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Glu Glu

115 120

<210> 6

<211> 217

<212> PRT

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 6

Met Ser His Ile Trp Asn Ala Arg Phe Pro Tyr Ser Asn Asn Leu Gly

1 5 10 15

Ile Cys Ser Asn Gln Thr Ile Thr Asn Ser His Asp Cys Ile Lys Thr

20 25 30

Glu Pro Cys Phe Pro Glu Glu Met Glu Arg Ile Pro Met Lys Glu Ile

35 40 45

Asn Asn Ile Glu Ser His Ile Arg Thr Asp Tyr Ser Val Gln Ser Tyr

50 55 60

Glu Tyr Asn Val Pro Ser Thr Asn Ile Thr Ser Tyr Ser Asp Asn Ala

65 70 75 80

Leu His Tyr Pro Val Lys Ser Gly Tyr Ser Thr Cys Gln Leu Ser Gly

85 90 95

Cys Thr Cys Cys Tyr Gln Ser Ser Met Thr Pro Asn Tyr Ser Tyr Ile

100 105 110

Pro Pro Asn Thr Tyr Phe Phe Gly His Ser Tyr Ser Ser Glu Tyr Leu

115 120 125

Ile Gly Asn Ile Gln His Pro Ser Asn Tyr Arg Gln Thr Tyr Asp His

130 135 140

Asp Ser Pro Tyr Leu Leu Thr Thr Asn Gln Arg Tyr Ser Pro Asp Glu

145 150 155 160

Ala Glu Met Thr Asp Ile Glu Asn Lys Lys Gly Asn Gln Thr Ile Lys

165 170 175

Asp Glu Pro Leu Asn Lys Lys Tyr Arg Cys Thr Phe Pro Gly Cys Glu

180 185 190

Lys Arg Tyr Leu Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His Tyr Arg Ile His

195 200 205

Thr Asp Tyr Asn Glu Glu Ile Ser Phe

210 215

<210> 7

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Leu Lys Arg Leu Phe Ile Leu Ile Val Ile Leu Gly Val Asn Glu

1 5 10 15

Val Thr Leu Gly Leu Glu Asn Ser Val Ser Pro Leu Lys Gln Pro Asn

20 25 30

Cys Arg Leu Leu Cys Gly Thr Cys Leu Phe Met Gly Arg Met Thr Lys

35 40 45

Val Phe Leu Glu Ser Glu Pro Phe Ile Pro Ile Met Ala Arg Ile Ile

50 55 60

Ser Pro Leu Cys His Leu Ile Pro Asn Glu Glu Cys Lys His Asn Cys

65 70 75 80

Leu Asn Val Thr His Glu Leu Pro Arg Glu Ile Lys Thr Trp Ala Lys

85 90 95

His Met Asn Val Ser His Asp Cys Ser Lys Leu Gly Leu Cys His Lys

100 105 110

Asn His Ser Met Val Ser Ser Phe Glu Phe Thr Ser Phe Leu Lys Glu

115 120 125

His Met Asn Tyr Trp Leu Ser Leu Asp Gln Asn Gly Lys Tyr Lys Asn

130 135 140

Thr Phe Ile Lys Asn Leu Cys Lys His His Ala Ala Asp Thr Asp Lys

145 150 155 160

Cys Ile Glu Thr Leu Glu Thr Ile Val Lys Phe Leu Val Gln Phe Thr

165 170 175

Ile

Claims

1.日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57，其特征在于，由i)或ii)的氨基酸序列组成：

i)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。

2.日本血吸虫抗原蛋白rSjScP57的编码基因SjScP57，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述抗原蛋白的以下任一应用：

1)用于制备日本血吸虫病检测试剂或试剂盒；

2)用于制备日本血吸虫病疫苗；

3)用于制备日本血吸虫病药物。

4.日本血吸虫检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有：权利要求1所述的抗原蛋白，或编码所述抗原蛋白的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。

5.含有权利要求4所述检测试剂的试剂盒。

6.日本血吸虫病ELISA免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)包被有1-5μg/mL权利要求1所述抗原蛋白的微孔反应板；用含0.05％v/vTWEEN20的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液作为包被缓冲液；

2)洗涤缓冲液：PBST液，即含0.05％v/v TWEEN20的PBS溶液，pH7.4；

3)样本稀释液：5％-10％BSA溶液，以PBS缓冲液为溶剂配制；

4)酶标抗体：碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体；

5)底物显色液：pNPP显色液；

6)反应终止液：120g/L NaOH水溶液；

7)阳性对照：以1μg/mL人免疫球蛋白IgG包板；

8)阴性对照：以相应的抗原蛋白包板，酶标抗体替换为样本稀释液。

7.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述的抗原蛋白。

8.血吸虫病疫苗，其特征在于，其包含权利要求7所述的免疫原性组合物。