CN111337328A - 一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法 - Google Patents

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Abstract

一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，涉及生物技术与生物医药领域，采用磁纳米捕获探针捕获循环肿瘤细胞，所述磁纳米捕获探针为叶酸修饰的磁性纳米粒子，磁纳米捕获探针上的叶酸与循环肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性的结合，从而在外加磁场上实现循环肿瘤细胞的捕获和分离。该方法中以叶酸代替抗体，降低循环肿瘤细胞磁分离的成本且该磁纳米捕获更稳定更易长时间储存。此外，该方法可实现循环肿瘤细胞的捕获后的释放，使得磁珠从循环肿瘤细胞表面脱落，便于随后的应用研究。经释放后的循环肿瘤细胞具有较高的活性，可用于循环肿瘤细胞相关的后续研究，如检测计数、体外培养、耐药性分析、基因测序以及蛋白质组学研究等。

Description

一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法
技术领域
本发明涉及生物技术与生物医药领域，尤其涉及一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法。
背景技术
癌症的早期诊断、干预和治疗可以显著改善患者的预后，提高患者的生存率。目前临床上常规的检测方法，如影像学检查具有滞后性，血清标志物检测方法往往灵敏度较低，组织穿刺活检可能会对患者造成二次伤害。微创的液体活检技术为癌症的早期筛查和诊断提供了可能。循环肿瘤细胞(CTCs)是液体活检的重要的生物标志物，与肿瘤的发生发展、转移和预后等密切相关。然而循环肿瘤细胞的含量极其稀少，因此对其进行检测和研究需对其进行捕捉、富集和分离。免疫磁分离技术因其操作简单，特异性好且易于与其他的检测技术联合使用而广泛应用于循环肿瘤细胞的研究中来。然而，常规的免疫磁分离方法成本高、捕获的细胞无法释放，容易干扰细胞的检测；同时容易产生细胞毒性，也为循环肿瘤细胞后续的应用研究带来不便。鉴于此，亟需开发高效、快速的循环肿瘤细胞无损伤的富集分离的新方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，基于磁分离的原理对血液中的循环肿瘤细胞进行富集和分离，为循环肿瘤细胞检测和后续研究提供可能。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，采用磁纳米捕获探针捕获循环肿瘤细胞，所述磁纳米捕获探针为表面修饰有叶酸的的磁性纳米粒子，磁纳米捕获探针上的叶酸与循环肿瘤细胞表面的叶酸受体(FR)特异性的结合，基于叶酸和叶酸受体的高亲和力，磁纳米捕获探针可特异快速地结合到循环肿瘤细胞的表面，从而在外加磁场上实现循环肿瘤细胞的捕获和分离。
所述磁性纳米粒子为羧基官能团化的磁性纳米粒子(MNs)。
所述磁纳米捕获探针的构建方法如下：首先将二硫键的胱胺分子(Cystamine)修饰在磁性纳米粒子的表面，形成MNs@Cys偶联复合物，然后将活泼酯化的含聚乙二醇链的叶酸(FA-PEG2K-NHS)与MNs@Cys偶联复合物偶联，形成MNs@Cys@PEG2k-FA磁纳米捕获探针。
本发明中，对磁捕获的循环肿瘤细胞进行释放是通过断裂偶联修饰在磁性纳米粒子表面的胱胺分子中的二硫键，从而破坏磁纳米捕获探针的完整性，使磁性纳米粒子与细胞分离实现循环肿瘤细胞的释放。
所述磁性纳米粒子的粒径为180nm。
所述活泼酯化的含聚乙二醇链的叶酸分子，其分子量为2000g/mol。
断裂磁纳米捕获探针中的二硫键所用的缓冲液中含有50mM的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)。
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
1、本发明中采用的磁性纳米粒子为羧基官能团化的磁性纳米粒子，其平均粒径约为180nm，具有快速的磁响应能力和较高的磁回收效率，可以实现循环肿瘤细胞的快速捕捉和分离。
2、本发明中采用小分子叶酸代替免疫磁分离方法中使用的抗体作为循环肿瘤细胞的靶向分子，具有成本低、稳定性高、可控易偶联修饰以及可以长时间储存等优势。
3、本发明中在磁性纳米粒子构建中，首先修饰含有二硫键的胱胺分子，随后将含有聚乙二醇(PEG)链的叶酸修饰在胱胺分子修饰的磁性纳米粒子表面。由于磁性纳米离子具有一定的空间位阻，叶酸为小分子直接修饰在磁性纳米粒子的表面可能会由于空间位阻效应而无法与循环肿瘤细胞表面的叶酸受体有效地识别。PEG链的引入可以将叶酸伸展出去，柔性链的延伸促进磁性纳米粒子表面的叶酸与循环肿瘤细胞表面的叶酸受体结合，使磁性纳米探针更有效地靶向结合到循环肿瘤细胞的表面。
4、本发明中磁捕获的循环肿瘤细胞的释放是通过断裂磁性纳米粒子表面的二硫键来实现循环肿瘤细胞的释放，使得捕获释放的循环肿瘤细胞具有较高的活性，可进行后续的研究，如检测计数、体外培养、药物筛选、耐药性分析、基因测序分析以及蛋白自组学研究等。
5、本发明中构建的磁纳米捕获探针为叶酸修饰的磁纳米粒子，其与循环肿瘤细胞识别并结合是通过叶酸与循环肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性地结合。由于大部分的肿瘤组织中均高表达叶酸受体，因此，该磁纳米捕获探针对多种肿瘤衍生出的循环肿瘤细胞均具有普遍适用性。
6、本发明中的方法相对简单，易于操作。
附图说明
图1为本发明涉及的循环肿瘤细胞的捕获和释放的原理示意图。
图2为实施例2中的实验结果图。
图3为实施例3中的实验结果图。
图4为实施例5中的实验结果图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所述磁纳米捕获探针的构建方法如下：首先将二硫键的胱胺分子(Cystamine)修饰在磁性纳米粒子的表面，形成MNs@Cys偶联复合物，然后将活泼酯化的含PEG链的叶酸(FA-PEG2K-NHS)与MNs@Cys偶联复合物偶联，形成MNs@Cys@PEG2k-FA磁纳米捕获探针；所述磁性纳米粒子为羧基官能团化的磁性纳米粒子(MNs，磁性纳米粒子的粒径为180nm；所述活泼酯化的含聚乙二醇链的叶酸分子，其分子量为2000g/mol。
如图1所示为本发明的原理图，一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，采用磁纳米捕获探针捕获循环肿瘤细胞，所述磁纳米捕获探针为叶酸修饰的磁性纳米粒子，磁纳米捕获探针上的叶酸与循环肿瘤细胞表面的叶酸受体(FR)特异性的结合，基于叶酸和叶酸受体的高亲和力，磁纳米捕获探针可特异快速地结合到循环肿瘤细胞的表面，从而在外加磁场上实现循环肿瘤细胞的捕获和分离；
对磁捕获的循环肿瘤细胞进行释放是通过断裂偶联修饰在磁性纳米粒子表面的胱胺分子中的二硫键，从而破坏磁纳米捕获探针的完整性，使磁性纳米粒子与细胞分离实现循环肿瘤细胞的释放，断裂磁纳米捕获探针中的二硫键所用的缓冲液中含有50mM的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)。
本发明中，实施例中的磁性纳米离子购买自上海奥润有限公司；胱胺盐酸盐购买自安耐吉化学；FA-PEG2k-NHS购买自上海芃硕生物有限公司；1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N,N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-NHS)等均为常规试剂，不再赘述。
实施例1
叶酸修饰的磁纳米捕获探针的偶联制备，包括如下步骤：
(1)取5mg的磁性纳米粒子重悬于10mL的25mM MES缓冲液中(pH 6.0)，磁分离清洗3次；
(2)5mL 25mM MES缓冲液重悬磁性纳米粒子于2mL离心管中，加入150μg 1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二雅安盐酸盐(EDC·HCl)和163μg N,N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-NHS)(EDC·HCl和Sulfo-NHS溶液需现配现用)，置于旋转混合仪上于室温持续混合孵育45min；
(3)磁分离吸去清夜，去除多余的EDC·HCl/Sulfo-NHS，PBS清洗两次后重悬于5mlPBS溶液中(1×PBS,pH 7.4)，加入0.5mg的胱胺盐酸盐，混匀后置于旋转混合仪上于室温持续混合孵育3h；
(4)加入200μg的乙醇胺孵育1h，封闭未偶联的活化的羧基；
(5)磁分离吸去清夜，偶联复合物经PBS清洗两次后重悬于5ml PBS溶液中；
(6)加入7.5mg的FA-PEG2k-NHS，混匀后置于旋转混合仪上于室温持续混合孵育3h；
(7)偶联复合物经PBS洗涤后重悬于5ml PBS溶液中即得循环肿瘤细胞磁纳米捕获探针溶液。
实施例2
循环肿瘤细胞的加标回收实验，包括如下步骤：
(1)HEK293细胞培养至70％～80％汇合度时经胰酶消化后吹打混匀制备单细胞悬液(细胞悬液浓度为106/mL，模拟血液中的单核细胞)，取1mL加入到2mL的牛血清蛋白包被的离心管中；
(2)将预染色的不同数目的***细胞(Hela)加入到HEK293细胞悬液中，模拟循环肿瘤细胞；
(3)混匀细胞悬液后加入100μL的叶酸修饰的磁纳米捕获探针，置于旋转混合仪上于室温持续孵育15min；
(4)随后离心管置于0.6T的磁力架中，磁分离2min，吸弃上清液；
(5)100μL的含1％BSA的PBS重悬磁纳米捕获探针-循环肿瘤细胞复合物；
(6)重悬液铺于载玻片上置于荧光显微镜下观察计数；
(7)捕获效率计算：捕获效率＝[磁分离的癌细胞数/加标的癌细胞数]*100％。
各组捕获效率如图2所示，叶酸修饰的磁纳米捕获探针可以高效地从复杂的背景细胞中富集出目的肿瘤细胞。向细胞悬液中加入不同浓度的肿瘤细胞模拟不同进展期的癌症患者外周血中肿瘤细胞的数目，该磁纳米捕获探针表现出优良高效的靶向富集能力。捕获癌细胞的数目(y)与加标癌细胞的数目(x)的关系为；y＝0.924x+0.9074(R2＝0.9984)
实施例3
磁捕获的循环肿瘤细胞的释放效率验证，包括如下步骤：
(1)本实施例中约200个预染色的Hela细胞加入到1mL的HEK293细胞悬液中，颠倒离心管数次混匀后加入100μL的磁纳米捕获探针溶液，置于旋转混合以上于室温持续孵育15min；
(2)随后离心管置于0.6T的磁力架中，磁分离2min，吸弃上清液；
(3)1mL的含50mM的细胞培养液重悬磁纳米捕获探针-循环肿瘤细胞复合物，应置于37℃的恒温水浴锅中持续孵育30min；
(4)随后离心管置于0.6T的磁力架中，磁分离2min，吸弃上清液；
(5)100μL的含1％BSA的PBS重悬磁纳米捕获探针-循环肿瘤细胞复合物；
(6)重悬液铺于载玻片上置于荧光显微镜下观察计数。
(7)释放效率计算：释放效率＝[1-(第二次磁富集的癌细胞数/第一次磁富集的癌细胞数)]*100％。
释放效率结果如图3所示，表明该磁纳米捕获探针可以实现循环肿瘤细胞的捕获与释放。经50mM的DTT于37℃处理45min，磁捕获的循环肿瘤细胞的释放效率超过了80％。
实施例4
释放的循环肿瘤细胞的活性验证，包括如下步骤：
(1)本实施例中胰酶消化处理Hela细胞，吹打成单细胞悬液，经细胞培养液稀释至103～104/mL；
(2)取1mL的细胞悬液中，加入100μL的磁纳米捕获探针溶液，置于旋转混合以上于室温持续孵育15min；
(3)随后离心管置于0.6T的磁力架中，磁分离2min，吸弃上清液；
(4)1mL的含50mM的细胞培养液重悬磁纳米捕获探针-循环肿瘤细胞复合物，置于37℃的恒温水浴锅中孵育30min；
(5)1500rmp，3min，吸弃上清液，收集细胞沉淀；
(6)100μL的PBS重悬细胞，加入2μL的1mM的Calcein-AM和3μL的1.5mM的PI(碘化丙啶)，混匀于37℃孵育15min；
(7)PBS清洗两次后，重悬液铺于载玻片上置于荧光显微镜下观察、拍照、计数。
活/死细胞染色结果：
实验结果发现，释放后的Hela细胞基本呈绿色荧光，仅较少的细胞呈现出红色荧光，表明释放的细胞仍具有较高的活性。Image J软件统计分析，呈绿色荧光的活细胞的含量占98.6％，表明该发明中的方法可实现循环肿瘤细胞的无损伤的捕获和释放。
实施例5
血液中循环肿瘤细胞的捕获，包括如下步骤：
(1)取1mL血液加入到10mL的离心管中，将预染色的***细胞(Hela)加入血液中，模拟循环肿瘤细胞，移液器轻轻吹打混匀；
(2)向离心管中加入3mL的红细胞裂解液，离心管静置10min，期间震动数次；
(3)混匀细胞悬液后加入100μL的叶酸修饰的磁纳米捕获探针，置于旋转混合仪上于室温持续孵育15min；
(4)裂解结束后，2000rpm，3min，吸弃上清液后1mL的PBS重悬沉淀后转移至2mL的BSA包被的离心管中；
(5)向其中加入100μL的叶酸修饰的磁纳米捕获探针，置于旋转混合仪上于室温持续孵育15min；
(6)随后离心管置于0.6T的磁力架中，磁分离2min，吸弃上清液；
(7)100μL的含1％BSA的PBS重悬磁纳米捕获探针-循环肿瘤细胞复合物；
(8)重悬液铺于载玻片上置于荧光显微镜下观察计数；
(9)捕获效率计算：捕获效率＝[磁分离的癌细胞数/加标的癌细胞数]*100％。
捕获效率如图4所示，当1mL血液中加入150个癌细胞时，该磁纳米探针对癌细胞的捕获效率超过了90％(平均值)。既使当加标的癌细胞数目在10个左右时，该磁纳米探针对癌细胞的捕获效率超过了80％(平均值)。这表明该方法可以对血液中的循环肿瘤细胞实现高效、快速的捕获，可以应用于临床肿瘤患者血液样品中循环肿瘤细胞的快速捕获。

Claims (7)

1.一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，其特征在于：采用磁纳米捕获探针捕获循环肿瘤细胞，所述磁纳米捕获探针为表面修饰有叶酸的磁性纳米粒子，磁纳米捕获探针上的叶酸与循环肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性的结合，从而在外加磁场上实现循环肿瘤细胞的捕获和分离。
2.如权利要求1所述的一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，其特征在于：所述磁性纳米粒子为羧基官能团化的磁性纳米粒子(MNs)。
3.如权利要求2所述的一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，其特征在于：所述磁纳米捕获探针的构建方法如下：首先将二硫键的胱胺分子(Cystamine)修饰在磁性纳米粒子的表面，形成MNs@Cys偶联复合物，然后将活泼酯化的含聚乙二醇链的叶酸(FA-PEG2K-NHS)与MNs@Cys偶联复合物偶联，形成MNs@Cys@PEG2k-FA磁纳米捕获探针。
4.如权利要求2所述的一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，其特征在于：对磁捕获的循环肿瘤细胞进行释放是通过断裂偶联修饰在磁性纳米粒子表面的胱胺分子中的二硫键，从而破坏磁纳米捕获探针的完整性，使磁性纳米粒子与细胞分离实现循环肿瘤细胞的释放。
5.如权利要求2所述的一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，其特征在于：所述磁性纳米粒子的粒径为180nm。
6.如权利要求3所述的一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，其特征在于：所述活泼酯化的含聚乙二醇链的叶酸分子，其分子量为2000g/mol。
7.如权利要求4所述的一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法，其特征在于：断裂磁纳米捕获探针中的二硫键所用的缓冲液中含有50mM的二硫苏糖醇。
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