CN115089721A - Hl-60细胞来源的细胞外囊泡在作为靶向肿瘤的载药***中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HL‑60细胞来源的细胞外囊泡在作为靶向肿瘤的载药***中的应用。LPS和IFN‑γ处理后中性粒细胞内，获得的细胞外囊泡中相关促炎因子的表达水平显著上调，特别是中性粒细胞活化的重要指标ICAM‑1在mRNA和蛋白质表达水平均显著上升。高表达ICAM‑1的中性粒细胞来源EVs更容易被高表达整合素的肿瘤细胞黏附捕获。利用中性粒细胞来源的EVs负载Dox制备载药EVs，有效提高体内载药EVs被肿瘤细胞的摄取效率及其对杀伤肿瘤细胞的能力。
Description
技术领域
本发明涉及HL-60细胞来源的细胞外囊泡在作为靶向肿瘤的载药***中的应用。
背景技术
化学合成药物、基因药物，尤其是天然药物或中药活性成分因其溶解性差、稳定性低和副作用大等诸多问题严重限制了其在临床上的应用。使用有机或无机材料作为合成载体的药物递送***虽然能够提高药物的溶解度和生物利用度，但是不能有效靶向病灶部位，甚至会被机体的免疫***视为外源性毒物而排出体外，无法发挥作用。
细胞外囊泡(Extracellular vesicle，EVs)是由细胞产生的纳米级大小的膜结构，被认为是介导细胞间通讯的重要方式，参与了机体内多种生理反应过程。EVs由于其生物内源性和低免疫原性，可避免其在体内被快速清除，亦不会引起机体免疫反应。中性粒细胞具有高趋化性等特性，但是其来源的EVs是否能继承中性粒细胞的高趋化性等特征并不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供HL-60细胞来源的细胞外囊泡在作为靶向肿瘤的载药***中的应用。
优选的，所述的细胞外囊泡为用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)将 HL-60细胞诱导分化为中性粒细胞，再使用LPS和IFN-γ刺激中性粒细胞得到。
优选的，所述细胞外囊泡作为载药***时负载的药物为具有医疗用途的诊断或治疗活性的药物。
优选的，所述药物为顺铂、紫杉醇、吉非他滨、长春瑞滨、培美曲塞中的一种或多种。
有益效果：用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)将HL-60细胞诱导分化为中性粒细胞，再用LPS和IFN-γ处理后中性粒细胞内，获得的细胞外囊泡中相关促炎因子的表达水平显著上调，特别是中性粒细胞活化的重要指标细胞粘附分子1(Intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)在mRNA和蛋白质表达水平均显著上升。
高表达ICAM-1的中性粒细胞来源EVs更容易被高表达整合素的肿瘤细胞黏附捕获。利用中性粒细胞来源的EVs负载Dox制备载药EVs，有效提高体内载药EVs被肿瘤细胞的摄取效率及其对杀伤肿瘤细胞的能力。
附图说明
图1、HL-60细胞来源细胞外囊泡的透射电子显微镜分析图。
图2、HL-60细胞来源细胞外囊泡的纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)分析图。
图3、体外流式检测肿瘤细胞摄取药物效率。
图4、体外免疫荧光检测肿瘤细胞摄取药物。
图5、载药囊泡诱导肿瘤细胞凋亡的效率检测。
图6、体内检测HL-60细胞来源细胞外囊泡***效果。
图7、细胞对囊泡的捕获能力检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
使用ATRA诱导HL-60细胞分化为中性粒细胞，使用脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)刺激中性粒细胞，分离获得细胞外囊泡。
诱导HL-60细胞分化为中性粒细胞步骤：
(1)将购买的ATRA(25mg)用10ml DMSO溶解成25mg/ml的ATRA母液。
(2)用1640完全培养液稀ATRA母液，轻轻混匀，配置成工作浓度为5μM的ATRA混合液。摇晃细胞培养瓶，悬起细胞后后，将细胞悬液转移至15ml离心管，1000rpm离心5min，去除上清液。用ATRA混合液重悬后转移至新培养瓶。
(3)刺激培养3天后，离心去除上清液，更换新鲜的1640完全培养液培养2天后，HL-60分化为中性粒细胞。
刺激中性粒细胞分化为促炎表型：
(1)将购买的LPS(10mg)用灭菌的1xPBS溶解成1mg/ml的LPS母液。
将购买的IFN-γ(50μg)用灭绝的ddH2O溶解成100μg/ml的IFN-γ母液。
(2)取摇晃细胞培养瓶，悬起细胞后，将细胞悬液转移至15ml离心管，1000rpm离心5min，去除上清液。
(3)分别取1～2x107个细胞，用1640培养液重悬细胞。dHL-60-N1组中加入工作浓度为1μg/ml的LPS和20ng/ml，振荡混匀，在细胞培养箱中稳定培养诱导中性粒细胞分化。
提取细胞外囊泡：
(1)制备无外泌体血清：将胎牛血清放于超速离心机，4℃，160000g离心16h，回收上清液，得到无外泌体血清，并储存与-20℃中备用。
(2)使用含10％无外泌体血清的培养液培养细胞，不同培养条件下培养48h后收集细胞悬液，在300g离心10min。
(3)收集上清液，2000g离心10min去除细胞碎片。
(4)将上清液转移至超速离心管中，用超速离心机160000g离心70min。离心后去除上清，用1xPBS重悬沉淀(囊泡)，转移到1.5ml的EP管中，-80℃保存。
囊泡载药方式：
(1)用DMSO配置含量为1mg/ml的Dox溶液。
(2)在1xPBS中加入不同浓度的Dox，使用酶标仪在480nm检测吸光度，建立Dox浓度标准曲线。
(3)通过“直接装载”方法，将药物与囊泡进行共孵育。将囊泡蛋白浓度标准化为500 μg/ml，加入200μg/ml Dox(比值5:2)，并充分混匀后，室温孵育24h。
(4)300g离心5min，将含载药囊泡的上清液转移至新的EP管。收集未载入的Dox沉淀，用DMSO重悬后，使用酶标仪检测，根据标准曲线计算游离的Dox含量。
(5)囊泡的Dox包封率计算公式如下：包封效率(EE％)＝1-[游离的Dox含量(mg)/加入的Dox总量(mg)]x100％。
S1、HL-60细胞来源细胞外囊泡结构表征，通过透射电子显微镜(TEM)(如图1)和纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)(如图2)分析载药囊泡的物理特性。
实验方法：透射电镜检测
(1)用适量1×PBS稀释囊泡，将样品滴在透射电镜铜网上，静置1-2min后，用滤纸小心吸除参与液体，自然风干。
(2)室温下，磷钨酸溶液染色3-5min，染色完成后取下铜网，吸干多余的液体，自然风干。
(3)使用透射电子显微镜进行观察。
S2、为确定HL-60细胞来源细胞外囊泡是否能提高肿瘤细胞的摄取药物效率，同时进一步研究携带与肿瘤细胞膜受体可选择性相互作用配体的HL-60细胞来源细胞外囊泡，能否增强纳米载体的药物递送潜力。因为蒽环类药物Dox可自发荧光，我们将载药囊泡与肿瘤细胞短期共孵育后，使用流式细胞仪检测细胞内Dox荧光强度，从而确定肿瘤细胞对Dox的摄取效率(图3)。同时使用DiO染料标记载药囊泡，将DiO标记的载药囊泡与肿瘤细胞短期共孵育，通过共聚焦显微镜观察肿瘤细胞内荧光共定位。LPS+IFN-γEV-Dox与LLC细胞孵育6 小时后显示出较强的Dox荧光，相比之下，使用游离的Dox和NE-EV-Dox(没有诱导表型为促炎的中性粒细胞)处理的肿瘤细胞中Dox荧光较弱。实验结果表明，HL-60细胞来源的细胞外囊泡作为药物递送载体可有效提高肿瘤细胞对药物的摄取效率，提高药物在肿瘤细胞中累积量(图4)。
实验方法(图3)流式检测肿瘤细胞药物摄取
(1)将肺癌细胞LLC以2x105个/孔接种于24孔板中，过夜培养。
(2)将特定浓度的Dox和载药囊泡分别加入孔中，每个实验组设置3个平行孔，在细胞培养箱中培养4h。
(3)吸去孔中的培养液，用灭菌的PBS清洗2次。加入胰酶消化细胞，待细胞皱缩或轻微脱落，加入两倍培养液中和胰酶，800rpm离心3min收集细胞。
(4)去除上清液，用1％BSA清洗细胞1次，300g离心5min。
(5)用适量1％BSA重悬细胞，上机检测。
(图4)免疫荧光检测肿瘤细胞药物摄取
(1)将灭菌处理后的细胞爬片在75％乙醇中过夜浸泡，用灭菌的PBS清洗3次。
(2)将爬片置于24孔板中，以每孔约105个细胞接种，过夜培养。
(3)在囊泡中加入DiO溶液，充分混匀后，37℃孵育10min，离心去除游离的DiO。
(4)吸去孔中的培养液，用灭菌的PBS清洗1次。将Dox和载药囊泡根据特定Dox浓度分别加入孔中，在细胞培养箱中处理6h。
(5)4h后，吸去培养液，用1xPBS清洗3次，每次5min。
(6)用4％多聚甲醛室温固定15min。用1xPBS清洗3次，每次5min。
(7)加入DAPI染液，室温避光孵育10min后，用1xPBS清洗3次，每次5min。
(8)吸去残余液体，滴加抗荧光淬灭剂封片。使用共聚焦显微镜检测。
S3、载药囊泡诱导肿瘤细胞凋亡的实验结果表明空载囊泡(无论是否ICAM-1表达水平高低)本身不具有毒副作用，对肿瘤细胞无杀伤能力。而装载Dox后，载药囊泡相比游离Dox具有增强的细胞杀伤能力，同时在高表达ICAM-1的载药囊泡处理的肿瘤细胞中，晚期凋亡细胞和坏死细胞的比率显著提高，与肿瘤细胞的高药物摄取效率相对应，表明携带ICAM-1的载药囊泡促进肿瘤细胞对药物的摄取从而表现出较强的细胞杀伤能力(图5)。
实验方法：细胞凋亡检测
(1)将肺癌细胞LLC以2x105个/孔接种于24孔板中，过夜培养。
(2)将Dox和载药囊泡分别加入孔中，每个实验组设置3个平行孔，在细胞培养箱中培养24h。
(3)吸去孔中的培养液，用灭菌的PBS清洗2次。加入不含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞皱缩或轻微脱落，加入两倍培养液中和胰酶，800rpm离心3min收集细胞。
(4)去除上清液，用4℃预冷的PBS清洗细胞2次，使用细胞凋亡试剂盒，用250μl 结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1x106 cell/ml。
(5)取100μl细胞悬液，加入5μl Annexin V/PE和10μl 7AAD溶液。轻轻混匀后，室温避光孵育15min。
(6)加入400μl PBS清洗，300g离心5min后用适量PBS重悬细胞，上机检测。
通过细胞裂解液提取两种细胞蛋白，结果如图6所示，实验结果表明在促炎表型中性粒细胞中ICAM-1主要以非分泌蛋白的形式显著表达。即LPS和IFN-γ可诱导中性粒细胞中粘附分子ICAM-1的表达增加。
实验方法：western blot。
使用DiO染料标记囊泡，将DiO标记的囊泡与细胞短期共孵育，通过流式细胞仪检测细胞上DiO的荧光强度，分析细胞对囊泡的捕获能力，结果如图7所示。流式细胞术结果显示，肿瘤细胞对中性粒细胞来源囊泡具有良好的捕获能力，并且当囊泡高表达ICAM-1时，肿瘤细胞对囊泡的捕获效率明显提高。相比之下，低表达整合素的成纤维细胞对囊泡的捕获效率较低。
实验方法：细胞摄取流式检测
(1)将购买的DiO溶液用DMSO溶解，分装后-20℃存储。DiO的工作浓度为5μMM， Ex/Em＝484nm/501nm。
(2)将LLC细胞和NIH 3T3细胞以2x105个/孔接种于24孔板中，过夜培养。
(3)在囊泡中加入DiO溶液，充分混匀后，37℃孵育10min，离心去除游离的DiO。
(4)将DiO标记的囊泡分别加入孔中，每个实验组设置3个平行孔，在细胞培养箱中培养4h。
(5)吸去孔中的培养液，用灭菌的PBS清洗2次。加入胰酶消化细胞，待细胞皱缩或轻微脱落，加入两倍培养液中和胰酶，800rpm离心3min收集细胞。
(6)去除上清液，用1％BSA清洗细胞1次，300g离心5min。
(7)用适量1％BSA重悬细胞，上机检测。
Claims (4)
1.HL-60细胞来源的细胞外囊泡在作为靶向肿瘤的载药***中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的细胞外囊泡为用ATRA将HL-60细胞诱导分化为中性粒细胞，再使用LPS和IFN-γ刺激中性粒细胞得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞外囊泡作为载药***时负载的药物为具有医疗用途的诊断或治疗活性的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物为顺铂、紫杉醇、吉非他滨、长春瑞滨、培美曲塞中的一种或多种。
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