CN114740204A - 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片及其应用,该芯片的双四面体DNA探针组装到银纳米棒基底,形成具有纳米粗糙表面特征的生物识别界面;Zn离子响应型DNAzyme‑适配体链与待检测样品混合,通过适配体与待检测样品中的目标细胞的膜蛋白特异性结合而绑定到细胞表面。将待检测样品与芯片共培养,目标细胞经由Zn离子响应型DNAzyme‑适配体链与Zn离子响应型DNAzyme底物‑连接链杂交而被芯片捕获,实现从复杂样品中分离;芯片捕获的细胞经荧光成像Zn酶‑适配体链上修饰的荧光分子实现细胞计数;通过向芯片上加入Zn离子,实施DNAzyme核酸切割,实现细胞从芯片的无损释放。
Description
技术领域
本发明属于功能纳米材料和生物检测领域,具体涉及一种用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片及其应用。
背景技术
在癌症的死亡病例中,有超过90%的癌症患者死于肿瘤的转移和复发。由于肿瘤的侵袭和转移特性,肿瘤细胞能够从原位肿瘤或其转移过程中脱落进入血液循环***,从而形成循环肿瘤细胞。近年来,循环肿瘤细胞已被公认为重要的肿瘤标志物,与肿瘤的转移机制有着密切关系,检测计数外周血中的循环肿瘤细胞,对于肿瘤的发生、复发及预后评估具有重要指导意义。但循环肿瘤细胞在外周血中的含量极低,通常每毫升癌症病人的外周血中仅有几个或几十个,同时循环肿瘤细胞存在异质性。因此,迫切需要发展检测技术,能够高效率、高特异性捕获循环肿瘤细胞,并进行灵敏检测计数。此外,分离外周血中的循环肿瘤细胞,进一步对其进行更深层次的细胞层面下游分析,可以揭示肿瘤转移机制,以及指导肿瘤细胞的基因和蛋白质等方面研究,然而分离过程通常容易污染细胞,且在释放过程会引起细胞的损伤,验证影响下游的分析准确性。因此,如何获得无损且干净的循环肿瘤细胞,是循环肿瘤细胞分析的难点和瓶颈。
目前,具有粗糙表面特征的纳米基底已被证实对循环肿瘤细胞存在增强的亲附性,可有效提高循环肿瘤细胞的捕获效率,但此方法由于缺乏特异性,捕获得到的循环肿瘤细胞往往纯度较低,不利于进一步分析研究;与此同时,基于生物亲和性的细胞识别可以高特异性捕获目标细胞,使得捕获纯度大大提高,但是现有生物亲和性识别捕获机制存在循环肿瘤细胞释放困难等问题( [1] Dong J., Chen J. F., Smalley M., Zhao M., KeZ., Zhu Y., Tseng H. R. Nanostructured Substrates for Detection andCharacterization of Circulating Rare Cells: From Materials Research toClinical Applications [J]. Advanced Materials, 2019, e1903663.[2] ShenQinglin, Xu Li, Zhao Libo, Wu Dongxia, Fan Yunshan, Zhou Yiliang, OuYang Wei-Han, Xu Xiaochun, Zhang Zhen, Song Min, Lee Tom, Garcia Mitch A., Xiong Bin,Hou Shuang, Tseng Hsian-Rong, Fang Xiaohong. Specific Capture and Release ofCirculating Tumor Cells Using Aptamer-Modified Nanosubstrates [J]. AdvancedMaterials, 2013, 25(16): 2368-2373)。
因此,结合粗糙纳米基底的物理亲附性和核酸适配体的生物亲和性捕获机制,构建合理的捕获和计数策略,实现循环肿瘤细胞的高效捕获、高灵敏计数及无损释放,是实施基于外周血中痕量循环肿瘤细胞开展肿瘤检测的有效途径也是难点和挑战。
发明内容
发明目的:针对现在循环肿瘤细胞本身丰度极低且存在异质性,同时无损释放循环肿瘤细胞困难以及当前传感检测计数循环肿瘤细胞策略不足,本发明提出了一种用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片。所述芯片包含双四面体DNA探针、银纳米棒阵列基底、Zn离子响应型DNAzyme-适配体链和核酸Key链;其中,双四面体DNA探针组装到银纳米棒基底,形成具有纳米粗糙表面特征的生物识别界面;Zn离子响应型DNAzyme-适配体链与待检测样品混合,通过适配体与待检测样品中的目标细胞的膜蛋白特异性结合而绑定到细胞表面。
本发明的另一个目的是提供一种用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放芯片的应用,实现对循环肿瘤细胞的高效且高特异性分离捕获,高灵敏检测计数以及无损释放。是将待检测样品与芯片共培养,目标细胞经由Zn离子响应型DNAzyme-适配体链与双四面体DNA探针上的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链杂交而被芯片捕获,实现从复杂样品中分离;芯片捕获的细胞经荧光成像Zn酶-适配体链上修饰的荧光分子实现细胞计数;通过向芯片上加入Zn离子,实施基于Zn离子响应的DNAzyme核酸切割,实现细胞从芯片的无损释放。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明采用了以下技术方案:
一种用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片,所述芯片包含双四面体DNA探针、银纳米棒阵列基底、Zn离子响应型DNAzyme-适配体链和核酸Key链。
所述双四面体DNA探针,包含底座四面体DNA、捕获四面体DNA,Carpture链以及Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链。其中,所述四面体DNA具有三维立体结构,座四面体DNA和捕获四面体DNA以顶-顶相连的方式连接。
底座四面体由四条单链DNA,即巯基修饰的A1(A1-SH,5’端修饰巯基)、巯基修饰的B1(B1-SH,5’端修饰巯基)、巯基修饰的C1(C1-SH,3’端修饰巯基)和D1自组装形成。组装形成的底座四面体DNA底面三个顶角修饰有巯基,顶端延伸出一段碱基序列。捕获四面体DNA由单链DNA A2、B2、C2、D2自组装形成,一个顶角处延伸出一段与底座四面体顶端延伸出的碱基序列互补的碱基序列,另外三个顶角上均延伸出一段相同的碱基序列能与Capture链部分碱基互补杂交。Capture链剩余部分碱基序列能与Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链部分碱基序列互补杂交。
具体来说,将底座四面体DNA和捕获四面体DNA混合孵育形成双四面体DNA结构,进一步与Carpture链及荧光分子标记的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链共孵育,形成具有3个细胞识别端的双四面体DNA探针。双四面体DNA探针经由Ag-S共价键组装到银纳米棒基底,形成具有纳米粗糙表面特征的生物识别界面。当目标细胞存在时,Zn离子响应型DNAzyme-适配体链的适体部分靶向识别目标细胞,经由Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链与Zn离子响应型DNAzyme-适配体链的特异识别实现目标细胞的捕获。
芯片捕获的细胞经荧光成像Zn离子响应型DNAzyme-适配体链上修饰的荧光分子实现细胞计数。Zn酶响应探针可被Zn离子选择性破坏并切割Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链,因此实现目标细胞的无损释放。将芯片与核酸Key共孵育,将切割后四面体DNA探针上残余的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链从芯片表面清除,实现芯片的重复利用。
其中,所述荧光分子标记的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链为3’端修饰了荧光染料分子,作为荧光检测的信号来源。
其中,所述染料分子为本领域常规的标记染料,包括但不限于ROX等染料分子。
其中,仅有Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链为修饰有荧光染料分子的DNA单链,其连接在双四面体DNA探针上,而双四面体DNA探针通过底端巯基与银纳米棒作用形成的Ag-S键固定在银纳米棒基底表面。当目标细胞存在时,Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链与Zn离子响应型DNAzyme-适配体链的特异识别,结合银纳米棒阵列基底的粗糙表面对细胞的亲附性从而实现特异性捕获,此时染料分子被固定在银纳米棒表面。随后的细胞无损释放在无明显细胞毒性的含有Zn离子的PBS溶液中进行,Zn离子选择性切割染料分子修饰的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链,染料分子游离至上清,因此上清溶液中的染料分子的量与目标细胞数目相关,依据荧光检测能够实现循环肿瘤细胞的检测计数。
上述用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放芯片的制备方法,包括以下步骤:
1)组装底座四面体DNA:将3条单链A1-SH、B1-SH、C1-SH用TCEP试剂除去双硫键后与D1链等物质的量混合,组装形成三维立体结构的四面体DNA,即三条单链按DNA:TCEP =1:900~1:1100的比例混匀过夜反应,然后与D1链等物质的量混合,经退火处理(即加热至95°C并保持5 min,再自然冷却至室温)得到底座四面体DNA。
所述的四条DNA单链(A1-SH、B1-SH、C1-SH和D1)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~4所示。
2)组装捕获四面体DNA:将4条DNA单链A2、B2、C2、D2等物质的量混合,经退火处理得到四面体DNA。
所述的四条DNA单链(A2、B2、C2和D2)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5~8所示。
3)形成双四面体DNA:将底座四面体DNA探针和捕获四面体DNA探针按1:1~1:1.3的比例混合,在25~37℃共孵育3~5 h,制得双四面体DNA结构。
4)制备双四面体DNA探针:双四面体DNA与Capture链比例为1:2.8~1:3.5,以及双四面体DNA与荧光分子标记的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链比例为1:2.8~1:3.5将四面体DNA和Capture链及Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链混合,在25~37℃共孵育3~5 h,双四面体DNA探针。
5)双四面体DNA探针修饰银纳米棒:浓度为0.8~1.2 μM的双四面体DNA探针与银纳米棒基片共孵育,温度为25~37℃,时间为2~5 h。进去离子水冲洗,制得用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片。
所述步骤5)中两条DNA单链Capture链和Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
上述的用于循环肿瘤细胞检测捕获、计数、无损释放芯片的应用,包括以下步骤:
1)将Zn离子响应型DNAzyme-适配体链与待检测样品共孵育。
2)将步骤1)中含有待测目标细胞的样品溶液滴加到芯片上共孵育。
3)将步骤2)孵育后的芯片去离子水冲洗,进行荧光成像,基于荧光图像计数被捕获目标细胞数目。
4)将步骤2)孵育后的芯片多次清洗后,加入含有Zn离子的PBS溶液共培养,实现目标细胞的无损释放。
5)将步骤4)共培养后的芯片清洗后进行荧光成像,基于荧光图像计数基片上存留的目标细胞数目。
6)配置含有已知不同目标细胞数的待检测液,利用步骤1)-4)得到孵育后的上清液与清洗液(即收集液),对收集液进行荧光光谱表征,得到目标细胞浓度对应的荧光光谱及其特征峰强度值,以目标细胞浓度为横坐标,以荧光特征峰强度值为纵坐标,做出荧光检测的工作曲线,根据信噪比S/N=3的判据,计算得到检测限。
7)对于任意待检测液,利用步骤1)-4)得到孵育后的收集液,根据收集液的荧光特征峰强度,对照工作曲线,计算得到收集液中目标细胞数目。
8)将步骤S4)得到的芯片与核酸Key链共孵育,之后芯片与Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链共孵育,重新获得权力要求3的生物识别界面。
其中,所述应用方法中,步骤1)的Zn离子响应型DNAzyme-适配体链核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示;
其中,所述应用方法中步骤1)的Zn离子响应型DNAzyme-适配体链为过量,其与目标细胞共孵育时间为35~45 min。
其中,所述应用方法中步骤2)中待检测细胞数目为50~2000个;
其中,所述应用方法中步骤2)中待检测细胞与芯片的共孵育时间为40~50 min。
其中,所述应用方法中步骤4)中Zn离子共培养时间为30~40 min。
其中,所述应用方法中步骤8)的核酸Key链核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
其中,所述应用方法中步骤8)的核酸Key链为过量,与芯片共孵育,温度为25~37℃,时间为3~5 h。
有益效果:相对于现有技术,本发明具备以下优势:
1、本发明所制备的芯片可用于循环肿瘤细胞的高效捕获、高灵敏检测计数及无损释放,是基于物理和生物两种捕获机制协同作用实现捕获CTC(循环肿瘤细胞),而传统的DNA探针是仅发挥生物捕获机制。
2、银纳米棒阵列基底在传统中主要用作表面增强拉曼基底,本发明首次将之用作粗糙物理界面用于构建CTC捕获界面,所采用的银纳米棒阵列基底具有大面积均一、银纳米棒阵列排列与表面纳米级粗糙等结构特征,便于功能化修饰及对细胞表现出明显的亲附性能,利于细胞捕获。
3、本发明所制备的芯片采用双四面体DNA探针实现生物功能化修饰,相比于常规使用的单链DNA,四面体DNA具有良好的结构刚性和稳定性,能够通过四面体尺寸的调控实现修饰有四面体DNA在纳米界面表面分布的密度,具有优异的空间定位能力;同时,四面体DNA在纳米界面具有较好的取向性,避免了单链在界面上的倒伏和缠绕等不足,因而提高了生物功能化的界面对于目标细胞的捕获能力和效果;结合Zn离子响应的DNAzyme与底物之间的特异性识别能够提高细胞捕获的特异性,以及Zn离子响应的DNAzyme核酸切割介导可实现无损的细胞释放;此外,双四面体DNA探针修饰纳米界面后能够高效封闭界面上的吸附位点,能够有效降低界面对非特异性物质的吸附,提高细胞捕获与检测的特异性。
4、该芯片同时具有DNA适体的生物亲和性与纳米级粗糙界面对细胞的亲附性。本发明在保证纳米基底对细胞有效捕获的同时大大提高了捕获特异性,提高捕获纯度。此外,Zn离子介导的无损释放保证了被释放细胞的生物活性,便于进一步细胞层面的下游分析,使得肿瘤转移机制的研究成为可能。
5、该芯片能够实现对循环肿瘤细胞高灵敏检测计数。结合荧光检测技术,实现了单个细胞的计数分析,并在白细胞为背景的复杂环境中表现出优异的检测性能。
6、本发明设计了芯片的重复使用机制,DNAzyme切割Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链导致细胞释放后,部分被切的链残留在芯片上。同时发明人设计了核酸Key链,利用核酸Key链杂交四面体探针上的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链的残存链,使得残存链从四面体上彻底脱离,使得基片可以再次结合新的完整的 Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链,实现重复使用。
综上,本发明公开的芯片结合了DNA适体的生物亲和性与纳米级粗糙界面对细胞的亲附性,实现了对循环肿瘤细胞的高效率、高特异性的分离捕获以及无损释放与检测计数分析。该固相芯片为实际病人血液样品检测提供可能性,可作为实际癌症病人液体活检的有效工具。可用于实际样本分析研究,为拓展纳米粗糙基底及纳米界面生物功能化在循环肿瘤细胞分离捕获及检测计数中的广泛应用提供技术支持。
附图说明
图1是实施例1所得银纳米棒阵列基底的扫描电镜图;
图2是本发明所涉及的用于循环肿瘤细胞分离、捕获及释放的固相芯片构建及工作原理图;
图3是本发明涉及的用于循环肿瘤细胞捕获释放的固相芯片工作机制验证,其中:(a)为凝胶电泳表征,其中:1. Marker;2.Capture;3.Zn酶底物-连接;4.Zn-适体;5.Capture+Zn酶底物-连接;6.Z酶底物-连接+Zn酶-适体;7.Capture+Zn酶底物-连接+Zn酶;8. Capture+ Zn酶底物-连接+ Zn酶+Zn离子;9. Capture+ Zn酶底物-连接+ Zn酶+Zn离子+置换链;10. 置换链;
(b)、(c)和(d)分别是固相芯片本身、捕获和释放细胞后的固相芯片荧光成像表征;
图4是实施例3中固相芯片用于循环肿瘤细胞捕获的时间表征,其中,(a)为0~50min捕获细胞的荧光成像表征,(b)为对应的捕获效率统计;
图5是实施例3中固相芯片用于循环肿瘤细胞捕获的捕获效率表征,其中包括在PBS缓冲溶液和10%人血清中不同数目的细胞捕获(50、100、200、500、1000和2000个);
图6是实施例3中固相芯片用于循环肿瘤细胞捕获的增强捕获性能及特异性表征,其中,(a)-(d)是SGC-7901细胞在不同基底(Ag NRs(T)、Ag film(T)、Ag NRs(S)、Ag film(N))上被捕获后的荧光成像,具体来说,(a)是SGC-7901细胞在Ag NRs(T)上被捕获后的荧光成像、(b)是SGC-7901细胞在Ag film(T)上被捕获后的荧光成像、(c)是SGC-7901细胞在Ag NRs(S)上被捕获后的荧光成像、(d)是SGC-7901细胞在Ag film(N))上被捕获后的荧光成像;(e)是LO2细胞在Ag NRs(T)上被捕获后的荧光成像、(f)是Hela细胞在Ag NRs(T)上被捕获后的荧光成像、(g)是MDA-MB-231细胞在Ag NRs(T)上被捕获后的荧光成像;(h)是SGC-7901细胞在不同基底上的捕获效率统计;(i)为Ag NRs(T)上不同细胞的捕获效率统计;(j)是具有3个捕获末端的四面体DNA探针示意图、(k)是具有1个捕获末端的四面体DNA探针示意图;
图7是实施例3中固相芯片用于循环肿瘤细胞捕获的扫描电镜表征。(a)和(b)分别为基于粗糙银纳米棒(Ag NRs(T))和光滑银膜界面(Ag film(T))上细胞捕获的扫描电镜表征图;
图8是实施例5中固相芯片用于循环肿瘤细胞释放的时间表征,其中,(a)为0~40min细胞释放后的荧光成像表征,(b)为对应的释放效率统计;
图9是实施例5中固相芯片用于循环肿瘤细胞捕获的释放效率表征,其中包括在PBS缓冲溶液和10%人血清中不同数目的细胞释放(50、100、200、500、1000和2000个);
图10是实施例5中循环肿瘤细胞被固相芯片释放后的细胞活性表征,其中,(a)-(e)为释放后不同时期(刚释放、第一、二、三和四天)细胞增殖生长显微成像;(f)和(g)为细胞一次和三次传代后增殖生长的显微图像;(h)为释放细胞AM/PI染色后的荧光成像;
图11是实施例6中用于循环肿瘤细胞分离、捕获及释放的固相芯片的循环使用表征。(a)为1-4次重复使用时固相芯片捕获和释放细胞后荧光成像;(b)为每次重复使用时银纳米棒纳米生物界面捕获和残留细胞效率统计;
图12是实施例7用于循环肿瘤细胞分离、捕获及释放的固相芯片在白细胞为背景中的捕获释放性能表征。其中,对于不同数目(5、10、25、50和100个)SGC-7901细胞,(a)为细胞捕获效率计算;(b)为目标细胞SGC-7901与白细胞捕获效率比较;(c)为细胞释放效率计算;
图13是实施例8中固相芯片用于循环肿瘤细胞检测计数的原理示意图;
图14是实施例8中固相芯片用于循环肿瘤细胞检测计数的荧光表征。其中,对于不同数目(0、1、5、10、25、50和100个)SGC-7901细胞在不同背景中的荧光检测,(a)为PBS缓冲溶液中荧光检测图谱,对应607 nm处荧光强度值与细胞个数的线性拟合曲线呈现在(b)中;(c)为白细胞为背景的荧光检测图谱,对应604 nm处荧光强度值与细胞个数的线性拟合曲线呈现在(d)中。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明的内容并不限于所举的实施例。
本发明所使用的DNA碱基序列片段均为人工合成得到,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1、实施例中特殊设计的双四面体DNA探针的10条DNA单链的碱基序列如表1所示,对应于底端四面体DNA制备所需的4条DNA单链(A1-SH、B1-SH、C1-SH和D1);捕获四面体DNA制备所需的4条DNA单链(A2、B2、C2和D2);Capture链以及Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链:
表1
2、实施例中的用于特异识别连接Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链且可特异靶向目标细胞的Zn离子响应型DNAzyme-适配体链的碱基序列为:
Zn离子响应型DNAzyme-适配体:
5' -GAT CTC TCT CTG CCC TAA GTC CGC ACC CGT GCT TCC CTG TTT TTT AGGTAT CTA GTT GAG CTG TCT GCA TCA GG- 3'
3、实施例中用于恢复固相芯片捕获、无损释放及检测计数能力的核酸Key链的碱基序列为:
核酸Key链:5' -TCA ACG TCT GCA TCA GGT ACA GTC GTA TTG CAT TCC TCT C-3'
实施例1 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片的制备
第一步、采用斜角沉积法蒸发镀膜技术制备( [3] Liu Y J, Chu H Y, Zhao YP. Silver Nanorod Array Substrates Fabricated by Oblique Angle Deposition:Morphological, Optical, and SERS Characterizations [J]. The Journal ofPhysical Chemistry C, 2010, 114(18): 8176-8183)。将1 cm×1 cm玻片放入真空沉积室中,以0.2 nm/s,0.3 nm/s和0.3 nm/s的速率分别依次沉积20 nm的Ti、200 nm的Ag膜层和2000 nm的Ag膜以形成银纳米棒,其形貌如图1所示。整个蒸发过程在压力<3×10-6 Torr的高真空条件下进行。
第二步,制备直径4 mm,高度1 mm的PDMS小孔粘贴在银纳米棒阵列型基底上,获得尺寸固定且规则的工作区域。
第三步、构建双四面体DNA探针,以修饰在银纳米棒上构建纳米生物界面。如图2中(a)所示,双四面体DNA探针包含4个部分,分别为底座四面体DNA、捕获四面体DNA,Carpture链以及Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链。
构建底座四面体DNA和捕获四面体DNA的具体DNA链碱基序列如表1所列。
组装底座四面体DNA前,先进行了TCEP去双硫键实验,按单条DNA链终浓度10 μM及DNA:TCEP = 1:1000的比例混匀过夜,避免因形成双硫键而影响组装。
组装底座四面体DNA和捕获四面体DNA的单链按终浓度按1 μM混匀,95℃,5 min退火,并自然降温至室温以自组装形成DNA四面体结构。
接着按底座四面体DNA:捕获四面体DNA = 1:1.2的比例混合并加入1 μM的Capture链和1 μM的Zn酶底物-连接链进行共孵育,以形成双四面体DNA探针。
第四步、吸取20 μL 1 μM的双四面体DNA探针滴加到银纳米棒阵列基底上PDMS小孔内,湿盒(80%湿度)中孵育2 h,以构建基于银纳米棒阵列基底的用于循环肿瘤细胞检测的固相芯片,超纯水清洗3次。
实施例2 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片的工作机制表征
1、对实施例1所制备用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片进行工作机制表征。如图2中(b)所示,构建好的双四面体DNA探针通过底座四面体DNA底面上的3个巯基与银共价结合而固定到银纳米棒表面,形成具有纳米粗糙表面特征的生物识别界面。
实施循环肿瘤细胞捕获和释放时,首先,将Zn离子响应型DNAzyme-适配体链(可特异靶向结合细胞表面膜蛋白)与循环肿瘤细胞(人源胃癌细胞SGC-7901作为分析模型)共孵育,通过适配体与细胞表面蛋白特异性结合而修饰到循环肿瘤细胞表面。
之后,将目标循环肿瘤细胞与芯片共孵育,利用Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链和Zn离子响应型DNAzyme-适配体链的特异性互补杂交,将样品中的循环肿瘤细胞捕获,实现循环肿瘤细胞的捕获和分离。
释放时,Zn离子切割Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链,杂交双链结构被破坏,实现循环肿瘤细胞的高效、无损释放。
与此同时,基于荧光信号变化来进行循环肿瘤细胞检测计数。
2、芯片用于循环肿瘤细胞捕获释放机制验证。
图3中(a)为凝胶电泳表征,1泳道为Marker(20 bp),2至4号泳道分别显示了Capture、Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链和Zn离子响应型DNAzyme-适配体链的PAGE凝胶电泳条带。5号泳道的条带位置表明Capture和Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链可杂交。6号泳道的条带位置表明Zn离子响应型DNAzyme-适配体链和Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链可杂交。7号泳道的条带表明Capture、Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链和Zn离子响应型DNAzyme-适配体链可杂交成一个大结构。与7号泳道相比,观察到8号泳道加入Zn离子后,出现与5号泳道条带位置一致的条带,证实Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链被切割而引起原形成的大结构被破坏,而留有部分底物链与Capture链杂交,同时释放出Zn离子响应型DNAzyme-适配体链。进一步加入核酸Key链后(核酸Key链的条带显示于泳道10),相比于8泳道,9泳道中可以清楚地看到原被破坏的大结构发生了进一步的分解,泳道中的成分对应于Zn离子响应型DNAzyme-适配体链、Capture链和破坏后留有的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链与置换链杂交结构。由胶图表征结果可知,所设计的基于Zn酶响应探针的捕获和剪切释放机制可行。
3、芯片捕获及释放循环肿瘤细胞性能表征。
为便于表征纳米生物界面的性能,实验之前先对SGC-7901进行染色(绿色)。如图3中(b)显示纳米生物界面本身无荧光亮点,在捕获细胞之后界面上出现大量绿色荧光点(图3中(c)),之后加入Zn离子进行细胞释放,绿色荧光点的大量减少(图3中(d)),目标细胞被有效被释放。
实施例3 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片细胞捕获性能表征
1、在确保Zn离子响应型DNAzyme-适配体链相对于细胞数目过量的情况下,将Zn离子响应型DNAzyme-适配体链与目标细胞SGC-7901共孵育以得到Zn离子响应型DNAzyme-适配体链标记的SGC-7901细胞。
2、将芯片与Zn离子响应型DNAzyme-适配体链结合的SGC-7901细胞共孵育,实施细胞的捕获与分离。为了确定最佳的细胞捕获时间,实验研究了0~50 min不同孵育时间纳米生物界面的细胞捕获性能。图4中(a)为0~50 min捕获细胞的荧光成像表征,图4中(b)为对应的捕获效率统计,随孵育时间增加,SGC-7901细胞的捕获效率随捕获时间的增长而提高,孵育40 min后,捕获效率可以达到约90%且不再发生明显上升,因此最佳的细胞捕获时间为40 min。
3、细胞捕获效率(Capture yield)的计算依据公式(1)。
其中,n是实际被捕获在基底上的细胞数目,N是被加入到基底上的细胞总数。
将不同数目的SGC-7901细胞分散在PBS缓冲溶液中进行细胞捕获效率表征,结果如图5所示,捕获效率达到约90%。
以更复杂且接近实际样品的血清环境中进行同样的捕获效率探究(将不同数目的SGC-7901细胞分散在10%人血清中),结果也统计在图5中,此时尽管背景更为复杂,但捕获效率仍可达到约84%,且对于不同SGC-7901细胞数目的血清样品,捕获效率较为稳定,研究结果为开展实际样本的分析提供了依据。
实施例4 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片细胞增强捕获性能及特异性研究
1、该芯片具有特殊的纳米表面结构和界面生物功能化修饰,能够协同纳米粗糙表面和生物亲和效应,提高细胞捕获效率。为探究粗糙银纳米棒阵列基底与具有3个Zn酶响应探针(T,图6中(j))的固相芯片用于循环肿瘤细胞增强捕获性能表征,选择由光滑银膜构建的纳米生物界面和修饰1个Zn酶响应探针(S,图6中(k))作为参照,在相同条件下实施细胞捕获,结果如图6所示。
通过比较光滑银膜和银纳米棒纳米结构,同样修饰有四面体DNA探针时,银纳米棒纳米生物界面(Ag NRs(T))的细胞捕获效率更高,达到了91.08%(图6中(a)),而修饰四面体的光滑银膜界面(Ag film(T))上只有32.68%的捕获效率(图6中(b)),纳米生物界面捕获效率是光滑银膜生物界面的2.79倍(图6中(h)),表明银纳米棒粗糙结构与细胞的交互作用可以增强对SGC-7901细胞的捕获。但修饰单四面体DNA探针时,由于捕获末端的减少(由四面体DNA探针的3个捕获端减为单四面体DNA探针的1个捕获端),单四面体修饰的银纳米棒界面(Ag NRs(S))捕获效率只有61.93%(图6中(c)),四面体DNA探针可以提供更多的捕获端,可使得捕获效率提升1.47倍(图6中(h))。
需要指出的是,未经任何修饰的银纳米棒(Ag NRs(N))基于纯物理吸附作用而缺少底物链与酶链的特异性结合,捕获的SGC-7901细胞极少(图6中(d))。
2、为研究基底对不同细胞的特异性捕获,选择LO2、Hela和MDA-MB-231细胞作为对照组。通过荧光成像表征,图6中(a)、(e)、(f)、(g)分别是固相芯片对不同细胞的捕获数据,各组的捕获效率统计于图6中(i)。结果显示,该固相芯片仅对SGC-7901细胞有捕获效果,而对其它细胞几乎无法实现捕获,证明所设计的四面体DNA探针可以实现SGC-7901细胞的特异性捕获,且对其它细胞有很好的抗干扰性能,表明所提出的四面体DNA探针不仅可以提供更多的捕获端,还可以实现纳米结构表明的非特异性封闭,有效减弱非特异性吸附。
3、图7为银纳米棒纳米生物界面(Ag NRs)和银光滑薄膜(Ag film)捕获细胞后的SEM表征结果。图7中(a)中可见细胞表面纳米尺度成分(微绒毛和丝状足等)与银纳米棒之间有明显的交互作用,放大的图中细胞表面的伪足等成分与银纳米棒之间的结合被清晰地展示出来,更多的层状脂膜渗出,表明银纳米棒与细胞之间的粘附力相对较大。为了进一步展示这一个交互作用主要存在于粗糙纳米界面,光滑银膜作为参照,如图7中(b)所示,光滑银膜界面几乎观察不到上述交互作用,放大的图中也未呈现细胞表面伪足等成分与光滑银膜之间存在交互作用。
实施例5 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片细胞释放性能表征
1、按实施例3中的策略进行循环肿瘤细胞捕获后进行细胞释放。目标细胞被银纳米棒纳米生物界面捕获后通过Zn离子切割介导实现细胞释放。为确定最佳的细胞释放时间(Zn离子作用时间),表征了0~40 min释放时间下固相芯片上剩余细胞数目。如图8荧光成像和计数结果所示,随着释放时间的增加,SGC-7901细胞的释放效率随时间增长明显增加,30min后剩余细胞数目几乎不再发生变化,因此最佳的释放时间确定为30 min,此时释放效率可以达到约94%。
2、细胞释放效率(Release rate)的计算依据公式(2)。
其中,n是实际被捕获的细胞数目,m是释放后银纳米棒纳米生物界面上剩余细胞的数目。
结果呈现在图9中,PBS缓冲溶液环境中细胞的释放效率可以达到93.44%,血清环境中(将不同数目的SGC-7901细胞添加于10%血清中)释放效率可以达到91.44%。
3、循环肿瘤细胞的研究不仅仅局限在对细胞进行分离捕获并计数,同时,细胞层面的分析对于癌症的转移机制研究也具有极大的指导意义,因此高效率的无损释放十分必要。对释放后细胞的活性进行了进一步分析。细胞释放后被重新培养,刚被释放时细胞呈悬浮状态,每天对其更换培养液,1~4天内细胞呈现出增殖生长状态,不同培养天数后细胞的显微图像如图10中(a)-(g)所示,可见仍然具有很好的细胞活性,并且在经过多次传代后细胞仍可以正常生长,说明本发明所提出的无损释放策略可以很大程度上保留细胞的活性,不对其产生伤害。此外,通过活死细胞染色(AM/PI染色)进一步验证了细胞的活性,对于刚释放的细胞,共聚焦荧光显微镜下活细胞呈现绿色,而死细胞则是红色(如图10中(h)),可见绝大数细胞呈现较好的存活状态。细胞活性(Cell viability)依据公式(3)计算,
其中,s是活细胞数目,t是死细胞的数目。经过计算,被释放的细胞的活性可以达到约98%。
实施例6 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片的循环使用表征
芯片用于细胞捕获和释放后,其表界面上捕获端会残留Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链被切割后的剩余部分序列,此时加入核酸Key链,借助核酸Key链与剩余部分序列的特异性杂交能力,互补结合后将从四面体DNA探针上脱落,清洗后进一步将固相芯片与新加入的Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链共培养,该芯片将重新具备细胞捕获及释放能力。对此,细胞捕获策略参照实施例3和释放策略参照实施例5,重复进行4次,图11中(a)为每次细胞捕获和释放后的荧光图像,图11中(b)汇总了每次的捕获和残留效率,可看出在经过4次循环使用后,其仍可有效工作,第4次时目标细胞捕获效率可达到约85.2%,表面本发明所提出的固相芯片能够具有较好的循环使用性能,在实际使用中可以有效降低使用成本。
实施例7 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片在以白细胞为背景的捕获、释放性能表征
循环肿瘤细胞存在于癌症病人的外周血中,1 mL的血液中有大量的血细胞,主要为白细胞和红细胞,其中白细胞约为106个,白细胞约为109个,而经过对血样的预处理,大量红细胞可以被清除,因此实际检测时,白细胞将是主要背景细胞。鉴于此,我们通过对人全血进行处理提取出白细胞,并将其与目标细胞SGC-7901混合后(白细胞浓度为5×106 个/mL)进行细胞捕获和释放实验以验证银纳米棒纳米生物界面对实际样本的处理能力。
图12中(a)呈现了不同数目(5、10、25、50和100个)SGC-7901细胞分散在白细胞中时的捕获效率,可达到约83.8%。进一步分析了白细胞被非特异性捕获的情况,并与SGC-7901细胞的捕获效率进行比较,结果如图12中(b)所示,白细胞的非特异性捕获效率仅为0.522%,与目标细胞的捕获效率相比可以忽略不计。同样白细胞为背景时,研究了目标细胞的释放,其结果统计在图12中(c)中,释放效率可达到91.2%。以上结果证明本发明所提出的捕获、释放SGC-7901细胞的策略在白细胞为背景时仍具有很好的工作性能,表明此策略在实际血液样本检测时具有很好的可行性。
实施例8 用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片的细胞检测计数表征
1、为方便检测计数,我们在Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链的5'端修饰ROX分子,即作为荧光探针。如图13所示,Zn离子响应性切割Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链放细胞时,ROX分子会随着链被切割而后游离到溶液中,从而达到荧光“on”的信号输出。
2、PBS缓冲溶液下,不同数目(0、1、5、10、25、50和100个)SGC-7901细胞被释放后上清溶液607 nm处的荧光信号值与对应的细胞数目经拟合后呈现一个良好的线性关系,工作曲线为I 607 = -4.83 + 9.96 × Nc(图14中(b)),以blank荧光信号强度值的3倍标准偏差与拟合工作曲线的斜率的比值来定义检测限,经计算其可以实现对1个细胞的检测。同样考虑应用到实际病人血液样本,在实验室环境下,选择以白细胞为背景进行荧光检测以验证其实际应用能力。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种用于循环肿瘤细胞检测的固相芯片及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> A1-SH(Artificial Sequence)
<400> 1
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> B1-SH(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> C1-SH(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> D1(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaaaaaaaa aaaaaaaaac attcctaagt ctgaaacatt acagcttgct acacgagaag 60
agccgccata gta 73
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> A2(Artificial Sequence)
<400> 5
tacagtcgta ttgcattccg tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat 60
gcgagggtcc aatac 75
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> B2(Artificial Sequence)
<400> 6
tacagtcgta ttgcattccg tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta 60
ctatggcggc tcttc 75
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> C2(Artificial Sequence)
<400> 7
tacagtcgta ttgcattccg ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt 60
attggaccct cgcat 75
<210> 8
<211> 73
<212> DNA
<213> D2(Artificial Sequence)
<400> 8
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagtaggttt 60
tttttttttt ttt 73
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Capture(Artificial Sequence)
<400> 9
tacagtcgta ttgcattccg 20
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链(Artificial Sequence)
<400> 10
gagaggaatg caatacgact gtacctgatg cagacgttga aggatacct 49
<210> 11
<211> 74
<212> DNA
<213> Zn离子响应型DNAzyme-适配体(Artificial Sequence)
<400> 11
gatctctctc tgccctaagt ccgcacccgt gcttccctgt tttttaggta tctagttgag 60
ctgtctgcat cagg 74
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 核酸Key链(Artificial Sequence)
<400> 12
tcaacgtctg catcaggtac agtcgtattg cattcctctc 40
Claims (3)
1.用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片,其特征在于,所述芯片包含双四面体DNA探针、银纳米棒阵列基底、Zn离子响应型DNAzyme-适配体链和核酸Key链;双四面体DNA探针组装到银纳米棒基底,形成具有纳米粗糙表面特征的生物识别界面,所述的肿瘤细胞是人源胃癌细胞SGC-7901;所述双四面体DNA探针由4部分构建,分别为底座四面体DNA、捕获四面体DNA,Carpture链以及Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链;是将底座四面体DNA和捕获四面体DNA混合孵育形成双四面体DNA结构,进一步与Carpture链及Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链共孵育,形成具有3个细胞识别端的双四面体DNA探针;
其中,底座四面体DNA由四条单链DNA,即巯基修饰的A1、巯基修饰的B1、巯基修饰的C1和D1自组装形成;组装形成的底座四面体DNA底面三个顶角修饰有巯基,顶端延伸出一段碱基序列;
捕获四面体DNA由单链DNA A2、B2、C2、D2自组装形成,一个顶角处延伸出一段与底座四面体顶端延伸出的碱基序列互补的碱基序列,另外三个顶角上均延伸出一段相同的碱基序列能与Capture链部分碱基互补杂交;
Capture链剩余部分碱基序列能与Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链部分碱基序列互补杂交;
所述的银纳米棒阵列基底为利用真空蒸发斜角沉积法在玻片表面形成阵列型排布的银纳米棒,玻片表面具有纳米粗糙特征;
双四面体DNA探针通过底座四面体上的3个巯基与银形成Ag-S共价键而组装到银纳米棒表面,构建得到具有纳米粗糙特征的生物识别界面;
上述用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片是基于以下方法制得的:
1)组装底座四面体DNA:将3条单链A1-SH、B1-SH、C1-SH用TCEP试剂除去双硫键后与D1链等物质的量混合,组装形成三维立体结构的四面体DNA;
2)组装捕获四面体DNA:将4条DNA单链A2、B2、C2、D2等物质的量混合,经退火处理得到四面体DNA;
3)形成双四面体DNA:将底座四面体DNA探针和捕获四面体DNA探针按1:1~1:1.3的比例混合,在25~37℃共孵育3~5 h,制得双四面体DNA结构;
4)制备双四面体DNA探针:双四面体DNA与Capture链比例为1:2.8~1:3.5,以及双四面体DNA与荧光分子标记的Zn酶底物-连接链比例为1:2.8~1:3.5将四面体DNA和Capture链及Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链混合,在25~37℃共孵育3~5 h,双四面体DNA探针;
5)双四面体DNA探针修饰银纳米棒:浓度为0.8~1.2 μM的双四面体DNA探针与银纳米棒基片共孵育,双四面体DNA探针经由Ag-S共价键组装到银纳米棒基底,形成具有纳米粗糙表面特征的生物识别界面,孵育温度为25~37℃,时间为1~3 h;经去离子水冲洗,制得用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片;
所述的银纳米棒基片是采用斜角沉积法蒸发镀膜技术制备获得。
2.权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片的应用,其特征在于,步骤如下:
1)将Zn离子响应型DNAzyme-适配体链与待检测样品共孵育35~45 min,通过适配体与待检测样品中的目标细胞的膜蛋白特异性结合而绑定到循环肿瘤细胞表面,所述的Zn离子响应型DNAzyme-适配体链为过量;
2)将步骤1)中含有待测目标循环肿瘤细胞的样品溶液滴加到芯片上共孵育40~50min,利用Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链和Zn离子响应型DNAzyme-适配体链的特异性互补杂交,将样品中的循环肿瘤细胞捕获;
3)将步骤2)孵育后的芯片去离子水冲洗,进行荧光成像,基于荧光图像计数被捕获目标细胞数目;
4)将步骤2)孵育后的芯片多次清洗后,加入含有Zn离子的PBS溶液共培养30~40 min,实现目标细胞的无损释放,释放时,Zn离子切割Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链,杂交双链结构被破坏,实现循环肿瘤细胞的高效、无损释放;
5)将步骤4)共培养后的芯片清洗后进行荧光成像,基于荧光图像计数基片上存留的目标细胞数目;
6)配置含有已知不同目标细胞数的待检测液,利用步骤1)-4)得到孵育后的上清液与清洗收集液,对收集液进行荧光光谱表征,得到目标细胞浓度对应的荧光光谱及其特征峰强度值,以目标细胞浓度为横坐标,以荧光特征峰强度值为纵坐标,做出荧光检测的工作曲线,根据信噪比S/N=3的判据,计算得到检测限;
7)对于任意待检测液,利用步骤1)-4)得到孵育后的收集液,根据收集液的荧光特征峰强度,对照工作曲线,计算得到收集液中目标细胞数目;
8)将步骤4)得到的芯片与核酸Key链共孵育,之后芯片与Zn离子响应型DNAzyme底物-连接链共孵育,重新获得具有纳米粗糙特征的生物识别界面,实现芯片的重复利用;所述的核酸Key链为过量,与芯片共孵育,温度为25~37℃,时间为3~5 h。
3.根据权利要求2所述的用于循环肿瘤细胞捕获、计数、无损释放的芯片的应用,其特征在于,所述步骤2)中待检测目标细胞的数目为50~2000个。
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