CN111334456A - 用于北方低温条件下秸秆腐解菌剂的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于北方低温条件下秸秆腐解菌剂的制备方法，其特征在于：将功能菌枯草芽杆菌、长枝木霉和嗜热毁丝霉分别在液体基础培养基中进行单独培养制备一级种子发酵液，然后在二级发酵培养基中进行二次发酵扩繁制备二级发酵液，将以上三种扩繁后的二级发酵液按1：1：1的比例混合，即为液体腐解菌剂；其是利用筛选获得低温功能菌进行农作物秸秆腐解菌剂制备并在北方室外温度零度以下进行腐解效果验证，属于农业生产实践中的植物营养与土地可持续利用领域。

Description

用于北方低温条件下秸秆腐解菌剂的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种用于北方低温条件下秸秆腐解菌剂的制备方法及应用，其是利用筛选获得低温功能菌进行农作物秸秆腐解菌剂制备并在北方室外温度零度以下进行腐解效果验证，属于农业生产实践中的植物营养与土地可持续利用领域。

背景技术

秸秆作为优质的生物质能可部分替代和节约化石能源，减少对化石能源的依赖。按热值测算，2吨秸秆相当于1吨标准煤，开发利用秸秆能源，可有效增加农村地区能源供应，改善能源结构，减少二氧化碳排放。二是秸秆含有丰富的有机质、氮磷钾和微量元素，是一种具有多用途和可再生的生物资源，也是农业生产重要的有机肥源。据测算，7亿吨秸秆中含氮350万吨、磷80万吨、钾800万吨，相当于2010年全国化肥施用总量的五分之一左右。三是秸秆纤维是一种天然纤维素纤维，生物降解性好，可替代木材用于造纸、生产板材、制作工艺品、生产活性炭等，节约大量木材，保护宝贵的森林资源。四是秸秆含有丰富的营养物质，4吨秸秆的营养价值相当于1吨粮食，可为畜牧业持续发展提供物质保障。这为秸秆的综合利用提供了十分重要的理论意义。

国内也有关于秸秆腐解菌剂研制与应用相关报道，四川乐山师范学院研制发明了一种秸秆腐解菌剂及其应用，其主要活性成分是由黑曲霉、拟康氏木霉、鲜绿青霉、解木聚糖梭菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌能成。其效果可使小麦和水稻秸秆的腐解率在15 天达到60.1%。

车团结、车锐发明的一种秸秆腐熟剂及其制备和应用，其特点是能有效降解秸秆细胞壁中存在的果胶、多糖-多糖复合物和木质素多糖复合物，成为游离的多糖，增加进一步降解的程度和速度；腐熟剂的制备方法简单实用，菌剂活性好，产酶量高，制备的秸秆有机肥营养物质丰富，有效改善土壤状况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于北方低温条件下秸秆腐解菌剂的制备方法及应用，其可以在北方低温条件下促进农作物秸秆的快速腐解，同时可以改善土壤物理性状、增加土壤有机质与土壤速效养分含量，实现农作物秸秆资源再利用，经济效益、社会效益和环境效益十分明显。

秸秆腐解剂含有大量的细菌、霉菌、酵母菌和芽孢杆菌等，是一种高效微生物制剂，秸秆腐解剂中的微生物大量繁殖能够有效地将作物秸秆分解，具有改良土壤团粒结构、提高土壤通气性和保肥保水性以及改善土壤养分状况的功能，同时微生物活动产生的热量和一定量的二氧化碳能够改善植物的生长环境并促进秸秆的有效利用；因此，筛选、分离适宜北方低温、干旱气候条件下，高效快速降解纤维素酶和木质素的高酶活性菌株，进行秸秆低温快速转化微生物菌剂与酶制剂的研制以及田间应用调控技术研究是解决东北地区主要农作物秸秆综合利用的重要科学问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种用于北方低温条件下秸秆腐解菌剂的制备方法，其特征在于：将功能菌枯草芽杆菌、长枝木霉和嗜热毁丝霉分别在液体基础培养基中进行单独培养制备一级种子发酵液，然后在二级发酵培养基中进行二次发酵扩繁制备二级发酵液，将以上三种扩繁后的二级发酵液按1：1：1的比例混合，即为液体腐解菌剂；其具体步骤如下：

1、一级种子液制备

用接种环取活化后的斜面菌种1环，接种于盛有100 mL ~150 mL的基础培养基的三角瓶中，pH 5.8~7.2 、温度 28 ~37℃、150~180r/min 振荡培养24-36小时后获得的发酵液即为一级种子发酵液；

分别制备细菌（LB）和真菌（PDB）液体种子合成培养基，然后将液体培养基放入高压灭菌锅121℃灭菌30 min，冷却后分别在LB培养基中接入枯草芽孢杆菌，在PDB培养基中接入长枝木霉和嗜热毁丝霉，依据细菌和真菌的发酵工艺设置不同的发酵参数，发酵培养后即得液态种子，即一级种子液；

表 1 制备一级种液培养基配方及培养条件

2、二级种子发酵液的制备

取振荡培养后的一级种子液，以0.5%的接种量接入到发酵培养基中，在大型发酵设备进行二次发酵培养（扩繁培养），即得二级种子培养液，二级发酵培养基配方及发酵条件见表2；

表 2 制备二级种液培养基配方及培养条件

二级发酵液选用的培养基是用玉米加工厂的废弃物质—玉米浆做为氮源代替发酵母粉或者牛肉膏，在生产上应用可以节约成本50%以上；

3、液体复合腐熟剂的制备

将发酵好的枯草芽孢杆菌、长枝木霉和嗜热毁丝霉二级种子液按照1:1:1的比例进行混合，即为液体复合腐熟剂。

所述的秸秆腐解菌剂在北方低温条件下对玉米、水稻秸秆腐解的应用。

本发明的积极效果是在北方低温条件下促进农作物秸秆的快速腐解，同时可以改善土壤物理性状、增加土壤有机质与土壤速效养分含量。 1、秸秆腐解菌剂堆腐过程中的温度变化

1.1单株功能菌对玉米秸秆的腐解效果

为了验证秸秆腐解菌对玉米秸秆的腐解效果，2018年3月在野外布置了牛粪与秸秆堆腐试验，试验设置了3个处理，即不接菌的对照处理、长枝木霉、嗜热毁丝霉。连续11天测定了温度变化情况，结果表明，不同种类的菌剂温度变化差异明显，在第5天接菌的长枝木霉温度就持续稳定在了40 ℃以上，嗜热毁丝霉在第7天达到40 ℃。而不接菌的对照温度一直在20 ℃左右。测定时的气温为1 ℃日，整个测试期间的气温为 -4 ℃~10 ℃（图 1）。

1.2 复合功能菌对玉米、水稻秸秆的腐解效果

2019年6月1日，在吉林省前郭县宝甸乡进行了秸秆腐解菌剂对玉米、水稻秸秆腐解效果的堆腐试验，每天固定时间在上午9：00连续监测了堆腐过程温度变化。结果表明，在堆腐的第2天6个处理的温度已经上升到45 ℃以上，接种腐解菌剂的处理测试温度低于没有接种菌剂的处理。但是到第5天水稻秸秆接种不同剂型菌剂的处理温度都上升到58 ℃以上，玉米秸秆接种固体菌剂的处理温度已经达到65℃，接种液体菌剂的处理也达到了63℃。而后随着发酵时间的延长，堆腐温度维持在60℃左右波动，一直发酵到33天的时候温度也没有表现出下降的趋势，而此时玉米和水稻秸秆的腐率率已经达到80%以上（图2、图3）。

1.3复合功能菌在低温条件下对玉米、水稻秸秆的腐解效果

2019年11月11日，在吉林省长春市合隆镇进行了秸秆腐解菌剂对玉米、水稻秸秆腐解效果的堆腐试验，每天固定时间在上午7：00连续监测了堆腐过程温度变化。结果表明，在堆腐的第2天玉米和水稻秸秆配合牛粪接种腐解菌剂的处理的温度已经上升到50 ℃以上，而后一直维持在这个温度上下波动。尤其是水稻秸秆接种液体和固体菌剂温度明显高于没有接种的对照处理。而此时正值严冬，室外温度最低已经达到的-18℃，说明本产品在北方低温条件下也能存活，并具有较强的活性（图4、图5）。

2、秸秆腐解菌剂对玉米秸秆降解率的影响

分别在玉米秸秆深翻和旋耕模式下施用了不同种类的秸秆腐解菌剂，在玉米关键物候期取样测定玉米秸秆腐解率。结果表明，玉米秸秆在深翻还田模式下接种腐解菌剂的腐解率为85.5%，比市面销售的产品提高7.82%，比不接菌剂的秸秆处理提高了8.16%。玉米秸秆在旋耕还田模式下接种腐解菌剂的腐解率达到94.05%，比不接菌剂的秸秆处理提高了17.01%，而比市面销售的产品提高3.18%。说明该产品的腐解效果除了本身配方的影响之外，在很大程度上还会受到到环境条件的影响。这也是生物制剂产品的一个缺点，因为其本身是活体制剂，对环境条件的要求会敏感很多（图6）。

3、施用秸秆腐解菌剂土壤养分含量的影响

3.1 施用秸秆腐解菌剂对土壤速效养分的影响

3.1.1施用秸秆腐解菌剂对土壤硝态氮和铵态氮含量的影响

秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对土壤硝态氮影响的研究结果表明，在深翻模式下施用腐解菌剂的土壤硝态氮含量高于市面上同类产品和单施秸秆不施菌剂的处理，但提高幅度不是很大。在旋耕模式下施用腐解菌剂土壤硝态氮含量比市面同类产品提高3.8%，比单施秸秆不施菌剂提高8.79%，腐解菌剂也表现了较好的效果。在混拌模式下施用腐解菌剂土壤硝态氮含量比市面同类产品提高20.29%，比单施秸秆不施菌剂提高30.28%，腐解菌剂表现出了极好的效果。充分体现了该产品改善土壤硝态氮养分含量状况的功能（图 7）。

秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对土壤铵态氮影响的研究结果表明，在深翻模式下施用腐解菌剂土壤铵态氮含量高于市面上同类产品6.16%，比单施秸秆不施菌剂的处理提高8.63%。在旋耕模式下施用腐解菌剂土壤铵态氮含量比市面同类产品提高幅度不大，但比单施秸秆不施菌剂提高12.21%。混拌模式下施用腐解菌剂土壤铵态氮含量比市面同类产品提高2.61%，比单施秸秆不施菌剂提高21.23%。说明腐解菌剂对于改善土壤铵态氮含量也有积极的作用（图 8）。

3.1.2 施用秸秆腐解菌剂对土壤速效磷和速效钾含量的影响

秸秆不同还田模式下田施用腐解菌剂对土壤速效磷含量影响的研究结果表明，在深翻模式下施用腐解菌剂土壤速效磷含量与市面同类产品相比提高幅度达到3.23%，与单施秸秆处理相比提高幅度为5.83%。在旋耕模式下施用腐解菌剂土壤速效磷含量比市面同类产品提高4.25%，比单施秸秆不施菌剂提高9.63%。混拌模式下施用腐解菌剂土壤速效磷含量比市面同类产品提高6.59%，比单施秸秆不施菌剂提高19.15%。再次说明腐解菌剂对于改善土壤养分含量的作用（图 9）。

秸秆不同还模式下田施用腐解菌剂对土壤速效钾含量影响的研究结果表明，在深翻模式下施用腐解菌剂土壤速效钾含量与市面同类产品相比提高幅度达到4.98%，与单施秸秆处理相比提高幅度为6.20%。在旋耕模式下施用腐解菌剂土壤速效钾含量比市面同类产品提高2.63%，比单施秸秆不施菌剂提高4.20%。混拌模式下施用腐解菌剂土壤速效钾含量比市面同类产品提高3.96%，比单施秸秆不施菌剂提高6.06%。说明腐解菌剂对于改善土壤速效钾含量也有积极的促进作用（图 10）。

3.1.3施用秸秆腐解菌剂对土壤有机质含量的影响

秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对土壤有机质含量影响的研究结果表明，在深翻模式下施用腐解菌剂土壤有机质含量与市面同类产品相比提高幅度达到16.92%，与单施秸秆处理相比提高幅度为9.89%。在旋耕模式下施用腐解菌剂土壤有机质含量比市面同类产品提高15.01%，比单施秸秆不施菌剂提高3.92%。混拌模式下施用腐解菌剂土壤有机质含量比市面同类产品提高10.07%，比单施秸秆不施菌剂提高5.77%。说明腐解菌剂对于提高土壤有机质含量的效果特别明显，这也本专利的创新之处。（图 11）。

4、施用秸秆腐解菌剂对玉米生物量和产量的影响

4.1施用秸秆腐解菌剂对玉米生物量的影响

秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对玉米生物量影响的研究结果表明，在深翻模式下施用腐解菌剂玉米生物量与市面同类产品相比提高幅度达到8.11%，与单施秸秆处理相比提高幅度为14.67%。在旋耕模式下施用腐解菌剂玉米生物量比市面同类产品提高8.95%，比单施秸秆不施菌剂提高9.87%。混拌模式下施用腐解菌剂玉米生物量比市面同类产品提高1.24%，比单施秸秆不施菌剂提高8.35%。说明腐解菌剂的施用对于提高玉米植物生物量也有促进作用（图 12）。

4.2施用秸秆腐解菌剂对玉米产量的影响

秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对玉米产量影响的研究结果表明，在深翻模式下施用腐解菌剂玉米生物量与市面同类产品相比提高幅度达到4.27%，与单施秸秆处理相比提高幅度为4.63%。在旋耕模式下施用腐解菌剂玉米生物量比市面同类产品提高7.84%，比单施秸秆不施菌剂提高8.82%。混拌模式下施用腐解菌剂玉米生物量比市面同类产品提高9.59%，比单施秸秆不施菌剂提高14.7%。说明腐解菌剂的施用能够明显提高玉米产量（图13）。

附图说明

图1玉米秸秆接种不同剂型功能菌腐解过程的温度变化示意图。

图2为玉米、水稻秸秆堆腐过程温度变化示意图。

图3为玉米、水稻堆腐33天的腐解效果图。

图 4 水稻秸秆低温堆腐过程中的温度变化示意图。

图 5玉米秸秆低温堆腐过程中的温度变化示意图。

图6为深翻和旋耕还田模式下玉米秸秆接种腐解菌剂的腐解率示意图。

图7为秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对土壤硝态氮含量影响示意图。

图8为秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对土壤铵态氮含量影响示意图。

图9为秸秆不同还模式下田施用腐解菌剂对土壤速效磷含量影响示意图。

图10为秸秆不同还模式下田施用腐解菌剂对土壤速效钾含量影响示意图。

图11为秸秆不同还田模式下施用秸秆腐解菌剂对土壤有机质含量的影响示意图。

图12为秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对玉米生物量影响示意图。

图13为秸秆不同还田模式下施用腐解菌剂对玉米产量影响示意图。具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1

细菌（枯草芽孢杆菌）一级种子发酵液的制备：制备细菌（LB）液体合成培养基（蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠5 g/L、pH 7.0）100 mL盛于 250mL三角瓶中，然后将液体培养基放入高压灭菌锅 121℃灭菌 30 min，冷却后分别接入活化后斜面保存的枯草芽孢杆菌，于28~35℃、150~180r/min 振荡培养24-36小时，即得一级种子发酵液。

实施例2

细菌（枯草芽孢杆菌）二级种子发酵液的制备：制备细菌液体合成培养基（葡萄糖20 g/L、玉米浆 10 ml/L、硫酸镁 0.2 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、柠檬酸钠 0.1 g/L、pH 6.8~7.2）投放于大型发酵设备， 121℃高压灭菌 30 min，冷却后按 0.5% 的接种量接入实施例1所述的一级种子发酵液进行二次发酵培养（扩繁培养）于28~35℃、150~180r/min 培养24-36小时，即得二级种子发酵液。

实施例 3

真菌（长枝木霉）一级种子发酵液的制备：制备真菌（PDB）液体马铃薯合成培养基（马铃薯浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L、 pH 5.8~6.2）100 mL 盛于 250mL三角瓶中，然后将液体培养基放入高压灭菌锅 121℃灭菌 30 min，冷却后分别接入活化后斜面保存的长枝木霉，于32~37℃、150~180r/min 振荡培养24-36小时，即得一级种子发酵液。

实施例 4

真菌（长枝木霉）二级种子发酵液的制备：制备真菌液体发酵培养基（葡萄糖15 g/L、红糖 5 g/L、玉米浆 10 ml/L、硫酸镁 0.2 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、吐温80 1 g/L、pH 5.8~6.2）投放于大型发酵设备， 121℃高压灭菌 30 min，冷却后按 0.5% 的接种量接入实施例3所述的一级种子发酵液进行二次发酵培养（扩繁培养）于32~37℃、150~180r/min 培养24-36小时，即得二级种子发酵液。二级发酵液选用的培养基是目前生产上应用较少的配方，其特点是用玉米加工厂的废弃物质—玉米浆做为氮源代替发酵母粉或者牛肉膏，在生产上应用可以节约成本50%以上。

实施例 5

真菌（嗜热毁丝霉）一级种子发酵液的制备：制备真菌（PDB）液体马铃薯合成培养基（马铃薯浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、pH 5.8~6.2）100 mL 盛于 250mL三角瓶中，然后将液体培养基放入高压灭菌锅 121℃灭菌 30 min，冷却后分别接入活化后斜面保存的嗜热毁丝霉，于32~37℃、150~180r/min 振荡培养24-36小时，即得一级种子发酵液。

实施例 6

真菌（嗜热毁丝霉）二级种子发酵液的制备：制备真菌液体发酵培养基（葡萄糖15 g/L、红糖 5 g/L、玉米浆 10 ml/L、硫酸镁 0.2 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、吐温80 1 g/L、 pH5.8~6.2）投放于大型发酵设备， 121℃高压灭菌 30 min，冷却后按 0.5% 的接种量接入实施例3所述的一级种子发酵液进行二次发酵培养（扩繁培养）于32~37℃、150~180r/min 培养24-36小时，即得二级种子发酵液。二级发酵液选用的培养基是目前生产上应用较少的配方，其特点是用玉米加工厂的废弃物质—玉米浆做为氮源代替发酵母粉或者牛肉膏，在生产上应用可以节约成本50%以上。

实施例 7

液体复合腐熟剂的制备：将实施例2、实施例4和实施例 6所述的二级种子液按照1:1:1的比例进行混合，即为液体复合腐熟剂。液体复合腐熟剂技术指标符合表3的要求。

表 3 液体复合菌剂的技术指标

实施例 8

腐解菌剂的堆腐时间及使用方法：在北方玉米收获后时间大概在9月末10月初旬进行堆腐，经历一个冬季的腐解第二年接种前使用。方法是将粉碎后的秸秆与畜禽粪便按照体积1:1配比进行叠堆。每15 cm -25 cm厚度为1层，按照秸秆—腐熟菌剂—尿素—畜禽粪便的顺序进行叠堆。

技术参数：（1）整堆物料含水量控制在60%-65%之间。（2）堆腐高度为2 m-2.5 m之间。（3）腐熟菌剂用量为秸秆重量的0.25%，尿素用量为秸秆重量的0.5%。

实施例 9

单株功能菌腐解玉米秸秆过程中的温度变化：2018年3月在野外布置了牛粪与秸秆堆腐试验，试验设置了3个处理，不接菌的对照处理、长枝木霉、嗜热毁丝霉。连续11天测定了温度变化情况，结果表明，不同种类的菌剂温度变化差异明显，在第5天接菌的长枝木霉温度就持续稳定在了40 ℃以上，嗜热毁丝霉在第7天达到40 ℃。而不接菌的对照温度一直在20 ℃左右。测定时的气温为1 ℃日，整个测试期间的气温为 -4 ℃~10 ℃（图1）。

实施例 10

复合功能菌腐解玉米、水稻秸秆过程中的温度效果：2019年11月11日，在吉林省长春市合隆镇进行了秸秆腐解菌剂对玉米、水稻秸秆腐解效果的堆腐试验，每天固定时间在上午7：00连续监测了堆腐过程温度变化。结果表明，在堆腐的第2天玉米和水稻秸秆配合牛粪接种腐解菌剂的处理的温度已经上升到50 ℃以上，而后一直维持在这个温度上下波动。尤其是水稻秸秆接种液体和固体菌剂温度明显高于没有接种的对照处理。而此时正值严冬，室外温度最低已经达到的-18℃，说明本产品在北方低温条件下也能存活，并具有较强的活性（图4、图5）。

Claims (2)

1.用于北方低温条件下秸秆腐解菌剂的制备方法，其特征在于：将功能菌枯草芽杆菌、长枝木霉和嗜热毁丝霉分别在液体基础培养基中进行单独培养制备一级种子发酵液，然后在二级发酵培养基中进行二次发酵扩繁制备二级发酵液，将以上三种扩繁后的二级发酵液按1：1：1的比例混合，即为液体腐解菌剂；其具体步骤如下：

1）一级种子液制备

用接种环取活化后的斜面菌种1环，接种于盛有100 mL ~150 mL的基础培养基的三角瓶中，pH 5.8~7.2 、温度 28 ~37℃、150~180r/min 振荡培养24-36小时后获得的发酵液即为一级种子发酵液；

分别制备细菌（LB）和真菌（PDB）液体种子合成培养基，然后将液体培养基放入高压灭菌锅121℃灭菌30 min，冷却后分别在LB培养基中接入枯草芽孢杆菌，在PDB培养基中接入长枝木霉和嗜热毁丝霉，依据细菌和真菌的发酵工艺设置不同的发酵参数，发酵培养后即得液态种子，即一级种子液；制备一级种液培养基配方及培养条件如下：

2）二级种子发酵液的制备

二级发酵液选用的培养基是用玉米加工厂的废弃物质—玉米浆做为氮源代替发酵母粉或者牛肉膏，其制备方法如下：

取振荡培养后的一级种子液，以0.5%的接种量接入到发酵培养基中，在大型发酵设备进行二次发酵培养，扩繁培养即得二级种子培养液，二级发酵培养基配方如下：

3）液体复合腐熟剂的制备

将发酵好的枯草芽孢杆菌、长枝木霉和嗜热毁丝霉二级种子液按照1:1:1的比例进行混合，即为液体复合腐熟剂。

2.秸秆腐解菌剂在北方低温条件下对玉米、水稻秸秆腐解的应用。

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