CN111334442A - 一株耐高温的酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株耐高温的酿酒酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，公开了一株用于生产工业液体燃料乙醇的耐高温酿酒酵母菌株及其应用。本发明所述耐高温的酿酒酵母菌株S.C HR，其保藏编号为CGMCC No.16831。本发明所述耐高温的酿酒酵母菌株在高温下的发酵各项指标均达到目前工业生产使用商业酿酒酵母菌株正常控温条件下的指标要求。与对照菌株相比，本发明所述酿酒酵母菌菌株乙醇产量和细胞存活率均明显提高，色谱总糖含量、滴定过滤总糖含量以及甘油含量则明显降低，表明本发明所述酿酒酵母菌菌株可在不严格控温的条件下保证液体燃料乙醇生产的稳定性，提高乙醇生产效率，降低生产成本，适合于工业乙醇的大规模生产。

Description

一株耐高温的酿酒酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及耐高温的酿酒酵母菌及其应用，尤其是涉及耐高温的酿酒酵母菌及其在发酵生产工业液体燃料乙醇中的应用和生产工业液体燃料乙醇的方法。
背景技术
液体燃料乙醇指以生物物质为原料通过生物发酵等途径获得的可作为燃料用的乙醇。液体燃料乙醇经变性后与汽油按一定比例混合可制车用乙醇汽油。燃料乙醇通常采用酿酒酵母发酵，酿酒酵母最适生长温度为30-32℃。在工业生产中随着菌株生产所产生的代谢热、机械搅拌热、***热等常导致发酵体系温度升高(时常可达35-37℃)，高温胁迫使得菌株的生产性能大幅下降。高温通常会引起酵母细胞内各种成分，如脂肪酸、磷脂、麦角固醇等的变化。而这些成分的变化反过来就会影响细胞本身正常的生理活动。从而表现出高温对酵母细胞有毒性，温度越高越容易引起酵母早衰、死亡。如能达到良好控温维持在32℃左右，全年可维持稳定生产。然而目前工业生产中均以自来水循环对发酵罐进行控温，随季节环境温度变化影响，很难实现稳定控温32℃左右，因此由于高温导致生产不稳定所带来的经济损失非常巨大。而耐高温酿酒酵母的开发及应用可实现在不严格控温的前提下保证燃料乙醇生产的稳定性，避免这部分经济损失。
由于微生物对发酵微环境的适应性是其长期进化的结果，也是细胞内决定其生化反应与代谢途径对发酵微环境变化适应的综合表现。而目前燃料乙醇发酵产业普遍采用间歇式发酵，使工业酿酒酵母失去了对发酵微环境长期适应性进化的机会，很难从现有发酵菌株中获得遗传性状稳定的正向突变株。因此利用真实发酵物料对筛选获得的菌株进行适配性驯化，以期望为现代燃料乙醇发酵工业获得高产、高效、对高温耐受性高的工业发酵菌株。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题提供耐高温的酿酒酵母菌株。
为实现本发明的目的本发明采用了如下技术方案。
本发明以中粮生化能源(肇东)有限公司连续发酵5代的酿酒酵母为出发菌株，为出发菌株，通过常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)诱变的方法，经两轮诱变、液化醪摇瓶发酵验证、工业物料小试验证和工业物料中试验证后获得耐高温的酿酒酵母菌。
本发明所述ARTP诱变为将中粮生化能源(肇东)有限公司连续发酵5代的酿酒酵母通过ARTP诱变后接种于工厂工艺水配制的YPD固体培养基中，40℃高温筛选，从第一轮诱变中选取生长及发酵性能较好的菌株进行第二轮的ARTP诱变。其中所述ARTP诱变方法的具体条件为：以氮气作为等离子体的工作气体，在电源功率300W，平台高度14mm，等离子体的温度＜35℃，湿度＞10％，气体流量12slpm，诱变方式A的条件下，分别将50μl制备的菌悬液滴于无菌金属槽内中心位置，分别进行等离子体照射20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s、200s、220s、240s、260s、280s、300s、320s、340s、360s、380s、400s。
本发明所述液化醪摇瓶发酵验证为将第二轮诱变后生长及发酵性能较好的7个菌株接种液化醪，37℃摇瓶发酵。
将液化醪摇瓶发酵验证选出的酿酒酵母菌进一步进行工业物料小试验证和工业物料中试验证，比较发酵液中的乙醇产量、色谱总糖含量、过滤总糖含量、细胞存活率、甘油含量等参数，最终确定耐高温、乙醇产量高的酿酒酵母菌菌株S.C HR。
本发明所述耐高温的酿酒酵母菌菌株S.C HR已于2018年11月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16831。
在一些实施方案中，本发明采用中粮生化能源(肇东)有限公司三期液化醪中试验证本发明所述酿酒酵母菌菌株发酵效果。实验表明，本发明所述酿酒酵母菌菌株高温下的发酵各项指标均达到目前液体燃料乙醇工业生产菌株正常控温条件下的指标要求。与对照菌株相比，本发明所述酿酒酵母菌菌株乙醇产量和细胞存活率均明显提高，色谱总糖含量、滴定过滤总糖含量以及甘油含量则明显降低，即本发明所述酿酒酵母菌菌株可在不严格控温的条件下保证燃料乙醇生产的稳定性，提高乙醇生产效率，降低生产成本，适合于工业液体燃料乙醇的大规模生产。因此本发明提供了保藏编号为CGMCC No.16831的酿酒酵母菌在发酵生产工业液体燃料乙醇中的应用。
本发明还提供了一种生产工业液体燃料乙醇的方法，发酵保藏编号为CGMCCNo.16831的耐高温的酿酒酵母菌获得工业液体燃料乙醇。
作为优选，所述发酵具体为将保藏编号为CGMCC No.16831的耐高温酿酒酵母接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物接种发酵培养基发酵。
其中，本发明所述生产工业乙醇的方法中，所述发酵培养基为液化醪。
本发明所述生产工业液体燃料乙醇的方法中可以在不严格控温的条件下进行。
作为优选，本发明所述生产工业液体燃料乙醇的方法中所述发酵的发酵条件为前12h，32℃；12-24h，温度最高不超过36℃；24-48h，维持温度不低于35℃；48-72h，32℃。
作为优选，本发明所述生产工业液体燃料乙醇的方法中，所述耐高温的酿酒酵母菌的接种量为：按扩繁后的培养物耐高温酿酒酵母浓度为0.125亿/ml计算，所述扩繁后的培养物接种量为16v/v％。
在一些实施方案中，本发明所述生产工业液体燃料乙醇的方法中，在发酵前还包括所述耐高温的酿酒酵母菌经过种子培养基扩大培养的步骤，以达到一定的酵母数利于后续接种发酵底物发酵生产乙醇，所述种子培养基为YPD液体培养基，pH值为7.0-7.2。
由上述技术方案可知，本发明提供了耐高温的酿酒酵母菌株及其应用。本发明所述耐高温的酿酒酵母菌株S.C HR在高温下的发酵各项指标均达到目前液体燃料乙醇工业生产菌株正常控温条件下的指标要求。与对照菌株相比，本发明所述酿酒酵母菌菌株乙醇产量和细胞存活率均明显提高，色谱总糖含量、滴定过滤总糖含量以及甘油含量则明显降低，表明本发明所述酿酒酵母菌菌株可在不严格控温的条件下保证燃料乙醇生产的稳定性，提高乙醇生产效率，降低生产成本，适合于工业液体燃料乙醇的大规模生产。
生物保藏说明
菌株S.C HR：分类命名：酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae，于2018年11月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16831。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1ARTP第一轮诱变图；
图2示实施例1ARTP第二轮诱变图；
图3示实施例3发酵过程失重图；
图4示实施例3酒份分析结果统计图。
具体实施方式
本发明公开了耐高温的酿酒酵母菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中的对照菌株均为目前液体燃料乙醇工业生产菌株。实验中所用到的化学药品和试剂，如尿素、青霉素、苏宏糖化酶等均为工业级。
实施例1、ARTP诱变
1、将酿酒酵母发酵液稀释107，取100μl涂布YPD(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉、2％琼脂粉，pH7.0)固体平板，待长出单菌落后，挑取单菌落接种至YPD(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，pH 7.0)液体培养基中，30℃、250rpm进行摇瓶培养，培养至OD600为1.0～1.5左右，取一定量培养液以无菌生理盐水清洗菌体并用无菌生理盐水制备菌悬液。
2、设置多功能等离子体诱变***(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)，以氮气作为等离子体的工作气体，在电源功率300W，平台高度14mm，等离子体的温度＜35℃，湿度＞10％，气体流量12slpm，诱变方式A的条件下，分别将50μl制备的菌悬液滴于无菌金属槽内中心位置，分别进行等离子体照射20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s、200s、220s、240s、260s、280s、300s、320s、340s、360s、380s、400s后，以无菌生理盐水对处理完的菌悬液进行梯度稀释涂布于YPS(2％可溶淀粉、2％蛋白胨、1％酵母粉、2％琼脂粉，pH 7.0)固体平板，将平板分别放置于不同温度生化培养箱中培养。
3、ARTP诱变及筛选：出发进行两轮ARTP诱变，使用工厂工艺水配制YPD固体培养基，在40℃高温筛选。共进行两轮诱变，从第一轮诱变中选取生长及发酵性能较好的菌株进行第二轮的诱变(图1和图2)。
4、选择第二轮诱变后生长及发酵性能较好的7个菌株进行液化醪摇瓶发酵验证。使用中粮生化能源(肇东)有限公司三期液化醪，37℃摇瓶发酵72h验证结果。7个菌株37℃摇瓶发酵结果见表1。
表1 37℃摇瓶发酵结果
g/100ml 对照菌株 HR-3 HR-16 HR-31 HR-B6 HR-B19 HR-C16 HR-C76
四糖以上 3.85 4.52 4.54 4.50 4.60 3.79 3.82 3.63
麦芽三糖 0.75 0.77 0.77 0.75 0.78 0.73 0.74 0.70
麦芽糖 2.35 3.40 3.25 3.06 2.19 2.29 2.52 2.20
葡萄糖 4.04 6.95 2.22 0.25 3.8 0.66 1.09 0.54
果糖 0.45 0.83 0.64 0.36 0.75 0.34 0.50 0.33
丁二酸 1.31 1.01 1.14 1.02 1.18 1.08 10.8 1.16
乳酸 1.79 1.64 1.58 1.51 1.67 1.63 1.63 1.54
甘油 11.48 10.34 10.63 10.84 10.85 11.25 11.11 10.79
乙酸 0.89 0.47 0.52 0.60 0.49 0.77 0.77 0.74
乙醇 119.13 113.93 117.46 116.92 118.36 121.75 120.71 118.25
色谱还原糖 4.80 7.73 2.99 1.01 4.61 1.40 1.83 1.24
色谱总糖 11.47 16.50 11.44 8.95 13.37 7.84 8.42 7.42
乙醇/甘油 10.37 11.01 11.04 10.77 10.87 10.81 10.86 10.95
总有机酸 4.01 3.13 3.25 3.14 3.35 3.49 3.49 3.45
注：对照菌株为目前液体燃料乙醇工业生产菌株
结果显示，其中HR-B19(命名为S.C HR)乙醇产量均显著高于对照菌株，葡萄糖残留、残还原糖、残总糖、乙醇/甘油均优于对照菌株。
实施例2、工业物料小试验证
取中粮生化能源(肇东)有限公司三期液化醪对ARTP诱变筛选出的S.C HR进一步调整温度的工业物料小试验证。工艺条件：三期液化醪为底物，对照菌株(目前液体燃料乙醇工业生产菌株)干粉35℃活化后添加，ARTP诱变筛选出的S.C HR接种于种子培养基(YPD液体培养基)中，经过二级培养达到一定的酵母数，按0.125亿/ml液化醪折算用量，离心、水洗一次，用生理盐水悬浮至2ml，在1L摇瓶中加入350g液化醪中。发酵过程测试菌株试验组均进行温度调整(0-16h 32℃，17h 33℃，18h 34℃，19h-72h 35℃)，并加入对照菌株的空白试验组(不调整温度，一直控温32℃)进行对照。其中物料三期液化醪基础数据见表2，各组发酵化学滴定检测数据见表3，各组发酵HPLC数据见表4。
表2 物料三期液化醪基础数据：
Figure BDA0001912014250000061
表3 S.C HR菌株与对照菌株发酵化学滴定检测数据：
Figure BDA0001912014250000071
注：对照菌株32℃(空白)为目前液体燃料乙醇工业生产所用的商业酵母菌株，发酵过程不调整温度，一直控温32℃；对照菌株(温度调整)为目前液体燃料乙醇工业生产所用的商业酵母菌株，温度调整规律：0-16h 32℃，17h 33℃，18h 34℃，19h-72h 35℃；S.CHR(温度调整)为ARTP诱变筛选菌株，温度调整规律：0-16h 32℃，17h 33℃，18h 34℃，19h-72h 35℃。
表4 S.C HR菌株与对照菌株发酵HPLC数据：
Figure BDA0001912014250000072
注：对照菌株32℃(空白)为目前液体燃料乙醇工业生产所用的商业酵母菌株，发酵过程不调整温度，一直控温32℃；对照菌株(温度调整)为目前液体燃料乙醇工业生产所用的商业酵母菌株，温度调整规律：0-16h 32℃，17h 33℃，18h 34℃，19h-72h 35℃；S.CHR(温度调整)为ARTP诱变筛选菌株，温度调整规律：0-16h 32℃，17h 33℃，18h 34℃，19h-72h 35℃。
表3和表4的结果显示，其中菌株S.C HR在高温下的发酵各项指标均达到对照菌株正常控温条件下的发酵性能。
实施例3、工业物料中试验证
三期液化醪中试验证发酵条件：控温方式为前12h，32℃；12-24h，不控温，温度缓慢升高，最高不超过36℃；24-48h，维持温度不低于35℃；48-72h，32℃，发酵罐体积为50L，结果如图3和图4、表5和6。
表5 细胞计数(单位：亿/ml)
24h 36h 48h
对照菌株 2.97 2.92 2.7
S.C HR 3.52 3.42 3.92
表6 化学滴定检测发酵数据：
对照菌株 S.C HR
还原糖(％) 0.63 0.25
残总糖(％) 3.02 2.75
过滤总糖(％) 1.23 0.92
残糊精(％) 0.54 0.61
残淀粉(％) 1.61 1.65
酵母死亡率(％) 100 91
酒分％(v/v) 14.22 14.45
结果可见，发酵液检测结果反映整体中试发酵性能及发酵各指标，结果可见S.CHR菌株发酵过程中在发酵温度高于32℃，发酵罐不控温的高温情况下(35～37℃)，72h乙醇产量比对照提高0.23％(v/v)，发酵72h还原糖基本耗尽，滴定过滤总糖含量则为对照的69.6％，发酵产酒酒份为14.45％(v/v)，符合目前液体燃料乙醇的发酵生产要求。说明酿酒酵母S.C HR高温下的发酵各项指标均达到目前液体燃料乙醇工业生产所用酿酒酵母菌株正常控温条件下的指标要求。
综上所述，诱变选育的酿酒酵母S.C HR发酵生长适宜温度35～37℃，具有一定的鲁棒性，产酒酒份14.45％(v/v)，残总糖2.75(g/100ml)，具有良好的发酵性能，该菌株可在不严格控温的条件下保证液体燃料乙醇生产的稳定性，提高乙醇生产效率，降低生产成本，适合于工业乙醇的大规模生产。

Claims (8)

1.耐高温的酿酒酵母菌，其保藏编号为CGMCC No.16831。
2.权利要求1所述的酿酒酵母菌在发酵生产工业液体燃料乙醇中的应用。
3.一种生产工业液体燃料乙醇的方法，发酵保藏编号为CGMCC No.16831的耐高温的酿酒酵母菌获得工业体燃料乙醇。
4.根据权利要求3所述的方法，所述发酵具体为将保藏编号为CGMCC No.16831的耐高温酿酒酵母接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物接种发酵培养基发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，所述发酵培养基为液化醪。
6.根据权利要求4所述的方法，所述发酵的发酵条件为前12h，32℃；12-24h，温度最高不超过36℃；24-48h，维持温度不低于35℃；48-72h，32℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，按扩繁后的培养物耐高温酿酒酵母浓度为0.125亿/ml计算，所述扩繁后的培养物接种量为16v/v％。
8.根据权利要求4所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基YPD液体培养基，pH值为7.0-7.2。
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