CN107385099A - 用于诊治胃腺癌转移的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了KIF14基因可以作为胃腺癌诊断的生物标志物。本发明的实验证明，与正常对照组织相比，胃腺癌组织中的KIF14基因表达显著升高，且经过干扰实验证明KIF14能够影响胃腺癌的侵袭与迁移。根据本发明的研究成果，可以研发能够抑制KIF14基因表达的药物，从而实现临床上对于胃腺癌的预防和治疗。

Description

用于诊治胃腺癌转移的生物标志物
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断、治疗领域，更具体地，本发明涉及以检测KIF14异常为手段的肿瘤诊断方法；及抑制KIF14基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。
背景技术
胃癌是源于胃粘膜上皮细胞的恶性肿瘤，主要为腺癌。2008年全球新诊断出胃癌近100万例，病死人数74万，是全世界发病率第四、致死率第二的癌症，是一种临床上常见的恶性肿瘤。虽然胃癌全球总发病率有所下降，但有将近三分之二的胃癌病例集中在经济欠发达国家和地区，中国及其他东亚国家高发。据《生命时报》2014年发布的最新版“中国癌症地图”。我国每年新发肿瘤病例约为3120000例，平均每天8550例，每分钟有6人被诊断为癌症，有5人死于癌症。而根据世界卫生组织的调查显示，我国属于胃癌高发区，辽宁、山东、甘肃、江苏、福建等省情况更为严重。在临床上，尽管早期胃癌的治疗己经取得了重大进步，常用外科手术切除加区域***清扫及术后放化疗支持，然而晚期胃癌的长期生存率仍然很低。很多文献及研究表明，肿瘤的侵袭、转移导致了大部分胃癌患者的死亡并在胃癌的不良预后中扮演关键角色。胃癌的侵袭、转移是一个多基因调控、多因子参与、多步骤进行的复杂的生物学过程，一般认为癌细胞的运动和侵袭能力是产生转移的重要条件。但对于晚期胃癌，其侵袭和转移潜在的分子机制尚不明确。因而寻找可靠的肿瘤预后的标志性因子，并找到能够有效抑制肿瘤转移和侵袭的分子靶点，改善肿瘤的预后，是近年来研究的热点，也是肿瘤研究中的一个重点和难点。因此，迫切的需要鉴别胃癌进展期的重要分子，研发新的药物作用靶点，为肿瘤的治疗和患者的预后提供有价值的帮助。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测KIF14基因表达差异来实现胃腺癌转移诊断、胃腺癌预测预后、胃腺癌预后评估的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过抑制KIF14基因表达来治疗胃腺癌转移的方法。
本发明的目的之三在于提供一种用于筛选胃腺癌转移治疗药物的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于治疗胃腺癌转移的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测KIF14的试剂在制备胃腺癌转移诊断、胃腺癌预测预后、胃腺癌预后评估工具中的应用。
进一步，所述检测KIF14的试剂包括检测KIF14基因表达量的试剂。
更进一步，所述检测KIF14的试剂包括能够定量KIF14基因mRNA的试剂，和/或能够定量KIF14蛋白的试剂。
本发明的定量KIF14基因mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变***)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量KIF14基因mRNA的试剂可以是KIF14基因或转录本的特异性引物，也可以是KIF14基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
上面所述的KIF14基因或转录本的特异性引物包括实时定量PCR中使用的特异扩增KIF14基因的引物。在本发明的的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的定量KIF14蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量KIF14蛋白的试剂包括特异性结合KIF14蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量KIF14蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的KIF14蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对KIF14蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
本发明的用于检测KIF14基因表达量检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
所述的样品可以是(但不限于)：外周血、骨髓、***、腹腔清洗液、胃壁细胞或胃液。在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
本领域技术人员公知，肿瘤组织的细胞会脱落到体液中，这些脱落的细胞称之为循环肿瘤细胞，循环肿瘤细胞的性质同肿瘤组织中肿瘤细胞的性质相同，因此检测体液中尤其是血液中循环肿瘤细胞的性质就可以代表肿瘤组织的性质。就本发明而言，通过检测肿瘤组织中KIF14基因表达可以用于诊断胃腺癌转移，可以容易得出也可以通过检测循环肿瘤细胞中KIF14基因表达来诊断胃腺癌转移。
本发明还提供了一种用于胃腺癌转移诊断、胃腺癌预测预后、胃腺癌预后评估的工具，所述工具能够检测KIF14基因表达量。
进一步，所述工具包括能够定量KIF14基因mRNA的试剂，和/或能够定量KIF14蛋白的试剂。
通常，所述的试剂存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述引物或探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。
进一步，所述能够定量KIF14基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增KIF14基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述用于胃腺癌转移诊断、胃腺癌预测预后、胃腺癌预后评估的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知KIF14基因的异常与胃腺癌转移相关也属于使用了本发明的KIF14的新用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测胃腺癌转移的方法的说明书等。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于KIF14基因或转录本的检测来判断胃腺癌转移的试剂均包含在本发明范围内。
本发明还提供了一种胃腺癌转移诊断、胃腺癌预测预后、或胃腺癌预后评估的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中KIF14基因表达水平；
(3)将测得的KIF14基因表达水平与受试者的疾病相关性关联起来。
(4)与正常对照相比，KIF14基因表达水平在统计学上升高，表明受试者被判断胃腺癌已经发生转移、或者预测胃腺癌转移的受试者预后不良、或者评估胃腺癌转移的受试者已经复发。
本发明还提供了一种胃腺癌转移的治疗方法，所述方法包括抑制KIF14基因或KIF14蛋白。
进一步，所述方法包括抑制KIF14基因的表达，或抑制KIF14基因的表达或抑制KIF14蛋白的活性。
本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量KIF14基因或者KIF14蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当KIF14基因或者KIF14蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。
本发明还提供了一种治疗胃腺癌转移的药物，所述药物包含KIF14的抑制剂。
本发明的KIF14的抑制剂不受限制，只要所述抑制剂能够抑制KIF14或涉及KIF14上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于***转移有效的药物即可。
本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗胃腺癌转移的药物中的应用。
进一步，所述抑制剂包括针对KIF14基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。
本发明的抑制剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，***，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以***地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明的“KIF14基因”(NC_000001.11(200551497..200620791))序列可以NCBI数据库中进行查询。
在本发明的上下文中，“胃腺癌转移诊断”包括判断受试者是否已经发生胃腺癌转移、判断受试者是否存在胃腺癌转移的风险、判断胃腺癌转移患者是否已经复发转移。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现并证实KIF14基因表达与胃腺癌组织转移的密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为胃腺癌转移的诊断与治疗提供了新的途径。
本发明开发出了适合于进行胃腺癌转移检测的试剂或试剂盒，检测灵敏度良好。
附图说明
图1显示利用QPCR检测KIF14基因在转移性胃腺癌组织与正常对照组织中的差异表达；
图2显示利用Western blot实验检测KIF14蛋白在转移性胃腺癌组织与正常对照组织中的差异表达；
图3显示利用Western blot实验检测KIF14基因表达抑制率。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1KIF14基因差异表达
1、样本收集
收集转移性胃腺癌组织及其癌旁正常组织50例，收集非转移性胃腺癌组织及其癌旁正常组织45例。组织样本由病理科医生帮助取样，收取样本标准如下：(1)原发胃腺癌，无其他疾病，患者术前未经癌症放化疗的；(2)样本由病理科诊断为胃腺癌，且癌旁正常组织并未检测到肿瘤细胞；(3)为了避免不必要的交叉染污，取样时采用两套器材，先取离癌组织最少5cm的肉眼观察无明显病变的癌旁正常组织样本，后取全层的胃腺癌组织样本，样本收取后立即分装放入加有1ml RNAlater的EP管中，4℃过夜，而后放置在-70℃的冰箱中长期保存。并在每个EP管上进行编号与标注。同时在样本记录本上做好相关信息的备注。
2、提取配对胃腺癌及癌旁组织样本的RNA
采用购自北京全式金生物技术有限公司的RNA提取试剂盒(Trans Zol TM UpPlusRNA Kit)提取组织样本RNA。具体步骤如下：
(1)将超低温冷冻的样品称量后，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨直至研磨成粉末状，将研磨成粉末状的样品转移至离心管中，每50-100mg样品加入1mlTrans ZolTM Up用匀浆仪进行匀浆处理，或用枪反复吹吸混匀。室温静置5分钟。
(2)每使用1ml Trans ZolTM Up，加0.2ml氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育3分钟。
(3)10000×g4℃离心15分钟。此时样品分成三层，无色水相(上层)，中间层，粉红色有机相(下层)。RNA在无色水相中，吸取无色水相层500μl液体。
(4)转移吸取的500μl无色的水相于新的离心管中，加入500μl的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。(此后离心均可在室温中进行)
(5)将700μl得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000×g室温离心30秒，弃掉流出液(如果体积大于离心柱容量，可以分几次完成)。
(6)加入500μl CB9，室温12000×g室温离心30秒，弃掉流出液。
(7)重复步骤(6)一次。
(8)加入500μl WB9(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，室温12000×g室温离心30秒，弃掉流出液
(9)重复步骤(8)一次。
(10)室温12000×g室温离心2分钟，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。
(11)将离心柱放入RNase-free Tube(试剂盒已配)中，加30μl RNase-freeWater在离心柱的中央，室温静置1分钟。
(12)室温12000×g室温离心1分钟，洗脱RNA。
(13)将RNA置于-80℃冰箱保存。
3、提取好的RNA浓度与纯度的测定
使用美国Nano Drop公司的ND-1000仪器检测RNA的浓度与纯度。
使用紫外分光光度仪Nano Drop 1000，双击电脑屏幕上的Nano Drop图标，进入***菜单；选择核酸测量选项后按照***提示，在加样孔中加入2μl双蒸水；点击确定，以初始化***；在加样孔加入2μl双蒸水，选择RNA项，点击Blank以测量***背景。用后擦镜纸擦净双蒸水后点入待测RNA样品，点击Measure。读取数值并记录，RNA浓度(ng/μl)，此时务必需要注意A值260/280，如果数值介于1.8-2.0之间，说明RNA样品质量较好。将每个样本的RNA浓度标记完全后冻存于-70℃冰箱。
4、提取好的RNA完整性测定
琼脂糖凝胶检测RNA样本操作步骤：
1)电泳槽，制胶用具的清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)，水冲洗后用，3％H2O2灌满电泳槽，室温放置10min，用0.1％(V/V)DEPC水冲洗，晾干备用。
2)制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有45ml的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5ml的10×TAE电泳缓冲液及终浓度为0.5μg/ml的溴化乙啶。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。
3)加样：样本与6×电泳缓冲液混合后，加样于凝胶点样孔内。
4)电泳：打开电泳仪，稳压80V电泳。
5)电泳结束后(约30分钟)，紫外灯下观察，并用凝胶成像***拍照保存。
完整性测定通过琼脂糖凝胶电泳检测，如果可清晰看到28s rRNA、18s r RNA、5srRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。说明提取的总RNA完整性较好，RNA质量符合要求。
5、引物的设计与制备
qRT-PCR检测KIF14基因表达的引物序列以及qRT-PCR扩增内参GAPDH的引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成，并经UCSC数据库的检索，将其序列信息录入NCBI软件设计引物，并在基因库内的blast进行确认正确无误。
KIF14基因引物：
上游引物：5’-AAGGAAGGTGTGAGTATT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物5’-GGACTAATCGTAGCAATC-3’(SEQ ID NO.2)，
GAPDH基因引物：
上游引物：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCA-3’(SEQ ID NO.3)；
下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’(SEQ ID NO.4)。
6、实时荧光定量cDNA逆转录检测步骤
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
7、PCR
(1)应用Bio-RAD实时荧光定量PCR仪器，按表1配制反应体系。
表1 PCR反应体系
(2)采用下列qPCR反应参数进行：95℃预变性10min，随后，95℃变性15s，57℃退火、延伸1min，共40循环；然后，进行荧光信号的采集及产物溶解曲线的制作，每个样本3个重复，取其平均值。采用2-△△Ct相对定量法分析KIF14的表达水平，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值。计算方法为：ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)肿瘤组织实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)正常组织对照组，2-△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，实验数据分析由Bio-RAD分析软件完成。
5、统计学分析采用统计学软件SPSS19.0进行数据分析，应用配对T检验判断胃腺癌组织与癌旁组织样本中KIF14的表达是否存在统计学意义的差异所有统计检验都为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，在转移组，胃腺癌组织与癌旁组织相比，KIF14基因mRNA表达水平升高了，差异具有统计学意义；而在非转移组，胃腺癌组织与癌旁组织相比，KIF14基因mRNA表达水平并没有发生统计学意义上的改变，同时检测到转移组癌旁组织和非转移组癌旁组织中KIF14基因mRNA表达水平是相同的。上述结果表明，KIF14基因参与了胃腺癌组织的转移。
实施例2KIF14蛋白的差异表达
1、提取实施例1中组织样本的总蛋白
按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
2、Western blot
以β-actin为内参。50μg总蛋白经SDS-PAGE分后，电转移至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的1×TBST室温轻摇封闭1h；分别加入兔抗人KIF14单抗(1∶800稀释)和鼠抗人β-actin多抗(1∶3 000稀释)，4℃过夜；1×TBST洗膜4次，加入羊抗兔及羊抗鼠Ig G(1∶2 000稀释)，室温孵育1h；1×TBST洗膜4次后，置于Super Signal化学发光试剂中反应2min，暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影。
3、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将KIF14蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图2所示，在转移组，胃腺癌组织与癌旁组织相比，KIF14蛋白水平升高了，差异具有统计学意义；而在非转移组，胃腺癌组织与癌旁组织相比，KIF14蛋白水平并没有发生统计学意义上的改变，同时检测到转移组癌旁组织和非转移组癌旁组织中KIF14蛋白水平是相同的。上述结果表明，KIF14蛋白参与了胃腺癌组织的转移。
实施例3干扰KIF14基因表达
1、干扰RNA设计合成
根据KIF14基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA。上海吉玛制药技术有限公司同时提供与KIF14基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA-NC)。
siRNA-KIF14：
正义链为5’-ACAUUCAUUUGAUUUCCAGCC-3’(SEQ ID NO.5)；
反义链为5’-CUGGAAAUCAAAUGAAUGUCC-3’(SEQ ID NO.6)，
2、人胃腺癌细胞的培养
人胃腺癌SGC7901细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基加青霉素100units/ml、链霉素100μg/ml，置37℃，5％CO2的培养箱内培养，每隔24h换1次培养液，48h传代1次。取对数生长期的细胞进行后续实验。
3、细胞转染
采用脂质体Lipofectamine2000为转染试剂。实验分2组：阴性对照组(转染siRNA-NC)；实验组(转染siRNA-KIF14)。取对数生长期的SGC7901细胞细胞，接种于6孔细胞培养板。24h后细胞培养板覆盖率约为70％-80％。转染方式参照Lipofectamine2000说明书进行。
4、Western blot实验检测siRNA-KIF14的干扰效率
步骤同实施例2。
5、结果
如图3所示，与阴性对照组(转染siRNA-NC)相比，实验组(转染siRNA-KIF14)细胞中KIF14蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4KIF14基因的表达对胃腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响
1、胃腺癌细胞体外迁移能力的检测
转染后48h，将各组的转染SGC7901细胞用无双抗的RPMI1640培养液制备成单细胞悬液，以106个/400μl的密度加入Transwell上层小室中，在下层小室中加入600μl小鼠成纤维细胞系NIH3T3条件培养液，置于37℃，5％CO2孵箱中，培养24h后，用湿棉签擦去上室内的细胞，经无水乙醇固定15min，HE染色，光镜下观察，并随机选取上、下、左、右及中间各5个视野，计数穿膜细胞，并取平均值，以穿膜细胞的数目代表SGC7901细胞的体外迁移能力。
结果：实验组SGC7901细胞的穿膜细胞数(191.2±13.6)较阴性对照组(371.8±8.9)明显降低，差异无统计学意义(P＞0.05)。上述实验结果表明，抑制KIF14基因表达可以抑制胃腺癌细胞迁移。
2、胃腺癌细胞体外侵袭能力的检测
将ECM基质胶按1∶7的比例用无血清RP-MI1640培养液稀释后，取30μl均匀地涂在Tran-swell小室底部膜的上室面，紫外线照射过夜，使ECM基质胶自然聚合成凝胶。将各组SGC7901细胞用无双抗的RPMI1640培养液制成单细胞悬液，以105个/400μl的密度加入Transwell上层小室中，其余步骤同迁移实验，以穿膜细胞的数目代表SGC7901细胞的体外侵袭能力。
结果：实验组SGC7901细胞的穿膜细胞数(37.6±3.5)较阴性对照组(92.4±5.7)明显降低。上述实验结果表明，抑制KIF14基因表达可以抑制胃腺癌细胞侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 用于诊治胃腺癌转移的生物标志物
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggaaggtg tgagtatt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggactaatcg tagcaatc 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggagccaaa agggtca 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagtccttcc acgataccaa 20
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acauucauuu gauuuccagc c 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cuggaaauca aaugaauguc c 21

Claims (10)

1.检测KIF14的试剂在制备胃腺癌转移诊断、胃腺癌预测预后、或胃腺癌转移复发评估工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测KIF14的试剂包括检测KIF14基因表达量的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测KIF14的试剂包括能够定量KIF14基因mRNA的试剂，和/或能够定量KIF14蛋白的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够定量KIF14基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增KIF14基因的引物；所述能够定量KIF14蛋白的试剂包括特异性结合KIF14蛋白的抗体。
5.一种用于胃腺癌转移诊断、胃腺癌转移预测预后、或胃腺癌转移复发评估的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测KIF14基因表达量的工具；优选的，所述工具包括能够定量KIF14基因mRNA的试剂，和/或能够定量KIF14蛋白的试剂。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述能够定量KIF14基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增KIF14基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；所述能够定量KIF14蛋白的试剂包括特异性结合KIF14蛋白的抗体。
7.根据权利要求5或6所述的工具，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
8.一种用于治疗胃腺癌转移的药物，其特征在于，所述药物包含KIF14的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述抑制剂包括能够抑制KIF14或涉及KIF14上游或下游途径的物质的表达或活性的抑制剂。
10.权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗胃腺癌转移的药物中的应用。
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