JP2021515784A - 修飾オリゴヌクレオチド及びタウオパチーにおける使用方法 - Google Patents

修飾オリゴヌクレオチド及びタウオパチーにおける使用方法 Download PDF

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Abstract

作製方法に沿って２’及び／又は３’位で修飾を含むオリゴヌクレオチド並びにアルツハイマー病及び他のタウオパチーに対する使用が開示される。

Description

アンチセンスオリゴヌクレオチド療法は、ウイルス性疾患、神経性疾患、神経変性疾患、線維性疾患及び過剰増殖性疾患などの様々な疾患及び状態の治療又は予防について検討されている。
ヒト脳における神経原線維濃縮体又は神経膠線維濃縮体におけるタウタンパク質の病的凝集を伴う神経変性疾患は、タウオパチーとして知られる。濃縮体は、不溶性形態において凝集した高リン酸化型微小管結合タンパク質タウで構成される。神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）は、神経細胞死をもたらす場合があり、したがって、アルツハイマー病を含むタウオパチーにおける主要な原因因子であり得る。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、慢性神経変性脳障害であり、認知症の全症例の５０〜７０％を占める。世界中でおよそ４７００万人が認知症を抱えて生活しており、その数は２０５０年までに１億３１００万人に増加すると予想されている。対症療法のみが利用可能であり、病気の進行を遅らせるか、又は進行を止めさえする疾患修飾治療を見出す必要性を示している。
病理学的に、ＡＤは、細胞外アミロイドβプラークの異常な蓄積及び高リン酸化型タウタンパク質からなるＮＦＴの細胞内形成によって特徴付けられる。タウは、ＭＡＰＴ遺伝子によってコードされる微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）である。ＮＦＴ蓄積の位置及び強度は、ＡＤにおける認知機能低下と強く相関し、ＭＡＰＴ遺伝子の変異は、パーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を引き起こす。これらの要因は、タウに基づく療法の開発を支持する。凝集を減少させ、細胞内凝集体を除去し、拡散を止め、細胞内クリアランスを増加させ、且つ翻訳後修飾を変化させることは、タウの病態を低減することを目的としたいくつかの治療戦略である。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖をもたらす古典的なワトソン−クリック塩基対形成を介してそれらのＲＮＡ標的に結合する小分子一本鎖核酸分子である。リン酸−糖骨格の化学修飾に応じて、形成されるＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖は、ＡＳＯをそのまま残して二重鎖のＲＮＡ鎖を切断することになるＲＮａｓｅ−Ｈをリクルートできる。次に、切断されたＲＮＡはさらに分解されて、ｍＲＮＡ及び標的遺伝子のタンパク質発現レベルの低減をもたらす。ＡＳＯ骨格の化学修飾はまた、結合親和性、ヌクレアーゼ活性に対する耐性及び（血清）タンパク質に対する結合能を変化させることができる。
したがって、異なる作用機序、効力の増大、親和性の増大及び／又は副作用の減少を伴う新規の療法を発見し、且つ開発することが当技術分野で必要とされる。
本開示は、オリゴヌクレオチドを含有する化合物及び組成物並びに疾患及び状態、例えば、アルツハイマー病などのタウオパチーを予防するか又は治療する際のそれらの使用に関する。
いくつかの実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（Ｉ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは、核酸塩基であり、
Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、且つＲ’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＦである）のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、式（Ｉ）のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜４０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜２６個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５〜１０個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて未修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂは、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂは、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいて未修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂは、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいて修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいてＨである。いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいてＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいて−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは核酸塩基であり、Ｒ２は、−ＣＲ’３、−ＣＲ’２ＯＣＲ’３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３又は−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３であるか、又はＲ２は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、且つＹはＯであり、且つＲ’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＦである）の１個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ２は−ＣＲ’３である）の少なくとも１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ２は、−（ＣＲ’２）１〜２ＯＣＲ’３である）の少なくとも１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ２は、−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３である）の少なくとも１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは、式（ＩＩ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、式（ＩＩ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、式（ＩＩ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいてＯである。いくつかの実施形態では、Ｙは、式（ＩＩ）の各ヌクレオチドにおいてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、式（ＩＩ）の各ヌクレオチドにおいてＯである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはさらに、式（ＩＩＩａ）又は式（ＩＩＩｂ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、且つＢは、核酸塩基である）の１個以上のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはさらに、式（Ｖ’）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、Ａは−（ＣＲ’’Ｒ’’）１〜２−であり、且つＲ’’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ又はＭｅである）の１個以上のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＶＩ）：５’Ｘ−Ｙ−Ｚ３’（ＶＩ）（式中、Ｘ、Ｙ及びＺの各々は、２〜１４個のヌクレオチドを含むドメインであり、Ｘ及びＺドメインの少なくとも１つは、少なくとも１個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含み、且つＹドメインのヌクレオチドの各々は、２’−デオキシヌクレオチドである）のコンストラクトにおいて配置される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８〜２２個のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインはそれぞれ、５〜１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、５〜１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインはそれぞれ、５〜１０個のヌクレオチドを含み、且つＹドメインは、５〜１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインはそれぞれ、５個のヌクレオチドを含み、且つＹドメインは、１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインの各ヌクレオチドは、式（Ｉ）のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｘドメインの少なくとも１個のヌクレオチド及びＺドメインの少なくとも１個のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、式（ＩＩ）のヌクレオチド、式（ＩＩＩａ）のヌクレオチド、及び式（ＩＩＩｂ）のヌクレオチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインの少なくとも１個のヌクレオチドの各々は、同じヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｙドメインの各ヌクレオチドは、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヒトＭＡＰＴ遺伝子のエクソン５の少なくとも一部と相補的である。
他の実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（ＶＩ）：
５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’（ＶＩ）
（式中、Ｘ−Ｙ−Ｚは、１８〜２２個のヌクレオシドの配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであり、且つ任意選択によりリガンド標的化基に対して５’及び／又は３’末端でコンジュゲートされ；Ｘは、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；Ｚは、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；且つＹは、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された２〜１４個の２’−デオキシ−ヌクレオシドの配列を含むドメインである）のヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、６〜１０ヌクレオシド長である。いくつかの実施形態では、Ｘ及び／又はＺドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された修飾ヌクレオシドの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、少なくとも１つのホスホジエステルサブユニット間結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、チオホスフェートサブユニット間結合、及び任意選択により、１個又は２個のホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシ−ヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、修飾ヌクレオシドを含み、修飾は、独立して、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、立体構造的に制限されたヌクレオシド、２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート及び２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｚの機能ドメインは、修飾ヌクレオシドを含み、修飾は、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、立体構造的に制限されたヌクレオシド、２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート及び２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ及び／又はＺドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された１個以上の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインは、１個以上の２’−アラビノ−Ｆ及び／又は２’−リボ−Ｆ修飾ヌクレオシドを含み、各前記ヌクレオシドは、独立して、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合の少なくとも１つを介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインは、１個以上の２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドを含み、各前記ヌクレオシドは、独立して、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、又はチオホスフェートサブユニット間結合の少なくとも１つを介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインの各々における修飾ヌクレオシドは、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドであり、且つ修飾ヌクレオシドは、５−メチルシトシン核酸塩基を含むが、任意選択によりシトシンを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、任意選択によりアデニンを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意選択によりウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、アデニンを含まず、及び５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意選択によりウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、６〜８個の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインの各々における修飾ヌクレオシドは、チオホスフェートサブユニット間結合を介して任意選択により連結された２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシド及び立体構造的に制限されたヌクレオシドを含み、且つ２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドは、５−メチルシトシン核酸塩基を含むが、任意選択によりシトシンを含まない。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインの各々における修飾ヌクレオシドは、２’−ＯＭｅ及び立体構造的に制限されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインの各々における修飾ヌクレオシドは、立体構造的に制限されたヌクレオシドを含み、且つ少なくとも１個の修飾ヌクレオシドは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、７〜８個の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドは、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意選択によりウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、９〜１０個の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインは、式（Ａ１）：
Figure 2021515784
（Ａは、それぞれの場合において独立して、ＮＨ又はＯであり；Ｂは、それぞれの場合において独立して、未修飾又は修飾核酸塩基であり；Ｗは、それぞれの場合において独立して、ＯＲ又はＳＲであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり；Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、及びＯ−メトキシエトキシからなる群から選択され；Ｒ’’’はＨであるか、又はＲ’及びＲ’’’を合わせて−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成し、且つａは、３〜９の整数であり、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’がそれぞれＨである場合、ＡはＮＨであり、且つ任意選択によりＡがＯである場合、ＷはＳＲである）によって表されるヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、リガンド標的化基は、トコフェロール、パルチミン酸及びリポ酸並びにこれらの組合せからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｘ及び／又はＺドメインは、１個以上のオリゴヌクレオチドを含み、修飾は、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’である。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、１個以上のオリゴヌクレオチドを含み、修飾は、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’である。いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、１個以上のオリゴヌクレオチドを含み、修飾は、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’である。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドのコンストラクトは、表Ｂのコンストラクトに相当する。
他の実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（ＶＩＩ）：
５’−Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’−３’（ＶＩＩ）
（式中、Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’は、１６〜２２個のヌクレオシドの配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであり、且つ任意選択により５’及び／又は３’末端でコンジュゲートされ；Ｘ’は、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；Ｚ’は、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；且つＹ’は、サブユニット間結合を介して連結された２〜４個の２’−デオキシ−ヌクレオシドの配列を含むドメインであり、Ｘ’及び／又はＺ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された修飾ヌクレオシドの配列を含む）のヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｙ’ドメインは、チオホスフェートサブユニット間結合、及び任意選択により、１個のホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシ−ヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、Ｘ’ドメインは、９又は１０ヌクレオシド長である。いくつかの実施形態では、Ｘ’ドメインは、修飾ヌクレオシドを含み、修飾は、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、及び立体構造的に制限されたヌクレオシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｚ’ドメインは、修飾ヌクレオシドを含み、修飾は、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、及び立体構造的に制限されたヌクレオシドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ’及び／又はＺ’ドメインは、１個以上の２’−アラビノ−Ｆ及び／又は２’−リボ−Ｆ修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ’及び／又はＺ’ドメインにおける修飾ヌクレオシドは、２’−ＯＭｅ及び立体構造的に制限されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘ’及び／又はＺ’ドメインにおける修飾ヌクレオシドは、立体構造的に制限されたヌクレオシド及びＮ３’→Ｐ５’修飾を含む。いくつかの実施形態では、配列は、表Ｂにおいて２〜４個のヌクレオチドＹドメインを有するものから選択される。
他の実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、表Ｄにおいて列挙される配列に相当するキメラオリゴヌクレオチドを含む。
他の実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、以下の式（ＶＩＩＩ）：
Figure 2021515784
（式中、ＸＡは、ＮＨ又はＯであり、Ｙは、ＯＲ又はＳＲであり、ここで、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、ＢＡは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、ＲＡ’及びＲＡ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され、且つＲＡ’’’はＨであるか又はＲＡ’及びＲＡ’’’を合わせて、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成する）のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡ’及びＲＡ’’’はＨであり；且つＲＡ’’はＦである。いくつかの実施形態では、ＲＡ’及びＲＡ’’はＨであり；且つＲＡ’’’はＦ、ＯＨ、Ｈ又はＯＭｅである。いくつかの実施形態では、ＸＡはＮＨであり；ＢＡは、未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＡ’及びＲＡ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオシド（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）を形成し；且つＲＡ’’はＨである。いくつかの実施形態では、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つはＨである。いくつかの実施形態では、ＢＡがプリン核酸塩基であるとき、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つはＯＨ又はＦであり、且つ／又はＢＡがピリミジン核酸塩基であるとき、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つは、ＯＭｅ、ＯＨ又はＦである。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルウラシル、及びｇ−クランプから選択される。
他の実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１０個以上のヌクレオチドが、以下の式（ＩＸ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、ＢＢは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、ＲＢ’及びＲＢ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され、且つＲＢ’’’はＨであるか又はＲＢ’及びＲＢ’’’を合わせて、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成する）のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＢ’及びＲＢ’’’はＨであり；且つＲＢ’’はＦである。いくつかの実施形態では、ＲＢ’及びＲＢ’’はＨであり；且つＲＢ’’’はＦ、ＯＨ、Ｈ又はＯＭｅである。いくつかの実施形態では、ＢＢは未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＢ’及びＲＢ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオシド（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）を形成し；且つＲＢ’’はＨである。いくつかの実施形態では、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つはＨである。いくつかの実施形態では、ＢＢがプリン核酸塩基であるとき、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つはＯＨ又はＦであり、且つ／又はＢＢがピリミジン核酸塩基であるとき、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つは、ＯＭｅ、ＯＨ又はＦである。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルウラシル、及びｇ−クランプから選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｂ）のヌクレオチドは、表ＡにおいてＸＡがＮＨであるものを含む。いくつかの実施形態では、式（Ｂ）のヌクレオチドは、表Ｂにおいて列挙されるコンストラクトに従って配置され、修飾される。いくつかの実施形態では、式（Ｂ）のコンストラクトは、表Ｄのものから選択される配列と１、２、３、４、又は５個の核酸塩基が異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、どのオリゴヌクレオチドも式（Ｂ）のヌクレオチドである。
実施形態において、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に相当する。実施形態において、配列番号１の配列は、開示される修飾の少なくとも１つに従って修飾される。実施形態において、配列番号１に相当する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の２個のヌクレオチドは、ホスホロアミダート結合を含むように修飾され、さらに２’−メトキシエトキシ（２’ＭＯＥ）修飾を含むように修飾される。実施形態において、配列番号１に相当する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の３個のヌクレオチドはさらに、２’ＭＯＥ修飾を含むように修飾される。実施形態において、配列番号１に相当する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の４個のヌクレオチドはさらに、２’ＭＯＥ修飾を含むように修飾される。実施形態において、配列番号１に相当する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の５個のヌクレオチドはさらに、２’ＭＯＥ修飾を含むように修飾される。実施形態において、配列番号１に相当する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の６個のヌクレオチドはさらに、２’ＭＯＥ修飾を含むように修飾される。
他の実施形態は、前述の実施形態のいずれかのオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、髄腔内又は脳室内送達に好適である。他の実施形態は、ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞及び小膠細胞などの中枢神経系（ＣＮＳ）細胞におけるＭＡＰＴ遺伝子発現を阻害する方法であって、細胞を前述の実施形態のいずれかのオリゴヌクレオチド又は組成物と接触させることを含む方法を含む。他の実施形態は、ＣＮＳ細胞におけるＭＡＰＴの転写又は翻訳を阻害する方法であって、細胞を前述の実施形態のいずれかのオリゴヌクレオチド又は組成物と接触させることを含む方法を含む。他の実施形態は、アルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチー及び／又は任意のタウオパチー関連障害を有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量の前述の実施形態のいずれかのオリゴヌクレオチド又は組成物を投与することを含む方法を含む。他の実施形態は、前述の実施形態のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と複合体を形成した前記オリゴヌクレオチドが、＞３７℃の融解温度（Ｔｍ）を有するオリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態は、アルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチー及び／又は任意のタウオパチー関連障害を有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量の前述の実施形態のいずれかのオリゴヌクレオチド又は組成物を投与することを含む方法を含む。他の実施形態は、ＣＮＳ細胞において標的ＲＮＡの発現を阻害する方法であって、細胞を前述の実施形態のいずれかの前記ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は組成物と接触させることを含み、キメラオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの一部と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有する方法を含む。他の実施形態は、ＣＮＳ細胞においてＭＡＰＴ遺伝子の転写又は翻訳を阻害する方法であって、細胞を前述の実施形態のいずれかの前記オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は組成物と接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドが、ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有する方法を含む。他の実施形態は、アルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチー及び／又は任意のタウオパチー関連障害を有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量の前述の実施形態のいずれかの前記オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は組成物を投与することを含み、オリゴヌクレオチドが、ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有する方法を含む。他の実施形態は、標的核酸を前述の実施形態のいずれかの前記ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は組成物を含むアンチセンス化合物と接触させることによって標的の発現を調節する方法であって、オリゴヌクレオチドが、標的核酸の一部と相補的であるか、又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有する方法を含む。
本開示は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを対象とし、そのオリゴヌクレオチドのうちの１個以上のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、且つ２個以上のヌクレオチドは、ヌクレオチド間に修飾された結合を含有する。本開示はまた、共通の特徴及び標的化部分などのオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた追加の構成成分を有するオリゴヌクレオチド内のドメイン、領域又は部分を含む、オリゴヌクレオチドのコンストラクトも対象とする。本開示はさらに、オリゴヌクレオチド及びそれらのコンストラクトを使用及び調製する方法を対象とする。
当技術分野で知られ、且つ本開示において記載されるとおり、修飾ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドではない任意のヌクレオチドである。例えば、デオキシリボースの２’炭素は、ヒドロキシ（ＯＨ）以外の置換基によって置換されてもよく；デオキシリボースの３’炭素は、酸素原子（Ｏ）以外の置換基によって置換されてもよい。当技術分野で知られ、且つ本開示において記載されるとおり、２個のヌクレオチド間の修飾された結合は、第１のヌクレオチドのデオキシリボースの３’炭素と第２のヌクレオチドのデオキシリボースの５’炭素の間のホスホジエステル結合ではない任意の結合である。
１．２’，３’−修飾ヌクレオチド及び関連オリゴヌクレオチド
本開示の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、特定の２’及び３’修飾を有する修飾ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。実施形態において、本開示の化合物は、デオキシリボース糖の２’炭素でヒドロキシの置き換え、又は置換を含む。加えて、本開示のこれらの化合物は、デオキシリボース糖の３’炭素で酸素原子の置き換え、又は窒素原子（Ｎ）による置換を含む、２個のヌクレオシド間の結合の修飾を含む。結合の修飾はさらに、ホスホジエステル結合において、別の酸素原子の置き換え、又は置換を含む。
これらの修飾ヌクレオチドは、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈによる遺伝的標的の酵素的切断を可能にするキメラオリゴヌクレオチド又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。
２’，３’−修飾ヌクレオチド
したがって、本開示の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（Ｉ）：
Figure 2021515784
（式中、ＲはＨ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、Ｒ’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＦである）のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。
式（Ｉ）のヌクレオチドにおいて、Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、それぞれの場合においてＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’がＦであり、例えば、１、２、３、４、５、６、又は７つのＲ’がＦである。いくつかの実施形態では、ＣＲ’３は、１、２又は３つのＦ部分を含有する。例えば、実施形態において、Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（又はＭＯＥ）、−ＣＦ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＯＣＦ３、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦＣＨＦＯＣＨ３、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨＦＣＨ２ＯＣＨＦ２及び−ＣＨ２ＣＨＦＯＣＨ３からなる群から選択される。実施形態において、式Ｉのヌクレオチドは、
Figure 2021515784
である。
実施形態において、本開示の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（ＩＩ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ２は、−ＣＲ’３、−ＣＲ’２ＯＣＲ’３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３又は−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３であるか、又はＲ２は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、且つＹはＯであり、且つＲ’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＦである）のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。
式（ＩＩ）のヌクレオチドにおいて、Ｒ２は、−ＣＲ’３、−（ＣＲ’２）１〜３ＯＣＲ’３、又は−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＣＲ’３又は−ＣＲ’２ＣＲ’３である。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、それぞれの場合においてＨである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’がＦであり、例えば、１、２、３、４、又は５つのＲ’がＦである。いくつかの実施形態では、ＣＲ’３は、１、２又は３つのＦ部分を含有する。例えば、実施形態において、Ｒ２は、−ＣＨ３（又はＭｅ）、−ＣＦＨ２、−ＣＨＦ２、ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＦＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦ２ＯＣＨ３、−ＣＦ３ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨ２ＯＣＨＦ２、−ＣＨ２ＯＣＦ３、−ＣＦＨ２ＯＣＨ３、−ＣＦＨ２ＯＣＦＨ２、−ＣＦＨ２ＯＣＨＦ２、−ＣＦＨ２ＯＣＦ３、−ＣＨＦ２ＯＣＨ３、−ＣＨＦ２ＯＣＦＨ２、−ＣＨＦ２ＯＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＯＣＦ３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３、−ＣＨ２ＣＨ３（又はＥｔ）、−ＣＦＨ２ＣＨ３、−ＣＨＦ２ＣＨ３、−ＣＦ３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＦＨ２、−ＣＨ２ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＦＨ２ＣＨ３、−ＣＦＨ２ＣＦＨ２、−ＣＦＨ２ＣＨＦ２、−ＣＦＨ２ＣＦ３、−ＣＨＦ２ＣＨ３、−ＣＨＦ２ＣＦＨ２、−ＣＨＦ２ＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＦ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨＦＣＨ２ＣＨ３、ＣＨＦＣＨＦＯＣＨ３、ＣＨＦＣＨ２ＣＦＨ２、ＣＨＦＣＨ２ＣＨＦ２及びＣＨ２ＣＨＦＣＨ３からなる群から選択される。実施形態において、Ｒ２は、−ＣＨ３（又はＭｅ）又は−ＣＨ２ＣＨ３（又はＥｔ）である。
実施態様において、式ＩＩのヌクレオチドは、
Figure 2021515784
からなる群から選択される。
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物において、Ｙは、Ｏ又はＳであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合（例えば、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０など）においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合においてＳであり、且つ少なくとももう１つの場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、それぞれの場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合（例えば、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０など）においてＯである。
開示されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含む。実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含む。実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の式（ＩＩ）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜４０個のヌクレオチド、例えば、８〜２６個又はそれらの間の整数のヌクレオチドを含む。
２個以上の式（Ｉ）のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに含まれる実施形態において、ヌクレオチドは、同じであっても、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、１個以上の式（ＩＩ）のヌクレオチドが含まれ、且つそれらは、同じであっても、異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の式（Ｉ）のヌクレオチド及び少なくとも１個の式（ＩＩ）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含み、少なくとも１つのＲ１は、ＭＯＥ及び少なくとも１個の式（ＩＩ）のヌクレオチドであり、Ｒ２は、Ｍｅ又はＥｔである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の式（Ｉ）と式（ＩＩ）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、交互に２’修飾を有する２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチド（例えば、Ｍｅ−ＭＯＥ−Ｍｅ−ＭＯＥ．．．又はＥｔ−ＭＯＥ−Ｅｔ−ＭＯＥ−Ｅｔ−ＭＯＥ．．．）。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）のヌクレオチドは、以下の：
Figure 2021515784
によって表される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはさらに、式（ＩＩＩａ）及び／又は（ＩＩＩｂ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、且つＢは、核酸塩基である）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４個の式（Ｉ）と式（ＩＩＩａ）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の交互のヌクレオチドを含む。
ある種の実施形態は、４〜４０個のヌクレオチド、及び式（ＩＶ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、Ｒ２は、−ＯＣＲ’３、−ＯＣＲ’２ＯＣＲ’３、−Ｏ（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３又は−Ｏ（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３及びＦから選択され、Ｒ’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＦであり、且つａは、１〜１０の整数であり、且つｂは、１〜１０の整数であり、ここで、２０までとは、例えば、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）を含むオリゴヌクレオチドを含む。
本開示の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（ＩＩＩ’）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、且つＢは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基である）のヌクレオチドであり；且つ任意選択により、式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び／又は（ＩＶ）の１つ以上を含むオリゴヌクレオチドを含む。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）のヌクレオチドの核酸塩基Ｂは、それぞれ独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、任意選択によりアデニンを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意選択によりウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、アデニンを含まず、及び５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意選択によりウラシルを含まない。
式（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）の各ヌクレオチドにおけるＹは、独立して、Ｏ又はＳであり得る。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合（例えば、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０など）においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合においてＳであり、且つ少なくとももう１つの場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、それぞれの場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合（例えば、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０など）においてＯである。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）の各々の２個以上のヌクレオチドが含まれる実施形態において、そのような式の２個以上ヌクレオチドは、同じであっても、異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも１個の式（Ｉ）のヌクレオチドに加えて、少なくとも１個の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、式（Ｉ）並びに／又は式（ＩＩ）並びに／又は（ＩＩＩ）並びに／又は（ＩＶ）、（Ｖ）及び／若しくは（Ｖ’）の少なくとも２個の交互のヌクレオチドを含む。例えば、開示されるオリゴヌクレオチドは、交互の２’修飾を有する２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチドを含み得る。
実施態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、
Figure 2021515784
（式中、Ｂは、任意の天然又は修飾塩基であり得る）からなる群から選択される。
本開示の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（Ｖ’）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、Ａは−（ＣＲ’’Ｒ’’）１〜２−であり、且つＲ’’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ又はＭｅである）のヌクレオチドであり、且つ任意選択により、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）の１つ以上を含むオリゴヌクレオチドを含む。
式（Ｖ’）を含む化合物において、Ａは、−（ＣＲ’’Ｒ’’）１〜２−である。いくつかの実施形態では、Ａは、−（ＣＲ’’Ｒ’’）−であり、他の実施形態では、Ａは、−（ＣＲ’’Ｒ’’）２−である。Ｒ’’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＭｅである。いくつかの実施形態では、１個のＲ’’はＭｅであり、残りのものはＨである。他の実施形態では、全てのＲ’’はＨである。
いくつかの実施形態では、ＡがＣＨ２である場合、ＹはＳである。他の実施形態では、ＡがＣＨ２ＣＨ２である場合、ＹはＯ又はＳである。いくつかの実施形態では、ＡはＣＨ２ＣＨ（Ｍｅ）又はＣＨ（Ｍｅ）であり、且つＹはＯ又はＳである。
式（Ｖ’）を含む化合物において、Ｙは、Ｏ又はＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合（例えば、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０など）においてＳである。他の実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合においてＳであり、且つ少なくとももう１つの場合においてＯである。他の実施形態では、Ｙは、それぞれの場合においてＳである。いくつかの実施形態では、Ｙは、少なくとも１つの場合（例えば、１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０など）においてＯである。
式（Ｖ’）（及び任意選択により式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’））の化合物は、オリゴヌクレオチドの一部であってもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）（及び任意選択により式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’））を含む化合物は、式（Ｖ’）（及び式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’））の１、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜４０個のヌクレオチド、例えば、８〜２６個又はそれらの間の整数のヌクレオチドを含む。
２個以上の式（Ｖ’）のヌクレオチドが含まれる実施形態において、２個以上の式（Ｖ’）のヌクレオチドは、同じであっても、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、１個以上の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドが含まれ、且つそれらは、同じであっても、異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも１個の式（Ｖ’）のヌクレオチド及び少なくとも１個の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも２個の式（Ｖ’）並びに式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）の交互のヌクレオチドを含む。例えば、交互の２’修飾を有する２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個のヌクレオチド。
いくつかの実施形態では、式（Ｖ’）（及び任意選択により式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’））のヌクレオチドを含むヌクレオチドはさらに、以下の構造：
Figure 2021515784
（式中、Ｙ、Ｒ及びＢは、式（Ｉ）についてのものと同じである）の２−フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも４個の式（Ｖ’）と２−フルオロヌクレオチドの交互のヌクレオチドを含む。
本開示の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドが、式（Ｖ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｙは、Ｓ又はＯであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、且つＢは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基である）のヌクレオチドであり；且つ任意選択により、１個以上の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び／又は（Ｖ’）を含むオリゴヌクレオチドを含む。
キメラオリゴヌクレオチド
本開示は、共通の特徴を有するオリゴヌクレオチド内のドメイン、領域又は部分を含む、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドのコンストラクトを対象とする。これらのドメインを有するオリゴヌクレオチドは、本明細書でキメラオリゴヌクレオチドと称される。いくつかの実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、式（ＶＩ）：
５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’ （ＶＩ）
（式中、キメラオリゴヌクレオチドは、１４〜２２個のヌクレオシドの配列を含み、Ｘは、３〜１０ヌクレオチド長である修飾ヌクレオチドの配列を含むドメインであり；Ｚは、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオチドの配列を含むドメインであり；且つＹは、２〜１０個の２’−デオキシ−ヌクレオチド、又は未修飾ヌクレオチドの配列を含むドメインである）によって表される。それぞれのドメインにおけるヌクレオシドの各々は、サブユニット間結合を介して連結される。
いくつかの実施形態では、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むキメラオリゴヌクレオチドは、１個以上の式（ＶＩ’）：
５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’ （ＶＩ’）
（式中、キメラオリゴヌクレオチドは、１４〜２２個のヌクレオシドの配列を含み、Ｘは、２〜１０ヌクレオチド長である修飾ヌクレオチドの配列を含むドメインであり；Ｚは、２〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオチドの配列を含むドメインであり；且つＹは、６〜１４個の２’−デオキシ−ヌクレオチド、又は未修飾ヌクレオチドの配列を含むドメインである）のヌクレオチドを含む。それぞれのドメインにおけるヌクレオシドの各々は、サブユニット間結合を介して連結される。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドは、Ｘ及び／又はＺドメインにおいて存在し得る。キメラオリゴヌクレオチドは、５’及び／又は３’末端でリガンド−標的化基にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、チオホスフェートサブユニット間結合によって連結された２’デオキシ−ヌクレオシドを含有する。実施形態において、Ｙドメインは、少なくとも１つのホスホジエステルサブユニット間結合によって連結された２’デオキシ−ヌクレオシドを含有する。実施形態において、Ｙドメインは、２つのホスホジエステルサブユニット間結合によって連結された２’デオキシ−ヌクレオシドを含有する。実施形態において、Ｙドメインは、チオホスフェートサブユニット間結合及び１つ又は２つのホスホジエステルサブユニット間結合によって連結された２’−デオキシ−ヌクレオシドを含有する。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、６〜１０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、修飾ヌクレオチドを含み、修飾は、独立して、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＥｔ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、及び立体構造的に制限されたヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、９又は１０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、２’修飾ヌクレオチドを含み、修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＥｔ又は２’−ＭＯＥである。いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、９又は１０ヌクレオチド長である。
実施形態において、キメラオリゴヌクレオチドは、１４〜２２個のヌクレオチドの配列を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個のヌクレオチドを含み得る。
実施形態において、Ｘは、３〜１０ヌクレオチド長である１個以上の修飾ヌクレオチドを含有する配列からなるドメインであり；Ｚは、３〜１０ヌクレオチド長である１個以上の修飾ヌクレオチドを含有する配列からなるドメインであり；且つＹは、チオホスフェートサブユニット間結合及び任意選択により１つ又は２つのホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２〜１０個の２’−デオキシ−ヌクレオシドの配列からなるドメインである。いくつかの実施形態では、Ｘは５〜９個であり、Ｙは６〜１０個であり、且つＺは５〜９個である。いくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ及びＺの各々におけるヌクレオチドの数はそれぞれ、６／６／６、６／６／７、６／６／８、６／７／６、６／７／７、６／７／８、６／８／６、６／８／７、６／８／８、３／１０／３、４／１０／４、５／１０／５、５／１０／６、２／１２／２、３／１２／３、２／１４／２、５／９／５、５／９／６、５／８／５、５／８／６、５／８／７、７／５／７、７／５／８、７／５／９，７／６／６、７／６／７、７／６／８、７／６／９、７／７／６、７／７／７、７／７／８、７／７／９、７／５／７、７／５／８、７／５／９、７／４／７、７／４／８、７／４／９、８／４／７、８／４／８、８／４／９、７／３／７、７／３／８、７／３／９、８／３／７、８／３／８、８／３／９、８／３／１０、９／３／７、９／３／８、９／３／９、９／３／１０、８／２／７、８／２／８、８／２／９、８／２／１０、９／２／７、９／２／８、９／２／９、９／２／１０、１０／２／８、１０／２／９、１０／２／１０である。Ｘドメイン及びＺドメインはそれぞれ、修飾ヌクレオチドの配列を含み、ドメインは４〜１０ヌクレオチド長である。例えば、Ｘドメイン及び／又はＺドメインは、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの配列を含み得る。これらのヌクレオチドの１個以上が修飾される（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）。例えば、いくつかの実施形態では、Ｘドメイン及び／又はＺドメインの各々における全てのヌクレオチドが修飾される。
Ｘ及びＺドメインのヌクレオチドは、それらの核酸塩基、リボース糖の２’及び／又は３’位並びにそれらのサブユニット間結合の１つ以上に関して、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）に従って修飾され得る。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態はまた、２’位がＯＭｅで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）及びＭｅ又はＯＭｅで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＯ−メトキシエトキシで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態はまた、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’及び４’位が、立体構造的に制限されたヌクレオチドを形成する修飾された架橋基（本明細書の他の箇所で記載される）であり、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。これらの実施形態の各々は、チオホスフェート（又は３’置換に応じてチオホスホロアミダート）及びホスホロアミダートサブユニット間結合を含んでもよい。
実施形態はまた、少なくとも１個のヌクレオチドの２’位がＨであり、且つ３’位がＮＨであるオリゴヌクレオチドを含む。これらの実施形態の各々は、チオホスホロアミダート及び／又はホスホロアミダートサブユニット間結合を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、Ｘドメイン及びＺドメインの修飾ヌクレオチドはそれぞれ、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、立体構造的に制限されたヌクレオチドの少なくとも１つから独立して選択される修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、以下の式（Ａ）：
Figure 2021515784
（式中、Ａは、それぞれの場合において独立して、ＮＨ又はＯであり、Ｂは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、且つＲ’及びＲ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され、且つＲ’’’はＨであるか、又はＲ’及びＲ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオシドを形成する２〜４個の原子架橋を形成する（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（Ｍｅ）−、又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）によって表されるヌクレオシドを含有する。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｆ、ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され；Ｒ’’はＨ及びＦであり；且つＲ’’’は、Ｈ、Ｍｅ又は−ＯＭｅである。他の実施形態では、Ｒ’’及びＲ’’’はＨであり；且つＲ’は、Ｆ、ＯＭｅ、ＯＥｔ及びＯ−メトキシエトキシから選択される。いくつかの実施形態では、Ａは、それぞれの場合においてＮＨである。
いくつかの実施形態は、式（Ａ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオシドを含み、式中、ＡはＮＨであり；ＢはＧ−クランプであり；Ｒ’はＦ又はＯＭｅであり且つＲ’’はＨであるか；又はＲ’はＨであり且つＲ’’はＨ又はＦであり；且つＲ’’’はＨである。
いくつかの実施形態は、式（Ａ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオシドを含み、式中、ＡはＮＨであり；Ｂは未修飾又は修飾核酸塩基であり；Ｒ’及びＲ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオシドを形成し（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（Ｍｅ）−、又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）；且つＲ’’はＨである。いくつかの実施形態では、Ｂは、未修飾核酸塩基又は５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、及び５−メチルウラシルからなる群から選択される修飾核酸塩基である。
いくつかの実施形態は、式（Ａ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオシドを含み、式中、ＡはＮＨであり；Ｂは未修飾又は修飾核酸塩基であり；Ｒ’はＦ又はＯＭｅであり、Ｒ’’はＨであり且つＲ’’’はＨである。
いくつかの実施形態は、式（Ａ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオシドを含み、式中、ＡはＮＨであり；Ｂは未修飾又は修飾核酸塩基であり；Ｒ’はＨであり、Ｒ’’はＦであり且つＲ’’’はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺドメインは、式（Ａ１）：
Figure 2021515784
（式中、Ｗは、それぞれの場合において独立して、ＯＲ又はＳＲであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり；Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、Ａ及びＢは、式（Ａ）について記載されるとおりである）によって表される。他の実施形態では、ＡはＯであり、且つＲ’、Ｒ’’は、独立して、Ｈ又はＯＥｔであり、Ｒ’、Ｒ’’の少なくとも１つはＯＥｔである。
例えば、ＡがＮＨであり、ＷがＳであり、且つＲ’がＭＯＥであるＸ及びＺドメインの各々における少なくとも１個のヌクレオチドに加えて、Ｘ及びＺのヌクレオチドは、表Ａ２に記載されるとおりの式Ａ２の１個以上のヌクレオチド又は表Ａ３に記載されるとおりの式Ａ３の１個以上のヌクレオチドを含み得る。
Figure 2021515784
Figure 2021515784
Figure 2021515784
Figure 2021515784
Figure 2021515784
いくつかの実施形態では、Ｘドメイン及びＺドメインはそれぞれ独立して、２個、３個又はそれ以上の異なるヌクレオチド１〜４７を含む。
Ｘドメインのヌクレオシドは、サブユニット間結合、例えば、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、チオホスフェート、ホスホジエステルサブユニット間結合又はこれらの組合せを介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、及びこれらの組合せから選択されるサブユニット間結合を介して連結される。
キメラオリゴヌクレオチドのＸドメインは、修飾ヌクレオチドの一定の配置を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、１個以上の立体構造的に制限されたヌクレオチドを含む。立体構造的に制限されたヌクレオチドは、ＬＮＡ及びＥＮＡなどのＢＮＡを含んでもよい。（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の立体構造的に制限されたヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、１個以上の２’−Ｆ及び／又は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、交互の立体構造的に制限されたヌクレオチドを含み、例えば、１つおきのヌクレオチドが、立体構造的に制限されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、１個以上の２’−Ｆ及び／又は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の２’−Ｆ及び／又は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、Ｘドメインは、交互の２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。実施形態において、Ｘドメインは、２’−Ｆ又は２’−ＯＭｅ及び立体構造的に制限されたヌクレオチドを、例えば、交互の配列で含む。
Ｙドメインは、２〜１４個の２’−デオキシヌクレオチドの配列を含む。例えば、Ｙドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個の２’−デオキシヌクレオチドの配列を含み得る。２’−デオキシヌクレオシドの１個以上が、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結され得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のチオホスフェートサブユニット間結合）。いくつかの実施形態では、２’−デオキシヌクレオシドの各々は、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｙドメインは、少なくとも１個のホスホジエステルサブユニット間結合（例えば、１、２又は３個のホスホジエステルサブユニット間結合）を含む。他の実施形態では、Ｙドメインは、チオホスフェートサブユニット間結合、及び任意選択により、１個又は２個のホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシ−ヌクレオシドからなる。
実施形態において、Ｙドメインは、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、式（Ａ）のヌクレオチドは、表ＡにおいてＸＡがＮＨであるものを含む。いくつかの実施形態では、式（Ａ）のヌクレオチドは、表Ｂにおいて列挙されるコンストラクトに従って配置され、修飾される。いくつかの実施形態では、式（Ａ）のコンストラクトは、表Ｄのものから選択される配列と１、２、３、４、又は５個の核酸塩基が異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のどのヌクレオチドも式（Ａ）のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシヌクレオシドは、以下の式（Ｂ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｂは、それぞれの場合において独立して、未修飾又は修飾核酸塩基である）によって表され得る。いくつかの実施形態では、Ｂは、未修飾核酸塩基又は５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、及び５−メチルウラシルからなる群から選択される修飾核酸塩基である。
他の実施形態では、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシヌクレオシドは、修飾２’−デオキシヌクレオシドを含み、これはＸ及びＺドメインと同じ様式で修飾され得る。例えば、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された修飾２’−デオキシヌクレオシドは、以下の式（Ｃ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｂは、それぞれの場合において独立して、未修飾又は修飾核酸塩基であり、且つＲ’’及びＲ’’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択されるか、又はＲ’及びＲ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオシドを形成する２〜４個の原子架橋を形成する）によって表され得る。いくつかの実施形態では、Ｂは、未修飾核酸塩基又は５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、及び５−メチルウラシルからなる群から選択される修飾核酸塩基である。
Ｚドメインは、修飾ヌクレオチドの配列を含み、Ｚドメインは４〜１０ヌクレオチド長である。例えば、Ｚドメインは、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの配列を含み得る。これらのヌクレオチドの１個以上が修飾される（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個）。例えば、いくつかの実施形態では、Ｚドメインにおける全てのヌクレオチドが修飾される。
Ｚドメインの修飾ヌクレオチドは、例えば、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＥｔ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、立体構造的に制限されたヌクレオチド、２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート及び２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートの少なくとも１つから独立して選択される修飾を含む。
Ｚドメインのヌクレオチドは、例えば、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、チオホスフェート又はホスホジエステルサブユニット間結合などのサブユニット間結合を介して連結され得る。いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、サブユニット間結合、及びこれらの組合せを介して連結される。
キメラオリゴヌクレオチドのＺドメインは、修飾ヌクレオチドの一定の配置を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上）の立体構造的に制限されたヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡなどのＢＮＡであって、それぞれが任意選択により置換されてもよい）を含む。いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、交互の立体構造的に制限されたヌクレオチドを含み、例えば、１つおきのヌクレオチドが、立体構造的に制限されたヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡなどのＢＮＡであって、それぞれが任意選択により置換されてもよい）である。いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上）の２’−Ｆ及び／又は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態は、Ｚドメインが、交互の２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含むか、又はＺドメインが、交互の２’−Ｆ又は２’−ＯＭｅ及び立体構造的に制限されたヌクレオチドを含むものを含む。
いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）の修飾ヌクレオチドは、５−メチルシトシン核酸塩基を含むが、シトシンを含まない。いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）の修飾ヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、アデニンを含まない。いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）の修飾ヌクレオチドは、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、ウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）の修飾ヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ及び立体構造的に制限されたヌクレオチドを含み、且つチオホスフェートサブユニット間結合を介して連結され、且つ修飾ヌクレオチドは、５−メチルシトシン核酸塩基を含むが、シトシンを含まない。いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）の修飾ヌクレオチドは、５−メチルウラシル核酸塩基を伴う２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含むが、ウラシルを含まない。
ある種の実施形態では、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むキメラオリゴヌクレオチドにおける式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）のヌクレオチドは、表Ｂのコンストラクトの少なくとも１つに従って配置され、Ｘ及びＺドメインにおける少なくとも１つのサブユニット間結合は、ＮＰＳ結合である。
Figure 2021515784
表Ｂにおいて、Ｘ及びＺドメインの各々におけるヌクレオチドは、表Ａ２及びＡ３において番号を付けられたヌクレオチドのうちの１個以上であり得る。いくつかの実施形態では、表Ｂのキメラオリゴヌクレオチドは、表Ａにおける修飾ヌクレオチドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８個以上を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ及び／又はＺのヌクレオチドの全ては、修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、表Ｂにおけるヌクレオチドは、ヌクレオチド番号１〜４又は５〜８又は９〜１２又は１３〜１６又は１７〜２０又は２１〜２４又は２５〜２８又は２９〜３０又は３１〜３２又は３３などの表Ａにおいて列挙されるある種の修飾ヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、表Ｂにおけるヌクレオチドは、ヌクレオチド番号９〜１２及び２１〜２８、又は９〜１２及び２１〜２４、又は１〜４及び２１〜２８、又は１〜４及び２１〜２４、又は５〜８及び２１〜２８、又は５〜８及び２１〜２４などの表Ａにおいて列挙されるある種の修飾ヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、表Ｂにおけるヌクレオチドは、ヌクレオチド番号２９〜３１又は３１〜３２又は３３などの表Ａにおいて列挙される１又は２又は３個の修飾ヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、表Ｂにおけるヌクレオチドは、ヌクレオチド番号２９又は３１又は３３などの表Ａにおいて列挙されるある種の修飾ヌクレオチドから選択される。表ＢのＹドメインにおけるヌクレオチドは、式Ｂのヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、表Ｂのオリゴヌクレオチドは、５’及び／又は３’末端でリガンド標的化基及び／又は脂質部分にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド化合物は、表Ｃにおいて記載される以下の核酸塩基配列を含む。
Figure 2021515784
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列を含む。実施形態において、配列番号１の配列は、開示される修飾の少なくとも１つに従って修飾される。実施形態において、配列番号１は、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の２個のヌクレオチドにおいてチオホスホロアミダート結合及び２’−メトキシエトキシ（２’ＭＯＥ）修飾を有して修飾される。実施形態において、配列番号１は、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の３個のヌクレオチドにおいて２’ＭＯＥ修飾を有して修飾される。実施形態において、配列番号１は、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の４個のヌクレオチドにおいて２’ＭＯＥ修飾を有して修飾される。実施形態において、配列番号１は、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の５個のヌクレオチドにおいて２’ＭＯＥ修飾を有して修飾される。実施形態において、配列番号１は、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端から少なくとも最初の６個のヌクレオチドにおいて２’ＭＯＥ修飾を有して修飾される。
いくつかの実施形態では、ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、表Ｄの修飾配列に従って修飾配列を含み、ここで、Ｘは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ、２，６−ジアミノプリン、５−Ｍｅピリミジン（例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル）、及びｇ−クランプから選択される。実施形態において、配列番号１は、表Ｄにおける各Ｘが、配列番号１の核酸塩基の各々に相当するように、表Ｄの修飾配列に従って修飾される。
Figure 2021515784
実施形態において、ドメインのヌクレオチドの各々は、修飾される。実施形態において、ドメインのヌクレオチドの各々は、同じ修飾を有する。実施形態において、Ｘ及びＺドメインのヌクレオチドの各々は、修飾される。実施形態において、Ｘ及びＺドメインのヌクレオチドの各々は、同じ修飾を有する。実施形態において、ドメインのヌクレオチドの各々は、２’ＭＯＥで修飾される。実施形態において、Ｘ及びＺドメインのヌクレオチドの各々は、２’ＭＯＥで修飾される。実施形態において、ドメインのヌクレオチドの各々は、２’ＯＭｅで修飾される。実施形態において、Ｘ及びＺドメインのヌクレオチドの各々は、２’ＯＭｅで修飾される。実施形態において、ドメインのヌクレオチドの各々は、２’ＯＥｔで修飾される。実施形態において、Ｘ及びＺドメインのヌクレオチドの各々は、２’ＯＥｔで修飾される。実施形態において、Ｘ及びＺドメインのヌクレオチドの各々は、ＮＰＳ結合によって連結される。実施形態において、Ｘ及びＺドメインは、同じ数のヌクレオチドを有する。実施形態において、Ｘ及びＺドメインはそれぞれ、４〜８個のヌクレオチドを有する。実施形態において、Ｘ及びＺドメインはそれぞれ、５〜６個のヌクレオチドを有する。実施形態において、Ｘ及びＺドメインはそれぞれ、５個のヌクレオチドを有する。実施形態において、Ｙドメインは、Ｘ及びＺドメインの各々の少なくとも２倍の数のヌクレオチドを有する。実施形態において、Ｙドメインは、８〜１２個のヌクレオチドを有する。実施形態において、Ｙドメインは、１０個のヌクレオチドを有する。実施形態において、Ｙドメインのヌクレオチドの各々は、ＰＳ結合によって連結される。実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個の核酸塩基は、修飾される。実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’末端に隣接する少なくとも１個の核酸塩基は、修飾される。実施形態において、オリゴヌクレオチドのＺドメインの少なくとも１個の核酸塩基は、修飾される。実施形態において、オリゴヌクレオチドのＹドメインの少なくとも１個の核酸塩基は、修飾される。
本開示のオリゴヌクレオチドはまた、表Ｂ及びＤにおいて列挙される配列の修飾とは独立して、表Ｃにおいて列挙される配列から選択される核酸塩基配列と少なくとも９０％同一である配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５個の核酸塩基が、表Ｂ及びＤにおいて列挙される配列の修飾とは独立して、表Ｃにおいて列挙される配列とは異なる。
実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドは、同じ配列の未修飾オリゴヌクレオチドと比較して、標的核酸配列に対する親和性の増大を示す。例えば、一部の配列において、開示されるオリゴヌクレオチドは、同じ配列の未修飾オリゴヌクレオチドより高い親和性で標的核酸配列と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を有する。実施形態において、相補的な標的核酸配列と複合体を形成した開示されるオリゴヌクレオチドは、＞３７℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。複合体は、生理的条件又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などのほぼ生理的条件下で形成され得る。実施形態において、複合体のＴｍは、＞５０℃である。実施形態において、複合体のＴｍは、５０〜１００℃である。実施形態において、生理的条件又はほぼ生理的条件下で標的核酸配列と二重鎖を形成した開示されるオリゴヌクレオチドのＴｍは、＞５０℃である。
ある種の実施形態では、標的核酸配列は、ＭＡＰＴ遺伝子などの既知のＤＮＡ又はＲＮＡの核酸配列から選択され得る。ＭＡＰＴ遺伝子は、エクソン５、エクソン１０又はエクソン１２などのＤＮＡ又はＲＮＡ配列であり得る。
実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴ遺伝子又はＭＡＰＴ ｍＲＮＡなどのそのＲＮＡ等価物の少なくとも一部に対して親和性を示し、且つ／又はＭＡＰＴ遺伝子又はそのＲＮＡ等価物の少なくとも一部と複合体が形成される安定性を示す。実施形態において、相補的なＭＡＰＴ遺伝子配列と複合体を形成したオリゴヌクレオチドは、＞３７℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。ＭＡＰＴ遺伝子は、エクソン５、エクソン１０又はエクソン１２などのＲＮＡ配列を含み得る。複合体は、生理的条件又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などのほぼ生理的条件下で形成され得る。実施形態において、複合体のＴｍは、＞５０℃である。実施形態において、複合体のＴｍは、５０〜１００℃である。実施形態において、生理的条件又はほぼ生理的条件下でＭＡＰＴ遺伝子と二重鎖を形成した開示されるオリゴヌクレオチドのＴｍは、＞５０℃である。
本開示の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドコンストラクトであって、以下の式（ＶＩＩ）：
５’−Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’−３’ （ＶＩＩ）
（式中、Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’は、１４〜２２個のヌクレオシドの配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであり、且つ任意選択により、５’及び／又は３’末端でリガンド標的化基にコンジュゲートされ、Ｘ’は、３〜１４ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；Ｙ’は、サブユニット間結合を介して連結された２〜４個の２’−デオキシヌクレオシドの配列を含むドメインであり；且つＺ’は、３〜１４ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり、Ｘ’及び／又はＹ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された１個以上の修飾ヌクレオシドを含む）を有するコンストラクトを含む。
式（ＶＩＩ）のＸ’−Ｙ’−Ｚ’によって表されるキメラオリゴヌクレオチドは、１４〜２２個のヌクレオチド、例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個のヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’の各々におけるヌクレオチドの数はそれぞれ、８／２／１０、９／２／１０、１０／２／１０、７／３／１０、８／３／１０、９／３／１０、８／４／８、９／４／９、６／４／８である。いくつかの実施形態では、Ｘ’は６〜１０個であり、Ｙ’は２〜４個であり、且つＺ’は８〜１０個である。
いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、１４〜２２個のヌクレオチドの配列からなるＸ’−Ｙ’−Ｚ’キメラオリゴヌクレオチドからなり、且つ任意選択により、５’及び／又は３’末端（例えば、５’末端、３’末端又は５’及び３’の両方の末端）でリガンド標的化基にコンジュゲートされ、Ｘ’は、３〜１０ヌクレオチド長である１個以上の修飾ヌクレオチドを含有する配列からなるドメインであり；Ｚ’は、３〜１０ヌクレオチド長である１個以上の修飾ヌクレオチドを含有する配列からなるドメインであり；且つＹ’は、チオホスフェートサブユニット間結合及び任意選択により１つのホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２〜４個の２’−デオキシ−ヌクレオチドの配列からなるドメインであり、Ｘ’及び／又はＹ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された１個以上の修飾ヌクレオチドを含有する。
Ｘ’ドメインは、修飾ヌクレオチドの配列を含み、Ｘ’ドメインは４〜１０ヌクレオチド長である。例えば、Ｘ’ドメインは、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの配列を含み得る。これらのヌクレオチドの１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個）が修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｘ’ドメインにおける全てのヌクレオチドが修飾される。
Ｘ’ドメインの修飾ヌクレオチドは、式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）におけるＸについて開示されるものと同じであり得る。例えば、Ｘ’ドメインのヌクレオチドは、それらの核酸塩基、リボース糖の２’及び／又は３’位並びにそれらのサブユニット間結合の１個以上に関して修飾され得る。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態はまた、２’位がＯＭｅで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）及びＭｅ又はＯＭｅで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＯ−メトキシエトキシで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態はまた、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’及び４’位が、立体構造的に制限されたヌクレオチドを形成する修飾された架橋基（本明細書の他の箇所で記載される）であり、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。これらの実施形態の各々は、チオホスフェート（又は３’置換に応じてチオホスホロアミダート）及びホスホロアミダートサブユニット間結合を含んでもよい。
実施形態はまた、２’位がＯＨであり、且つ３’位がＮＨであるか、又は２’位がＨであり、且つ３’位がＮＨであるものを含む。これらの実施形態の各々は、チオホスホロアミダート及び／又はホスホロアミダートサブユニット間結合を含んでもよい。
Ｘ’ドメインのヌクレオチドは、サブユニット間結合、例えば、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、チオホスフェート又はホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｘ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、及びこれらの組合せから選択されるサブユニット間結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｘ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート及び／又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を含む。
Ｙ’ドメインは、２〜４個の２’−デオキシヌクレオチドの配列を含む。例えば、Ｙ’ドメインは、２、３、又は４個の２’−デオキシヌクレオチドの配列を含み得る。２’−デオキシヌクレオチドの１個以上が、チオホスフェート又はホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結され得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個）。いくつかの実施形態では、２’−デオキシヌクレオチドの各々は、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結される。他の実施形態では、２’−デオキシヌクレオチドの各々は、ホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結される。他の実施形態では、Ｙ’ドメインは、チオホスフェートサブユニット間結合、及び任意選択により、１個のホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシ−ヌクレオチドからなる。
Ｚ’ドメインは、修飾ヌクレオチドの配列を含み、Ｚ’ドメインは、４〜１０ヌクレオチド長である。例えば、Ｚ’ドメインは、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの配列を含み得る。これらのヌクレオチドの１個以上が修飾される（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個）。例えば、いくつかの実施形態では、Ｚ’ドメインにおける全てのヌクレオチドが修飾される。
Ｚ’ドメインの修飾ヌクレオチドは、式（ＶＩ）又は（ＶＩ’）におけるＺについて開示されるものと同じであり得る。例えば、Ｚ’ドメインのヌクレオチドは、それらの核酸塩基、リボース糖の２’及び／又は３’位並びにそれらのサブユニット間結合の１個以上に関して修飾され得る。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態はまた、２’位がＯＭｅで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）及びＭｅ又はＯＭｅで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’位がＯ−メトキシエトキシで修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態はまた、２’位がＦ（リボ又はアラビノ）で修飾され、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。実施形態は、２’及び４’位が、立体構造的に制限されたヌクレオチドを形成する修飾された架橋基（本明細書の他の箇所で記載される）であり、且つ３’位がＯ又はＮＨであるものを含む。これらの実施形態の各々は、チオホスフェート（又は３’置換に応じてチオホスホロアミダート）及びホスホロアミダートサブユニット間結合を含んでもよい。
実施形態はまた、２’位がＯＨであり、且つ３’位がＮＨであるか、又は２’位がＨであり、且つ３’位がＮＨであるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。これらの実施形態の各々は、チオホスホロアミダート及び／又はホスホロアミダートサブユニット間結合を含んでもよい。
Ｚ’ドメインのヌクレオチドは、サブユニット間結合、例えば、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、チオホスフェート又はホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｚ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、及びこれらの組合せから選択されるサブユニット間結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、Ｚ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート及び／又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を含む。
さらなる実施形態は、
（Ａ）以下の式
Figure 2021515784
（式中、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ１は、−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３又は−ＯＣＨ３である）の１個以上のヌクレオチド及び
（Ｂ）チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された２〜１０個の２’−デオキシ−ヌクレオシドの配列を含むドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された１０個の２’−デオキシ−ヌクレオシドの配列を含むドメインを含む。
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド
他の化合物は、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び／又は（Ｖ’）のヌクレオチドを含む。
本開示の他の化合物は、ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、以下の式（ＶＩＩＩ）：
Figure 2021515784
（式中、ＸＡは、ＮＨ又はＯであり、Ｙは、ＯＲ又はＳＲであり、ここで、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、ＢＡは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、ＲＡ’及びＲＡ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され、且つＲＡ’’’はＨであるか又はＲＡ’及びＲＡ’’’を合わせて、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（Ｍｅ）−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成する）を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＡ’及びＲＡ’’’はＨであり；且つＲＡ’’は、Ｆ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択される。他の実施形態では、ＲＡ’’及びＲＡ’’’はＨであり；且つＲＡ’は、Ｆ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択される。いくつかの実施形態では、ＸＡは、それぞれの場合においてＮＨである。
いくつかの実施形態は、式（ＶＩＩＩ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、ＸＡはＮＨであり；ＢＡはＧ−クランプであり；ＲＡ’はＦ又はＯＭｅであり且つＲＡ’’はＨであるか；又はＲＡ’はＨであり且つＲＡ’’はＨ又はＦであり；且つＲＡ’’’はＨである。
いくつかの実施形態は、式（ＶＩＩＩ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、ＸＡはＮＨであり；ＢＡは未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＡ’及びＲＡ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオチドを形成し（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）；且つＲＡ’’はＨである。いくつかの実施形態では、ＢＡは、未修飾核酸塩基又は５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、及び５−メチルウラシルからなる群から選択される修飾核酸塩基である。
いくつかの実施形態は、式（ＶＩＩＩ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、ＸＡはＮＨであり；Ｂは未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＡ’はＦ又はＯＭｅであり、ＲＡ’’はＨであり且つＲＡ’’’はＨである。
いくつかの実施形態は、式（ＶＩＩＩ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、ＸＡはＮＨであり；ＢＡは未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＡ’はＨであり、ＲＡ’’はＦであり且つＲＡ’’’はＨである。
いくつかの実施形態では、ＸＡは、ＮＨである。他の実施形態では、Ｙは、Ｏ−又はＳ−（正に荷電した対イオンを伴う）である。いくつかの実施形態では、ＲＡ’又はＲＡ’’はＨであり、且つ他方はＦ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシ（例えば、アラビノ−Ｆ又はリボ−Ｆ又はＯＭｅ）である。
いくつかの実施形態では、ＢＡは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ及びＴから選択される。さらなる実施形態では、ＢＡは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ、２，６−ジアミノプリン、５−Ｍｅピリミジン（例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル）から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つはＨである。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＡ’はＦ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシであり、且つＲＡ’’はＨである。他の実施形態では、ＲＡ’はＨであり、且つＲＡ’’はＦである。
いくつかの実施形態では、ＢＡがプリン核酸塩基であるとき、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つは、ＯＨ又はＦであり、且つ／又はＢＡがピリミジン核酸塩基であるとき、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つは、ＯＭｅ、ＯＨ又はＦである。
他の実施形態では、ヌクレオチドは、表Ｅ又は表Ｆにおけるヌクレオチドの１個以上を含む。
Figure 2021515784
Figure 2021515784
Figure 2021515784
本開示の化合物はまた、ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、以下の式（ＩＸ）：
Figure 2021515784
（式中、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、ＢＢは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、ＲＢ’及びＲＢ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＭｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され、且つＲＢ’’’はＨであるか又はＲＢ’及びＲＢ’’’を合わせて、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（Ｍｅ）−、又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成する）を有する少なくとも１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、どのオリゴヌクレオチドも式（ＩＸ）のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ＲＢ’及びＲＢ’’’はＨであり、且つＲＢ’’は、Ｆ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択される。他の実施形態では、ＲＢ’’及びＲＢ’’’はＨであり；且つＲＢ’は、Ｆ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択される。
いくつかの実施形態は、式（ＩＸ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、ＢＡはＧ−クランプであり；ＲＢ’はＦ又はＯＭｅであり且つＲＢ’’はＨであるか；又はＲＢ’はＨであり且つＲＢ’’はＨ又はＦであり；且つＲＢ’’’はＨである。
いくつかの実施形態は、式（ＩＸ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、ＢＡは未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＢ’及びＲＢ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオチドを形成し（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）；且つＲＢ’’はＨである。いくつかの実施形態では、ＢＡは、未修飾核酸塩基又は５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、及び５−メチルウラシルからなる群から選択される修飾核酸塩基である。
いくつかの実施形態は、式（ＩＸ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、Ｂは未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＢ’はＦ又はＯＭｅであり、ＲＢ’’はＨであり且つＲＢ’’’はＨである。
いくつかの実施形態は、式（ＩＸ）によって表される１個以上の修飾ヌクレオチドを含み、式中、ＢＡは未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＢ’はＨであり、ＲＢ’’はＦであり且つＲＢ’’’はＨである。
他の実施形態では、Ｙは、Ｓ−（正に荷電した対イオンを伴う）である。いくつかの実施形態では、ＲＢ’又はＲＢ’’はＨであり、且つ他方はＦ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシ（例えば、アラビノ−Ｆ又はリボ−Ｆ又はＯＭｅ）である。
いくつかの実施形態では、ＢＢは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ及びＴから選択される。さらなる実施形態では、ＢＢは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ、２，６−ジアミノプリン、５−Ｍｅピリミジン（例えば、５−メチルシトシン）から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つはＨである。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＡ’はＦ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシであり、且つＲＢ’’はＨである。他の実施形態では、ＲＢ’はＨであり、且つＲＢ’’はＦである。
いくつかの実施形態では、ＢＢがプリン核酸塩基であるとき、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つは、ＯＨ又はＦであり、且つ／又はＢＢがピリミジン核酸塩基であるとき、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つは、ＯＭｅ、ＯＨ又はＦである。
いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、表Ａのものから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、表Ｄのものから選択される配列と１、２、３、４、又は５個の核酸塩基が異なる配列を含む。
実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部又はそのＲＮＡ等価物に対して親和性を示し、且つ／又はＭＡＰＴ遺伝子又はそのＲＮＡ等価物の少なくとも一部の以下の６つの配列のうちの少なくとも１つと複合体が形成される安定性を示す。実施形態において、相補的なＭＡＰＴ遺伝子配列と複合体を形成したオリゴヌクレオチドは、＞３７℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。ＭＡＰＴ遺伝子は、エクソン５、エクソン１０又はエクソン１２などのＲＮＡ配列であり得る。複合体は、生理的条件又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などのほぼ生理的条件下で形成され得る。実施形態において、複合体のＴｍは、＞５０℃である。実施形態において、複合体のＴｍは、５０〜１００℃である。実施形態において、生理的条件又はほぼ生理的条件下でＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と二重鎖を形成した開示されるオリゴヌクレオチドのＴｍは、＞５０℃である。
本開示のいくつかの態様では、式（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、１２〜２２個のヌクレオチド、例えば、１４〜２０個のヌクレオチド又は１６〜１９のヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド長である。
本開示の別の態様では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの１つ以上の末端でコンジュゲートされるか又は修飾される。
例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端は、前記末端での少なくとも１個の修飾ヌクレオチドによる加水切断から保護される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、３’−Ｎ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドであり、チオホスホロアミダートサブユニット間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドはさらに、３’及び／又は５’末端でチオホスフェートサブユニット間結合及びチミン核酸塩基を含有する少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、１又は２個）を含む。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドはさらに、３’及び／又は５’末端で２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド及びチミン核酸塩基を含有する少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、１又は２個）を含む。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドはさらに、３’及び／又は５’末端でチオホスフェートサブユニット間結合及びウラシル核酸塩基を含有する少なくとも１個の２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、反転ｄＴは、式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のオリゴヌクレオチドの３’−末端で組み込まれる場合があり、３’エキソヌクレアーゼによる分解及び／又はＤＮＡポリメラーゼによる分解を阻害し得る３’−３’結合をもたらす。
コンジュゲートオリゴヌクレオチド
本開示はまた、標的化部分及び１つ以上の末端で修飾されたオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたさらなる構成成分を対象とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、任意選択によりＨＥＧリンカー又はＣ６若しくはＣ７アミノリンカーなどの連結部分を介して、１つ以上のリガンド標的化基にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドはさらに、任意選択のリンカーを介して５’及び／又は３’末端でコンジュゲートされたリガンド標的化基を含む。好ましい実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドはさらに、任意選択のリンカーを介して５’及び／又は３’末端でコンジュゲートされたリガンド標的化基を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの３’末端にある。
いくつかの実施形態では、リガンド標的化基は、ＣＮＳ細胞などの特定の種類の細胞によるオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞による取込みを増強する。
いくつかの実施形態では、リガンド標的化基は、トコフェロールなどの脂質部分並びにパルミトイル部分であるヘキサデカン酸（パルチミン酸）及びジチオオクタン酸（リポ酸）などのオクタン酸などの脂肪酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端は、末端での少なくとも１個の修飾ヌクレオチドによる加水切断から保護される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、３’−Ｎ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドであり、チオホスホロアミダートサブユニット間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖はさらに、３’及び／又は５’末端でチオホスフェートサブユニット間結合及びチミン核酸塩基を含有する少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、１又は２個）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖はさらに、３’及び／又は５’末端で２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＥｔ、又は２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを含有する少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、１又は２個）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖はさらに、３’及び／又は５’末端でチオホスフェートサブユニット間結合及びウラシル核酸塩基を含有する少なくとも１個の２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。実施形態において、ＡＳＯの３’末端は、ｎｐ又はｐｏ結合を介して標的化部分にさらに連結されたＣ６アミノリンカーに結合される。
いくつかの実施形態では、反転ｄＴは、オリゴヌクレオチド鎖の３’−末端で組み込まれる場合があり、３’エキソヌクレアーゼによる分解及び／又はＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害し得る３’−３’結合をもたらす。
２．組成物
本開示はまた、本開示のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を包含する。一実施形態は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、若しくは（ＶＩ）のオリゴヌクレオチド、又は本開示の他のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される希釈剤若しくは担体を含む医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、髄腔内又は脳室内送達などの中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤化される。他の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、非経口送達を介する全身投与のために製剤化される。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入；また、例えば、インプラントデバイスを介する皮下投与を含む。好ましい実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、髄腔内又は脳室内送達のために製剤化される。ＣＮＳ投与のための製剤は、当業者によって理解されるとおりの緩衝剤、希釈剤及び他の薬学的に許容される添加剤も含有する場合がある、無菌水性懸濁液を含んでもよい。
本開示のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、例えば、ＡＤ遺伝子の発現又は活性に関連する疾患又は障害を治療するのに有用である。
３．使用方法
本技術の一態様は、アルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチー及び／又は任意の他のタウ関連障害を有すると診断されたか、それを有する疑いがあるか、又はそれを有するリスクのある対象を治療するための方法を含む。治療的適用において、本開示のオリゴヌクレオチドを含む組成物は、ＡＤなどのタウオパチー及び／又は任意のタウオパチー関連障害の疑いがあるか、又は既に罹患している対象に、タウオパチーの発症においてその合併症及び中等度の病的表現型を含む疾患の症状を治癒、又は少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で投与される。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、エクソン及び／又はイントロン領域を含むタウｃＤＮＡ配列に対する親和性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＰＬＣＧ２、ＣＤ３３、ＴＲＥＭ２などの小膠細胞標的又はＡｐｏＥなどのアストログリア標的及びＡＰＰなどの他の神経細胞標的に対する親和性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、表ＧにおけるＭＡＰＴ遺伝子の以下の領域の少なくとも１つに対する親和性を示す。
Figure 2021515784
ある実施形態では、本開示のヌクレオチドは、タウｍＲＮＡのエクソン１０又はエクソン１２に対する親和性を示す。
別の一般的態様では、本開示は、必要とする対象におけるタウオパチーなどの疾患、障害又は状態の症状を治療又は低減する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
別の一般的態様では、本開示は、必要とする対象における病的なタウの凝集又はタウオパチーの伝播を低減する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
本開示の実施形態によれば、医薬組成物は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチドを含む。本開示のオリゴヌクレオチドに関して本明細書で使用する場合、治療有効量は、疾患、障害、又は状態の治療をもたらすか；疾患、障害、又は状態の進行を予防又は遅らせるか；又は免疫疾患、障害、又は状態を伴う症状を低減するか若しくは完全に軽減する本開示のオリゴヌクレオチドの量を意味する。
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果の１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な療法の量を指す：（ｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の重症度を低減若しくは改善すること；（ｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の期間を減少させること；（ｉｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の進行を予防すること；（ｉｖ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の退行をもたらすこと；（ｖ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の発症若しくは発病を予防すること；（ｖｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の再発を予防すること；（ｖｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の入院を減少させること；（ｖｉｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の入院期間を減少させること；（ｉｘ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の生存を増加させること；（ｘｉ）対象において治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を阻害若しくは低減すること；及び／又は（ｘｉｉ）別の療法の予防効果若しくは治療効果を増強若しくは改善すること。
特定の実施形態によれば、治療されることになる疾患、障害又は状態は、タウオパチーである。より具体的な実施形態によれば、治療されることになる疾患、障害又は状態としては、家族性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維型老年認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン認知症複合、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルトヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、慢性外傷性脳症、又は拳闘家認知症（ボクサー病）が挙げられるが、これらに限定されない。
タウオパチー関連行動表現型としては、認知障害、初期人格変化及び脱抑制、無関心、無為症、無言症、失行症、保続症、常同運動／行動、口愛過度、無秩序、逐次的な課題を計画したり又は取りまとめたりできないこと、利己的／冷淡、***的特性、共感の欠如、もたつき、高頻度の錯語的誤りを伴うが理解力は比較的保たれている失文法発話、理解力低下及び喚語困難、緩徐進行性歩行不安定性、後方突進、すくみ、頻繁な転倒、レボドパ不応性軸性硬直、核上性注視麻痺、矩形波眼球運動、緩徐な垂直性サッケード、仮性球麻痺、失行、ジストニー、皮質性感覚消失、並びに振戦が挙げられるが、これらに限定されない。
治療に適した患者には、ＡＤ又は他のタウオパチーのリスクがある無症候者、並びに現在症状を示している患者が含まれるが、これらに限定されない。治療に適した患者には、ＡＤの家族歴又はゲノムにおける遺伝的リスク要因の存在など、ＡＤの既知の遺伝的リスクを有する個体が含まれる。例示的リスク要因は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の、特に７１７位、並びに６７０位及び６７１位における変異（それぞれ、ハーディ型変異及びスウェーデン型変異）である。他のリスク要因は、プレセニリン遺伝子ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４の変異、高コレステロール血症又はアテローム性動脈硬化症の家族歴である。現在ＡＤに罹患している個体は、上記のリスク要因の存在による特徴的な認知症から認めることができる。加えて、ＡＤを有する個体を特定するためのいくつかの診断検査が利用可能である。これらには、脳脊髄液タウ及びＡベータ４２レベルの計測が含まれる。タウレベルの上昇及びＡベータ４２レベルの低下はＡＤの存在を意味する。ＡＤ罹患者はまた、アルツハイマー病・関連障害協会（ＡＤ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の基準によって診断することができる。
本開示のオリゴヌクレオチドは、タウの病的凝集を伴う神経変性疾患、例えば、ＡＤ又は他のタウオパチーを治療又は予防するための治療用薬剤及び予防用薬剤のいずれとしても好適である。無症候患者では、治療は任意の年齢（例えば、約１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳）で始まってもよい。しかしながら、通常は、患者が約４０歳、５０歳、６０歳、又は７０歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は、一般的には、ある期間にわたって複数回の投薬を伴う。
予防的適用においては、医薬組成物又は医薬は、ＡＤに罹り易い、又はさもなければそのリスクがある患者に対して、疾患の生化学的、組織学的な及び／又は行動上の症状、その合併症、及び疾患の発症中に現れる中等度の病的表現型を含む、疾患のリスクを解消又は低減するか、その重症度を軽減するか、又はその発生を遅らせるのに十分な量で投与される。治療的適用においては、組成物又は医薬は、そうした疾患の疑いがあるか、又は既にそれに罹患している患者に対して、疾患の症状（生化学的、組織学的な及び／又は行動上の）のいずれかを低減するか、抑えるか、又は遅らせるのに十分な量で投与される。治療薬の投与により、特徴的なアルツハイマーの病変を未だ発症していない患者における軽度認知障害を低減するか又は消失させることができる。
治療有効量又は投与量は、治療されることになる疾患、障害又は状態、投与の手段、標的部位、対象の生理的状態（例えば、年齢、体重、健康を含む）、対象がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかなどの様々な要因に応じて変動し得る。治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するように最適に用量設定される。
本開示のオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される担体中の有効成分として治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物として調製され得る。担体は、液体、例えば、水及び油、例えば、石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、通常、粒子状物質を含まない。それらは、従来のよく知られる滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などの生理条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物質を含有し得る。そのような医薬製剤における本開示のオリゴヌクレオチドの濃度は、幅広く異なり、すなわち、約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％から１５又は２０重量％まで異なる場合があり、選択された特定の投与方法に従って、必要な用量、液体体積、粘度などに主に基づいて選択されることになる。
本開示のオリゴヌクレオチドの治療的使用のための投与方法は、その薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であり得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、又は頭蓋内投与に好適であるように製剤化され得るか、或いはそれらは、脳又は脊椎の脳脊髄液に投与され得る。
いくつかの実施形態では、本開示に従う注射用製剤は、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接的に投与されてもよい。本明細書で定義する場合、用語「中枢神経系」は、脊椎動物において、脳と脊髄からなる神経系の部分であり、感覚インパルスが伝達され、運動インパルスを配り、且つ神経系全体の活動を連係して働かせる部分として定義される。
ＣＮＳへの直接的な投与の例としては、髄腔内（ＩＴ）投与、及び脳内（ＩＣ）、脳室内、側脳室内（ＩＣＶ）、頭蓋内又は硬膜下投与経路などの脳への直接的な投与が挙げられる。そのような投与経路は、中枢神経系を冒す疾患に特に有益であり得る。
したがって、本開示のある種の態様及び実施形態では、非全身投与は、髄腔内、脳内、脳室内、側脳室内、頭蓋内、及び硬膜下投与からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書で定義される非全身投与は、髄腔内投与である。当業者に知られるとおり、用語「髄腔内投与」は、血液脳関門をバイパスしながらの脊髄のくも膜下腔への注射による治療物質の導入を指す。
他の実施形態では、本明細書で定義される非全身投与は、側脳室内投与である。
当技術分野で知られるとおり、脳室系は、脳内の４つの相互接続した空洞（脳室）のセットであり、ここで、脳脊髄液（ＣＳＦ）が産生される。各脳室内には、ＣＳＦの産生に関与する上衣細胞のネットワークである脈絡叢の領域がある。脳室系は、ＣＳＦの流動の循環を可能にする脊髄の中心管と連続している。
血液脳関門は脳を遮蔽する保護的な役割にもかかわらず、それは、神経変性障害のために設計された潜在的な治療薬の中枢神経系（ＣＮＳ）へのアクセスを制限する。アルツハイマー病などであるがこれに限定されない神経変性疾患は、治療剤をＣＮＳに直接的に導入することから非常に利益を得ることができる。ＣＮＳへの直接的な投与経路の１つは、脳室内投与によって側脳室に直接的に注射することであり、これは、脳脊髄液を介したＣＮＳへの物質の送達をもたらす。
したがって、当技術分野で知られるとおり及び本明細書で使用する場合、用語「側脳室内投与」は、側脳室に直接的に注射することを指す。
本明細書で使用する場合、用語「注射」又は「注射用」は、ボーラス注射（体液中の濃度を上昇させるための薬剤の離散的量の投与）、数分間にわたる緩徐なボーラス注射、若しくは長時間の注入、又は間隔をあけた複数回の継続的な注射／注入を指す。
治療は、単回投与スケジュールで与えられても、又は複数回投与スケジュールとして与えられてもよく、複数回投与スケジュールでは、主要な治療コースは１〜１０回の別個の投与と、続いて応答の維持及び／又は強化に必要な時間間隔後に、例えば２回目の用量について１〜４ヵ月の時点で与えられる他の投与、及び必要であれば数ヵ月後のその後の投与を含むものであり得る。好適な治療スケジュールの例としては、以下が挙げられる：（ｉ）０、１ヵ月、及び６ヵ月、（ｉｉ）０、７日、及び１ヵ月、（ｉｉｉ）０及び１ヵ月、（ｉｖ）０及び６ヵ月、又は疾患症状を低減し、若しくは疾患の重症度を低減すると予想される所望の応答を誘発するのに十分な他のスケジュール。
特定の実施形態によれば、タウオパチーの治療において使用される組成物は、関連する神経変性疾患の治療に有効な他の薬剤と併用して投与され得る。ＡＤの場合、本開示のオリゴヌクレオチドは、アミロイドベータ（Ａベータ）の沈着を低減又は予防する薬剤と併用して投与され得る。ＰＨＦタウ病変及びＡベータ病変は相乗的である可能性がある。したがって、ＰＨＦタウ病変並びにＡベータ病変及びＡベータ関連病変の両方の同時の除去を目的とする併用療法は、各々を個別に標的化するより有効であり得る。パーキンソン病及び関連する神経変性疾患の場合、凝集形態のアルファ−シヌクレインタンパク質を除去するための免疫調節もまた、新たな療法である。タウ及びアルファ−シヌクレインの両タンパク質の除去を同時に標的化する併用療法は、いずれかのタンパク質を個別に標的化するより有効であり得る。
別の一般的態様では、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を作製する方法であって、オリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体を組み合わせて医薬組成物を得ることを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物で治療される対象は、以下の状態又は症状の１つ以上の改善又は消失を示すことになる：家族性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維型老年認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン認知症複合、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルトヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド組成物で治療される対象は、ＡＤなどのタウオパチー及び／又は任意の他のタウ関連障害に罹患している未治療の対象と比較して、タウタンパク質及びＭＡＰＴ ｍＲＮＡの間から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現レベルにおいて低減を示すことになる。
本開示は、ＡＤなどのタウオパチー及び／又は任意の他のタウ関連障害を有すると診断されたか又はそれを有する疑いがある対象を治療するための方法であって、対象に有効量の本開示のオリゴヌクレオチド組成物を投与することを含む方法を提供する。
本開示のオリゴヌクレオチド及び組成物は、アンチセンス療法において使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部などのＡＤに関係付けられる既知のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の標的核酸配列と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有し得る。
いくつかの実施形態は、標的核酸を本開示のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物と接触させることによって、標的の発現を調節する方法を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞、例えば、ヒトなどの動物中にある。
いくつかの実施形態は、動物中のＭＡＰＴ遺伝子の発現を阻害する方法であって、動物に本開示のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を投与することを含む方法を含む。オリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴ遺伝子の一部と相補的であり得るか又はハイブリダイズし得る。
いくつかの実施形態は、ＡＤを有する対象におけるタウｍＲＮＡ発現又はタウタンパク質のレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする対象に投与し、それにより対象中のタウｍＲＮＡ発現又はタウタンパク質のレベルを低減することを含む方法を含む。オリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴ ｍＲＮＡなどのタウｍＲＮＡの発現に関与する標的ＲＮＡの一部と相補的であり得るか又はハイブリダイズし得る。
本開示のオリゴヌクレオチド及び組成物は、例えば、ＡＤを有する対象の治療のために又はＡＤを有するか若しくはＡＤと診断された対象においてタウ又はＭＡＰＴタンパク質レベルを低減するために、タウ又はＭＡＰＴ遺伝子発現を阻害するか又は低減するか、又はタウ又はＭＡＰＴの転写又は翻訳を阻害するために使用され得る。実施形態において、開示されるキメラオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴ遺伝子などの標的遺伝子でＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導するために使用される。
本開示はまた、対象への送達のためのオリゴヌクレオチドを安定化する方法を対象とする。オリゴヌクレオチドの安定化は、オリゴヌクレオチドの融点又は融解温度であるＴｍを上昇させることとして本明細書で特徴付けられる［定量化される］。
開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、単独で又は標的となる病気のための１つ以上の追加の治療と併用して投与され得る。開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、単独で又はＡＤのための１つ以上の追加の治療と併用して投与され得る。併用療法において、オリゴヌクレオチドコンストラクト及びＡＤのための１つ以上の追加の治療は、同じ又は別個の組成物において同時に投与されてもよいし、同時に又は逐次的に別々に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、タウ若しくはＭＡＰＴ転写又は翻訳阻害剤と併用して、又は抗ＡＤオリゴヌクレオチド薬剤とタウ若しくはＭＡＰＴ転写又は翻訳阻害剤を併用するレジメンにおいて投与される。実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ＡＤなどのタウオパチーのための標準治療と併用して投与される。ＡＤなどのタウオパチーの標準治療は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体調節剤、ＢＡＣＥ阻害剤、タンパク質凝集阻害剤、抗タウ抗体、抗Ａベータ抗体、タウワクチン投与、Ａベータワクチン投与及びタウオパチーのための他の既知の治療を含み得る。実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、同時（同時投与）又は逐次的投与のいずれかの後に１種以上のオリゴヌクレオチドと併用して投与される。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、タウＡＳＯ−１２などのアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｄｅｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７ Ｊａｎｕａｒｙ ２５；９（３７４））、ｍｉＲＮＡ模倣物若しくは阻害剤、アプタマー、立体配置に関する遮断薬、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又は免疫調節性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態は、細胞又は対象中のＭＡＰＴ遺伝子発現の阻害であって、細胞と本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を接触させること、又は治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む阻害を含む。
いくつかの実施形態は、ＭＡＰＴ遺伝子の発現又は活性と関連する疾患又は障害の治療であって、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む治療を含む。
いくつかの実施形態は、タウオパチーを有する対象におけるタウｍＲＮＡ発現又はアルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチーのタウタンパク質のレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする対象に投与し、それにより対象中のタウｍＲＮＡ発現又はタウタンパク質のレベルを低減することを含む方法を含む。
いくつかの実施形態は、タウオパチーを有する対象におけるＭＡＰＴ ｍＲＮＡ発現又はアルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチーのＭＡＰＴタンパク質のレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする対象に投与し、それにより対象中のＭＡＰＴ ｍＲＮＡ発現又はＭＡＰＴタンパク質のレベルを低減することを含む方法を含む。
一実施形態では、ＭＡＰＴを標的化する本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物は、本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物の対象への投与時に、ＭＡＰＴ遺伝子の発現及び／又はタウタンパク質レベルが、例えば、対象の細胞、組織、血液又は他の組織若しくは体液において、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％以上、又はこれらの数値の２つの間の値だけ低減されるように、アルツハイマー病などのタウオパチー及び／又は任意のタウオパチー関連障害を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、タウタンパク質レベルは、上に列挙した量だけ低減される。いくつかの実施形態では、ＭＡＰＴ遺伝子を含む１つ以上の遺伝子の発現が、上に列挙した量だけ低減される。
本開示の方法及び使用に従う本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物の投与は、アルツハイマー病などのタウオパチー及び／又は任意のタウオパチー関連障害を有する患者において、そのような疾患又は障害の重症度、徴候、症状、及び／又はマーカーの低減をもたらし得る。この文脈における「低減」は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは約１００％、又はこれらの数値の２つの間の値であり得る。
本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物の量は、医療従事者によって決定され得る。製品の１日投与量は、１日に成人のヒト当たり０．００１〜１，０００ｍｇの幅広い範囲、又はその中の任意の範囲にわたって変動され得る。ＩＴ又はＩＣＶ投与に関して、組成物は、好ましくは、治療されることになる患者に対する投与量の症状による調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０、及び５００ミリグラムの有効成分を含有する懸濁剤の形態で提供される。有効量の薬物は通常、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、又はその中の任意の範囲の投与量レベルで供給される。好ましくは、範囲は、１日当たり約０．０１〜約５０．０ｍｇ／ｋｇ体重、又はその中の任意の範囲である。より好ましくは、１日当たり約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重、又はその中の任意の範囲である。より好ましくは、１日当たり約０．０１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ体重、又はその中の任意の範囲である。オリゴヌクレオチドは、１日当たり１〜４回のレジメンに基づいて投与され得る。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇのうちの１つ以上の用量で投与され得る。例えば、開示されるオリゴヌクレオチドは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本開示の一部であることが意図される。これらの値は、髄腔内又は脳室内送達に適用され得る。本明細書に記載される送達の他の形態もまた、これらの用量で投与され得る。投与量は、患者の必要性、治療されている状態の重症度、及び利用されているオリゴヌクレオチドに応じて変動され得る。毎日の投与又は間欠投与のいずれかの使用が行使され得る。
本開示のオリゴヌクレオチドは、ある期間にわたって、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は約２５分の期間にわたって髄腔内又は脳室内注入によって投与され得る。投与は、例えば、定期的に、例えば、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、又はそれ以上の間毎週、隔週（すなわち、２週間毎）に繰り返され得る。最初の治療レジメンの後、治療は、より少ない頻度で施され得る。例えば、３ヶ月の間の毎週又は隔週の投与の後、投与は、６ヶ月間又は１年以上の間１ヶ月に１回繰り返され得る。
疾患の治療又は予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、認知機能検査の指標、疼痛の減少、生活の質、治療効果を維持するのに必要な医薬の用量、疾病マーカーのレベル又は治療されているか若しくは予防の標的となる所与の疾患に適した任意の他の測定可能なパラメーターレベルを測定することによって評価することができる。このようなパラメーターのいずれか１つ、又はパラメーターの任意の組合せを測定することによって、治療又は予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＡＤなどのタウオパチーの治療の有効性は、例えば、ＭＡＰＴ遺伝子の発現及び／又はタウタンパク質レベルの定期的なモニタリングによって評価され得る。最初の読み取り値と後の読み取り値の比較は、治療が有効かどうかの指標を提供する。
４．定義
本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、本発明の範囲を限定することが意図されていないことを理解すべきである。別段の指示がない限り、以下の定義が適用されるものとする。
本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関して本明細書で使用される場合の用語「相補的な」又は「相補性」は、塩基対形成の規則を指す。本明細書で使用する場合、核酸配列の相補物は、一方の配列の５’末端が、他方の３’末端と対になるように核酸配列を整列させたとき、「逆平行の会合」にあるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５」と相補的である。本明細書に記載される核酸には、天然に存在する核酸に一般的に見出されない特定の塩基が含まれてもよい。これらは、例えば、イノシン、７−デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。相補性は、完全である必要はない；安定な二重鎖は、ミスマッチ塩基対、変性、又は非対応塩基を含有し得る。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成物、及びオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の発生率を含むいくつかの可変要素を実験的に検討して二重鎖安定性を決定することができる。相補的配列はまた、ＤＮＡ配列又はその相補物と相補的なＲＮＡ配列であってもよいし、ｃＤＮＡであってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリダイズ」は、２つの実質的に相補的な核酸鎖（少なくとも１４〜２５個の一続きのヌクレオチドにわたって少なくとも約６５％相補的、少なくとも約７５％相補的、又は少なくとも約９０％相補的）が、適切にストリンジェントな条件下で互いにアニールして、相補的な塩基対間の水素結合の形成を介して二重鎖又はヘテロ二重鎖を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーションは通常、及び好ましくは、プローブ長の核酸分子、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１８〜５０ヌクレオチド長で行われる。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙを参照されたい。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連する条件のストリンジェンシー、及び形成されるハイブリッドの熱的融点（Ｔｍ）のような要因によって影響される。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列は、安定にハイブリダイズすることになるが、より低い相補性を有するものはハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定し且つ調整する方法を理解している。ハイブリダイゼーション条件及びパラメーターの例に関して、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊを参照されたい。いくつかの実施形態では、特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で発生する。標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、プローブ又はプライマー）は、好適な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズする」ことになる。
本明細書で使用する場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも以下と同程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの超音波処理されたサケ***ＤＮＡ、及び５×デンハート液中において４２℃で一晩のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳによる４５℃での洗浄；及び０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳによる４５℃での洗浄。別の例において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、一続きの２０個の連続するヌクレオチドに対して３塩基以上異なる２つの核酸のハイブリダイゼーションを可能にしないはずである。
本明細書で使用する場合、用語「実質的に相補的」は、２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。当業者は、実質的に相補的な配列が、それらの全長に沿ってハイブリダイズする必要はないことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする塩基の連続する配列に対して３’又は５’に位置する、標的配列にハイブリダイズしない塩基の連続する配列を含んでもよい。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」は、生物学的に又はその他の点で望ましくないことはない材料を指し、すなわち、当該材料は、患者に投与される医薬組成物に組み込んでもよく、何らかの望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、又は当該材料を含有する組成物のその他の構成成分のうちのいずれかと有害な様式で相互作用することもない。用語「薬学的に許容される」が、医薬担体又は賦形剤を指すために使用される場合、担体又は賦形剤が、毒性学的試験及び製造試験の要求される基準を満たしたこと又はそれが米国医薬品局（Ｕ．Ｓ．ａｎｄ Ｄｒｕｇ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれることを意味する。
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドの「コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」又は「コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」という用語は、本開示のオリゴヌクレオチド、及び例えば、一部のキメラオリゴヌクレオチドにおける（１）本明細書に記載されるものなどのコンジュゲート部分（標的化部分など）又は（２）修飾／未修飾ヌクレオチドのドメインを指すことができる。
本明細書で使用する場合、用語「キメラオリゴヌクレオチド」は、例えば、式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）によって例示されるとおり、２つ以上のドメインを有するオリゴヌクレオチドを指す。キメラオリゴヌクレオチドは、追加の構成成分、例えば、リガンド標的化基又は追加のヌクレオチド、リンカーなどを含んでもよい。
本明細書で使用する場合、用語「修飾ヌクレオシド」は、独立して修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを指す。ヌクレオシドは、ホスホジエステルサブユニット間結合、チオホスフェートサブユニット間結合、ホスホロアミダートサブユニット間結合、及びチオホスホロアミダートサブユニット間結合などのサブユニット間結合を介して連結され得ることが理解される。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオチドとサブユニット間結合を合わせて指してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「未修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。「修飾核酸塩基」としては、５ーメチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル並びに他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル並びに他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及び他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成核酸塩基及び天然核酸塩基が挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環系ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ（２−ａｍ−ｏｅ１ｈｏｘｙ））−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３，２，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプが挙げられる。修飾核酸塩基はまた、プリン又はピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンで置換されているものを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルウラシル、及びｇ−クランプからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｇ−クランプは、
Figure 2021515784
である。
本明細書で使用する場合、用語「リガンド標的化基」又は「標的化部分」は、細胞による取込みを増強するか又はその標的配列に対するオリゴヌクレオチドの生体利用能を含む薬物動態を向上させる、タウオパチーに関係付けられる細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する部分を指す。これらの基は、細胞表面上の受容体を標的化する受容体標的化リガンドを含む。
本明細書で使用する場合、用語「立体構造的に制限されたヌクレオシド」は、架橋又は二環式糖構造を有するヌクレオシドであって、ヌクレオシドの立体構造が、特定の配置に固定され得るヌクレオシドを指す。例えば、立体構造的に制限されたヌクレオシドは、固定されたＣ３’−エンド糖パッカリングを有するものを含む。例示的な実施形態としては、架橋核酸（ＢＮＡ）、例えば、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＨ］、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＭｅ］、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＢｎ］、アミノオキシ（４’ーＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、及びオキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡなどの２’，４’−ＢＮＡヌクレオシドが挙げられる。他の例示的なＢＮＡ構造としては、糖の４’位と２’位の間で少なくとも１つの架橋を有するオリゴヌクレオチドであって、架橋の各々が独立して、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ１）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ（Ｒ１）−（式中、ｘは、０、１、又は２であり；ｎは、１、２、３、又は４であり；各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環基、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環基、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環基、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；且つ各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環基、置換複素環基、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である）から独立して選択される１個又は２〜４個の連結基を含むオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ある種のＢＮＡが作製されており、特許文献及び科学文献において開示される（例えば、全体として参照により本明細書に援用される、登録された米国特許第７，０５３，２０７号明細書；同第６，２６８，４９０号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；同第６，５２５，１９１号明細書；同第７，６９６，３４５号明細書；同第７，５６９，５７５号明細書；同第７，３１４，９２３号明細書；同第７，２１７，８０５号明細書；及び同第７，０８４，１２５号明細書を参照されたい）。「立体構造的に制限されたヌクレオチド」は、サブユニット間結合を介して連結された立体構造的に制限されたヌクレオシドを指す。
いくつかの実施形態では、立体構造的に制限されたヌクレオシドは、任意選択により置換されたＬＮＡ又は任意選択により置換されたＥＮＡから選択される。任意選択により置換されたＬＮＡ又はＥＮＡは、アルキル部分、例えば、−ＣＨ２−部分の１つにおけるメチル又はエチルによって置換され得る。
本明細書で使用する場合、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。本用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。本用語はまた、ＲＮＡの転写の１つ以上のポリペプチドへの転写を包含し、且つさらに天然に存在する全ての転写後修飾及び翻訳後修飾を包含する。本開示のオリゴヌクレオチドは、宿主細胞の細胞質内にあるか、細胞培養の増殖培地などの細胞外環境中にあるか、又は細胞膜に繋留され得る。
本明細書で使用する場合、用語「発現を阻害する」は、発現又は活性の低減又は遮断を指し、必ずしも発現又は活性の全体的な消失を示さない。
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質レベルを低減する」は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を形成するｍＲＮＡの転写の低減又は遮断を指し、必ずしもｍＲＮＡの転写又はタンパク質の全体的な消失を示さない。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物を指し、ヒト及び非ヒト動物を含む。いくつかの実施形態では、対象は、成人のヒトなどのヒトである。
本明細書で使用する場合、用語「タウ」又は「タウタンパク質」は、複数のアイソフォームを有する大量の中枢及び末梢神経系タンパク質を指す。ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）においては、３５２〜４４１アミノ酸長のサイズにわたる６つの主要なタウアイソフォームが、選択的スプライシングのために存在する（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１５：１１２−９，２００９）。これらのアイソフォームは、０〜２個のＮ末端インサート、及び３個又は４個のタンデムに配置された微小管結合リピートを規定された形式で含むことによって互いに異なり、０Ｎ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ、２Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ及び２Ｎ４Ｒと称される。本明細書で使用する場合、用語「対照タウ」は、リン酸化及び他の翻訳後修飾を欠くタウアイソフォームを指す。本明細書で使用する場合、用語「タウ」は、変異、例えば、全長野生型タウの点変異、断片、挿入、欠失及びスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。用語「タウ」はまた、タウアミノ酸配列の翻訳後修飾を包含する。翻訳後修飾としては、リン酸化が挙げられるが、これに限定されない。タウは、微小管に結合し、タウリン酸化によって調節され得るプロセスである細胞を介するカーゴの輸送を制御する。ＡＤ及び関連障害において、タウの異常なリン酸化が優勢であり、タウのペアードヘリカルフィラメント（ＰＨＦ）と呼ばれる細線維への凝集に先行し、且つそれを誘発すると考えられる。ＰＨＦの主要な成分は、高リン酸化型タウである。本明細書で使用する場合、用語「ペアードヘリカルフィラメント−タウ」又は「ＰＨＦ−タウ」は、ペアードヘリカルフィラメントにおけるタウ凝集物を指す。ＰＨＦ構造における２つの主な領域であるファジーコート及びコアフィラメントは、電子顕微鏡観察において明らかであり；ファジーコートは、タンパク質分解に対して感受性であり、且つフィラメントの外側に位置し、フィラメントのプロテアーゼ耐性コアは、ＰＨＦの骨格を形成する（Ｗｉｓｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８５：４８８４−８，１９８８）。
本明細書で使用する場合、「タウオパチー」は、脳内におけるタウの病的凝集を伴う任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び孤発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウオパチーは、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維型老年認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン認知症複合、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルトヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、及び慢性外傷性脳症、例えば、拳闘家認知症（ボクサー病）である（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ７０：４１０−２６，２０１１）。
本明細書で使用する場合、用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は全て、対象において必ずしも識別可能ではないが、対象において識別可能であり得るタウオパチーに関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメーターの改善又は回復を指すことが意図される。用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」はまた、疾患、障害、又は状態の退行をもたらすこと、進行を予防すること、又は少なくとも進行を遅らせることを指してもよい。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、タウオパチーに関連する１つ以上の症状の改善、発症若しくは発病の予防、又は期間の減少を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、疾患、障害、又は状態の再発の予防を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、疾患、障害、又は状態を有する対象の生存の増加を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は状態の消失を指す。
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、対象における所望の生物学的応答又は医学的応答を誘発する有効成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記述されている目的に対して、実験的に且つ通例の様式で決定され得る。例えば、インビトロアッセイは任意選択により、最適な投与量範囲の特定を助けるために利用され得る。特定の有効用量の選択は、治療又は予防されることになる疾患、関連する症状、患者の体重、患者の免疫状態及び当業者によって知られる他の因子を含むいくつかの因子の検討に基づいて、当業者によって（例えば、臨床試験により）決定され得る。製剤中に用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び疾患の重症度にも依存することになり、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」は、本開示の化合物の生理的且つ薬学的に許容される塩、すなわち、親オリゴヌクレオチド／化合物の所望の生物活性を保持し、且つそれに対して望ましくない毒性学的効果を与えない塩を意味する。
以下の略語が、本開示において使用される。２’−Ｈ（デオキシリボース）ヌクレオシドは、核酸塩基に対応する大文字、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴによって参照される。２’−ＯＨ（リボース）ヌクレオシドは、小文字ｒ及び核酸塩基に対応する大文字、例えば、ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、及びｒＵによって参照される。２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオシドは、小文字のｍ及び核酸塩基に対応する大文字、例えば、ｍＡ、ｍＣ、ｍＧ及びｍＵによって参照される。２’−ＭＯＥヌクレオシドは、小文字の「ｍｏｅ」及び核酸塩基に対応する大文字、例えば、ｍｏｅＡ、ｍｏｅＣ、ｍｏｅＧ及びｍｏｅＵによって参照される。２’−リボ−Ｆヌクレオシドは、小文字の「ｆ」及び核酸塩基に対応する大文字、例えば、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ及びｆＵによって参照される。２’−アラビノ−Ｆヌクレオシドは、小文字の「ａｆ」及び核酸塩基に対応する大文字、例えば、ａｆＡ、ａｆＣ、ａｆＧ及びａｆＵによって参照される。ｍＡ＊は、３’−アミノ−２’−ＯＭｅ−２，６−ジアミノプリンである。Ａ＊は、３’−アミノ−２’−デオキシｋ−２，６−ジアミノプリンである。ｆＡ＊は、３’−アミノ−２’−Ｆ−２，６−ジアミノプリンである。ＬＮＡヌクレオシドは、「Ｌ」及び核酸塩基に対応する大文字、例えば、ＬＡ、ＬＣ、ＬＧ及びＬＴによって参照される。
ヌクレオチドの骨格又はサブユニット間結合に関して、ホスホジエステルサブユニット間結合は、「ＰＯ」として参照されるか、又は一般に配列の詳細に含まれない；チオホスフェートサブユニット間結合は、小文字の「ｐｓ」として略記され；ホスホロアミダートサブユニット間結合は、小文字の「ｎｐ」として略記され；且つチオホスホロアミダートサブユニット間結合は、小文字の「ｎｐｓ」として略記される。
Ｎ３’→Ｐ５’は、サブユニット間結合を有する修飾ヌクレオチドを指し、ここで、３’部分は、Ｎ（例えば、ＮＨ）を含有し、Ｐを介して連結される。例えば、以下の構造は、Ｎ３’→Ｐ５’結合を有する：
Figure 2021515784
本明細書で使用する場合、及び添付した特許請求の範囲においては、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲が、任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ〜のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語の使用、又は「否定的な」限定の使用のための先行詞として機能することを意図している。
用語「約」は、当業者により理解されることになり、用いられる文脈によりある程度変化することになる。使用される文脈から当業者には明らかでないその用語の使用がある場合、「約」は、特定の用語のプラス又はマイナス１０％までを意味することになる。一定の範囲は、用語「約」によって先行される数値とともに本明細書で提示される。本明細書では、用語「約」は、それが先行する正確な数及びその用語が先行する数に近い又はおよその数である数の文字どおりの裏付けを提供するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか又はおよその数であるかを判断する際、近いか又はおよその列挙されていない数は、それが提示された文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価物を提供する数であり得る。
また、本明細書に記載される疾患又は状態の治療又は予防の様々な様式は、全体的ではあるがそれに満たない治療又は予防を含む「実質的な」を意味することが意図されており、ここで、生物学的又は医学的に妥当な何らかの結果が達成されることも理解されたい。治療は、慢性疾患のための継続的な長期的治療又は急性状態の治療のための単回、又は数回の投与であり得る。
値の範囲が提供されている場合、文脈において明確に別段の指示がない限り、下限値の単位の１０分の１まで、その範囲の上限値と下限値の間の各中間の値、及びその指定された範囲における任意の他の指定された値又は中間の値が、本発明の範囲内に包含されると理解されたい。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、より狭い範囲に独立して含まれてもよく、これらはまた、指定された範囲においていずれかの明確に除外された端点によって変わる本発明の範囲内に包含される。指定された範囲が端点の一方又は両方を含む場合、含まれる端点のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
本開示は、変化する場合があるため、記載された特定の実施形態に限定されるものではない。さらに、本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、且つ本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、限定することを意図しないことが理解されるべきである。
本開示を読めば当業者には明らかであろうが、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるか又は組み合わせられ得る別個の構成要素及び特徴を有する。列挙した方法はいずれも、列挙した事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。
本明細書において引用された全ての刊行物及び特許が、各々の個々の刊行物又は特許が具体的に且つ個々に参照により援用されることが示されたかのように、参照により本明細書に援用され、また、関連して刊行物が引用されている方法及び／又は材料を開示及び説明するために参照により本明細書に援用される。あらゆる刊行物の引用は、出願日前のその開示についてであり、本発明が、先行発明のためにこのような刊行物より先行する権限はないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、これは独立して確認される必要があり得る。
５．実施例
以下の実施例は、本開示のある種の実施形態を例示して、本開示を実践する際に当業者を助ける。したがって、本実施例は、決して本開示の範囲を限定するものではない。
作製方法
全ての単量体は、乾燥剤（ＫＯＨ及びＰ２Ｏ５、室温、２４時間）とともに真空乾燥器中で乾燥された。最初の５’残基に結合された合成用固体支持体（ＣＰＧ）は、市販の供給元から得られた。全ての他の合成試薬及び溶媒は、市販の供給元から得られ、そのまま使用された。合成後のワークフローのための化学物質及び溶媒は、市販の供給元から購入され、いずれの精製又は処理も伴わずに使用された。溶媒（アセトニトリル）及び溶液（アミダイト及び活性化剤）は、合成の間モレキュラーシーブ上に貯えられた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ−３９４合成機上で、製造業者によって記載された標準的な９３−ステップのサイクルを使用して合成された。固体支持体は、制御された細孔ガラスであり、単量体は、標準的な保護基を含有した。各オリゴヌクレオチドは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルに従って、市販の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ＤＮＡ並びに／又は６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）、４−Ｎ−アセチルシチジン（ＣＡｃ）、２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）、及びチミジン（Ｔ）の２’−Ｏ−Ｍｅホスホラミダイト単量体を使用して個別に合成された。ホスホラミダイトは、市販の供給元から購入された。２’−Ｏ−Ｍｅ−２，６，ジアミノプリンホスホラミダイトは、市販の供給元から購入された。ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアザオリン−３−チオンは、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成のための硫黄移動剤として使用された。修飾オリゴヌクレオチドは、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化剤の存在下でのＣＨ３ＣＮ中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液の固体結合オリゴヌクレオチドに対する伸長カップリングに続く標準的なキャピング、酸化及び脱保護を使用して得られた。全ての修飾ホスホラミダイトの段階的なカップリング効率は、９８％を超えた。オリゴヌクレオチド担持固体支持体を、５５℃で８時間水性アンモニア／エタノール（３：１）溶液とともに加熱して、塩基不安定性の保護基を脱保護した。
トコフェロールコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、ＴＥＧリンカー上で結合したトコフェロール支持体上での最初の固相合成及び支持体結合オリゴヌクレオチドへのホスホラミダイトの最終的なカップリングによって得てもよい。トコフェロールコンジュゲート配列は、内製の充填済みＲＰＣ−Ｓｏｕｒｃｅ１５逆相カラム上での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製され得る。緩衝液は、１０％ ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭ ＮａＯＡｃ（緩衝液Ａ）及び７０％ ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭ ＮａＯＡｃ（緩衝液Ｂ）であってもよい。分析的ＨＰＬＣ及びＥＳ ＬＣ−ＭＳは、オリゴヌクレオチドの完全性を確証する。
Figure 2021515784
ホスホロアミダート（ＮＰ）及びチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）修飾オリゴヌクレオチドの合成
ＮＰ及びＮＰＳ修飾オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ−３９４合成機上で、デブロック、カップリング及び待ち時間のステップを変更して記載された９３−ステップのサイクルを使用して合成された。固体支持体は、３’−ＮＨＴｒ−５’−ＬＣＡＡ−ＣＰＧであった。各オリゴヌクレオチドは、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１４ ２６６１−２６６８において記載される手順を使用することによる標準的な固相ホスホラミダイト化学反応プロトコルに従って、６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）、４−Ｎ−ベンジルシチジン（ＣＢｚ）、２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）、及びチミジン（Ｔ）の３’−ＮＨ−Ｔｒ−５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ＤＮＡホスホラミダイト単量体を使用して個別に合成された。
Figure 2021515784
オリゴマー合成のための３’−ＮＨＴｒ−ＤＮＡ構成要素
２’−Ｆ ３’−ＮＨ−ＭＭＴｒ−５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ウリジン（Ｕ）及び４−Ｎ−ベンゾイルシチジン（ＣＢｚ）ホスホラミダイト単量体）は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１５，２９６６−２９７３において記載される手順を使用することによって合成された。
Figure 2021515784
２’−Ｆ ３’−ＮＨ−ＭＭＴｒ−５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）、２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）は、下記の手順のとおりに合成された。
Figure 2021515784
ＰＨ−１の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５００ｍＬ）中の（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３，４−ジオール（３００ｇ、１．１２３ｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、トリフェニルホスフィン（７３５ｇ、２．８０２ｍｏｌ、２．５０当量）を加えた。得られた溶液を、０℃で１５分間撹拌した。これに続いて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５００ｍＬ）中のアゾジカルボン酸ジエチル（４４９．４ｇ、２．５８１ｍｏｌ、２．５４当量）の溶液を、０℃にて６０分で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、２５℃で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。生成物を、エーテルの添加により沈殿させた。固体を濾過により回収した。粗生成物を、メタノールからの再結晶により精製した。固体を、減圧下にてオーブン中で乾燥させた。これにより、白色固体として１８６ｇ（６６％）のＰＨ−１を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：８．３４−８．０７（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．２６（ｍ，２Ｈ），６．３０−６．２１（ｍ，１Ｈ），５．０７−４．９５（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．２０（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．０３（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．５０（ｍ，２Ｈ）．
ＰＨ−２の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うピリミジン（１０００ｍＬ）中のＰＨ−１（１００ｇ、４０１．２ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、塩化ベンゾイル（１７５ｇ、１．２４５ｍｏｌ、３．１０当量）を０℃にて３０分で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、２５℃で３時間撹拌した。得られた溶液を、４００ｍＬの酢酸エチルで希釈した。得られた混合物を、３×３００ｍＬの水及び２×３００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液でそれぞれ洗浄した。得られた混合物を、１×３００ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、酢酸エチル／石油エーテル（２／１）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、白色固体として１５７ｇ（７０％）のＰＨ−２を得た。
ＰＨ−３の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）中のＰＨ−２（３０ｇ、５３．４２ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、塩化アンモニウム（５．７ｇ、１０６．５６ｍｍｏｌ、２．００当量）及びアジ化ナトリウム（３４．８ｇ、５３５．３０ｍｍｏｌ、１０．００当量）を順番に加えた。得られた溶液を、５０℃で５時間撹拌した。得られた溶液を、２０００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた混合物を、３×２０００ｍＬの水、１×２０００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び１×２０００ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液でそれぞれ洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、白色固体として２４ｇ（９０％）のＰＨ−３及びＰＨ−３Ｓ（５：１）を得た。
ＰＨ−４の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中のＰＨ−３及びＰＨ−３Ｓ（５：１）（１０ｇ、１９．９８ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１０．６９ｇ、７０．２２ｍｍｏｌ、３．５０当量）を加えた。これに続いて、パーフルオロブチルスルホニルフルオライド（１２．６９ｇ、２．１０当量）を、０℃にて１０分で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、０℃で１．５時間撹拌した。得られた溶液を、２００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた混合物を、３×２００ｍＬの水、１×２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び１×２００ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液でそれぞれ洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、１：１の比の酢酸エチル／石油エーテルから再結晶させた。これにより、白色固体として６ｇ（６０％）のＰＨ−４及びＰＨ−４Ｓ（５：１）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：５０３．
ＰＨ−５の調製
Figure 2021515784
テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中のＰＨ−４及びＰＨ−４Ｓ（５：１）（１０ｇ、１９．９０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、１０％パラジウム炭素（３．０ｇ）を加えた。フラスコを真空にし、窒素で３回フラッシングした後、水素でフラッシングした。得られた溶液を、室温で１時間撹拌した。固体を、濾過して取り出した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物（１０ｇ）を、次の条件を用いてフラッシュ−分取−ＨＰＬＣにより精製した（ＩｎｔｅｌＦｌａｓｈ−１）：カラム、Ｃ１８；移動相、水及びアセトニトリル（３０％アセトニトリルから３０分で５０％まで）；検出器、ＵＶ ２５４ｎｍ。これにより、白色固体として７ｇ（７４％）のＰＨ−５及び白色固体として１．０ｇのＰＨ−５Ｓを得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：４７７．
ＰＨ−６の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うピリジン（４０ｍＬ）中のＰＨ−５（４ｇ、８．４０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（１．５ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ、１．５０当量）及び塩化４−メトキシトリフェニルメチル（１０．３ｇ、４．００当量）を順番に加えた。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた溶液を、３００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた混合物を、１×３００ｍＬの水及び３×３００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。得られた混合物を、１×３００ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液でそれぞれ洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００／１）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、白色固体として５．７ｇ（９１％）のＰＨ−６を得た。
ＰＨ−７の調製
Figure 2021515784
ピリジン／メタノール／水（３２．２／１４．７／２．４ｍＬ）中のＰＨ−６（５ｇ、６．６８ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、水酸化ナトリウム（２ｍｏｌ／Ｌ）（７．２ｍＬ、１．１０当量）を０℃にて５分で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、０℃で２０分間撹拌した。次に、反応物を、２００ｍＬの氷水の添加によってクエンチした。得られた溶液を、４００ｍＬのジクロロメタンで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を、１×３００ｍＬの水及び１×３００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、メタノール／ジクロロメタン（１：１００）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、白色固体として４．３ｇ（１００％）のＰＨ−７を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：６４５．
ＰＨ−８の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＰＨ−７（１９．４ｇ、３５．８９ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、３−（［ビス［ビス（プロパン−２−イル）アミノ］ホスファニル］オキシ）プロパンニトリル（１１．７９ｇ、３９．１２ｍｍｏｌ、１．３０当量）を加えた。これに続いて、４，５−ジシアノイミダゾール（４．２６ｇ、１．２０当量）を０℃で加えた。得られた溶液を、室温で３０分間撹拌した。得られた溶液を、１０００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた混合物を、３×８００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び１×８００ｍＬの塩化ナトリウム溶液でそれぞれ洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、次の条件を用いてフラッシュ−分取−ＨＰＬＣにより精製した：カラム、Ｃ１８；移動相、水及びアセトニトリル（４０％アセトニトリルから６分で８０％まで）；検出器、ＵＶ ２５４ｎｍ。これにより、白色固体として１５．２ｇ（５０％）のＰＨ−８を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：８４５．
Figure 2021515784
ＰＨ−１１の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７Ｌ）中の２−アミノ−９−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−６−オン（７００ｇ、２．４７ｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、イミダゾール（５０４ｇ、７．４１ｍｏｌ、３．００当量）を加えた。これに続いて、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（７７０ｇ、２．４４ｍｏｌ、１当量）を、２０℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、２０℃で１６時間撹拌した。次に、反応溶液を、７０Ｌの水／氷に注いだ。固体を濾過により回収した。これにより、白色固体として１２００ｇ（９２％）のＰＨ−１１を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：５２６．
ＰＨ−１２の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うジクロロメタン（５０００ｍＬ）中のＰＨ−１１（５３０ｇ、１．０１ｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ピリジン（７２５ｇ、９．１７ｍｏｌ、９．００当量）及び４−ジメチルアミノピリジン（１４７ｇ、１．２０ｍｏｌ、１．２０当量）を順番に加えた。これに続いて、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（４２６ｇ、１．５１ｍｏｌ、１．２０当量）を０℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、０℃で１５分間撹拌した。次に、得られた溶液を、２０℃でさらに２時間撹拌しながら反応させた。得られた溶液を、５０００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた溶液を、２×３０００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム及び１×３０００ｍＬの飽和塩化ナトリウムでそれぞれ洗浄した。溶液を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、褐色固体として６００ｇ（９０％）のＰＨ−１２を得た。
生成物をさらに精製することなく次の工程で直接的に使用した。
ＰＨ−１３の調製
Figure 2021515784
アルゴンの不活性雰囲気を伴うＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０００ｍＬ）中のＰＨ−１２（２００ｇ、３０４．０４ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、亜硝酸ナトリウム（１１５ｇ、１．６７ｍｏｌ、５．００当量）を加えた。得られた混合物を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた溶液を、５０００ｍｌの水／氷に注いだ。固体を濾過により回収した。粗生成物を、１／４の比のジクロロメタン／アセトニトリル（５０ｍｌ／ｇ）から再結晶させた。これにより、固体として７８ｇ（最後の２工程にわたって４９％）のＰＨ−１３を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：５２６．
ＰＨ−１４の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中のＰＨ−１３（５０ｇ、９５．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、テトラブチルアンモニウムフルオライド（９５ｍＬ、１．００当量、テトラヒドロフラン中の１Ｎ）を加えた。得られた混合物を、２０℃で１２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗製物を、１／５の比のメタノール／酢酸エチル（２０ｍｌ／ｇ）から３回再結晶させた。固体を濾過により回収し、続いて以下の条件を用いてフラッシュにより精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、水及びアセトニトリル（２％アセトニトリルから１０分で１０％まで）；検出器、ＵＶ ２５４ｎｍ。これにより、褐色固体として１６ｇ（５９％）のＰＨ−１４を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：１０．４４（ｓ，１Ｈ），６．４９（ｓ，２Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），５．５５−５．６５（ｍ，２Ｈ），５．１０（ｓ，１Ｈ），４．０８（ｍ，２Ｈ），３．７６（ｍ，１Ｈ），３．６４（ｍ，１Ｈ）．
ＰＨ−１５の調製
Figure 2021515784
アルゴンの不活性雰囲気を伴うＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０００ｍＬ）中のＰＨ−１４（２２０ｇ、７７６．７２ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、トリフェニルホスフィン（５０９ｇ、１．９４ｍｏｌ、２．５０当量）を加えた。得られた溶液を、０℃で１．５時間撹拌した。これに、アゾジカルボン酸ジエチル（３３８ｇ、１．９４ｍｏｌ、２．５０当量）を０℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。得られた混合物を、２０Ｌの冷エチルエーテルに注いだ。固体を濾過により回収し、続いて１／１０の比のメタノール／酢酸エチル（１０ｍｌ／ｇ）から再結晶させた。これにより、褐色固体として１００ｇ（４９％）のＰＨ−１５を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２６６．
ＰＨ−１６の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０００ｍＬ）中のＰＨ−１５（１００ｇ、３７７．０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、イミダゾール（７７ｇ、１．１３１ｍｏｌ、３．００当量）を加えた。これに続いて、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１４２ｇ、９４２ｍｍｏｌ、１．５０当量）を０℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。次に、反応物を、メタノールの添加によりクエンチした。得られた混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００：１〜１５：１）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、固体として８０ｇ（８５％）のＰＨ−１６を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：３８０．
ＰＨ−１７の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うピリジン（７３０ｍＬ）中のＰＨ−１６（７３ｇ、１９２．３７ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（２３．５ｇ、１９２．３５ｍｍｏｌ、０．５０当量）を加えた。これに続いて、イソ酪酸無水物（２１３ｇ、１．３５ｍｏｌ、５．００当量）を撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、５０℃で３時間撹拌した。次に、反応物を、氷水の添加によってクエンチした。得られた溶液を、３×２０００ｍＬのジクロロメタンで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を、３×２０００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム、３×２０００ｍＬの水及び３×２０００ｍＬの飽和塩化ナトリウムでそれぞれ洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００：１〜２０：１）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、黄色固体として５２ｇ（６０％）のＰＨ−１７を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：４５０．
ＰＨ−１８の調製
Figure 2021515784
窒素の不活性雰囲気を伴うＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中のＰＨ−１７（２０ｇ、４４．４ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、アジ化ナトリウム（１８ｇ、２６７ｍｍｏｌ、６．００当量）を加えた。得られた溶液を、８０℃で２時間撹拌した。得られた混合物を、１０００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた溶液を、３×１０００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム、３×１０００ｍＬの水及び３×１０００ｍＬの飽和塩化ナトリウムでそれぞれ洗浄した。溶液を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００／１〜４０／１）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、黄色固体として１１ｇ（５０％）のＰＨ−１８／ＰＨ−１８Ｓ（５．２：１）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：４９３
ＰＨ−１９の調製
Figure 2021515784
ジクロロメタン（１６０ｍＬ）中のＰＨ−１８／ＰＨ−１８Ｓ（５．２：１）（１６ｇ、３７．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ピリミジン（２３ｇ、２９０．７７ｍｍｏｌ、９．００当量）及びジメチルアミノピリジン（４．３５ｇ、３５．６６ｍｍｏｌ、１．２０当量）を加えた。これに続いて、１，３−ビス（トリフルオロメチルスルホニル）トリオキシダン（１１．９ｇ、３７．８８ｍｍｏｌ、１．２０当量）を０℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、２０℃で２時間撹拌した。反応物を水／氷の添加によりクエンチした。得られた混合物を、２×１０００ｍＬのジクロロメタンで抽出し、有機層を合わせた。得られた溶液を、１×１０００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄した。得られた溶液を減圧下で濃縮した。これにより、褐色固体として１６ｇ（６８％）のＰＨ−１９／ＰＨ−１９Ｓを得た。生成物をさらに精製することなく次の工程で直接的に使用した。
ＰＨ−２０の調製
Figure 2021515784
アルゴンの不活性雰囲気を伴うテトラヒドロフラン（１６０ｍＬ）中のＰＨ−１９／ＰＨ−１９Ｓ（１６ｇ、２５．６１ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、テトラブチルアンモニウムフルオライド（１００ｍＬ、５．００当量）を０℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を、室温で５時間撹拌した。得られた溶液を、１０００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた溶液を、１×５００ｍＬの水及び１×５００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムでそれぞれ洗浄した。得られた溶液を減圧下で濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００／１〜２０／１）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、黄色固体として８ｇ（８５％）のＰＨ−２０／ＰＨ−２０Ｓ（７：１）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：３８１．
ＰＨ−２１の調製
Figure 2021515784
メタノール（５０ｍＬ）中のＰＨ−２０／ＰＨ−２０Ｓ（３．４ｇ、８．９４ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、１０％パラジウム炭素（１．７ｇ）を加えた。フラスコを真空にし、窒素で３回フラッシングした後、水素でフラッシングした。得られた溶液を、室温で１時間撹拌した。得られた溶液を、１００ｍＬのメタノールで希釈した。固体を、濾過して取り出した。得られた溶液を減圧下で濃縮した。粗生成物を、次の条件を用いてフラッシュ−分取−ＨＰＬＣにより精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、水及びアセトニトリル（５％アセトニトリルから３５分で５０％まで）；検出器、ＵＶ ２５４ｎｍ。これにより、白色固体として１．７ｇ（５４％）のＰＨ−２１を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：１２．１３（ｓ，１Ｈ），１１．９１（ｓ，１Ｈ），８．９１（ｓ，２Ｈ），８．２３（ｓ，２Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），５．７８（ｍ，１Ｈ），４．６２−３．７２（ｍ，４Ｈ），２．９２（ｍ，１Ｈ），１．１３（ｓ，６Ｈ）．
ＰＨ−２２の調製
Figure 2021515784
アルゴンの不活性雰囲気を伴うピリジン／Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１００／２０ｍＬ）中のＰＨ−２１（６．０ｇ、１６．９５ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、１−（クロロジフェニルメチル）−４−メトキシベンゼン（６．２４ｇ、２０．３４ｍｍｏｌ、１．２０当量）を加えた。得られた溶液を、室温で１６時間撹拌した。得られた溶液を、１０００ｍｌのジクロロメタンで希釈した。得られた溶液を、１×２５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム、１×２５０ｍｌの水及び１×２５０ｍＬの飽和塩化ナトリウムでそれぞれ洗浄した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００／１〜５０／１）とともにシリカゲルカラムにかけた。これにより、白色固体として１３ｇ（７４％）のＰＨ−２２を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：１２．１５（ｓ，１Ｈ），１１．７０（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｍ，６Ｈ），７．１５（ｍ，２Ｈ），６．７２（ｍ，２Ｈ），５．８２（ｍ，１Ｈ），５．３０（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｍ，３Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｍ，１Ｈ），２．８３−２．６２（ｍ，３Ｈ），１．１０（ｍ，６Ｈ）．
ＰＨ−２３の調製
Figure 2021515784
アルゴンの不活性雰囲気を伴うジクロロメタン（８０ｍＬ）中のＰＨ−２２（７．８ｇ、１２．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、３−（ビス［ビス（プロパン−２−イル）アミノ］ホスファニルオキシ）プロパンにトリル（７．５ｇ、２４．９２ｍｍｏｌ、２．００当量）及び４，５−ジシアノイミダゾール（２．２ｇ、１８．６３ｍｍｏｌ、１．５０当量）を順番に加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。得られた混合物を、１０００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。得られた溶液を、３×２５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム、３×２５０ｍＬの水及び３×２５０ｍＬの飽和塩化ナトリウムでそれぞれ洗浄した。得られた溶液を減圧下で濃縮した。粗生成物を、次の条件を用いてフラッシュ−分取−ＨＰＬＣにより精製した：カラム、Ｃ１８シリカゲル；移動相、水及びアセトニトリル（４０％アセトニトリルから３５分で９５％まで）；検出器、ＵＶ ２５４ｎｍ。これにより、白色固体として８．０６ｇ（７８％）のＰＨ−２３を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：８２７．
オリゴマー合成のための２’−Ｆ−３’−ＮＨＴｒ構成要素
以下に示されるとおりの６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）、４−Ｎ−ベンジルシチジン（ＣＢｚ）、２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）、及びウリジン（Ｕ）の２’−Ｏ−Ｍｅ ３’−ＮＨ−ＭＭＴｒ−５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト単量体は、国際公開第２００１１８０１５Ａ１号パンフレットにおいて記載される手順を使用して合成された。
Figure 2021515784
オリゴマー合成のための２’−Ｏ−Ｍｅ−３’−ＮＨＴｒ構成要素
例示的なホスホロアミダートとしては以下のものが挙げられる。
Figure 2021515784
リバースホスホラミダイトの３’−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシアデノシン（ＮＨ−Ｂｚ）、５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト、３’−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシグアノシン（ＮＨ−ｉｂｕ）、５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト、３’−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシシトシン（ＮＨ−Ｂｚ）、５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト、３’−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシチミジン（ＮＨ−Ｂｚ）、５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト及びリバース固体支持体は、市販の供給元（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）から購入された。
Figure 2021515784
オリゴマー合成のためのリバースＤＮＡ構成要素
本開示のために使用される例示的なリバースホスホロアミダイトとしては、以下のものが挙げられる。
Figure 2021515784
次の修飾：２’−Ｆ−ＮＰＳ−ＰＳ−２’−Ｆ−ＮＰＳ；２’−Ｆ−ＮＰ−ＰＳ−２’−Ｆ−ＮＰ；２’−ＯＭｅ−ＮＰ−ＰＳ−２’−ＯＭｅ−ＮＰ；２’−ＯＭｅ−ＮＰＳ−ＤＮＡ−ＰＳ−２’−ＯＭｅ−ＮＰＳを有するオリゴマーを作製するために、合成を、固体結合オリゴヌクレオチドに対して、５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化剤（カップリング時間２．０〜４．０分）の存在下で無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍの濃度に希釈された５’−ホスホラミダイト単量体とともに５’から３’方向において１μＭスケールで実施した後、標準的なキャッピング、酸化及び脱保護を行って、修飾オリゴヌクレオチドを得た。全ての修飾ホスホラミダイトの段階的なカップリング効率は、９８％を超えた。ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアザオリン−３−チオンは、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成のための硫黄移動剤として使用された。オリゴヌクレオチド担持固体支持体を、振盪機において３時間水性アンモニア／メチルアミン（１：１）溶液とともに室温で加熱して、支持体から切断し、塩基不安定性の保護基を脱保護した。
実施例１〜４
Figure 2021515784
適切に保護された２’−Ｏ−メトキシエチル−３’−アミノヌクレオシド−５’−ホスホラミダイト構成要素（実施例１〜４）は、スキーム１〜４において示される化学変換後に調製された。
まず、ウラシル系３’−ＮＨ−ＭＭＴｒ−２’−Ｏ−メトキシエチルホスホラミダイト実施例５の合成のために、キーとなる３’−アジド−２’−メトキシエチル中間体３が、スキーム１に示されるとおりに無水中間体２を介して低収率で得られた。
アルキル化は低収率であるため、３−１をＢＯＭＣｌ／ＤＢＵと反応させてＮ−３保護中間体３−４を得て、これを、２−ブロモエチルメチルエーテル／Ａｇ２Ｏ／ＮａＩ／ＤＭＦを使用してアルキル化して、以下のスキーム１に示されるとおりに２’−Ｏ−メトキシエチル誘導体３−５を得た。水素化条件（Ｐｄ／Ｃ／Ｈ２）を使用してＮ−３−ＢＯＭ基を脱保護することによって、副生物３−６ｂの顕著な減少を伴って、１０〜２０％の所望の３’−アミノ中間体３−６ａを得た。
Figure 2021515784
高収率の２’−Ｏ−アルキル化は、以下のスキーム２において示されるとおりに得られる。この目的のため、３−１を、ＰＭＢＣｌ／ＤＢＵ／ＤＭＦで処理して、Ｎ−３保護中間体４−２を得て、これを、２−ブロモエチルメチルエーテル／Ａｇ２Ｏ／ＮａＩ／ＤＭＦを使用する２’−Ｏ−アルキル化にかけて、２’−Ｏ−メトキシエチル誘導体４−３を得た。次に、４−３の５’−脱トリチル化及び塩化ベンゾイルを使用する５’−ヒドロキシル基の再保護によって、４−５を得た。
Figure 2021515784
穏和な条件下での中間体４−５のＰＭＢ基の脱保護により、４−６を得る。中間体４−６の３’−アジド基をアミンに還元した後、４−モノメトキシトリチルクロリドとの反応などですぐに保護して、４−８を得た。次に、５’−ベンジルエステルを、アルカリ溶液を用いて開裂させ、その後、既知のプロトコルを使用してホスフィチル化して、所望の２’−Ｏ−メトキシエトキシウリジンホスホラミダイト単量体４−１０を得た。
（４−２）の調製：ＤＭＦ（１２０．００ｍＬ）中の３−１（４５．３０ｇ、８８．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＭＢＣｌ（２０．８０ｇ、１３２．８４ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（４４．６１ｇ、１７７．１２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。水を加え、ＥＡで抽出した。有機層を濃縮し、カラムにより精製して、白色固体として４−２（５２．００ｇ、８２．３２ｍｍｏｌ）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ６３２．３［Ｍ＋Ｈ］＋．
（４−３）の調製：ＤＭＦ（１２０．００ｍＬ）中の４−２（５０．００ｇ、７９．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、２−ブロモエチルメチルエーテル（１６．５０ｇ、１１８．７３ｍｍｏｌ）及びＡｇ２Ｏ（１８．３４ｇ、７９．１５ｍｍｏｌ、２．５７ｍＬ）を加え、続いて、ＮａＩ（５．９３ｇ、３９．５８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応が良好であることを示した。濾過し、水及びＥＡを加え、有機層を濃縮し、カラムにより精製して、無色油として４−３（５２．００ｇ、７５．３９ｍｍｏｌ）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ６９０．４［Ｍ＋Ｈ］＋．
（４−４）の調製：ＤＣＭ（２００．００ｍＬ）中の４−３（５２．００ｍｇ、７５．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１５０．００ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を冷ＮＨ４ＯＨにゆっくりと加え、ＤＣＭで抽出した。有機層を濃縮し、精製して、無色油として４−４（３１．００ｇ、６９．２８ｍｍｏｌ）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ４４８．２［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ８．０２（ｄ，Ｊ＝８．１２Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．２３（ｍ，２Ｈ），６．８７−６．８４（ｍ，２Ｈ），５．８７−５．８１（ｍ，２Ｈ），５．３８（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９６−４．８５（ｍ，２Ｈ），４．３６−４．３４（ｍ，１Ｈ），４．１７−４．１４（ｍ，１Ｈ），４．００−３．９７（ｍ，１Ｈ），３．８３−３．７７（ｍ，１Ｈ），３．７５−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．７０−３．６８（ｍ，１Ｈ），３．６１−３．５６（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．４３（ｍ，２Ｈ），３．１８（ｓ，３Ｈ）．
（４−５）の調製：ピリジン（２００．００ｍＬ）中の４−４（３１．００ｇ、６９．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢｚＣｌ（１３．１４ｇ、９３．８７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１５分間撹拌し、濃縮し、カラムにより精製して、白色固体として４−５（３５．１０ｇ、６３．８ｍｍｏｌ）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５５２．２［Ｍ＋Ｈ］＋．
（４−６）の調製：アセトニトリル（３００．００ｍＬ）及び水（１００．００ｍＬ）中の４−５（３５．１０ｇ、６３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、硝酸アンモニウムセリウム（１０５ｇ、１９１．４０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１２時間撹拌し、濃縮し、ＥＡで抽出した。有機層を濃縮し、カラムにより精製して、黄色固体として４−６（２７．５ｇ、６３．７５ｍｍｏｌ）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ４３２．２［Ｍ＋Ｈ］＋．
（４−７）の調製：ＴＨＦ（５００．００ｍＬ）中の４−６（２７．５０ｇ、６３．７５ｍｍｏｌ）の溶液にＰｄ／Ｃ（３．００ｇ）を加え、反応混合物を室温で１２時間撹拌し、濾過し、濃縮して、黄色固体として４−７（２５．００ｇ、６１．６７ｍｍｏｌ）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ４０６．２［Ｍ＋Ｈ］＋．
（４−８）の調製：ＤＣＭ（３００．００ｍＬ）中の４−７（２５．００ｇ、６１．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭＭＴｒＣｌ（２８．４９ｇ、９２．５１ｍｍｏｌ）及びコリジン（１４．９５ｇ、１２３．３４ｍｍｏｌ）を加え、続いてＡｇＮＯ３（１５．７ｇ、９２．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、濾過し、有機層を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、シリカゲルカラムにより精製して、黄色固体として４−８（３３．００ｇ、４８．６９ｍｍｏｌ）を得た。
（４−９）の調製：４−８（１４．５０ｇ、２１．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、メタノール（２００ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）中の１Ｎ ＮａＯＨを加え、反応混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮して、ＤＣＭで抽出し、有機層を濃縮し、シリカゲルカラムにより精製して、白色固体として４−９（１１．５０ｇ、２０．０５ｍｍｏｌ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ １１．２６（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４７−７．４４（ｍ，４Ｈ），７．３４−７．１７（ｍ，８Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），５．５０−５．４８（ｍ，２Ｈ），５．１３（ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０５−３．９８（ｍ，３Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４９（ｍ，１Ｈ），３．３４−３．３２（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｓ，３Ｈ），３．０８−３．０４（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．８６（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），１．５１（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ）．
（４−１０）の調製：ＤＣＭ（１００．００ｍＬ）中の４−９（１１．５０ｇ、２０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（４８９．８５ｍｇ、４．０１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１０．３６ｇ、８０．１９ｍｍｏｌ、１４．０１ｍＬ）を加えた。続いて、ＣＥＰＣｌ（５．７０ｇ、２４．０６ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物を飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチした。有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をフラッシュ−分取−ＨＰＬＣにより精製した。生成物を無水トルエン中で溶解させ、３回濃縮した。次に、生成物を無水アセトニトリル中で溶解させ、３回濃縮した。これにより、白色固体として１３ｇの４−１０を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：７７２．３；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：９．０１（ｓ，１Ｈ），８．０７−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４１（ｍ，６Ｈ），７．２９−７．１５（ｍ，５Ｈ），６．７９−６．７６（ｍ，２Ｈ），５．６３−５．５７（ｍ，２Ｈ），４．２７−４．１５（ｍ，２Ｈ），４．０６−３．９５（ｍ，１Ｈ），３．８５−３．７７（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．６９−３．３５（ｍ，７Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ），２．２６−２．９１（ｍ，３Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．７５−１．３９（ｍ，１Ｈ），１．２１−１．１１（ｍ，１２Ｈ）．３１ＰＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１４９．１０，１４８．２６．
実施例５
Figure 2021515784
以下のスキーム３において示されるとおり、ウリジン中間体４−８を３’−アミノシチジンアナログ５−１に変換した後、既知のプロトコルを使用してホスフィチル化して、所望の２’−Ｏ−メトキシエトキシシチジンホスホラミダイト単量体５−４を得ることによって、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−ＮＨ−ベンゾイル−シトシンホスホラミダイト化合物５−４を得た。
Figure 2021515784
（５−１）の調製：アセトニトリル（２５０．００ｍＬ）中の４−８（１８．５０ｇ、２７．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＰＳＣｌ（１６．４９ｇ、５４．６０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（６．６７ｇ、５４．６０ｍｍｏｌ）を加え、続いて、この溶液にＴＥＡ（５．５２ｇ、５４．６０ｍｍｏｌ、７．５６ｍＬ）を加えた。反応混合物を、Ｎ２下にて室温で５時間撹拌した。ＮＨ４ＯＨ（５０．００ｍＬ）を反応混合物に加えた。混合物を室温で１２時間撹拌した。溶液を濃縮し、ＥＡで抽出した。有機層を塩水により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機層を濃縮し、シリカゲルカラムにより精製して、黄色固体として５−１（１６．００ｇ、２３．６４ｍｍｏｌ）を得た。
（５−２）の調製：ピリジン（１００．００ｍＬ）中の５−１（１６．００ｇ、２３．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢｚＣｌ（４．９６ｇ、３５．４６ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。溶液を濃縮し、シリカゲルカラムにより精製して、白色固体として５−２（１７．４０ｇ、２２．２８ｍｍｏｌ）を得た。
（５−３）の調製：化合物５−２（１７．４０ｇ、２２．２８ｍｍｏｌ）を、１８０ｍＬのピリジン／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６５／３０／５）中の１Ｎ ＮａＯＨ溶液に０℃で加えた。懸濁液を０℃で１５分間撹拌した。反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液の添加によってクエンチした。溶液をＥＡで抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をカラムにより精製し、白色固体として５−３（１２．５０ｇ、１８．４７ｍｍｏｌ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ １２．２５（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６４−７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５２−７．４２（ｍ，６Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．２６−７．１４（ｍ，７Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），５．５５（ｓ，１Ｈ），５．２３（ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０９−３．９７（ｍ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．７０−３．６６（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ），３．１１−３．０５（ｍ，１Ｈ），２．９６−２．９１（ｍ，１Ｈ），２．６８（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）．
（５−４）の調製：ＤＣＭ（１００．００ｍＬ）中の５−３（１２．５０ｇ、１８．４７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（４５１．３０ｍｇ、３．６９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９．５５ｇ、７３．８８ｍｍｏｌ、１２．９０ｍＬ）を加え、続いて、ＣＥＰＣｌ（５．２５ｇ、２２．１６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物を飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチした。有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得た。粗製物をフラッシュ−分取−ＨＰＬＣによって行った。生成物を無水トルエン中で溶解させ、３回濃縮した。次に、生成物を無水アセトニトリル中で溶解させ、３回濃縮した。これにより、白色固体として１３ｇの５−４を得た。ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：８７５．４．１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ｐｐｍ ８．６４−８．２０（ｍ，２Ｈ），７．９０−７．８８（ｍ，２Ｈ），７．６２−７．５８（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．３９（ｍ，８Ｈ），７．２５−７．１５（ｍ，６Ｈ），６．７８−６．７４（ｍ，２Ｈ），５．６９（ｄ，Ｊ＝１．７２Ｈｚ，１Ｈ），４．３７−４．２１（ｍ，２Ｈ），４．１０−４．０３（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．７９（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝１．６４Ｈｚ，３Ｈ），３．６８−３．５２（ｍ，３Ｈ），３．４６−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ），３．１７−２．９７（ｍ，２Ｈ），２．９４−２．８７（ｍ，１Ｈ），２．６７−２．４８（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．５１（ｍ，１Ｈ），１．２６−１．１８（ｍ，１２Ｈ）．３１ＰＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１４８．９３，１４８．０３
実施例６
Figure 2021515784
以下のスキーム６に示されるとおり、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシンアナログ６−１０の合成が達成された。塩基性条件下（ＮＨ３／ＭｅＯＨ）の中間体６−２は、ジオール６−３をもたらし、続いて、ＴＢＤＰＳＣｌを使用して５’−ヒドロキシ基を保護すると、中間体６−４が得られた。次に、２−ブロモエチルメチルエーテル／ＮａＨ／ＤＭＦを使用する６−４の２’−Ｏ−アルキル化により、６−４のＣ−６−環外アミンの保護を伴わずに、２’−Ｏ−メトキシエチル誘導体６−５を得た。本発明の方法では、中間体６−４の２’−ＯＨ基の選択的アルキル化が達成された。
Figure 2021515784
中間体６−５の３’−アジド基をアミン６−７に還元し、続いてこれを、４−モノメトキシトリチルクロリドとの反応などですぐに保護し、ＴＢＡＦ／ＴＨＦを使用する５’−ＯＴＢＤＰＳ基の脱保護後に前駆体６−８を得た。既知のプロトコルを使用して６−９のホスフィチル化を実施して、所望の２’−Ｏ−メトキシエトキシアデニン−ＮＨ−ベンゾイルホスホラミダイト単量体６−１０を得る。
（６−２）の調製：乾燥ＡＣＮ（１．２０Ｌ）中の化合物１（７９．５０ｇ、２１０．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（５Ｈ−プリン−６−イル）ベンズアミド（１００．８０ｇ、４２１．３６ｍｍｏｌ）及びＢＳＡ（１８０．０７ｇ、８８４．８６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液を５０℃で透明になるまで撹拌した。続いて、混合物を−２０℃で冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（９３．５４ｇ、４２１．３６ｍｍｏｌ）をシリンジにより加えた。次に、混合物を、Ｎ２下にて７０℃で７２時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、続いて溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲル上で精製して、黄色固体として化合物６−２（１０７．５０ｇ、１９２．２６ｍｍｏｌ、収率９１．２６％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝１１．２８（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．３７（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１７（ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６９−４．５６（ｍ，２Ｈ），４．４０−４．３８（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ）．ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５５７．２［Ｍ＋Ｈ］＋．
（６−３）の調製：化合物６−２（１０７．５０ｇ、１９２．２６ｍｍｏｌ）の溶液をエタノール中３３重量％のメチルアミン（６００．００ｍＬ）に溶解した後、混合物を２０℃で１６時間撹拌し、続いて、溶媒を蒸発させ、石油エーテル中５０％ ＥｔＯＡｃ（１．５Ｌ）で洗浄し、濾過して、淡黄色固体として化合物６−３（５２．５０ｇ、１７９．６４ｍｍｏｌ、収率９３．４４％）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ２９３．１［Ｍ＋Ｈ］＋．
（６−４）の調製：ピリジン（５００．００ｍＬ）中の化合物６−３（５２．５０ｇ、１７９．６４ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１８．３２ｇ、２６９．４６ｍｍｏｌ）及びＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（５４．３４ｇ、１９７．６０ｍｍｏｌ）の溶液を、２０℃で２時間撹拌し、ＬＣＭＳは６−３が消費されたことを示した。次に、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）でクエンチし、濃縮して粗生成物を得て、これをシリカゲルで精製して、白色固体として化合物６−４（７２．６０ｇ、１３６．８１ｍｍｏｌ、収率７６．１６％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝８．２９（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），７．６３−７．５９（ｍ，４Ｈ），７．４８−７．３３（ｍ，８Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１０−５．０６（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１４−４．１１（ｍ，１Ｈ），３．９４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），０．９９（ｓ，９Ｈ）．ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５３１．３［Ｍ＋Ｈ］＋．
（６−５）の調製：乾燥ＤＭＦ（４００．００ｍＬ）中の６−４（３５．００ｇ、６５．９６ｍｍｏｌ）及び１−ブロモ−２−メトキシエタン（１８．３３ｇ、１３１．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＩ（１９．７７ｇ、１３１．９１ｍｍｏｌ）及びＡｇ２Ｏ（１５．２９ｇ、６５．９６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で５時間撹拌した。次に、反応物を氷水に注ぎ、ＥＡで抽出し、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルで精製して、白色固体として６−５（２３．７０ｇ、４０．２６ｍｍｏｌ、収率６１．０４％）を得て、白色固体として副生成物のＴＢＤＰＳ（５．２０ｇ、９．８１ｍｍｏｌ、収率１４．８７％）を失った。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝８．３１（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），７．６３−７．６０（ｍ，４Ｈ），７．４７−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３６（ｍ，６Ｈ），６．１０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１８−４．１４（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｄｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７８−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１６（ｓ，３Ｈ），０．９９（ｓ，９Ｈ）．ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５８９．５［Ｍ＋Ｈ］＋．
（６−６）の調製：ピリジン（３００．００ｍＬ）中の０℃の６−５（３１．２３ｇ、５３．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢｚＣｌ（１１．２２ｇ、７９．５６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。次に、溶液を０℃に冷却し、水酸化アンモニウム（２０ｍＬ、３０％）を加え、混合物を室温まで温めた後、溶媒を蒸発させ、３００ｍＬのＨ２Ｏ及び６００ｍＬのＥＡを加えて溶液を分離し、水相をＥＡで抽出し、有機相を合わせ、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、溶媒を除去し、残渣をシリカゲルで精製して、白色固体として６−６（２８．７０ｇ、４１．４２ｍｍｏｌ、収率７８．０９％）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ６９３．４［Ｍ＋Ｈ］＋．
（６−７）の調製：ＥＡ（１５０．００ｍＬ）中の６−６（２８．７０ｇ、４１．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２下でＰｄ／Ｃ（３．００ｇ）及びＭｅＯＨ（１５０．００ｍＬ）を加えた。混合物を室温で５時間撹拌した。次に、反応物を濾過し、濾液を濃縮して、灰色固体として６−７（２５．４９ｇ、３８．２２ｍｍｏｌ、収率９２．２７％）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ６６７．３［Ｍ＋Ｈ］＋．
（６−８）の調製：ＤＣＭ（３００．００ｍＬ）中の６−７（２５．４９ｇ、３８．２２ｍｍｏｌ）及びＡｇＮＯ３（１２．９８ｇ、７６．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、コリジン（１３．８９ｇ、１１４．６６ｍｍｏｌ）及びＭＭＴｒＣｌ（１９．４３ｇ、５７．３３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。次に、反応物を氷水に注ぎ、有機層をＤＣＭで抽出し、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去し、残渣をシリカゲルで精製して、灰色固体として６−８（３２．７９ｇ、３４．９２ｍｍｏｌ、収率９１．３６％）を得た。
（６−９）の調製：ＴＨＦ（３００．００ｍＬ）中の６−８（３２．７９ｇ、３４．９２ｍｍｏｌ）の溶液にＴＢＡＦ（１Ｍ、３５．００ｍＬ）を加え、混合物を室温で１５時間撹拌した。次に、溶媒を除去し、残渣を、ＥＡを用いてシリカゲルで精製して、白色固体として６−９（２２．２２ｇ、３１．７１ｍｍｏｌ、収率９０．８２％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．６８（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６１−７．５７（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４８（ｍ，６Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．２１−７．１２（ｍ，６Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．０９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），４．０８−４．０２（ｍ，２Ｈ），３．９３−３．８７（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．５８−３．５３（ｍ，１Ｈ），３．４３−３．３９（ｍ，３Ｈ），３．２４−３．１９（ｍ，４Ｈ），２．１９（ｂｒ，１Ｈ）．
（６−１０）の調製：乾燥ＤＣＭ（１００．００ｍＬ）中の６−９（１４．００ｇ、１９．９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４８８．１９ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（６．４６ｇ、４９．９５ｍｍｏｌ、８．７３ｍＬ）の溶液に、ＣＥＰＣｌ（５．６８ｇ、２３．９８ｍｍｏｌ）をＡｒ下で滴下して加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。次に、反応物を１０％ ＮａＨＣＯ３（水溶液）及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去し、残渣をＰＥ／ＥＡ混合物によるｃ．ｃ．により精製した後、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物（１０ｇ、１０ｍＬのＡＣＮ中で溶解）をフラッシュ−分取−ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として６−１０（１２．６０ｇ、１３．９８ｍｍｏｌ、収率６９．９９％）を得た。続いて、生成物を乾燥トルエン（１５ｍＬ）中で溶解させ、３回濃縮し、乾燥ＡＣＮで３回濃縮した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝９．１２（ｄ，Ｊ＝４６．８Ｈｚ，１Ｈ），δ＝８．７１（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｓ，０．６Ｈ），８．２２（ｓ，０．４Ｈ），８．０４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６３−７．５９（ｍ，１Ｈ），７．５５−７．４６（ｍ，６Ｈ），７．４０−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．０６（ｍ，６Ｈ），６．６９（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．２４（ｍ，２Ｈ），３．９２−３．７８（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，３Ｈ），３．６７−３．３３（ｍ，７Ｈ），３．２９（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３Ｈ），３．１７−３．１０（ｍ，１Ｈ），２．８８（ｄｄ，Ｊ＝２７．２Ｈｚ，１Ｈ），２．６５−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，０．４Ｈ），１．８０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，０．６Ｈ），１．２３−１．１５（ｍ，１２Ｈ）．３１ＰＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１４８．８６，１４８．２２．ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ９０１．３［Ｍ＋Ｈ］＋．
実施例７
Figure 2021515784
適切に保護された２’−Ｏ−エチル−３’−アミノ−５’−ホスホラミダイト（実施例９、１０、１１、１２）は、スキーム５において示される化学変換後に調製された。
まず、チミン系３’−ＮＨ−ＭＭＴｒ−２’−Ｏ−エチルホスホラミダイト実施例９の合成のために、中間体２をジメチルアミノピリジンの存在下にてプロピオール酸メチルなどで保護して（スキーム８）、塩基Ｎ−３保護中間体８−４を得て、２’−Ｏ−アルキル化の収率が高くなるように促進した。８−４のさらなる脱アセチル化により、Ｃ−２’−ヒドロキシ中間体８−５が得られる。
Figure 2021515784
ヨードエタンを使用するさらなるアルキル化により、２’Ｏ−エチルヌクレオシド８−６を得た。中間体８−６を、前述のスキーム４において示される化合物４−１０と同様の化学反応に従うことによって、チミン塩基２’−Ｏ−エチル−３’−アミノ−５’−ホスホラミダイト８−１１に変換した。
（８−４）の調製：ＭｅＣＮ（４００ｍＬ）中の８−２（２２．０ｇ、４９．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（１．２ｇ、９．９２ｍｍｏｌ）を加えた。次に、３（５．８ｇ、４１９．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、Ｎ２下にて室温で２時間撹拌し、ＴＬＣは、８−２が消費されたことを示した。濃縮し、シリカゲルカラムで（ＰＥ：ＥＡ＝６：１）により精製して、黄色油として８−４（２２．０ｇ、４０．６３ｍｍｏｌ、収率８１．９％）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５６４［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（８−５）の調製：ＭｅＯＨ（４００ｍＬ）中の８−４（２８．０ｇ、５１．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で濃ＮＨ４ＯＨ水溶液（２８ｍＬ）を加えた。反応混合物を０℃で１．５時間撹拌し、ＴＬＣは、８−４が消費されたことを示した。濃縮し、シリカゲルカラムで（ＰＥ：ＥＡ＝１０：１〜２：１）により精製して、黄色油として８−５（２１．０ｇ、４２．０４ｍｍｏｌ、収率８１．３％）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５２２［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（８−６）の調製：ヨードエタン（１００ｍＬ）中の８−５（２０．０ｇ、４０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ａｇ２Ｏ（１８．６ｇ、８０．０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で５時間撹拌した後、ＬＣ−ＭＳは８−５の完全な消費を示し、珪藻土で濾過し、濃縮して、黄色油として８−６（１６．０ｇ、３０．３３ｍｍｏｌ、収率７５．７％）を得て、これを次の工程において直接的に使用した。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５２８［Ｍ＋Ｈ］＋．
（８−７）の調製：ＭｅＣＮ（４００ｍＬ）中の８−６（１６．０ｇ、３０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ピロリジン（８．６３ｇ、１２１．３２ｍｏｌ、１２ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌し、ＴＬＣは、８−６が完全に消費されたことを示した。濃縮し、シリカゲルカラムで（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１００：１〜５０：１）により精製して、黄色油として７（１２．０ｇ、２７．９４ｍｍｏｌ、収率９２．１％）を得た。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ４３０［Ｍ＋Ｈ］＋．
（８−８）の調製：ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の８−７（１２．０ｇ、２７．９４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１．２ｇ）を加え、混合物を、Ｈ２下にて室温で一晩撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、７が完全に消費されたことを示した。濾過し、ＤＣＭ（１００ｍＬ＊３）で洗浄した後、濃縮して、灰色固体として８−８（１１．０ｇ、２７．２７ｍｍｏｌ、収率９７．６％）を得て、これを次の工程において直接的に使用した。ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ４０４［Ｍ＋Ｈ］＋．
（８−９）の調製：ＤＣＭ（８０ｍＬ）中の８−８（１０．０ｇ、２４．７９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭＭＴｒＣｌ（１１．４ｇ、３７．１８ｍｍｏｌ）、２，４，６−コリジン（２．０ｇ、１６．６１ｍｍｏｌ、６．５ｍＬ）及びＡｇＮＯ３（６．３ｇ、３７．１８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１．５時間撹拌した。ＴＬＣは、８−８が完全に消費されたことを示した。濾過し、有機層を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、濃縮し、シリカゲルカラムで（ＰＥ：ＥＡ＝５：１〜１：１）により精製して、明黄色固体として８−９（１６．０ｇ、２３．６８ｍｍｏｌ、収率９５．５％）を得た。
（８−１０）の調製：８−９（４．０ｇ、５．９２ｍｍｏｌ）を、１．０Ｎ ＮａＯＨ溶液（２０ｍＬ、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝９：１）の溶液に加えた。反応混合物を４０℃で２時間撹拌し、ＴＬＣは、８−９が消費されたことを示し、これを濃縮し、ＤＣＭ（２０ｍＬ＊２）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムで（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２００：１〜５０：１）により精製して、白色固体として８−１０（３．０ｇ、５３．８ｍｍｏｌ、収率９０．９）を得た。
（８−１１）の調製：ＤＣＭ（２．０ｍＬ）中の８−１０（２．３６ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（１０３ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．２ｇ、１６．９２ｍｍｏｌ、２．９６ｍＬ）を加えた。次に、ＣＥＰＣｌ（１．０ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＴＬＣは、８−１０が消費されたことを示し、これを飽和ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ）で洗浄し、有機層を分離し、水層をＤＣＭ（１０ｍＬ＊２）で洗浄した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、フラッシュ−分取−ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として８−１１（２．４５ｇ、３．２３ｍｍｏｌ、収率７６．３６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．６２（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，０．５Ｈ），７．６０−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．５１−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．１６（ｍ，７Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，０．５Ｈ），６．８８−６．７６（ｍ，２Ｈ），５．６６（ｓ，１Ｈ），４．３７−４．２３（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．０５（ｍ，１Ｈ），４．０５−３．９４（ｍ，０．５Ｈ），３．８８−３．７４（ｍ，４．５Ｈ），３．７２−３．３５（ｍ，３Ｈ），３．２２（ｔｄ，Ｊ＝１０．３，４．７Ｈｚ，０．５Ｈ），３．０３−２．８９（ｍ，１．５Ｈ），２．８０−２．６９（ｍ，１Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｔｄ，Ｊ＝６．６，１．３Ｈｚ，１Ｈ），１．９７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，０．５Ｈ），１．９１（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，１．２Ｈｚ，３Ｈ），１．５２（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，０．５Ｈ），１．２９−１．１７（ｍ，１２Ｈ），１．０８（ｔｄ，Ｊ＝７．０，４．９Ｈｚ，３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １４９．３１，１４７．１４．ＥＳＩ−ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ５７６［Ｍ＋Ｈ］＋．
粗オリゴマーの定量化又は未加工の分析
試料を脱イオン水（１．０ｍＬ）中で溶解させ、次のとおりに定量した。最初に水のみ（１．０ｍＬ）によりブランキングを実施し、２０ｕｌの試料及び９８０μＬの水をマイクロチューブ内で十分に混合し、キュベットに移し、２６０ｎｍでの吸光度測定値を得た。粗材料を乾燥させ、−２０℃で保管する。
粗ＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳ分析
０．１ＯＤの粗試料を、粗ＭＳ分析にかけた。粗ＬＣ−ＭＳデータを確認した後、精製工程を実施した。
ＨＰＬＣ精製
コンジュゲートを有するホスホロアミダート（ＮＰ）及びチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）修飾オリゴヌクレオチド並びにコンジュゲートを有しないホスホロアミダート（ＮＰ）及びチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）修飾オリゴヌクレオチドは、アニオン交換ＨＰＬＣによって精製された。緩衝液は、１０％ ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）及び１０％ ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１．８Ｍ ＮａＢｒ、ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ）であった。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分は、プールされ、脱塩され、且つ凍結乾燥された。
精製オリゴマーの脱塩
次に、精製された乾燥オリゴマーは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して脱塩された。カートリッジは、１０ｍＬの脱イオン水で３回条件付けされた。次に、２．５ｍＬのＲＮＡｓｅを含まない水に完全に溶解した精製オリゴマーを、カートリッジにアプライし、非常に低速で一滴ずつ溶出した。３．５ｍｌの脱イオン水により、塩を含まないオリゴマーを、直接的にスクリューキャップバイアルに溶出した。
インビトロアッセイ
ヒトＭＡＰＴのエクソン５を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を合成した。分子のいずれかの末端上の５ヌクレオチド長のウイングにおいてホスホロチオエート結合化学構造及び２’−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）保護基を有するＡＳＯが合成され、また、Ｐ５’−Ｎ３’ホスホロアミダート結合ＡＳＯ化学構造（ホスホロチオエート化学構造ではなく）を使用してＭＡＰＴのエクソン５を標的化する同じ配列を有するＡＳＯも合成された。ＭＡＰＴ ｍＲＮＡレベルは、これらのＡＳＯがタウｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを効率的に低減したか及びどの程度低減したか、加えてＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおけるタウ病態に対するそれらの効果を決定するために、ホスホロチオエート（ＯＰＳ）又はホスホロアミダート（ＮＰＳ）化学構造のいずれかであるがウイングにおける同じ２’ＭＯＥ保護基による処理の後に、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したヒトニューロンにおいて評価された（ＤｅＶｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，２０１７）。
ｉＰＳＣの作製及び皮質ニューロンへの分化
親ｉＰＳＣ株（Ｓｉｇｍａカタログ＃ｉＰＳＣ００２８）は、２４歳の女性ドナーからの上皮細胞を、４種の山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ）によりレトロウイルスベクターを使用して初期化することによって作製された。ヒトｉＰＳＣは、フィーダーフリーで培養され、新鮮なｍＴｅＳＲ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を毎日供給された。細胞は、コンフルエント状態にてＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で継代され、神経前駆細胞（ＮＰＣ）及び皮質ニューロンへの分化は、従来の二重ＳＭＡＤ阻害プロトコルを使用して実施された。このプロトコルは主に、ＴＢＲ１（およそ２０％）及びＣＴＩＰ２（およそ８０％）を発現するグルタミン酸作動性レイヤーＶ皮質ニューロンを作製する。簡単に言えば、ｉＰＳＣは、単一細胞懸濁液に解離され、神経誘導が、ＳＢ４３１５４２及びドルソモルフィン（神経誘導培地、表１を参照されたい）による１２日間の処理に従うことにより誘発された。
Figure 2021515784
誘導後、神経前駆細胞（ＮＰＣ）をディスパーゼで処理し、増殖のためにさらに３回（およそ１７、２０及び２５日目）サブプレーティングした。２５日目と３０日目の間に、ＮＰＣ凍結ストックを、神経前駆細胞凍結培地（表２を参照されたい）中で調製し、後の実験のために液体窒素中で維持した。ＮＰＣを、ＮＰＣ再構成培地（表３を参照されたい）中で解凍し、ＡＳＯ処理のために最終サブプレーティング前の３日間、培養において維持した。
Figure 2021515784
Figure 2021515784
ＮＰＣを、ポリ−オルニチン／ラミニン（Ｓｉｇｍａ）コーティング９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１５，０００細胞の密度でＮ２Ｂ２７培地（表３を参照されたい）にプレーティングした。
細胞増殖を阻止するために、細胞は、サブプレーティング後の７日目及び１１日目に１０μＭ Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ、Ｓｉｇｍａ）による２回の処理を受容した。解凍の１４日後、Ｎ２Ｂ２７培地は、１５日目又は２５日目まで１週間当たり２〜３回変化された（５０％）最終分化培地（表４を参照されたい）によって置き換えられ、その時ＡＳＯ処理が実施された。
Figure 2021515784
標的ＭＡＰＴ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）処理
ＡＳＯは、当技術分野で知られるとおりの完全なホスホロチオエート（ＯＰＳ）として合成された。チオホスホロアミダート（ＮＰＳ）ＡＳＯの合成は、本開示に従ってなされた。ＮＰＳ ＡＳＯは、ＡＳＯのいずれかの末端上の５ヌクレオチドにおけるＮＰＳによって連結されたヌクレオシド及びＯＰＳ連結ヌクレオチドを有する中央の１０ヌクレオチド長ギャップを含有した。ＯＰＳ及びＮＰＳ ＡＳＯの両方に関して、ＡＳＯのいずれかの側の５ヌクレオチド長ウイングは、２’メトキシエチル（ＭＯＥ）保護基を含有した。ＡＳＯは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）中で再構成され、それらの最終濃度は、２６０ｎｍでのそれらの吸光度を測定することによって、ベール−ランベルトの法則により決定された。次の配列：ＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＧＡＧ（配列番号１）を有する２０ヌクレオチド長ＭＡＰＴ ＡＳＯは、２’ＭＯＥ置換及びホスホロチオエート（ＯＰＳ）結合（ＯＰＳ修飾対照配列番号１）を有するように修飾され、且つ２’ＭＯＥ置換及びチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）結合（ＮＰＳ修飾配列番号１）を有するように修飾された。次の配列を有する非標的化スクランブルＡＳＯが、陰性対照として使用された：ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ（非ＭＡＰＴ対照）。ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンは、指定の用量及び指定の期間においてＡＳＯの自由な送達によって処理された。
Figure 2021515784
ＲＮＡ単離及びリアルタイム定量的ＰＣＲ
ＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ９６（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離された。簡単に言えば、本発明者らは、１５０μＬのＲＬＴ緩衝液を加え、オービタルシェーカー上で３０分間振盪させた後、同じ体積の７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加えることによって細胞を溶解させた。続いて、混合物をカラムに移し、Ｓｉｇｍａ ４−１８Ｋ遠心機を使用する室温で４分間の５，６００×ｇの遠心分離により、ＲＮＡをフィルターに結合させた。ＲＷ１緩衝液（７００μｌ、４分）、ＲＰＥ緩衝液（７００μｌ、４分）及び第２のＲＰＥ緩衝液工程（７００μｌ、１０分）による連続的な洗浄工程は全て、室温にて５，６００×ｇでなされた。ＲＮＡは、６０μｌのヌクレアーゼフリー水を使用して、室温で４分間の５，６００×ｇの遠心分離により溶出された。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−８０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、分光法によって決定された。等量のＲＮＡが、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、２０μｌの最終反応体積において製造業者の指示書に従って逆転写された。２５℃で１０分のインキュベーションの後、３７℃で２時間の間に逆転写が起こり、続いて８５℃で５分間の酵素不活性化が行われた。総ＭＡＰＴ ｍＲＮＡレベルを定量化するために、ｃＤＮＡを１：１０に希釈し、２Ｘ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＤＮＡプライマーと混合して、１０μｌの最終反応体積にした。以下のプライマーを使用して、５００ｎＭの最終濃度で総ＭＡＰＴ ｍＲＮＡを検出した（表６）。
Figure 2021515784
ＤＮＡプライマー（表８を参照されたい）を使用して８種の異なるハウスキーピング遺伝子を増幅するアッセイもまた実行された。全てのＤＮＡプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応は、ＨＴ７９００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上において、標準的なサイクリングパラメーターを使用して実行された。ＤＮＡプライマーの特異性は、融解曲線分析を使用して確認された。ＧｅＮｏｒｍ分析は、ｑＢａｓｅ＋（Ｂｉｏｇａｚｅｌｌｅ）を使用して大部分の安定なハウスキーピング遺伝子を決定するために使用された。全てのデータは、大部分の安定なハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して正規化され、対照条件に較正される。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）イムノアッセイ
細胞は、ホスファターゼ阻害剤（ＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）及びプロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）を含有する１ウェル当たり４０μＬのＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を使用して、オービタルシェーカー中の９６ウェル培養プレートにおいて室温（ＲＴ）で３０〜６０分間溶解された。ＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とｈＴＡＵ１０抗体（Ｊａｎｓｓｅｎ）の組合せは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用する総タウ定量化のために使用された。測定は、各回において１：３で希釈された５μｌのライセートを使用して３つ組で実施された。各試料を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）反応のために３８４ウェルアッセイプレートに移し、その中で５μｌの細胞抽出物を、ビオチン化抗体及びアクセプタービーズの混合物（表７を参照されたい）とともに室温で２時間インキュベートした。
Figure 2021515784
その後、ドナービーズをウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上において６１５ｎｍ（６８０ｎｍでの照射時）で読み取りを行った。
総タンパク質定量化
総タンパク質定量化は、ビシンコニン酸キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して実施された。ＯＰＳ化学構造に対するＮＰＳ化学構造の優位性を評価するために、ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンを、様々な濃度のＭＡＰＴ ＡＳＯで処理した。ＭＡＰＴ ＡＳＯは、分化プロセス開始後２５日目に培養培地に直接的に加えられ、１．２５μＭ〜１０．０μＭの範囲の最終濃度にした。同じ化学構造を有する等モル濃度の非標的化対照ＡＳＯが陰性対照として使用された。５日後、相対的な総ＭＡＰＴ ｍＲＮＡレベルが、ＲＴ−ｑＰＣＲ（表８）によって決定された。
Figure 2021515784
両方の陰性対照のＡＳＯが、総ＭＡＰＴ ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかった（表９）。
Figure 2021515784
ＮＰＳ ＡＳＯは、表８において示されるとおり、ＯＰＳ ＡＳＯの２倍の量で総ＭＡＰＴ ｍＲＮＡレベルを低減させた。
ＮＰＳ ＭＡＰＴ ＡＳＯもまた、ＯＰＳ ＭＡＰＴ ＡＳＯと比較してタウタンパク質レベルを低減させるのにより効率的であったかどうかを評価するために、ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンを、分化の開始後１５日目から処理し、ＡＳＯを、１５日の全期間において５日毎に加えた。タウタンパク質の半減期は、特に長い軸索を有する神経細胞において微小管を安定化させる際のその機能を仮定すれば非常に長いと考えられるため、この治療方針が必要であった。この長期のＡＳＯ処理期間の後、細胞を溶解し、タウタンパク質レベルをビーズベースのイムノアッセイを使用して評価した（表１０）。
Figure 2021515784
陰性対照ＡＳＯは、タウタンパク質レベルに影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＭＡＰＴ ＮＰＳ ＡＳＯは、表９において示されるとおり、ＭＡＰＴ ＯＰＳ ＡＳＯよりも２倍多く用量依存的にタウタンパク質レベルを低減させた。
これらの実施例から、ＮＰＳ化学構造を有するＭＡＰＴ ＡＳＯは、同じ配列を有するがＯＰＳ化学構造を有するＡＳＯと比較して、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて総ＭＡＰＴ ｍＲＮＡ及びタウタンパク質レベルを低減するのに驚くほど優位であることが決定された。
ＩＥＸ ＨＰＬＣ及びエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳ分析
複合体を形成したオリゴヌクレオチドの安定性試験
およそ０．１０ＯＤのオリゴマーを水中で溶解させ、続いてＩＥＸ ＨＰＬＣ及びＬＣ／ＭＳ分析のための特別なバイアル中にピペットで分注した。分析的ＨＰＬＣ及びＥＳ ＬＣ−ＭＳは、オリゴヌクレオチドの完全性を確証した。
実施形態において、開示されるオリゴヌクレオチドは、同じ配列の未修飾オリゴヌクレオチドと比較して、標的核酸配列に対する親和性の増大を示す。例えば、一部の配列において、開示されるオリゴヌクレオチドは、同じ配列の未修飾オリゴヌクレオチドより高い親和性で標的核酸配列と相補的であり且つハイブリダイズする核酸塩基配列を有する。実施形態において、相補的な標的核酸配列と複合体を形成した／ハイブリダイズした開示されるオリゴヌクレオチドは、＞３７℃の融解温度Ｔｍを有する。二重鎖／複合体は、生理的条件又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などのほぼ生理的条件下で形成され得る。実施形態において、二重鎖／複合体のＴｍは、＞５０℃である。実施形態において、二重鎖／複合体のＴｍは、５０〜１００℃である。実施形態において、生理的条件又はほぼ生理的条件下で標的核酸配列と二重鎖を形成した開示されるオリゴヌクレオチドのＴｍは、＞５０℃である。
標的ＲＮＡ配列と結合する開示されるオリゴヌクレオチドの二重鎖安定性は、二重鎖の熱解離データを使用して評価された。熱解離試験は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ温度調節器及びＪｕｌａｂｏ Ｆ１２−ＥＤ恒温槽に接続されたＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ２６００分光計を使用して、二重鎖の２６０ｎｍでの温度依存的ＵＶ吸光度を測定することによって実施された。開示されるオリゴヌクレオチド及び標的核酸配列は、２μＭの最終二重鎖濃度を得るように等モル比で混合された。全ての試料は、１×ＰＢＳ緩衝液条件（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中で調製された。２６０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ吸光度が記録され、３８０ｎｍでの吸光度を使用して補正された（ＵＶセル光路長＝１ｃｍ）。データは、加熱（２０〜９５℃）と冷却（９５〜２０℃）の両方の行程に関して、１℃間隔で１℃／分の速度で記録された。Ｔｍ値は、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｔｍ分析ソフトウェアを使用して、加熱シグモイドプロファイルの一次導関数を取ることによって決定された。最終のＴｍは、３つの独立した試験の平均であり、誤差は、標準偏差を表す。表１１において記載されるとおり、ＮＰＳ修飾された配列番号１は、３’−ＮＨ当たり約＋０．８℃のＴｍを有する。
Figure 2021515784
タウＧＡＰｍｅｒの検証
タウＧＡＰｍｅｒの有効性を評価するために、ヒト神経細胞株（ＫＥＬＬＹ細胞）を、８０ｎＭ〜２０μＭまでの範囲の様々な濃度で処理した。リードＧＡＰｍｅｒの２つのバージョン：２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）及び２’−Ｏ−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）が評価された。これらのＧＡＰｍｅｒは、５−１０−５形態であり、これは、最初及び最後の５ヌクレオチドがＮＰＳ及び２’化学構造を含み、中間の１０ヌクレオチドがＯＰＳ化学構造を有する「ギャップ」であることを意味している。処理開始の３日後、総ＲＮＡが回収され、６種の異なるアッセイを使用するＲＴ−ｑＰＣＲにより総タウｍＲＮＡレベルに関して評価された（表６を参照されたい）。３Ｒ及び４ＲタウｍＲＮＡの発現は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、処理された細胞において評価された（表６を参照されたい）。
Figure 2021515784
全てのＧＡＰｍｅｒは、用量依存的に、総３Ｒ及び４ＲタウｍＲＮＡの用量依存的な減少を示した。タウｍＲＮＡのエクソン１０を標的化するＧＡＰｍｅｒ Ｃ及びＤは、他のＧＡＰｍｅｒと比較して、４ＲタウｍＲＮＡレベルを低減するのにより効率的であった。
これらのＧＡＰｍｅｒがヒトニューロンにおけるタウｍＲＮＡレベルも低減することを確認するために、同じ実験がヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて実施され、これらの細胞を同じＧＡＰｍｅｒで７２時間処理した。非常に類似した結果が、ＫＥＬＬＹ細胞と比較してｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてＧＡＰｍｅｒの各々について得られた。
ＧＡＰｍｅｒ体内分布
さらなるＡＳＯ ＧＡＰｍｅｒが、未修飾の化学構造及びＮＰＳ化学構造とともに合成された。これらのＡＳＯのＩＤ、化学構造、配列及び標的部位は、表１３において列挙される。これらのＧＡＰｍｅｒは、５−１０−５形態であり、これは、最初及び最後の５ヌクレオチドが指定の結合及び２’化学構造を含み、中間の１０ヌクレオチドがＯＰＳ化学構造を有する「ギャップ」であることを意味している。ＮＰＳタウＧＡＰｍｅｒが、異なる／優位な体内分布プロファイルを有したかどうかを評価するために、ＧＡＰｍｅｒ Ｅをヨウ素−１２５で放射性標識した。同様の手法によって、ＧＡＰｍｅｒ Ｇをヨウ素−１２５で放射性標識した。
Figure 2021515784
放射性標識化合物は、髄腔内ボーラス注射を介してラットの中に入り、注射後最初の１時間の間に４倍で動物を画像化し、その後、注射の６時間及び２４時間、並びに７日及び１４日後に単一陽電子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）を使用して画像を取得した。この体内分布試験の結果は、比較対象のＧＡＰｍｅｒ Ｇは、脳により速く移動するが、注射後６〜２４時間までに定常状態レベルに達するように脳外に速やかに排出されることを示した（表１４〜１５）。ＧＡＰｍｅｒ Ｅは脳への移動が遅いように見えるが、比較対象のＧＡＰｍｅｒ Ｇと比較して、脳内では高い定常状態レベルに達する（表１４〜１５）。加えて、ＧＡＰｍｅｒ Ｅは、比較対象のＧＡＰｍｅｒ Ｇと比較して、異なるＣＮＳ領域（深部脳領域及び脊髄を含む）において、より長い期間保持されているように見える（表１４〜１５）。結論として、本試験は、タウを標的化するＧＡＰｍｅｒ Ｅは、比較対象のＧＡＰｍｅｒ Ｇと比較して、齧歯類のＣＮＳにおいてより長い保持時間を有することを示す。
Figure 2021515784
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ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるタウＧＡＰｍｅｒの評価
次に、リードＧＡＰｍｅｒの１つ（ＧＡＰｍｅｒ Ｅ）の有効性が、ヒトｉＰＳＣ由来のニューロン（ｉＮｅｕｒｏｎ）において、タウｍＲＮＡを減少させる際のＩｏｎｉｓのタウＧＡＰｍｅｒ（ＧＡＰｍｅｒ Ｇ）の有効性と比較された。ｉＮｅｕｒｏｎは、合計７２時間、様々な用量の両方のＧＡＰｍｅｒで処理され、総細胞ＲＮＡを回収した。タウｍＲＮＡは、６種の異なるアッセイ並びに３Ｒ及び４Ｒタウ特異的アッセイで測定された（表１６）。両方の化合物が、タウｍＲＮＡレベルを用量依存的に低減した。しかしながら、ＧＡＰｍｅｒ Ｅは、約４〜５倍小さいＩＣ５０値を一貫して示したが、これは、そのＧＡＰｍｅｒがＧＡＰｍｅｒ Ｇより強力であることを示している。
Figure 2021515784
Figure 2021515784
Figure 2021515784
Figure 2021515784
治療方法
アルツハイマー病（ＡＤ）などのタウオパチーに罹患している成人ヒトは、髄腔内又は脳室内投与経路などの任意の好適な投与経路を介して、治療に有効な本開示のオリゴヌクレオチドの化合物、例えば、配列番号１に相当する核酸塩基配列を有し、且つ本開示に従って修飾されたオリゴヌクレオチドを投与される。好適な投与経路は、静脈内若しくは皮下投与経路などの全身投与又は髄腔内若しくは脳室内投与経路を介したＣＮＳへの直接的な投与を含んでもよい。治療は、ＡＤなどのタウオパチーの１つ以上の症状が改善するまで、又は例えば、タウタンパク質レベルが低減されるまで継続される。

Claims (102)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、
    Ｂは、核酸塩基であり、
    Ｒ１は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、且つ
    Ｒ’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＦである）の１個以上のヌクレオチドを含むＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチド。
  2. 前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、式（Ｉ）のヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 前記オリゴヌクレオチドが、２〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 前記オリゴヌクレオチドが、２〜２６個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 前記オリゴヌクレオチドが、５〜１０個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. Ｂが、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて未修飾核酸塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. Ｂが、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて修飾核酸塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. Ｂが、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいて未修飾核酸塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. Ｂが、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいて修飾核酸塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 各Ｒ’が、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいてＨである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 各Ｒ’が、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいてＨである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. Ｒ１が、式（Ｉ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. Ｒ１が、式（Ｉ）の各ヌクレオチドにおいて−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. 前記オリゴヌクレオチドがさらに、式（ＩＩ）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    Ｙは、Ｓ又はＯであり、
    Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、
    Ｂは、核酸塩基であり、
    Ｒ２は、−ＣＲ’３、−ＣＲ’２ＯＣＲ’３、−（ＣＲ’２）３ＯＣＲ’３又は−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３であるか、又はＲ２は、−（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、且つＹはＯであり、且つ
    Ｒ’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ又はＦである）の１個以上のヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  15. 前記オリゴヌクレオチドが、式（ＩＩ）（式中、Ｒ２は、−ＣＲ’３である）の少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  16. 前記オリゴヌクレオチドが、式（ＩＩ）（式中、Ｒ２は、−（ＣＲ’２）１〜２ＯＣＲ’３である）の少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  17. 前記オリゴヌクレオチドが、式（ＩＩ）（式中、Ｒ２は、−（ＣＲ’２）１〜２ＣＲ’３である）の少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  18. Ｂが、式（ＩＩ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいて修飾核酸塩基である、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  19. Ｙが、式（ＩＩ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいてＳである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  20. Ｙが、式（ＩＩ）の少なくとも１個のヌクレオチドにおいてＯである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. Ｙが、式（ＩＩ）の各ヌクレオチドにおいてＳである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  22. Ｙが、式（ＩＩ）の各ヌクレオチドにおいてＯである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  23. 前記オリゴヌクレオチドがさらに、式（ＩＩＩａ）又は式（ＩＩＩｂ）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    Ｙは、Ｓ又はＯであり、
    Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、且つ
    Ｂは、核酸塩基である）の１個以上のヌクレオチドを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  24. 前記オリゴヌクレオチドがさらに、式（Ｖ’）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    Ｙは、Ｓ又はＯであり、
    Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、
    Ｂは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、
    Ａは、−（ＣＲ’’Ｒ’’）１〜２−であり、且つ
    Ｒ’’は、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ又はＭｅである）の１個以上のヌクレオチドを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  25. 前記オリゴヌクレオチドが、式（ＶＩ）：
    ５’Ｘ−Ｙ−Ｚ３’ （ＶＩ）
    （式中、
    Ｘ、Ｙ及びＺの各々は、２〜１０個のヌクレオチドを含むドメインであり、前記Ｘ及びＺドメインの少なくとも１つは、少なくとも１個の式（Ｉ）のヌクレオチドを含み、且つ前記Ｙドメインのヌクレオチドの各々は、２’−デオキシヌクレオチドである）のコンストラクトにおいて配置される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  26. 前記オリゴヌクレオチドが、１８〜２２個のヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  27. 前記Ｘ及びＺドメインがそれぞれ、５〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  28. 前記Ｙドメインが、５〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  29. 前記Ｘ及びＺドメインがそれぞれ、５〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ前記Ｙドメインが、５〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  30. 前記Ｘ及びＺドメインがそれぞれ、５個のヌクレオチドを含み、且つ前記Ｙドメインが、１０個のヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  31. 前記Ｘ及びＺドメインの各ヌクレオチドが、式（Ｉ）のヌクレオチドである、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  32. 前記Ｘドメインの少なくとも１個のヌクレオチド及び前記Ｚドメインの少なくとも１個のヌクレオチドがそれぞれ、独立して、式（ＩＩ）のヌクレオチド、式（ＩＩＩａ）のヌクレオチド、及び式（ＩＩＩｂ）のヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  33. 前記Ｘ及びＺドメインの少なくとも１個のヌクレオチドの各々が、同じヌクレオチドである、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド。
  34. 前記Ｙドメインの各ヌクレオチドが、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結される、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  35. 前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  36. 前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド。
  37. 前記オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に相当する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  38. 前記オリゴヌクレオチドが、式（ＶＩ）：
    ５’Ｘ−Ｙ−Ｚ３’ （ＶＩ）
    （式中、
    前記Ｘ及びＺドメインはそれぞれ、５個のヌクレオチドを含み、各ヌクレオチドは、式（ＩＩ）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    Ｙは、Ｓであり、
    Ｒは、Ｈであり、
    Ｂは、核酸塩基であり、
    Ｒ２は、（ＣＲ’２）２ＯＣＲ’３であり、各Ｒ’は、Ｈであり；且つ
    前記Ｙドメインは、それぞれホスホロチオエート結合を介して連結された１０個のヌクレオチドを含み且つそれぞれ２’−デオキシヌクレオチドを含む）の構造を有する）のコンストラクトにおいて配置される、請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド。
  39. 式（ＶＩ）：
    ５’Ｘ−Ｙ−Ｚ３’ （ＶＩ）
    （式中、
    Ｘ−Ｙ−Ｚは、１８〜２２個のヌクレオシドの配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであり、且つ任意選択によりリガンド標的化基に対して５’及び／又は３’末端でコンジュゲートされ；
    Ｘは、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；
    Ｚは、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；且つ
    Ｙは、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された２〜１０個の２’−デオキシ−ヌクレオシドの配列を含むドメインである）によって表されるＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的なキメラオリゴヌクレオチド。
  40. 前記Ｙドメインが、６〜１０個のヌクレオシド長である、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  41. 前記Ｘ及び／又はＺドメインが、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された修飾ヌクレオシドの配列を含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  42. 前記Ｙドメインが、少なくとも１つのホスホジエステルサブユニット間結合を含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  43. 前記Ｙドメインが、チオホスフェートサブユニット間結合、及び任意選択により、１個又は２個のホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシ−ヌクレオシドからなる、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  44. 前記Ｘドメインが、修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾が、独立して、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、立体構造的に制限されたヌクレオシド、２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート及び２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートからなる群から選択される、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  45. Ｚの機能ドメインが、修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾が、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、立体構造的に制限されたヌクレオシド、２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート及び２’−ＯＨ−Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートからなる群から選択される、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  46. 前記Ｘ及び／又はＺドメインが、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された１個以上の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  47. 前記Ｘ及びＺドメインが、１個以上の２’−アラビノ−Ｆ及び／又は２’−リボ−Ｆ修飾ヌクレオシドを含み、各前記ヌクレオシドが、独立して、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合の少なくとも１つを介して連結される、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  48. 前記Ｘ及びＺドメインが、１個以上の２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドを含み、各前記ヌクレオシドが、独立して、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダート、又はチオホスフェートサブユニット間結合の少なくとも１つを介して連結される、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  49. 前記Ｘ及びＺドメインの各々における前記修飾ヌクレオシドが、チオホスフェートサブユニット間結合を介して連結された２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドであり、且つ前記修飾ヌクレオシドが、５−メチルシトシン核酸塩基を含むが、任意選択によりシトシンを含まない、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  50. 前記修飾ヌクレオシドが、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、任意選択によりアデニンを含まない、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  51. 前記修飾ヌクレオシドが、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意選択によりウラシルを含まない、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  52. 前記修飾ヌクレオシドが、２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含むが、アデニン及び５−メチルウラシル核酸塩基、並びに任意選択によりウラシルを含まない、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  53. 前記Ｙドメインが、６〜８個の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  54. 前記Ｘ及びＺドメインの各々における前記修飾ヌクレオシドが、チオホスフェートサブユニット間結合を介して任意選択により連結された２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシド及び立体構造的に制限されたヌクレオシドを含み、且つ前記２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドが、５−メチルシトシン核酸塩基を含むが、任意選択によりシトシンを含まない、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  55. 前記Ｘ及びＺドメインの各々における前記修飾ヌクレオシドが、２’−ＯＭｅ及び立体構造的に制限されたヌクレオシドを含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  56. 前記Ｘ及びＺドメインの各々における前記修飾ヌクレオシドが、立体構造的に制限されたヌクレオシドを含み、且つ少なくとも１個の修飾ヌクレオシドが、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  57. 前記Ｙドメインが、７〜８個の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  58. 前記２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドが、５−メチルウラシル核酸塩基を含むが、任意選択によりウラシルを含まない、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  59. 前記Ｙドメインが、９〜１０個の２’−デオキシ−ヌクレオシドを含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  60. 前記Ｘ及びＺドメインが、式（Ａ１）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    Ａは、それぞれの場合において独立して、ＮＨ又はＯであり；
    Ｂは、それぞれの場合において独立して、未修飾又は修飾核酸塩基であり；
    Ｗは、それぞれの場合において独立して、ＯＲ又はＳＲであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり；
    Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、及びＯ−メトキシエトキシからなる群から選択され；
    Ｒ’’’は、Ｈであるか、又はＲ’及びＲ’’’を合わせて−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成し、且つ
    ａは、３〜９の整数であり、
    Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’がそれぞれＨである場合、ＡはＮＨであり、且つ任意選択によりＡがＯである場合、ＷはＳＲである）によって表されるヌクレオチドを含む、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  61. 前記Ｘ及び／又はＺドメインが、１個以上のオリゴヌクレオチドを含み、前記修飾が、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’である、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  62. 前記Ｘドメインが、１個以上のオリゴヌクレオチドを含み、前記修飾が２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’である、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  63. 前記Ｚドメインが、１個以上のオリゴヌクレオチドを含み、前記修飾が２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’である、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  64. 前記オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に相当する、請求項３９に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  65. ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、式（ＶＩＩ）：
    ５’−Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’−３’ （ＶＩＩ）
    （式中、
    Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’は、１６〜２２個のヌクレオシドの配列を含むキメラオリゴヌクレオチドであり、且つ任意選択により５’及び／又は３’末端でコンジュゲートされ；
    Ｘ’は、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；
    Ｚ’は、３〜１０ヌクレオシド長である修飾ヌクレオシドの配列を含むドメインであり；且つ
    Ｙ’は、サブユニット間結合を介して連結された２〜４個の２’−デオキシ−ヌクレオシドの配列を含むドメインであり、
    前記Ｘ’及び／又はＺ’ドメインは、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート又はＮ３’→Ｐ５’チオホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結された修飾ヌクレオシドの配列を含む）によって表されるコンストラクトを含む、キメラオリゴヌクレオチド。
  66. 前記Ｙ’ドメインが、チオホスフェートサブユニット間結合、及び任意選択により、１個のホスホジエステルサブユニット間結合を介して連結された２’−デオキシ−ヌクレオシドからなる、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  67. 前記Ｘ’ドメインが、９〜１０個のヌクレオシド長である、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  68. 前記Ｘ’ドメインが、修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾が、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、及び立体構造的に制限されたヌクレオシドからなる群から選択される、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  69. 前記Ｚ’ドメインが、修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾が、２’−Ｆ、２’−Ｆ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ、２’−ＯＭｅ−Ｎ３’→Ｐ５’、２’−Ｏ−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｎ３’→Ｐ５’、及び立体構造的に制限されたヌクレオシドからなる群から選択される、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  70. 前記Ｘ’及び／又はＺ’ドメインが、１個以上の２’−アラビノ−Ｆ及び／又は２’−リボ−Ｆ修飾ヌクレオシドを含む、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  71. 前記Ｘ’及び／又はＺ’ドメインにおける前記修飾ヌクレオシドが、２’−ＯＭｅ及び立体構造的に制限されたヌクレオシドを含む、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  72. 前記Ｘ’及び／又はＺ’ドメインにおける前記修飾ヌクレオシドが、立体構造的に制限されたヌクレオシド及びＮ３’→Ｐ５’修飾を含む、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  73. 前記配列が、表Ｂにおいて２〜４個のヌクレオチドＹドメインを有するものから選択される、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  74. 前記オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に相当する、請求項６５に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
  75. ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、以下の式（Ａ）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    ＸＡは、ＮＨ又はＯであり、
    Ｙは、ＯＲ又はＳＲであり、Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、
    ＢＡは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、
    ＲＡ’及びＲＡ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され、且つ
    ＲＡ’’’は、Ｈであるか、又はＲＡ’及びＲＡ’’’を合わせて−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成する）の１個以上のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
  76. ＲＡ’及びＲＡ’’’がＨであり；且つＲＡ’’がＦである、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド。
  77. ＲＡ’及びＲＡ’’がＨであり；且つＲＡ’’’がＦ、ＯＨ、Ｈ又はＯＭｅである、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド。
  78. ＸＡがＮＨであり；ＢＡが未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＡ’及びＲＡ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオシド（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）を形成し；且つＲＡ’’がＨである、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド。
  79. ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つが、Ｈである、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド。
  80. ＢＡがプリン核酸塩基であるとき、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つは、ＯＨ又はＦであり、且つ／又はＢＡがピリミジン核酸塩基であるとき、ＲＡ’及びＲＡ’’の少なくとも１つは、ＯＭｅ、ＯＨ又はＦである、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド。
  81. 前記修飾核酸塩基が、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルウラシル、及びｇ−クランプから選択される、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド。
  82. ＭＡＰＴ遺伝子配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、以下の式（ＩＸ）：
    Figure 2021515784
    （式中、
    Ｒは、Ｈ又は正に荷電した対イオンであり、
    ＢＢは、それぞれの場合において独立して、天然若しくは未修飾核酸塩基又は修飾核酸塩基であり、
    ＲＢ’及びＲＢ’’はそれぞれ、それぞれの場合において独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ、Ｏ−メトキシエトキシから選択され、且つ
    ＲＢ’’’は、Ｈであるか、又はＲＢ’及びＲＢ’’’を合わせて−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−を形成する）の１０個以上のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
  83. ＲＢ’及びＲＢ’’’がＨであり；且つＲＢ’’がＦである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
  84. ＲＢ’及びＲＢ’’がＨであり；且つＲＢ’’’がＦ、ＯＨ、Ｈ又はＯＭｅである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
  85. ＢＢが未修飾又は修飾核酸塩基であり；ＲＢ’及びＲＢ’’’を合わせて、立体構造的に制限されたヌクレオシド（例えば、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−）を形成し；且つＲＢ’’がＨである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
  86. ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つが、Ｈである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
  87. ＢＢがプリン核酸塩基であるとき、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つは、ＯＨ又はＦであり、且つ／又はＢＢがピリミジン核酸塩基であるとき、ＲＢ’及びＲＢ’’の少なくとも１つは、ＯＭｅ、ＯＨ又はＦである、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
  88. 前記修飾核酸塩基が、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルウラシル、及びｇ−クランプから選択される、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
  89. 請求項１〜８８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  90. 前記組成物が、髄腔内又は脳室内送達に好適である、請求項８９に記載の医薬組成物。
  91. ＣＮＳ細胞におけるＭＡＰＴ遺伝子発現を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１〜９０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又は組成物と接触させることを含む、方法。
  92. ＣＮＳ細胞におけるＭＡＰＴ ｍＲＮＡの転写を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１〜９０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又は組成物と接触させることを含む、方法。
  93. タウオパチーを有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１〜９０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又は組成物を投与することを含む、方法。
  94. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項９３に記載の方法。
  95. ＭＡＰＴ遺伝子と複合体を形成した前記オリゴヌクレオチドが、＞３７℃の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜９４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  96. タウオパチーを有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１〜９０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又は組成物を投与することを含む、方法。
  97. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項９６に記載の方法。
  98. ＣＮＳ細胞においてＭＡＰＴ ｍＲＮＡの発現を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１〜９０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は組成物と接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記ＭＡＰＴ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有する、方法。
  99. タウオパチーを有する対象を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１〜９０のいずれかに記載の前記オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は組成物を投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記ＭＡＰＴ遺伝子配列の少なくとも一部と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有する、方法。
  100. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項９９に記載の方法。
  101. 標的核酸と請求項１〜９０のいずれかに記載の前記オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド又は組成物を含むアンチセンス化合物を接触させることによってＭＡＰＴ遺伝子の発現を調節する方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、前記ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的であるか又はハイブリダイズする核酸塩基配列を含有する、方法。
  102. 前記ＭＡＰＴ遺伝子の一部が、エクソン５である、請求項９８、９９及び１０１のいずれかに記載の方法。
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