ES2820713T3 - Terapia mediada por ARN interferente para enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

Abstract

Agente terapéutico para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT, en el que dicho agente terapéutico comprende uno o más ARNip dirigidos al exón 10 del gen MAPT, en el que los uno o más ARNip se seleccionan de entre un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases establecida en las SEQ ID No.: 2, 4 o 6, y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia mediada por ARN interferente para enfermedades neurodegenerativas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la terapia mediada por ARN interferente para enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de la proteína tau asociada a los microtúbulos.

Antecedentes de la invención

La modulación de la expresión génica por ARN endógenos no codificantes se han apreciado cada vez más y se sabe que desempeña un papel en el desarrollo eucariota y el control epigenético. Recientemente, se han desarrollado procedimientos para desencadenar ARN interferente (ARNi) contra dianas específicas en células de mamíferos mediante la introducción de pequeñas moléculas de ARN interferente (ARNip) producidas exógenamente o expresadas intracelularmente.

Se ha demostrado que estos rápidos procedimientos económicos y efectivos son efectivos para experimentos de disminución de expresión in vitro e in vivo. La capacidad de lograr tal silenciamiento génico selectivo ha llevado a la hipótesis de que los ARNip se pueden usar para suprimir la expresión génica con fines terapéuticos. Los candidatos ideales para un abordaje de ARNip de este tipo serían las enfermedades de herencia dominante.

Estudios recientes realizados por Miller V y col.1 han demostrado que los ARNip pueden usarse para atacar enfermedades neurodegenerativas intratables, tal como la neurodegeneración de poliglutamina (polyQ) en la enfermedad de Machado-Joseph, la ataxia espinocerebelosa de tipo 3 (MJDSCA3) y la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17). Estos estudios se han centrado exclusivamente en el silenciamiento selectivo de la transcripción producida por el alelo mutante1. El ARN interferente ha demostrado ser una estrategia eficaz para silenciar el alelo tau mutante V337M, sin embargo, el agotamiento selectivo del alelo mutante no se logró por completo en el estudio porque hubo un agotamiento parcial del alelo de tipo silvestre de tau1. Más recientemente, se ha descrito otro ejemplo de ARNip dirigido a MAPT2, en el que se analizó una mezcla de cuatro ARNip destinados a suprimir todas las isoformas de tau en un modelo de tauopatía de ratón.

El gen MAPT (proteína tau asociada a microtúbulos) consiste en 16 exones y su expresión está regulada por un corte y empalme alternativo complejo. Esto da como resultado la producción de dos tipos de transcripciones sometidas a corte y empalme alternativamente: uno que porta el exón 10, también conocido como isoforma 4R (cuatro repeticiones de microtúbulos) y el otra que carece del exón 10 se denomina isoforma 3R (tres repeticiones de microtúbulos). En el cerebro adulto humano normal se expresan niveles iguales de estas dos isoformas. Aunque en MAPT se conocen varias mutaciones que causan FTDP-17, la mitad de las cuales afectan al corte y empalme alternativo del exón 10. Estas incluyen mutaciones de sentido erróneo, mutaciones silenciosas y mutaciones puntuales que se encuentran en el exón 10, los intrones 9 y 10. Se sabe que implican un aumento en el exón 10 que provoca una acumulación excesiva de 4R. Esto conduce a la formación de ovillos neurofibrilares, lo que da como resultado neurodegeneración.

Vale la pena mencionar que las anomalías de tau están vinculadas a la patogenia de la enfermedad neurodegenerativa, denominada colectivamente "tauopatías", y en los cerebros con EA (enfermedad de Alzheimer) hay niveles significativamente elevados de tau.

Se han utilizado algunos abordajes para la corrección de la inclusión del exón 10 en FTDP-17:

- Moléculas pequeñas: se ha realizado un cribado que dio esteroides cardiotónicos como fármacos moduladores del corte y empalme del exón 10, aunque no específicos,3 y

- Oligonucleótidos antisentido para omisión del exón: el documento US-A-2003/0170704 de Stamm y col. se refiere a sustancias que son capaces de controlar la inclusión del exón 10 de MAPT (reguladores del corte y empalme proteico o su ADNc, polipéptidos que controlan la fosforilación de los reguladores de corte y empalme, o su ADNc y oligonucleótidos antisentido que interactúan con las uniones de corte y empalme del exón 10 de MAPT). Además, el trabajo de Kalbfuss y col.4 ha demostrado que los oligorribonucleótidos que se unen a las uniones de corte y empalme del exón 10 podrían suprimir la inclusión predominante del exón 10 en el ARNm de tau en el contexto de células PC12 de rata. Sin embargo, un trabajo reciente de Sud R y col.5 demostró que la selección del exón 10 con oligonucleótidos morfolino antisentido no producía omisión del exón en líneas celulares de neuroblastoma. Estos autores afirman que la regulación del corte y empalme del exón 10 en células que expresan predominantemente la isoforma 4R puede variar de la línea celular del neuroblastoma en la que domina la isoforma 3R.

- Trans-corte y empalme del exón 10: Se utilizó reprogramación de ARN mediante corte y empalme en trans de ARN mediado por espliceosomas (SMaRT) para corregir el corte y empalme aberrante del exón 10 resultante de mutaciones de FTDP-17 en un sistema de minigén en células en cultivo6. Este abordaje, sin embargo, se ve afectado por la baja eficiencia.

- En el documento WO 2007/107789 se desvelan moléculas de ARNip dirigidas al exón 10 del gen MAPT para terapia de enfermedades neurodegenerativas.

Objeto y sumario de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico eficaz en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT.

Según la invención, el objeto anterior se logra gracias al procedimiento especificado en las reivindicaciones siguientes, que se entienden como parte integrante de la presente descripción.

En una realización, la presente divulgación desvela un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT, en el que dicho agente terapéutico comprende uno o más ARNip dirigidos a la secuencia del exón 10 del gen MAPT (SEQ ID No.: 1), en el que uno o más ARNip se seleccionan de un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases descrita en una cualquiera de las SEQ ID No.: 2, 4, 6 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.

En otra realización adicional, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más ARNip, en la que uno o más ARNip comprenden una cadena sentido que comprende al menos 19 bases continuas de ARNm correspondientes a la secuencia del exón 10 de MAPT de la SEQ ID No.: 1 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que los uno o más ARNip se seleccionan de entre un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases descrita en una cualquiera de las SEQ ID No.: 2, 4, 6 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se describirá a continuación, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras de dibujo adjuntas, en las que:

- Figura 1. Análisis de RT-PCR semicuantitativa de los niveles del exón 10 en células SH-SY5Y transfectadas con plásmido de tipo silvestre y mutante N279. La electroforesis en gel muestra los productos de la RT-PCR de las transcripciones de los minigenes, que contienen el exón 10 (E10+, 290 pb) y sin exón 10 (E10-, 210 pb). El histograma representa las unidades densitométricas de cada condición de tratamiento normalizada en p actina. Los valores representan la media ± SD (n=3).

- Figura 2. Imágenes representativas de la línea celular SH-SY5Y transfectadas con 0,25 mg de plásmido de tipo silvestre o plásmido mutante. Plásmidos indicadores A) de tipo silvestre y B) Mutantes N279.

- Figura 3. Establecimiento de valores de umbral basadosen las intensidades de RFP y GFP. Gráficos de dispersión que representan los valores verde/rojo (G/R) de cada célula en un pocillo en particular que lleva uno de los plásmidos indicadores dobles (SV y Mut, respectivamente). Los umbrales indicados se seleccionan arbitrariamente para clasificar la población celular en tres clases diferentes.

- Figura 4. Análisis basado en imágenes de células SHYS5Y transfectadas con plásmidos indicadores de tipo silvestre y mutantes. El histograma representa las lecturas seleccionadas del análisis cuantitativo de los dos indicadores, tales como los porcentajes relativos de las tres subpoblaciones de células SHYS5Y clasificadas por propiedades de intensidad, la eficacia de la transfección y la viabilidad celular. Los valores representan la media ± SD (n = 3)

- Figura 5. Secuencias E10 de tau humana (mayúscula) y secuencias I9 e I10 flanqueantes (minúscula). Los sitios de corte y empalme en 5' y 3' se indican mediante 5'ss y 3'ss, respectivamente. Solo se indican las mutaciones de FTDP-17 que afectan al corte y empalme de E10. Las deleciones se indican mediante triángulos sombreados. Se indican las secuencias y la posición diana de los tres ARNip diseñados.

- Figura 6. Se ha realizado un ensayo de cribado basado en imágenes para los diferentes ARNip y se compararon con los valores obtenidos con un ARNip de control. Los ARNip se cotransfectaron en células SH-SY5Y junto con 0,25 |jg de plásmido de minigén indicador mutante. Los valores representan la media ± SD (n = 3)

- Figura 7. Se ha realizado un ensayo de cribado basado en imágenes para los diferentes ARNip y se ha comparado con los valores obtenidos con un ARNip de control. Los ARNip se cotransfectaron en células SH-SY5Y junto con 0,5 jg de plásmido de minigén indicador mutante. Los valores representan la media ± SD (n = 3).

- Figura 8. Análisis de RT-PCR semicuantitativa de células SH-SY5Y transfectadas con el plásmido indicador del minigén y el ARNip A.

- Figura 9. Análisis de RT-PCR semicuantitativa de células SH-SY5Y transfectadas con el plásmido indicador del minigén y el ARNip B.

- Figura 10. Análisis de RT-PCR semicuantitativa de células SH-SY5Y transfectadas con el plásmido indicador del minigén y ARNip C.

- Figura 11. RT-PCR semicuantitativa de células NSC34 transfectadas con tres ARNip o un ARNip de control.

- Figura 12. Secuencia de nucleótidos del exón 10 de PFLARE 5A MAPT.

- Figura 13. Secuencia de nucleótidos del exón 10 de PFLARE 5A MAPT MUT.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá con mayor detalle a continuación, a modo de ejemplo no limitante, con referencia a una terapia mediada por ARN interferente que hace uso de un modelo celular que recapitula las condiciones patológicas de la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17). No obstante, la terapia mediada por ARN interferente desvelada en el presente documento puede usarse para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías en la proteína tau codificada por el gen MAPT, como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la distrofia miotónica de tipo 1 y la enfermedad de Parkinson.

En la siguiente descripción, se dan numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones. Las realizaciones se pueden poner en práctica sin uno o más de los detalles específicos, o con otros procedimientos, componentes, materiales, etc. En otros casos, las estructuras, materiales u operaciones bien conocidos no se muestran ni describen con detalle para evitar enmascarar aspectos de las realizaciones.

La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a "una realización" o "realización" significa que un rasgo estructura o característica particular descritos en relación con la realización se incluye en al menos una realización. Por tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "en una realización" en varios lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren todas necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.

Los encabezados proporcionados en el presente documento son solo con fines de comodidad y no interpretan el ámbito o significado de las realizaciones.

La presente descripción se refiere a un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT, en el que dicho agente terapéutico comprende uno o más ARNip dirigidos al exón 10 del gen MAPT, en el que los uno o más ARNip se seleccionan de entre un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases descrita en una cualquiera de las SEQ ID No.: 2, 4, 6 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.

En todavía una realización adicional preferida, la presente descripción proporciona uno o más ARNip dirigidos al exón 10 del gen MAPT capaces de inducir la degradación selectiva de las transcripciones de MAPT que contienen el exón 10.

Las enfermedades neurodegenerativas asociadas a anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT que se pueden beneficiar de la administración de uno o más ARNip dirigidos al exón 10 del gen MAPT se seleccionan de entre enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, distrofia miotónica de tipo 1, enfermedad de Parkinson, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligada al cromosoma 17 (FTDP-17).

La descripción desvela un procedimiento de tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa asociada con anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT que comprende administrar a un paciente que lo necesita uno o más ARNip dirigidos al exón 10 del gen MAPT, en el que el uno o más ARNip comprenden una cadena sentido que comprende al menos 19 bases continuas de ARNm correspondiente a la secuencia del exón 10 de MAPT de la SEC ID No.: 1 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma en una cantidad suficiente para realizar dicho tratamiento, en el que uno o más ARNip inducen la degradación selectiva de las transcripciones de MAPT que contienen el exón 10, en el que los uno o más ARNip se seleccionan de entre un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases descrita en una cualquiera de las SEQ ID No.: 2, 4, 6 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.

En otra realización adicional, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más ARNip dirigidos al exón 10 del gen MAPT y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que los uno o más ARNip se seleccionan de entre un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases descrita en una cualquiera de las SEQ ID No.: 2, 4, 6 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.

La presente divulgación muestra la viabilidad de una terapia génica basada en ARNip para permitir el silenciamiento génico postranscripcional de las transcripciones de MAPT que contienen el exón 10 en FTDP-17. Se ha diseñado un panel de ARNip dirigidos al ARNm de tau que contiene el exón 10 y se ha probado en células SH-SY5Y en un plásmido indicador de minigén mutante en el contexto de la mutación de sentido erróneo N279 (AAT a AAG) que recapitula la enfermedad de FTDP-17. Además, los 3 ARNip se probaron en células NSC34 (una línea celular similar a una motoneurona)1 para validar los efectos sobre la afección endógena con una inclusión predominante del exón 10 (80 %).

El efecto de los ARNip se ha analizado utilizando un sistema de imágenes de alto contenido. Los resultados obtenidos a través del ensayo de detección se han validado aún más mediante un análisis de RT-PCR. El efecto sobre las transcripciones de MAPT que contienen el exón 10 endógeno se ha probado mediante análisis de RT-PCR.

En la presente descripción, los inventores diseñaron un nuevo abordaje para la restauración de una relación 4Rtau/3Rtau normal, en función del uso de ARNip dirigidos al exón 10 de MAPT e inducen la degradación selectiva de las transcripciones de MAPT que contienen el exón 10. Estos ARNip proporcionan un beneficio terapéutico para los pacientes con FTDP-17 que portan mutaciones en el exón 10 de MAPT que provocan la inclusión del exón 10, ya que las secuencias diana no se ven afectadas por las mutaciones.

Los tres ARNip evaluados en el presente documento tienen las siguientes secuencias de nucleótidos:

ARNip A':

cadena sentido: 5'AGUCCAAGUGUGGCUCAAA3' - SEQ ID No.:2,

cadena antisentido: 5'UUUGAGCCACACUUGGACU3' - SEQ ID No.: 3;

ARNip B':

cadena sentido: 5'GGCUCAAAGGAUAAUAUCA3' - SEQ ID No.: 4,

cadena antisentido: 5'UGAUAUUAUCCUUUGAGCC3' - SEQ ID No.: 5;

ARNip C':

cadena sentido: 5'GCAACGUCCAGUCCAAGUG3' - SEQ ID No.: 6,

cadena antisentido: 5'CACUUGGACUGGACGUUGC3' - SEQ ID No.: 7.

De los 3 ARNip probados (A, B y C), el ARNip B muestra la máxima eficacia en la degradación de la transcripción. Estos resultados se han validado usando un minigén que recapitula la mutación de corte y empalme N279 y se exhibe un efecto similar en células NSC3478 (un híbrido de neuronas motoras de la médula espinal de ratón y la línea celular de neuroblastoma).

Una revisión reciente de Rettig y col.9 ha resumido los posibles abordajes de administración de las moléculas de ARNip y su éxito en los ensayos clínicos. El desarrollo actual en el campo y los estudios en curso establecen la importancia de estos ARNip sintéticos, que pueden servir como agentes terapéuticos potenciales tras una liberación y administración adecuadas.

La administración directa en el SNC (sistema nervioso central) se utiliza como procedimiento de elección en enfermedades neurodegenerativas debido a la entrada restringida a través de la barrera hematoencefálica. Las opciones de liberación incluyen inyección intratecal, intraventricular, inyección epidural e intratisular directa. Los procedimientos de administración incluyen infusiones a largo plazo o mediante el uso de mini bombas.

Se utilizaron bombas intraventriculares crónicas para la liberación de ARNip contra el gen de la proteína precursora amiloide (App) para estudiar las funciones relacionadas con la enfermedad de Alzheimer en ratones adultos. Mediante ARNip potentes se observaron disminuciones eficientes10.

Usando la liberación desnuda y sin ayuda de ARNip en solución salina tamponada, se realizó una infusión crónica en primates no humanos para suprimir los niveles de a sinuceína11. Se sabe que esta proteína está asociada con la enfermedad de Parkinson. Se utilizaron minibombas osmóticas para la infusión directa en la sustancia negra, lo que condujo a una disminución de la a sinuceína tanto a nivel de ARNm como de proteína.

Se usaron ARNip con enlaces PS modificados y restos de 2'F-pirimidina cerca de los extremos de cada cadena12 para infusión crónica en el SNC del modelo de ratón de SOD1 (G93A) de esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Se observó una reducción significativa del ARNm de SOD1 en la médula espinal. En el modelo de ratón transgénico, una infusión durante un período de 28 días permitió aliviar la progresión de la enfermedad. Los ARNip se mantuvieron estables durante el transcurso de este período.

Se utilizaron ARNip13 conjugados con colesterol para la inyección intraestriatal directa para apuntar al gen de Huntington mutante (Htt) en el contexto de la enfermedad de Huntington.

Las estrategias mencionadas anteriormente destacan los diferentes modos de liberación de ARNip y demuestran eficacia in vivo.

Materiales y procedimientos

ARNip

Los siguientes ARNip, empleados en los presentes experimentos, se diseñaron a lo largo del tramo del exón 10 (SEQ ID No.: 1) y fueron producidos por Eurofin Genomics, Ebersberg, Alemania.

ARNip A:

cadena sentido: 5'AGUCCAAGUGUGGCUCAAAdTdT3' - SEQ ID No.:19,

cadena antisentido: 5'UUUGAGCCACACUUGGACUdTdT3' - SEQ ID No.:20;

ARNip B:

cadena sentido: 5'GGCUCAAAGGAUAAUAUCAdTdT3' - SEQ ID No.:21,

cadena antisentido: 5'UGAUAUUAUCCUUUGAGCCdTdT3' - SEQ ID No.:22;

ARNip C:

cadena sentido: 5'GCAACGUCCAGUCCAAGUGdTdT3' - SEQ ID No.:23,

cadena antisentido: 5'CACUUGGACUGGACGUUGCdTdT3' - SEQ ID No.:24;

ARNip de control:

cadena sentido: 5' UAAUGUAUUGGAACGCAUAdTdT3' - SEQ ID No.:8,

cadena antisentido: 5'UAUGCGUUCCAAUACAUUAdTdT3' - SEQ ID No.:9.

Las secuencias de ARNip anteriores difieren de la SEQ ID No.: 2 a 7 en la presencia de un saliente que consiste en dos monofosfato desoxirribosiltimina (dT), que se introdujeron en las SEQ ID No.: 2 a 7 en el extremo 3' para aumentar la estabilidad intracelular del ARNip y su eficacia.

La Figura 5 muestra la secuencia de E10 de tau humana (mayúsculas, correspondiente a la SEQ ID No.: 1) y secuencias flanqueantes 19 e I10 (minúsculas); la secuencia de E10 de tau humana que comprende las secuencias flanqueantes de 19 (11 bases) y 110 (26 bases) se proporciona en la SEC ID No.: 18. Los sitios de corte y empalme en 5' y 3' se indican mediante 5'ss y 3'ss, respectivamente. Solo se indican las mutaciones de FTDP-17 que afectan al corte y empalme del exón 10. Las deleciones se indican mediante triángulos sombreados. Se proporcionan las secuencias y la posición objetivo de los tres ARNip diseñados, A B y C.

Línea celular SHYS5Y

La línea celular SH-SY5Y (patrones ATCC-LGC, Teddington, UK; # CRL-2266) utilizada para experimentos de transfección es una sublínea clonada tres veces (SK-N-SH -> SH-SY -> SH-SY5 -> SH-SY5Y) de la línea celular de neuroblastoma SK-N-SH con un contenido de 15 % del exón 10+ y 85 % del exón 10- en su transcripción. La eficiencia de la transfección (25 % a 30 %) en esta línea celular es comparativamente más alta que en las otras líneas celulares de neuroblastoma. Por lo tanto, esta línea celular se eligió para probar la eficacia de los ARNip contra las transcripciones endógenas del exón 10+ y para las cotransfecciones de los ARNip con plásmidos indicadores del minigén.

Línea celular NSC-34

La línea celular híbrida de tipo motoneurona de ratón NSC-34 (Cellutions biosystems, Burlington, Ontario, Canadá; # CLU140-A) se produjo mediante fusión de células embrionarias de la médula espinal de ratón enriquecida en motoneuronas con neuroblastoma de ratón78. Los cultivos contienen dos poblaciones de células: células indiferenciadas pequeñas que tienen la capacidad de experimentar división celular y células multinucleadas más grandes. Estas células expresan muchas propiedades de las neuronas motoras, incluyendo colina acetiltransferasa, síntesis de acetilcolina, proteínas de almacenamiento y liberación y triplete de neurofilamentos. Estas células se pueden diferenciar utilizando el ácido retinoico todo trans (atRA), estableciéndose así como un modelo adecuado para el estudio in vitro de la fisiopatología en las neuronas motoras.

Mutagénesis del indicador fluorescente con el exón 10

El plásmido indicador fluorescente creado por Peter Stoilov y col.3, PFLARE 5A MAPT Exón 10 también denominado plásmido de tipo silvestre (WT) (SEQ ID No.: 10 - Figura 12), se mutó utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick change II site XL (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; n.° 200521) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los siguientes cebadores se diseñaron de manera que incorporaran el cambio de nucleótido de T a G. Cebador directo:

5'CCAAAGGTGCAGATAATTAAGAAG3' - SEQ ID No.: 11

Cebador inverso:

5'GTTGCTAAGATCCAGCTTCTTCTT3' - SEQ ID No.: 12

El plásmido resultante PFLARE 5A MAPT MUT Exón 10 (SEQ ID No.: 13 - Figura 13) se denominará plásmido mutante N279 (Mut).

Tratamiento de ARNip en afección endógena

1. Transfección de células SHYS5Y y células NSC-34 con ARNip

La transfección de células SHYS5Y y células NSC34 con ARNip se realizó utilizando el reactivo de transfección a base de lípidos Lipofectamine 3000 (Life Technologies-Invitrogen, Monza, Italia; n.° L3000-008).

1.1. Preparación de las células

1.1.1) El día anterior al experimento, se sembraron 5 x 104 células en una placa de 24 pocillos en 500 pl de medio completo sin antibióticos a 37 °C en CO2 al 5 %.

1.2. Transfección de ARNip

1.2.1) Las transfecciones se realizaron según las instrucciones del fabricante con 2 (pl) Lipofectamine 3000 para un intervalo de concentración de ARNip comenzando desde 10 nM a 100 nM, en medio Opti-MEM sin rojo fenol (Life Technologies-Gibco, Monza, Italia; # 11058-021) por pocillo en un volumen final de 500 pl.

1.2.2) Como controles, las células se trataron solo con Lipofectamine 3000 (Simulado) y se transfectaron con ARNip no dirigido (controles no específicos - SEQ ID No.: 8 y 9).

1.2.3) Después de la transfección, las células se incuban a 37 °C en CO2 al 5 % durante 48 horas.

1.2.4) A continuación, los pocillos se lavaron con PBS (1X) y el reactivo Trizol (Life Technologies, Monza, Italia; # 15596-026) se utilizó para la extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante para los análisis posteriores.

2. Co-transfección de plásmido indicador y ARNip en células SHYS5Y

2.1. Preparación de las células

1.1) El día anterior al experimento, se sembraron 5 x 104 células en una placa de 24 pocillos en 500 pl de medio competo (es decir, mezcla 1:1 de EMEM (Lonza # 12-125F) y MEZCLA DE NUTRIENTES F12 (Life Technologies-Gibco # 1765-054) con 10 % de suero bovino fetal (FBS)) sin antibióticos a 37 °C en CO2 al 5 %. El formato de placa de 24 pocillos se ha elegido para permitir la recuperación de un número suficiente de células al final del ensayo después del análisis basado en imágenes, para realizar análisis moleculares posteriores, tales como RT-PCR y transferencia Western.

2.2. Co-transfección basada en lípidos de ADN y ARNip

2.2.1) Las transfecciones se realizan según las instrucciones del fabricante con una relación de ADN (ng):Lipofectamine 3000 (pl) de 1:2 en medio Opti-MEM (GIBCO LIfetechnologies). Los plásmidos (SEQ ID No.: 10 y 13) se utilizan a una concentración de 0,25 pg y 0,5 pg por pocillo en un volumen final de 500 pl.

2.2.2) Dos indicadores plasmídicos diferentes (S^eQ ID No.: 10, 13) se utilizan para la transfección, a saber, el plásmido de tipo silvestre (SV) (SEQ ID No.: 10) y el plásmido de tipo mutante (Mut) (SEQ ID No.: 13).

2.2.3) ARNip (SEQ ID No.: 19 a 24) se utilizan a las concentraciones de 10 nM a 100 nM en un volumen final de 500 pl por pocillo.

3. Adquisición y análisis de imágenes de alto contenido

Preparación de células para adquisición de imágenes

3.1) Las imágenes de las células transfectadas se capturaron con un sistema de imágenes de alto contenido (Operetta, Perkin Elmer). 48 horas después de la transfección, las células se incuban durante 20 minutos a 37 °C en presencia de 1 mg/ml de colorante fluorescente Hoechst 33342. Esto permite la contratinción de los núcleos, lo que permitirá los análisis posteriores.

Adquisición de imágenes

3.2) Las imágenes se tomaron con un objetivo LWD 20X (Perkin Elmer # HH12940107), en combinación con diferentes conjuntos de filtros: en particular un filtro para tinción Hoechst 3342 (filtro de excitación: 360-400 nm (Perkin Elmer n.° HH12000301); filtro de emisiones: 410-480 nm (Perkin Elmer # HH12000401)) se utiliza para obtener imágenes de los núcleos teñidos a un tiempo de exposición de 20 ms, mientras que se utiliza una combinación de filtros para medir las intensidades de los indicadores: GFP (filtro de excitación: 460-490 nm (Perkin Elmer HH1200030); filtro de emisión: 500-550 nm (Perkin Elmer # HH12000405)) y RFP (filtro de excitación: 520-550 nm (Perkin Elmer n.° HH12000305); filtro de emisiones: 560-630 nm (Perkin Elmer # HH12000410)), ambos a un tiempo de exposición de 200 ms.

Análisis de imagen

3.3) Para el protocolo de extracción de rasgos, las células se segmentaron y se analizaron utilizando el siguiente flujo de trabajo:

3.3.1) La primera etapa es la identificación de Núcleos, los principales objetos de interés que se segmentan mediante el uso del algoritmo más adecuado (phenoLOGIC™, PerkinElmer).

3.3.2) Suponiendo una distribución homogénea de GFP y RFP en las células, la región nuclear se seleccionó para cuantificar la intensidad media de fluorescencia en los dos canales.

3.3.3) La subpoblación de células transfectadas se identificó utilizando una estrategia de doble umbral para filtrar las células que eran positivas para G(GFP) o para R(RFP) o para ambos.

3.3.4) Restringir el análisis solo a las células transfectadas, la relación entre las propiedades de fluorescencia, la intensidad media de G y R se calcula por célula. G/R es un parámetro que indica la prevalencia de expresión de un indicador sobre el otro. Específicamente, una puntuación baja indica la inclusión del exón del casete, mientras que una alta está conectada con un corte y empalme eficiente del exón 10.

3.3.5) Se puede visualizar una descripción general de las propiedades numéricas de las células campo por campo en un diagrama de dispersión. Como alternativa, para obtener una representación más completa de todas las células dentro de un pocillo, se pueden crear gráficos de dispersión o histogramas de propiedades de una sola célula para pocillos representativos de las condiciones de los plásmidos SV y Mut. Estas representaciones gráficas permiten una selección más precisa de un umbral superior J y un umbral inferior K, distinguir para las células que expresan preferentemente GFP (G/R> J), RFP (G/R <K) o que expresan ambos indicadores por igual (K <G/R <J) (Fig. 1). Se usó el software de imagen de alto contenido HarmonyR (PerkinElmer).

3.4.6) A continuación, los umbrales se aplicaron en un módulo basado en filtros para clasificar las células en tres subpoblaciones diferentes. En síntesis, en función de las intensidades emitidas por las señales de fluorescencia, se midieron 3 lecturas como resultado de establecer valores de umbral específicos: células que expresan principalmente GFP (G/R> J), células que expresan principalmente RFP (G/R <K), células que expresan por igual ambos indicadores (K <G/R <J).

3.4.7) Las salidas de rasgos incluyen el recuento total de células, el recuento de células transfectadas y el % calculado sobre el número total de células, la mediana el valor de G/R de todas las células del pocillo, el % de células que expresan preferentemente GFP (G/R> J), RFP (G/R <K) y que expresan ambos indicadores por igual (K <G/R <J).

3.4.8) El porcentaje de viabilidad celular se calculó de la siguiente manera: (número total de células en el pocillo transfectado/número total de células en Simulado) * 100

4. Extracciones de ARN y RT-PCR

4.1) Los pocillos se lavaron con 1X PBS y se extrajo el ARN de cada pocillo usando el reactivo Trizol siguiendo las instrucciones del fabricante.

4.2) El ARN extraído se trató con ADNasa utilizando el kit Turbo DNAse (Life Technologies-Ambion # AM1907) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4.3) Se realizó transcripción inversa de 500 ng del ARN extraído a ADNc con el kit de síntesis de ADNc Revert Aid First Strand (Thermoscientific # K1622) utilizando oligonucleótidos oligo dT18 (un oligonucleótido sintético de una sola cadena de 18 unidades con extremos 5'- y 3'-hidroxilo, disponible en el kit), siguiendo el protocolo del fabricante.

4.4) El ADNc obtenido sirve como molde para reacciones de RT-PCR semicuantitativas para evaluar la expresión del exón 10 en estas transcripciones.

CICLO DE PCR:

10 min 95 °C

0:30 segundos °C

0:40 segundos °C

1 min 72 °C

10 min 72 °C

4 °C

4.4) Los niveles de expresión de las transcripciones que contienen el exón 10 se analizan con los siguientes cebadores:

Afección endógena:

TAUR9F: 5'CTGAAGCACCACCAGCCGGGAGG3' - SEQ ID No.: 14,

TAU13R: 5'TGGTCTGTCTTGGCTTTGGC3' - SEQ ID No.: 15.

Indicadores plasmídicos:

Exón 1 Bgl para: 5'AAACAGATCTACCATTGGTGCACCTGACTCC3' - SEQ ID No.: 16,

EGFP Inv: 5'CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG3' - SEQ ID No.: 17.

4.5) Los productos amplificados se dejan correr con una escalera de ADN de 100 pb (Fermentas) en una electroforesis en gel de agarosa al 2% (bromuro de etidio al 5%) a 100 voltios en tampón de carrera TBE 1X durante 40 minutos.

4.6) Los análisis densitométricos se realizan con el software Image J (un sistema de arquitectura abierta que utiliza el complemento Java) después de la adquisición de imágenes con el sistema de imágenes BioDoc-It (UPV, Upland, CA, EE. UU.).

Resultados

Se analizó la eficacia de los ARNip en los minigenes indicadores transfectados. El trabajo anterior de Stoilov P y col.3 ha demostrado que el corte y empalme de un plásmido indicador fluorescente de dos colores (verde/rojo) con el exón 10 de MAPT se puede modular utilizando compuestos bioactivos. El plásmido indicador(SEQ ID No.: 10) se produjo de manera tal que la inclusión del exón 10 favorezca la producción de RFP (proteína roja fluorescente) y la exclusión del exón 10 produzca GFP (proteína verde fluorescente) (Fig. 1). Se usó el plásmido indicador creado por Stoilov y col. y denominado indicador de tipo silvestre (ya que recapitulaba la afección endógena del contenido del exón 10 en la mayoría de las líneas celulares de neuroblastoma) (Fig. 1). El plásmido se mutó aún más para incorporar la mutación N279 para alterar el corte y empalme (AAT a AAG), recapitulando la afección patológica FTDP-17 (SEQ ID No.: 13). Este cambio de base crea un tramo rico en purinas (AAGAAGAAG) y se asemeja a un consenso de potenciador del corte y empalme del exón; esto altera el corte y empalme que conduce a la inclusión del exón 10 y la posterior producción de RFP (Fig. 1).

Con el fin de analizar los efectos de los ARNip sobre los minigenes indicadores, los presentes inventores desarrolló un análisis basado en imágenes para cuantificar los indicadores fluorescentes, obteniendo lecturas basadas en una sola célula utilizando un sistema de cribado de alto contenido. En resumen, la línea celular SH-SY5Y se transfectó con plásmido de tipo silvestre o plásmido mutante. Los dos plásmidos aseguran diferentes porcentajes de inclusión del exón 10 en la transcripción sometida a corte y empalme, lo que es evidente por la diferencia en el número de células rojas o verdes, y en su intensidad (Fig. 2). La intensidad de la fluorescencia verde y roja en las células transfectadas se midió con un instrumento Operetta High Content Screening y las células se agruparon en tres categorías: células rojas en las que la mayoría de las transcripciones lleva el exón 10, células verdes en las que la mayoría de las transcripciones carece del exón 10 y células amarillas en las que la proporción de las dos isoformas de corte y empalme es de alrededor de 1:1 (Fig. 3). Mediante este análisis, la mutación puntual en el minigén indicador (SEQ ID No.: 13) se evaluó para cambiar el corte y empalme del exón 10, alterando de este modo las señales fluorescentes desde un nivel relativamente bajo de RFP (2 %) a un nivel muy alto (65 %) debido a la inclusión del exón 10 (Fig. 3 y Fig. 4). La eficacia de la transfección fue de aproximadamente el 20 % y la viabilidad celular de aproximadamente el 60 % (Fig. 4).

Se han diseñado tres ARNip diferentes dirigidos al exón 10 (SEQ ID Nos 19 a 24) que abarcan la secuencia del exón 10, sobre la base de las siguientes reglas: se evitaron los tramos de 4 o más bases (tales como AAAA o CCCC), las regiones con un contenido de GC <30 % o > 60 %, las repeticiones y las secuencias de baja complejidad, los sitios de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP); se realizó una búsqueda de homología BLAST para evitar efectos fuera del objetivo en otros genes o secuencias (Fig. 5).

La eficacia de los tres ARNip diseñados se analizó a concentraciones crecientes tras su cotransfección con 0,5 |jg (Fig. 6) o 0,25 jg el minigén indicador mutante (Fig. 7). En ambos diseños experimentales, el ARNip A (SEQ ID No.: 19 y 20), el ARNip B (SEQ ID No.: 21 y 22) y el ARNip C (SEQ ID No.: 23 y 24) fueron eficaces en la reducción de las transcripciones que contenían el exón 10. El ARNip B (SEQ ID No.: 21 y 22) parecía ser el ARNip más eficiente, disminuyendo las células rojas del 60 % al 15 % y aumentando las células amarillas del 40 % al 80 % (Fig. 7). El análisis de RT-PCR semicuantitativa confirmó la reducción del exón 10 tras el tratamiento con ARNip A (SEQ ID No.: 19 y 20, Fig. 8), ARNip B (SEC ID No .: 20 y 22, Fig. 9) y ARNip C (SEC ID No .: 23 y 24, Fig.10) alcanzando una reducción del 10 %, 25 % y 20 %, respectivamente, tras el tratamiento con una concentración de 50 nM.

El efecto del ARNip A (SEQ ID No.: 19 y 20), el ARNip B (SEQ ID No.: 20 y 22) y el ARNip C (SEQ ID No.: 23 y 24) sobre la transcripción de MAPT endógena tras su transfección en la línea celular NSC34 (Fig. 11). En las células NSC34, el 83 % de la transcripción de MAPT endógeno contiene el exón 10 y el 17 % restante carece del exón 10, lo que sirve como un modelo adecuado para el estudio de los efectos del ARNip sobre las transcripciones que contienen el exón 10 en afecciones endógenas (Fig. 11). El análisis de RT-PCR muestra una reducción de las transcripciones endógenas del Exón 10+ tras el tratamiento con ARNip A (SEC ID No.: 19 y 20) (6 %), B (SEQ ID No.: 20 y 22) (28 %) y C (SEQ ID No.: 23 y 24) (12 %) a una concentración de 50 nM. En este sistema modelo, por lo tanto, el ARNip B parece ser el ARNip más eficaz en la degradación selectiva de las transcripciones que contienen el exón 10.

REFERENCIAS

1. Miller y col. Targeting Alzheimer's disease genes with RNA interference: an efficient strategy for silencing mutant alleles. Nucl Acids Res (2004) 32(2): 661-668

2. Xu y col. Tau Silencing by siRNA in the P301S Mouse model of Tauopathy. Curr Gene Ther (2014); 14 (5):343-351.

3. Stoilov y col. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proc Natl Acad Sci U S A (2008) 105(32): 11218-23.

4. Kalbfuss y col. Correction of alternative splicing of tau in frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17. J Biol Chem (2001) 276: 42986-42993.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Agente terapéutico para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT, en el que dicho agente terapéutico comprende uno o más ARNip dirigidos al exón 10 del gen MAPT, en el que los uno o más ARNip se seleccionan de entre un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases establecida en las SEQ ID No.: 2, 4 o 6, y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.

2. Agente terapéutico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los uno o más ARNip inducen la degradación selectiva de las transcripciones de MAPT que contienen el exón 10.

3. Agente terapéutico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que las enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de la proteína tau codificada por el gen MAPT se seleccionan de entre enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, distrofia miotónica de tipo 1, enfermedad de Parkinson y demencia frontotemporal con parkinsonismo ligada al cromosoma 17 (FTDP-17).

4. Una composición farmacéutica que comprende uno o más ARNip, en la que los uno o más ARNip comprenden una cadena sentido que comprende al menos 19 bases continuas de ARNm correspondientes a la secuencia del exón 10 de MAPT establecida en la SEQ ID No.: 1 y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que los uno o más ARNip se seleccionan de entre un ARN bicatenario compuesto por una cadena sentido que comprende una secuencia de bases establecida en las SEQ ID No.: 2, 4 o 6, y una cadena antisentido que comprende una secuencia complementaria a la misma, que opcionalmente tiene un saliente en el terminal de la cadena sentido y/o cadena antisentido.