CN111239392B - 一种新型冠状病毒肺炎(covid-19)血清学诊断试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒肺炎(covid-19)血清学诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）血清学诊断试剂盒，包括S‑IgM/IgG和N‑IgM/IgG两种试纸条，组装成一个双抗原四联检试剂盒，可以针对新型冠状病毒肺炎COVID‑19病人血清抗新型冠状病毒棘突蛋白S的IgM/IgG抗体及抗新型冠状病毒核衣壳蛋白N的IgM/IgG抗体四个指标同时检测。本发明的试剂盒通过量子点荧光标记和多级偶联放大信号提高检测灵敏度、通过双抗原四联检提高检测准确性、通过建立病毒灭活***保障检测过程中的生物安全性。试剂盒适合包括全血、血浆、血清检测，可应用于新型冠状病毒肺炎(COVID‑19)血清学诊断。

Description

一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒。
背景技术
冠状病毒在***分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。在新疫情突发时，如2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，新病毒的早期检测一般采用核酸检测的方法，因为病毒的基因组可以很快被破译，随即可合成特异性核酸荧光探针制备荧光定量PCR检测试剂盒投入使用。该方法具有技术成熟、研发周期短、特异性好等优点；但同时也存在样本需前处理、检测时间长、需专业仪器专业人员操作、以及试剂贵等缺点，而且也存在一定的假阴性。血清中抗病毒-IgM抗体是病毒复制和早期感染的标志，随后会有IgG抗体升高。因而血清学IgM/IgG抗体通常作为病毒感染的检测指标，且可判断近期感染和继往感染。如HIV1/2、HBV、HCV、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒等的血清学IgM/IgG检测。同样，2019-nCoV感染的患者也可通过检测患者血清中2019-nCoV相关蛋白，如Nucleocapsid phosphoprotein(N-protein)和S-protein的IgM/IgG抗体来判断。这个指标的检测最常用的方法是胶体金免疫层析法试纸，但由于个体的差异，患者产生的抗体水平会差异非常大，有些含量会很底，用传统的胶体金试纸检测不到。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，我们采用量子点荧光标记、多级偶联放大检测信号、双抗原四联检等设计，发明了一种新型冠状病毒COVID-19血清学诊断试剂盒。同时考虑到新型冠状病毒高传染性和危害性，我们首创检测试剂盒的病毒灭活设计，保障检测过程中的生物安全性。为实现本发明，我们对抗原重组蛋白进行了定点生物素化设计，使其通过生物素-亲和素连接于量子点标记的链霉亲和素，从而实现检测信号的级偶联放大，提高检测的灵敏度；通过同时检测血清中抗新型冠状病毒S蛋白的IgM和IgG抗体，以及抗N蛋白的IgM和IgG抗体四项指标来确保检测的准确性；试剂盒设计了病毒灭活***，样本取样后即放入装有病毒灭活剂的管子里，在样本稀释液中加入了RNA酶，可有效降解破坏新型冠状病毒的核酸遗传物质，在试纸条的样本垫中加有病毒光化学灭活剂和RNA酶，在不影响检测的前提下，通过多环节、多手段来灭活病毒，确保检测过程中的生物安全性。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于包括S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条，所述S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条并排组装于一个双卡条中，构成一个双抗原四联检试剂卡；
所述S-IgM/IgG试纸条和N-IgM/IgG试纸条均包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸；所述样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，样品垫叠压在释放垫上；所述检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区M和G线、靠近吸水纸的一条控制线区C线；
将质控抗原偶联于羧基量子点微球，获得QM-质控抗原；
将量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在一个免疫层析试纸条的释放垫上，并在该免疫层析试纸条的M、G、C线区上分别包被第一检测抗体、第二检测抗体和质控抗体，获得所述的S-IgM/IgG试纸条；
将量子点标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在另一个免疫层析试纸条的释放垫上，并在该免疫层析试纸条的M、G、C线区上分别包被第一检测抗体、第二检测抗体和质控抗体，获得所述的N-IgM/IgG试纸条。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于所述质控抗原为兔IgG，QM-质控抗原为QM-兔IgG；所述第一检测抗体为小鼠抗人IgM的单克隆抗体hIgM-mAb，第二检测抗体为小鼠抗人IgG的单克隆抗体hIgG-mAb，质控抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体GAR。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于将量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白命名为QM-SB-S，其制备方法包括以下步骤：
S1：将新型冠状病毒棘突蛋白标记为S-蛋白，在S-蛋白膜外部分的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，该人工设计序列经宿主密码子优化后，亚克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达该人工设计序列蛋白的质粒，标记为S-融合蛋白质粒；
S2：将步骤S1构建的S-融合蛋白质粒转染到真核永生化细胞，并建立S-融合蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到含S-融合蛋白的培养上清液，用纯化蛋白亲和柱从该培养上清液中获得S-融合蛋白，随后用特异性蛋白酶切去S-融合蛋白的纯化标签获得S-蛋白；
S3：将步骤S2获得的S-蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白S-Biotin；将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将蛋白S-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的S-蛋白，标记为QM-SB-S。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤S1中，所述S-蛋白膜外部分即为NCBI Reference Sequence:YP_009724390.1的1-1213aa部分；S-蛋白膜外部分的C端顺序接上的蛋白定点生物素化序列的生物素蛋白连接酶识别位点为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW、特异性蛋白酶的切位点标签为Flag标签DYKDDDDK、纯化标签为小鼠IgG Fc段；密码子优化的宿主为人；所述含有EF1启动表达荧光蛋白的载体为慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，该EF1启动表达的荧光蛋白为绿色荧光蛋白copGFP，构建的S-融合蛋白质粒是pCDH-nCoVSmFc.copGFP；
其中，在S-蛋白膜外部分的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签的人工设计序列经宿主细胞密码子优化后的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；构建好的pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒所表达的S-融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤S2中，所述真核永生化细胞为HEK293，建立S-融合蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVSmFc.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立nCoVSmFc.copGFP/293稳转细胞系；所述S-融合蛋白为nCoVS-Flag-mFc；所述纯化蛋白亲和柱为ProteinA/G柱，特异性蛋白酶为EK酶；所述切去纯化标签后的S-蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤S3中，S-蛋白用BirA生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白S-Biotin，其连接识别位点为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW序列上的赖氨酸K，位于S-蛋白的氨基酸序列SEQID NO:3近C-末端；所述羧基量子点微球为表面具有羧基功能团的量子点荧光微球，用EDC/NHS交联剂活化，将链霉亲和素SA通过肽键偶联于量子点荧光微球，获得所述的QM-SA；
生物素化的蛋白S-Biotin通过链霉亲和素-生物素反应连接，获得量子点荧光标记的QM-SB-S。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于将量子点标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白命名为QM-SB-N，其制备方法包括以下步骤：
M1：将新型冠状病毒核衣壳蛋白标记为N-蛋白，在N-蛋白的C端接上蛋白定点生物素化序列、N端接上特异性蛋白酶切位点标签，并亚克隆到原核表达载体的纯化标签下游，获得表达N-纯化标签融合蛋白的质粒，标记为N-融合蛋白质粒；
M2：将步骤M1获得表达的N-融合蛋白质粒转化感受态E.Coli，扩增培养诱导表达N-融合蛋白，并进行化学法裂解表达N-融合蛋白的工程菌，裂解液过纯化蛋白亲和柱制备获得N-融合蛋白，随后用特异性蛋白酶切去N-融合蛋白的纯化标签，获得N-蛋白；
M3：将步骤M2获得的N-蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白N-Biotin；将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将蛋白N-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的N-蛋白，标记为QM-SB-N。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤M1中，新型冠状病毒核衣壳蛋白为NCBI Reference Sequence:YP_009724397.2的全长蛋白；所述N-蛋白的C端接上蛋白定点生物素化序列为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW、N端接上特异性蛋白酶切位点标签为Flag标签DYKDDDDK；所述原核表达载体为pGEX-4T-1，纯化标签为GST；所述N-融合蛋白为GST-nCoVNbio，构建的N-融合蛋白质粒为pGEX-nCovNBio，其中编码GST-nCoVNbio融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，构建好的N-融合蛋白质粒所表达的N-融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤M2中，所述感受态E.Coli为BL21(DE3)菌系；所述纯化蛋白亲和柱为GST亲和层析柱；所述特异性蛋白酶为EK酶；切去纯化标签后的N-蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
步骤M3中，N-蛋白用BirA生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白S-Biotin，其连接识别位点为位于N-蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6C-末端的GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW序列上的赖氨酸K；所述羧基量子点微球为表面具有羧基功能团的量子点荧光微球，用EDC/NHS交联剂活化，将链霉亲和素SA通过肽键偶联于量子点荧光微球，获得所述的QM-SA；生物素化的蛋白N-Biotin通过链霉亲和素-生物素反应连接，获得量子点荧光标记的QM-SB-N。
所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于所述S-IgM/IgG试纸条和N-IgM/IgG试纸条的免疫层析试纸条均进行生物安全性改良，即在样本垫预处理液中添加RNA酶以及光化学法灭活剂，以抑制或灭活检测样本中的病毒；试剂盒中配有装病毒灭活剂的EP管，取样后先放入装有病毒灭活剂的EP管中对样本中的病毒进行灭活处理，然后加入含有RNA酶的样本缓冲液稀释后点样检测；
其中，所述光化学法灭活剂为核黄素、补骨脂素、亚甲蓝中的至少一种；所述的病毒灭活剂为酒精、双氧水、***、甲醛、戊二醛、次氯酸钠、氯仿、辛酸、过氧乙酸中的至少一种。
相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：本发明的试剂盒通过量子点荧光标记和多级偶联放大信号提高检测灵敏度、通过双抗原四联检提高检测准确性、通过建立病毒灭活***保障检测过程中的生物安全性。试剂盒适合包括全血、血浆、血清检测，可应用于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断。
附图说明
图1为pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒图谱；
图2为S-IgM/IgG或N-IgM/IgG试纸条，对血液样本进行快速检测的原理示意图；
图3为双抗原四联检试剂盒的结构示意图；
图4为SEQ ID NO:1的具体序列结果；
图5为SEQ ID NO:2的具体序列结果；
图6为SEQ ID NO:3的具体序列结果；
图7为SEQ ID NO:4的具体序列结果；
图8为SEQ ID NO:5的具体序列结果；
图9为SEQ ID NO:6的具体序列结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
以下实施例中，慢病毒包装细胞293V购自于北京英茂盛业生物科技有限公司。
实施例1pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒构建
将新型冠状病毒棘突蛋白膜外部分的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，其中新型冠状病毒棘突蛋白膜外部分即为NCBI Reference Sequence:YP_009724390.1的1-1213aa部分；所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW，特异性蛋白酶为EK酶，其切位点标签为Flag标签DYKDDDDK，所述纯化标签为小鼠IgG Fc段(mFc)。
最终得到基因设计nCoVS-Flag-mFc融合蛋白的核酸序列，经宿主(人)密码子优化后序列如SEQ ID NO：1所示，两端分别设计EcoR I和Not I限制性内切酶，表达后氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；基因合成序列后，通过连接酶切位点EcoR I和Not I，克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，构建真核表达质粒pCDH-nCoVSmFc.copGFP(如图1所示)。
其中SEQ ID NO：1的具体序列如图4所示，SEQ ID NO：1为编码nCoVS-Flag-mFc融合蛋白的DNA基因人工序列。位于两端的限制性内切酶EcoRI(GAATTC)/XhoI(CTCGAG)用于基因亚克隆；7-1995bp为编码新型冠状病毒棘突蛋白S1部分的基因序列；1996-2067bp为编码BirA酶定点生物化作用识别位点的基因序列(图4中第1个下划线部分)；2074-2097bp为Flag标签的基因序列(图4中第2个下划线部分)；2098-2751bp为纯化标签mFc的基因序列。
SEQ ID NO:2的具体序列如图5所示，构建好的pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒所表达的S-融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。1-663aa为新型冠状病毒棘突蛋白S1部分的氨基酸序列；664-687aa为BirA酶定点生物化作用识别位点的氨基酸序列(图5中第1个下划线部分)；690-697bp为Flag标签的氨基酸序列(图5中第2个下划线部分)；698-914bp为纯化标签mFc的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3的具体序列如图6所示，SEQ ID NO:3为S1-蛋白人工序列(去掉了mFc标签)的氨基酸序列：664-687aa为BirA酶定点生物化作用识别位点的氨基酸序列(图6中下划线部分)。
SEQ ID NO:4的具体序列如图7所示，SEQ ID NO:4为编码GST-nCoVNbio融合蛋白的DNA基因人工序列。1-672bp为pGEX-4T-1载体自带的编码GST标签的基因序列；BamH I(GGATCC)(图7中第1个下划线部分)和未端的Xho I(CTCGAG)用于基因亚克隆；697-1959bp为Flag标签的基因序列；703-1959bp为新型冠状病毒核衣壳蛋白N的基因序列；1960-2031bp为编码BirA酶定点生物化作用识别位点的基因序列(图7中第2个下划线部分)。
SEQ ID NO:5的具体序列如图8所示，构建好的N-融合蛋白质粒所表达的N-融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。1-224bp为pGEX-4T-1载体自带的GST标签的氨基酸序列；227-234bp为Flag标签的氨基酸序列；235-653bp为新型冠状病毒核衣壳蛋白N的基因序列；654-677bp为编码BirA酶定点生物化作用识别位点的氨基酸序列(图8中第2个下划线部分)。
SEQ ID NO:6的具体序列如图9所示，SEQ ID NO:6为N-蛋白人工序列(去掉了GST标签)的氨基酸序列：420-443aa为BirA酶定点生物化作用识别位点的氨基酸序列(图9中下划线部分)。
实施例2建立nCoVSmFc.copGFP/293稳转细胞系
将pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVSmFc.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立nCoVSmFc.copGFP/293稳转细胞系。具体步骤如下：
1)实验前一天对5个15cm dish进行细胞铺板，保证在转染之前，细胞均达70％-80％汇合度。
2)转染前1～2h，更换dish内培养基为无血清无双抗的DMEM培养基。
3)准备一支15mL离心管，加入5mL 1×HBS，再依次加入100μg的pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒、100μg PH1/PH2混合质粒(PH1:PH2＝3:1，质量比)，轻轻混匀。
4)加入4mL PEI工作液(10μM)，轻轻混匀，置37℃孵育20min。
5)将转染复合液等分5份，均匀加入5个待转染的15cm dish内，轻轻晃动使复合物分布均匀。
6)转染5.5h后，再准备一支15mL离心管，加入5mL 1×HBS，再依次加入100μg的pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒、100μg PH1/PH2混合质粒(PH1:PH2＝3:1，质量比)，轻轻混匀。
7)加入4mL PEI工作液(10μM)，轻轻混匀，置37℃孵育20min。
8)更换dish内培养基为新鲜无血清无双抗的DMEM培养基。
9)将转染复合液等分5份，均匀加入5个待转染的15cm dish内，轻轻晃动使复合物分布均匀。
10)转染6h后换液，更换为DMEM完全培养基(+10％FBS+1％双抗)。
11)转染48h收集上清，于8000g离心15min后，冻于-80℃冰箱。
12)转染72h收集上清，于8000g离心15min后，合并转染48h所收集上清，过0.45μm滤膜，再以85000g离心2h。
13)弃上清，沉淀以1mL完全培养基(+10％FBS+1％双抗)重悬，感染HEK293细胞(6孔板1个孔，细胞60％-70％汇合度)。
14)感染的HEK293细胞培养2天后传代分至2个6孔板共12个孔；待分散的单个细胞形成克隆细胞团(约1周)，在荧光显微镜下挑取高表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞团进行扩增培养建立nCoVSmFc.copGFP/293稳转细胞系。
实施例3S-Biotin蛋白制备
用无蛋白293细胞培养基扩增培养nCoVSmFc.copGFP/293稳转细胞，收集上清培养液，并用protein A/G纯化nCoVSmFc融合蛋白，用EK酶将nCoVS从柱上切下，通过生物素蛋白连接酶将生物素偶联于nCoVS的(GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW)位点，获得S-Biotin蛋白。具体步骤如下：
1)将nCoVSmFc.copGFP/293稳转细胞扩增至五层细胞工厂，用不含蛋白和多肽的HektorHEK293细胞培养基培养；
2)收集培养液，1200g、4℃离心20min后，取上清液，用饱和硫酸铵法沉淀蛋白；
3)沉淀蛋白用1/10～1/100原液体积的PBS(pH7.4)复溶后，用30KD蛋白截留分子量的超滤管脱盐、浓缩、并置换为结合/洗涤缓冲液(0.5M NaCl，20mM Na2HPO4，pH8.0)；
4)脱盐后的蛋白液上Protein A/G柱，吸附目标蛋白，洗涤后加入EK酶缓冲液(250mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4，2.5mM CaCl2)，按产品说明书用EK酶将S蛋白从柱上切下；
5)切下的S蛋白用10KD蛋白截留分子量的超滤管浓缩，并置换为生物素蛋白连接酶(BirA酶)连接缓冲液(10mM ATP,10mM MgOAc,50μM D-Biotin)，按产品说明书用BirA酶使S蛋白定点生物素化，即将生物素连在GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW序列中赖氨酸(K)上，获得生物素化蛋白S-Biotin。
实施例4N-Biotin蛋白制备
根据NCBI Reference Sequence:NC_045512.2的信息，设计新型冠状病毒核衣壳蛋白全长蛋白(N-蛋白)与标签的融合蛋白基因序列，即在N-蛋白的C端接上蛋白定点生物素化序列为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW、N端接上Flag标签DYKDDDDK；在N未端和C未端分别添加限制性核酸内切酶BamH I和Xho I；该人工设计序列经E.Coli宿主密码子优化，基因合成后亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，克隆酶切位点BamH I/Xho I，获得质粒命名为pGST-nCoVN。进一步地：
1)按常规质粒转化方法将pGST-nCoVN质粒转化感受态BL21(DE3)，获得GST-nCoVN/BL21工程菌；
2)取50μl的GST-nCoVN/BL21工程菌，加至50ml含100mg/ml of氨苄青霉素的2×YT培养基中，37℃，200rpm，扩增培养过液；
3)第2天取5ml扩增培养的GST-nCoVN/BL21工程菌，加至500ml含100mg/ml of氨苄青霉素的2×YT培养基中，37℃，200rpm，扩增培养至A600在0.6～0.8之间；
4)加0.5mM的IPTG，37℃，200rpm，诱导培养3-5小时；
5)6000g,4℃离心10分钟，收集沉淀菌体；
6)室温下，按1g沉淀菌体，加5ml的BugBustter Buffer+5μl 
Figure BDA0002393093110000141
Nuclease 25U/μl+15μl 100mM PMSF比例混合。
7)200rpm室温振荡孵育10-20分钟。
8)16,000rpm离心20分钟，弃沉淀，取上清液。
9)配制结合缓冲液:1×PBS(140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH 7.3)，和EK酶缓冲液(250mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4，2.5mM CaCl2)；
10)取一支GST亲和层析柱，用结合缓冲液滤过平衡；
11)将步骤8)得到的上清液过柱。
12)用5–10柱体积的结合缓冲液洗柱；
13)加EK酶缓冲液，按产品说明书用EK酶将N-蛋白部分从柱上切下；
14)切下的N-蛋白用10KD蛋白截留分子量的超滤管浓缩，并置换为生物素蛋白连接酶(BirA酶)连接缓冲液(10mM ATP,10mM MgOAc,50μM D-Biotin)，按产品说明书用BirA酶使N-蛋白定点生物素化，即将生物素连在GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW序列中赖氨酸(K)上，获得生物素化蛋白N-Biotin。
实施例5量子点荧光标记蛋白QM-SB-S和QM-兔IgG的制备
将链霉亲和素(SA)偶联于羧基量子点微球，S-Biotin即可通过SA-Biotin***牢固地标记上量子点荧光。该方法不仅避免了S直接通过-NH4和-COOH缩合反应标记造成的S蛋白功能失活的问题，而且检测信号形成多级放大。具体步骤如下：
1)按产品说明书的方法将链霉亲和素(SA)偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；
2)同样将兔IgG也偶联于羧基量子点微球，获得QM-兔IgG，用于试纸条质控***；
3)在pH7.4的PBS缓冲液中将QM-SA和S-Biotin以1:4的摩尔比混合(QM-SA以标记的SA计)，37℃、150rpm振荡孵育1小时，获得QM-SB-S；
4)8000g、4℃离心30分钟，去上清，沉淀用PB缓冲液(pH7.0、1％BSA、8％蔗糖、0.05％NaN3)重悬。
实施例6量子点荧光标记蛋白QM-SB-N的制备
参照实施例5，按照同样的方法制备量子点荧光标记蛋白QM-SB-N，不同之处在于“将S-Biotin蛋白替换为N-Biotin蛋白”。
实施例7一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒的制备
在参考传统的免疫层析试纸制备工艺的基础上进行量子点荧光免疫层析试纸的制备，并创新地建立病毒灭活生物安全***。
1)样品垫预处理液中添加光化学法灭活剂补骨脂素和RNA酶。在后期用紫外手电筒观察或仪器分析时，补骨脂素/UV(紫外线)形成病毒光化学法灭活***；冠状病毒属于RNA病毒，因而RNA酶通过降解其核酸抑制或灭活病毒。样本垫预处理液为含0.5％吐温-20的Tris缓冲液，pH7.4，在样品垫预处理液中的补骨脂素的浓度为1μg/ml和RNA酶为0.2U/ml。
2)将上述实施例5制备的QM-SB-S和QM-兔IgG混合喷涂在释放垫上，37℃烘干12h备用；
3)用包被稀释液(150mM PB，pH 7.4)分别将小鼠抗人IgM的单克隆抗体(hIgM-mAb)、小鼠抗人IgG的单克隆抗体(hIgG-mAb)和质控抗体羊抗兔IgG多克隆抗体(GAR)稀释成0.2mg/mL，以膜液量30μL/30cm分别均匀喷涂划线于硝酸纤维素膜二条检测线区(标记为T1和T2线区)和一条控制线区(标记为C线区)上，37℃烘干处理12h，封袋备用；
4)将样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区(T1线区靠近释放垫，T2线区在中间，C线区靠近吸水纸)，样品垫叠压在释放垫上，组装后形成试纸板，切割成宽度3.78mm条状，制成可以检测血清抗新型冠状病毒S蛋白IgM/IgG抗体的S-IgM/IgG试纸条；其中，S-IgM/IgG或N-IgM/IgG试纸条对血液样本进行快速检测的原理示意图如图2所示，S-IgM/IgG试纸条的释放垫上喷涂QM-SB-S和QM-兔IgG混合物，N-IgM/IgG试纸条的释放垫上喷涂QM-SB-N和QM-兔IgG混合物。
5)用同样的方法制成可以检测血清抗新型冠状病毒N蛋白IgM/IgG抗体的N-IgM/IgG试纸条；将两种试纸条并排组装于一个双卡条中，构成一个双抗原四联检试剂卡(如图3所示)，试剂盒组成还包括1个装有20μL乙醇的1,5ml EP管、1个装有1ml稀释液(pH7.4的PBS，含0.2U/ml的RNA酶)的滴瓶、1个指尖采血针、1块酒精消毒棉、和1个废料处理的自封袋。其中在图3中，C线表示质控线，当对检测样本进行检测时，C线出现为有效板，否则为无效板；M线出现为IgM阳性，G线出现为IgG阳性。
实施例6一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒的应用
基于本发明技术方案研发的一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒可应用于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学快速检测和诊断，检测样本包括全血、血浆、血清。
我们取10个健康人的血清和10个临床确诊COVID-19病人的血清，用本发明技术方案研发的试剂盒进行检测，结果10个确诊病人的血清均为阳性；10个健康人的血清均为阴性，结果准确。
对比例1：胶体金法检测
根据目前的市场针对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学IgM/IgG检测基本是胶体金免疫层析法，且只测抗N-蛋白的抗体。为了做对比实验，我们用相同的抗原原料，参照(胶体金法)生产工艺规程模板(即乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂(胶体金法)生产工艺规程)制备了新型冠状病毒肺炎血清学N-IgM/IgG检测胶体金试纸。对实施例6中的10个健康人的血清和10个确诊COVID-19病人的血清进行对比检测，结果10个确诊病人的血清8个为阳性，2个为阴性；10个健康人的血清均为阴性。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
序列表
<110> 浙江诺迦生物科技有限公司
杭州迈尔德生物科技有限公司
<120> 一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2757
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcatgt tcgtgttcct ggtgctgctg cctctggtgt cctcccagtg tgtgaacctg 60
accaccagaa cccagctgcc tcctgcctac accaatagct tcaccagagg cgtgtactac 120
cccgataagg tgtttaggtc cagcgtgctg cactccaccc aggacctgtt tctgcctttc 180
tttagcaatg tgacctggtt ccacgccatc cacgtgagcg gcaccaacgg caccaagagg 240
tttgacaacc ctgtgctgcc cttcaatgat ggcgtgtact ttgcctccac cgagaagtcc 300
aacatcatca ggggctggat ctttggcacc accctggact ccaagaccca gagcctgctg 360
atcgtgaata acgccaccaa tgtggtcatt aaggtgtgcg agtttcagtt ctgcaatgac 420
cctttcctgg gcgtgtacta tcacaagaac aacaagagct ggatggagag cgagtttaga 480
gtgtacagct ccgccaacaa ttgtaccttt gagtacgtgt cccagccctt cctgatggat 540
ctggagggca agcagggcaa ctttaagaat ctgagagagt ttgtgttcaa gaatatcgac 600
ggctacttca agatctacag caagcacacc cccatcaacc tggtgaggga cctgcctcag 660
ggcttttccg ccctggagcc tctggtggac ctgcccatcg gcatcaacat caccagattc 720
cagaccctgc tggccctgca cagaagctac ctgacccccg gcgattcctc cagcggctgg 780
accgctggcg ccgctgctta ctacgtgggc tacctgcagc ccaggacctt tctgctgaag 840
tacaacgaga acggcaccat caccgacgcc gtggattgcg ccctggaccc tctgtccgag 900
acaaagtgca ccctgaagtc cttcaccgtg gagaagggca tctaccagac cagcaatttc 960
agggtgcagc ccaccgagag catcgtgagg tttcctaata tcaccaacct gtgccctttt 1020
ggcgaggtgt tcaatgccac cagattcgcc agcgtgtacg cctggaatag gaagaggatc 1080
tccaactgcg tggccgacta ctccgtgctg tacaactccg cctcctttag caccttcaag 1140
tgttacggcg tgagccctac caagctgaac gatctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 1200
agctttgtga tcaggggcga cgaggtgaga cagatcgccc ctggccagac cggcaagatc 1260
gccgattaca attacaagct gcctgacgat ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaatagc 1320
aacaacctgg atagcaaggt gggcggcaat tacaattacc tgtacaggct gttcagaaag 1380
tccaacctga agcccttcga gagggacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcagcacc 1440
ccttgtaatg gcgtggaggg cttcaattgc tacttccccc tgcagagcta cggcttccag 1500
cctaccaatg gcgtgggcta ccagccctac agagtggtgg tgctgagctt cgagctgctg 1560
cacgcccccg ccaccgtgtg tggacctaag aagagcacca acctggtgaa gaataagtgt 1620
gtgaacttca attttaacgg cctgaccggc accggcgtgc tgaccgaaag caataagaag 1680
tttctgccct ttcagcagtt cggcagagac atcgccgata ccaccgatgc cgtgagggac 1740
cctcagaccc tggagatcct ggacatcacc ccctgttcct ttggcggcgt gagcgtgatc 1800
acccctggca ccaacaccag caaccaggtg gccgtgctgt accaggacgt gaattgtacc 1860
gaggtgcccg tggccatcca cgccgaccag ctgaccccca cctggagggt gtactccacc 1920
ggcagcaatg tgttccagac cagggccggc tgtctgatcg gcgccgagca cgtgaacaac 1980
agctacgagt gtgatggcag cggcggcagc ggcggaagcg ctggaggagg actgaacgac 2040
atctttgagg cccagaagat cgagtgggga tccgactaca aggacgacga tgataagatc 2100
tgcaccgtgc ctgaggtgtc cagcgtgttt atcttccctc ccaagcctaa ggacgtgctg 2160
atgatcaccc tgacccccaa ggtgacctgt gtggtggtgg acatctccaa ggatgatccc 2220
gaggtgcagt tttcctggtt cgtggatgac gtggaggtgc acaccgccca gacccagcct 2280
agggaggagc agttcaactc caccttcaga tccgtgagcg agctgcctat catgcaccag 2340
gattggctga acggcaagga gtttaagtgc agggtgaata gcgccgcctt tcctgcccct 2400
atcgagaaga ccatctccaa gaccaagggc aggcctaagg cccctcaggt gtacaccatc 2460
cctcccccca aggagcagat ggccaaggat aaggtgagcc tgacctgtat gatcaccgac 2520
tttttccccg aggatatcac cgtggagtgg cagtggaatg gccagcccgc cgagaattac 2580
aagaataccc agcctatcat ggacaccgac ggctcctact tcgtgtacag caagctgaat 2640
gtgcagaagt ccaactggga ggccggcaac accttcacct gcagcgtgct gcacgagggc 2700
ctgcacaatc accacaccga gaagtccctg agccacagcc ccggcaagtg actcgag 2757
<210> 2
<211> 914
<212> PRT
<213> pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒(pCDH-nCoVSmFc.copGFP Plasmid)
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
            20                  25                  30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
        35                  40                  45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
    50                  55                  60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
                85                  90                  95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
            100                 105                 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
        115                 120                 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
    130                 135                 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
                165                 170                 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
            180                 185                 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
        195                 200                 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
    210                 215                 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
                245                 250                 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
            260                 265                 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
        275                 280                 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
    290                 295                 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305                 310                 315                 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
                325                 330                 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
            340                 345                 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
        355                 360                 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
    370                 375                 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
                405                 410                 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
            420                 425                 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
        435                 440                 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
    450                 455                 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
                485                 490                 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
            500                 505                 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
        515                 520                 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
    530                 535                 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
                565                 570                 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
            580                 585                 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
        595                 600                 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
    610                 615                 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
                645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala
            660                 665                 670
Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Gly
        675                 680                 685
Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val
    690                 695                 700
Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile
705                 710                 715                 720
Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp
                725                 730                 735
Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His
            740                 745                 750
Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
        755                 760                 765
Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
    770                 775                 780
Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu
785                 790                 795                 800
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr
                805                 810                 815
Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu
            820                 825                 830
Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp
        835                 840                 845
Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile
    850                 855                 860
Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln
865                 870                 875                 880
Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His
                885                 890                 895
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
            900                 905                 910
Gly Lys
<210> 3
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
            20                  25                  30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
        35                  40                  45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
    50                  55                  60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
                85                  90                  95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
            100                 105                 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
        115                 120                 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
    130                 135                 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
                165                 170                 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
            180                 185                 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
        195                 200                 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
    210                 215                 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
                245                 250                 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
            260                 265                 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
        275                 280                 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
    290                 295                 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305                 310                 315                 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
                325                 330                 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
            340                 345                 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
        355                 360                 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
    370                 375                 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
                405                 410                 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
            420                 425                 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
        435                 440                 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
    450                 455                 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
                485                 490                 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
            500                 505                 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
        515                 520                 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
    530                 535                 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
                565                 570                 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
            580                 585                 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
        595                 600                 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
    610                 615                 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
                645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala
            660                 665                 670
Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Gly
        675                 680                 685
Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
    690                 695
<210> 4
<211> 2040
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggttccgc gtggatccga ctacaaggac gacgacgaca agatgtctga taatggaccc 720
caaaatcagc gaaatgcacc ccgcattacg tttggtggac cctcagattc aactggcagt 780
aaccagaatg gagaacgcag tggggcgcga tcaaaacaac gtcggcccca aggtttaccc 840
aataatactg cgtcttggtt caccgctctc actcaacatg gcaaggaaga ccttaaattc 900
ccacgaggac aaggcgttcc aattaacacc aatagcagtc cagatgacca aattggctac 960
taccgaagag ctaccagacg aattcgtggt ggtgacggta aaatgaaaga tctcagtcca 1020
agatggtatt tctactacct aggaactggg ccagaagctg gacttcccta tggtgctaac 1080
aaagacggca tcatatgggt tgcaactgag ggagccttga atacaccaaa agatcacatt 1140
ggcacccgca atcctgctaa caatgctgca atcgtgctac aacttcctca aggaacaaca 1200
ttgccaaaag gcttctacgc agaagggagc agaggcggca gtcaagcctc ttctcgttcc 1260
tcatcacgta gtcgcaacag ttcaagaaat tcaactccag gcagcagtag gggaacttct 1320
cctgctagaa tggctggcaa tggcggtgat gctgctcttg ctttgctgct gcttgacaga 1380
ttgaaccagc ttgagagcaa aatgtctggt aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc 1440
actaagaaat ctgctgctga ggcttctaag aagcctcggc aaaaacgtac tgccactaaa 1500
gcatacaatg taacacaagc tttcggcaga cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttt 1560
ggggaccagg aactaatcag acaaggaact gattacaaac attggccgca aattgcacaa 1620
tttgccccca gcgcttcagc gttcttcgga atgtcgcgca ttggcatgga agtcacacct 1680
tcgggaacgt ggttgaccta cacaggtgcc atcaaattgg atgacaaaga tccaaatttc 1740
aaagatcaag tcattttgct gaataagcat attgacgcat acaaaacatt cccaccaaca 1800
gagcctaaaa aggacaaaaa gaagaaggct gatgaaactc aagccttacc gcagagacag 1860
aagaaacagc aaactgtgac tcttcttcct gctgcagatt tggatgattt ctccaaacaa 1920
ttgcaacaat ccatgagcag tgctgactca actcaggccg gaagcggagg aagcggagga 1980
agcgcaggag gaggattaaa tgatatattt gaagcacaaa aaatagaatg gtgactcgag 2040
<210> 5
<211> 677
<212> PRT
<213> N-融合蛋白质粒(N-fusion protein Plasmid)
<400> 5
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
    210                 215                 220
Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ser Asp Asn Gly Pro
225                 230                 235                 240
Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys
            260                 265                 270
Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr
        275                 280                 285
Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln
    290                 295                 300
Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys
                325                 330                 335
Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu
            340                 345                 350
Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala
        355                 360                 365
Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn
    370                 375                 380
Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr
385                 390                 395                 400
Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala
                405                 410                 415
Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr
            420                 425                 430
Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly
        435                 440                 445
Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu
    450                 455                 460
Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val
465                 470                 475                 480
Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg
                485                 490                 495
Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly
            500                 505                 510
Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln
        515                 520                 525
Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser
    530                 535                 540
Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro
545                 550                 555                 560
Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys
                565                 570                 575
Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp
            580                 585                 590
Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys
        595                 600                 605
Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln
    610                 615                 620
Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln
625                 630                 635                 640
Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala Gly Ser Gly
                645                 650                 655
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala
            660                 665                 670
Gln Lys Ile Glu Trp
        675
<210> 6
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1               5                   10                  15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
            20                  25                  30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
        35                  40                  45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
    50                  55                  60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
                85                  90                  95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
        115                 120                 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
    130                 135                 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145                 150                 155                 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
                165                 170                 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
            180                 185                 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
        195                 200                 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
    210                 215                 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225                 230                 235                 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
                245                 250                 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
            260                 265                 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
        275                 280                 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
    290                 295                 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305                 310                 315                 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
                325                 330                 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
            340                 345                 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
        355                 360                 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
    370                 375                 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385                 390                 395                 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
                405                 410                 415
Thr Gln Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Leu
            420                 425                 430
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
        435                 440

Claims (8)

1.一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于包括S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条，所述S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条并排组装于一个双卡条中，构成一个双抗原四联检试剂卡；
所述S-IgM/IgG试纸条和N-IgM/IgG试纸条均包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸；所述样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，样品垫叠压在释放垫上；所述检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区M和G线、靠近吸水纸的一条控制线区C线；
将质控抗原偶联于羧基量子点微球，获得QM-质控抗原；
将量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在一个免疫层析试纸条的释放垫上，并在该免疫层析试纸条的M、G、C线区上分别包被第一检测抗体、第二检测抗体和质控抗体，获得所述的S-IgM/IgG试纸条；
将量子点标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在另一个免疫层析试纸条的释放垫上，并在该免疫层析试纸条的M、G、C线区上分别包被第一检测抗体、第二检测抗体和质控抗体，获得所述的N-IgM/IgG试纸条；
将量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白命名为QM-SB-S，其制备方法包括以下步骤：
S1：将新型冠状病毒棘突蛋白标记为S-蛋白，在S-蛋白膜外部分的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，该人工设计序列经宿主密码子优化，基因合成后亚克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达该人工设计序列蛋白的质粒，标记为S-融合蛋白质粒；
S2：将步骤S1构建的S-融合蛋白质粒转染到真核永生化细胞，并建立S-融合蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到含S-融合蛋白的培养上清液，用纯化蛋白亲和柱从该培养上清液中获得S-融合蛋白，随后用特异性蛋白酶切去S-融合蛋白的纯化标签获得S-蛋白；
S3：将步骤S2获得的S-蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白S-Biotin；将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将蛋白S-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的S-蛋白，标记为QM-SB-S；
将量子点标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白命名为QM-SB-N，其制备方法包括以下步骤：
M1：将新型冠状病毒核衣壳蛋白标记为N-蛋白，在N-蛋白的C端接上蛋白定点生物素化序列、N端接上特异性蛋白酶切位点标签，并亚克隆到原核表达载体的纯化标签下游，获得表达N-纯化标签融合蛋白的质粒，标记为N-融合蛋白质粒；
M2：将步骤M1获得表达的N-融合蛋白质粒转化感受态E.Coli，扩增培养诱导表达N-融合蛋白，并进行化学法裂解表达N-融合蛋白的工程菌，裂解液过纯化蛋白亲和柱制备获得N-融合蛋白，随后用特异性蛋白酶切去N-融合蛋白的纯化标签，获得N-蛋白；
M3：将步骤M2获得的N-蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白N-Biotin；将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将蛋白N-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的N-蛋白，标记为QM-SB-N。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于所述质控抗原为兔IgG，QM-质控抗原为QM-兔IgG；所述第一检测抗体为小鼠抗人IgM的单克隆抗体hIgM-mAb，第二检测抗体为小鼠抗人IgG的单克隆抗体hIgG-mAb，质控抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体GAR。
3.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤S1中，所述S-蛋白膜外部分即为NCBI Reference Sequence: YP_009724390.1的1-1213aa部分；S-蛋白膜外部分的C端顺序接上的蛋白定点生物素化序列的生物素蛋白连接酶识别位点为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW、特异性蛋白酶的切位点标签为Flag标签DYKDDDDK、纯化标签为小鼠IgG Fc段；密码子优化的宿主为人；所述含有EF1启动表达荧光蛋白的载体为慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，该EF1启动表达的荧光蛋白为绿色荧光蛋白copGFP，构建的S-融合蛋白质粒是pCDH-nCoVSmFc.copGFP；
其中，在S-蛋白膜外部分的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签的人工设计序列经宿主密码子优化后的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；构建好的pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒所表达的S-融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤S2中，所述真核永生化细胞为HEK293，建立S-融合蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVSmFc.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立nCoVSmFc.copGFP/293稳转细胞系；所述S-融合蛋白为nCoVS- Flag - mFc；所述纯化蛋白亲和柱为ProteinA/G柱，特异性蛋白酶为EK酶；切去纯化标签后的S-蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤S3中，S-蛋白用BirA生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白S-Biotin，其连接识别位点为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW序列上的赖氨酸K，位于S-蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:3近C-末端；所述羧基量子点微球为表面具有羧基功能团的量子点荧光微球，用EDC/NHS交联剂活化，将链霉亲和素SA通过肽键偶联于量子点荧光微球，获得所述的QM-SA；
生物素化的蛋白S-Biotin通过链霉亲和素-生物素反应连接，获得量子点荧光标记的QM-SB-S。
6.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤M1中，新型冠状病毒核衣壳蛋白为NCBI Reference Sequence: YP_009724397.2的全长蛋白；所述N-蛋白的C端接上蛋白定点生物素化序列为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW、N端接上特异性蛋白酶切位点标签为Flag标签DYKDDDDK；所述原核表达载体为pGEX-4T-1，纯化标签为GST；所述N-融合蛋白为GST-nCoVNbio，构建的N-融合蛋白质粒为pGEX-nCovNBio，其中编码GST-nCoVNbio融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，构建好的N-融合蛋白质粒所表达的N-融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于步骤M2中，所述感受态E.Coli为BL21(DE3)菌系；所述纯化蛋白亲和柱为GST亲和层析柱；所述特异性蛋白酶为EK酶；切去纯化标签后的N-蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
步骤M3中，N-蛋白用BirA生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白S-Biotin，其连接识别位点为位于N-蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6C-末端的GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW序列上的赖氨酸K；所述羧基量子点微球为表面具有羧基功能团的量子点荧光微球，用EDC/NHS交联剂活化，将链霉亲和素SA通过肽键偶联于量子点荧光微球，获得所述的QM-SA；生物素化的蛋白N-Biotin通过链霉亲和素-生物素反应连接，获得量子点荧光标记的QM-SB-N。
8.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒，其特征在于所述S-IgM/IgG试纸条和N-IgM/IgG试纸条的免疫层析试纸条均进行生物安全性改良，即在样本垫预处理液中添加RNA酶以及光化学法灭活剂，以抑制或灭活检测样本中的病毒；试剂盒中配有装病毒灭活剂的EP管，取样后先放入装有病毒灭活剂的EP管中对样本中的病毒进行灭活处理，然后加入含有RNA酶的样本缓冲液稀释后点样检测；
其中，所述光化学法灭活剂为核黄素、补骨脂素、亚甲蓝中的至少一种；所述的病毒灭活剂为酒精、双氧水、***、甲醛、戊二醛、次氯酸钠、氯仿、辛酸、过氧乙酸中的至少一种。
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