CN111235174A - 利用枯草芽孢杆菌和核酸内切酶制备人碱性成纤维细胞生长因子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用枯草芽孢杆菌和核酸内切酶制备人碱性成纤维细胞生长因子。具体而言,本发明提供一种核酸构建体,其包含***物,所述***物从5’端到3’端包含编码短肽亲和标签、来源于鱼腥藻属(Anabaena sp.)的反式剪接内含肽、以及外源多肽的多核甘酸序列,其中所述短肽亲和标签作为所述反式剪接内含肽的N‑端外显肽,并且所述外源多肽作为所述反式剪接内含肽的C‑端外显肽。本发明还提供了包含该构建体的表达载体以及宿主细胞,以及一种产生和纯化外源蛋白的方法。通过本发明的表达***和方法,能够显著提高具有生物活性的外源蛋白的表达效率,减少包涵体的产生,简化了纯化步骤,大幅度降低纯化成本,特别适合规模化培养使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物学领域,并且一般地涉及用于表达外源多肽的***和方法。
背景技术
高效且成本有效地表达天然形式的外源多肽、尤其是细胞因子对于细胞生物学例如干细胞的研究日益重要。以人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,简称bFGF,也称为FGF2)为例。bFGF是成纤维细胞生长因子家族的成员,在神经退行性疾病、心脏病和难以愈合的伤口类病变中具有多种治疗用途[1-3]。此外,bFGF通过诱导成纤维细胞和干细胞的增殖在组织发育中发挥重要作用[4-8],它还在干细胞的大规模生产方面起到重要作用。然而,目前bFGF蛋白的生产成本高,产量低,阻碍了其在医药行业的商业应用[9-10]。例如,在干细胞培养条件下bFGF蛋白不稳定,易降解,而例行更换含有商购bFGF的新鲜培养基会极大提高研发成本。为了促进干细胞研究的发展,提高重组人bFGF的上游生产效益至关重要。
大肠杆菌(E.coli)作为细菌宿主,被广泛用于表达无翻译后修饰的重组蛋白。大肠杆菌具有生长速度快,成本低以及易于使用等优点而被广泛用于生物技术领域。然而,由于大肠杆菌是具有LPS外膜的革兰氏阴性细菌,因此,纯化的重组蛋白中一般伴有大量的内毒素。当将相关重组蛋白用于治疗组织培养样品或动物受试者时,这些内毒素可能会导致不良的毒性作用。除非使用无内毒素的水和内毒素去除试剂盒,否则内毒素很难通过下游纯化工艺分离。由此相关试剂盒的使用提高了目标蛋白质的生产成本。
相比之下,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种***,由于不含内毒素,因此被FDA认为是“公认安全”(GRAS)的[11]。枯草芽孢杆菌能够稳定表达外源多肽,并且已被工程化以表达分泌的内源蛋白和外源蛋白。然而,重组外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达水平比在大肠杆菌中低[12],其原因主要有:1.枯草芽孢杆菌在其对数生长末期表达和分泌大量蛋白酶,对外源蛋白的稳定表达和产量产生不良影响;2.部分外源蛋白分泌到培养基中会影响宿主菌的生长,这同样影响外源蛋白的高效表达;3.基因工程操作与大肠杆菌相比更为困难。这些因素据认为限制了枯草芽孢杆菌作为宿主细胞的使用。
内含肽(intein)是从其宿主蛋白质上自切除并催化侧翼序列(外显肽(extein))通过肽键连接的内部蛋白质元件。内含肽切除不需要辅助酶或辅因子的翻译后加工。该自切割过程称为“蛋白质剪接”。内部蛋白质序列的区段称为“内含肽”,外部蛋白质序列的区段称为“外显肽”,其中上游外显肽称为“N-端外显肽”并且下游外显肽称为“C-端外显肽”。
蛋白质内含肽不仅丰富了遗传信息翻译后加工的内容,而且在蛋白质纯化方面也获得了广泛的应用。从内含肽的内部有无自导引归巢核酸内切酶结构域,可将内含肽分为2种类型。一种是全功能型内含肽(maxi-intein),其具有蛋白剪接活性和自导引核酸内切酶(homing endonuclease)序列;另一种是微型内含肽(mini-intein),其仅具有蛋白剪接活性。根据其存在形式,分为整体内含肽和分离内含肽。前者的两个剪接区域共同存在于同一多肽片段上。后者的两个剪接区域存在于不同的多肽片段上,因此称为分离内含肽或断裂内含肽。整体内含肽进行顺式剪接作用,而分离/断裂内含肽进行反式剪接作用。
内含肽在蛋白纯化方面得到了广泛的应用,迄今为止,生物体中已经发现了400多种内含肽。已有多种不同来源和结构的内含肽用于构建蛋白表达和纯化***。不同内含肽的断裂反应速率和条件不同,纯化效率也存在很大差异。然而,影响内含肽断裂的因素目前尚不十分清楚。
在本领域中,对于能够成本有效地表达外源多肽的***和方法存在需求。
发明内容
在一个实施方案中,本发明提供了一种核酸构建体,其包含***物,所述***物从5’端到3’端包含编码短肽亲和标签、来源于鱼腥藻属(Anabaena sp.)的反式剪接内含肽、以及外源多肽的多核甘酸序列,其中所述短肽亲和标签作为所述反式剪接内含肽的N-端外显肽,并且所述外源多肽作为所述反式剪接内含肽的C-端外显肽。
在一个方面中,所述内含肽为鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽(Asp DnaE)。
在一个方面中,所述内含肽包含与SEQ ID NO:2具有至少75%序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一个方面中,所述外源多肽是成纤维细胞生长因子(FGF),例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),尤其是人bFGF。
在一个方面中,所述短肽亲和标签具有约4-15个氨基酸的长度,例如是5-15x His标签,尤其是6x His标签。
在一个方面中,所述核酸构建体进一步包含以下元件的一种或多种:启动子、操纵子、增强子和核糖体结合位点。
在一个方面中,所述核酸构建体从5’端到3’端,包含编码乳糖操纵子-核糖体结合位点(RBS)-T7启动子-6x His标签-Asp DnaE内含肽-bFGF的核苷酸序列。
在一个方面中,所述核酸构建体进一步包含位于所述***物上游的第一克隆位点和位于所述***物下游的第二克隆位点,其中所述第一克隆位点和第二克隆位点允许所述核酸构建体***表达载体。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种表达载体,其包含本发明的核酸构建体。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种转化的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),其包含本发明的表达载体。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种产生外源多肽的方法,其包括在允许外源多肽表达的条件下培养本发明的转化的枯草芽孢杆菌。
在一个方面中,所述产生外源多肽的方法进一步包括分离经培养的所述枯草芽孢杆菌并使其裂解以获得细胞裂解液,然后通过顺序采用阳离子交换色谱法和肝素-琼脂糖(HA)色谱从所述细胞裂解液纯化所述外源多肽。
附图说明
图1示出了根据本发明的一个实施方案的表达H6-DnaE-bFGF***物表达盒的质粒构建载体(6.6kb)的示意图。ori=枯草芽孢杆菌的复制起点;AmpR=氨苄青霉素抗性基因;KanR=卡那霉素抗性基因;bFGF=bFGF基因;DnaE=Asp DnaE内含肽;H6=6x His标签。箭头指示基因表达的方向。
图2示出了根据本发明的一个实施方案的枯草芽孢杆菌宿主细胞裂解液样品中bFGF蛋白免疫印迹试验结果。泳道0h、2h、4h、6h和8h:表示分别从诱导后0h、2h、4h、6h和8h的培养物中收集的样品,每个泳道上样5μl细胞裂解物。泳道-ve:5μl来自诱导后8小时的pECBS1载体培养物的细胞裂解物。
图3示出了根据本发明的一个实施方案的摇瓶培养枯草芽孢杆菌bFGF的时程研究。培养样品在IPTG诱导前和诱导后不同时间点获得。图3A:细胞裂解物(CL)样品中存在的bFGF的蛋白免疫印迹试验分析结果,其中每个泳道均上样5μl细胞裂解物。图3B:细胞活性和bFGF的定量。表示检测到的bFGF水平;CFU是指菌落形成单位。活细胞计数分别在普通琼脂平板和添加卡那霉素的平板上测定,分别以和表示。转化子生长试验重复3次,并显示标准误差棒。
图4示出了根据本发明的一个实施方案的分批补料发酵枯草芽孢杆菌中bFGF蛋白表达的时程研究。培养样品在IPTG诱导前和诱导后不同时间点获得。图4A:细胞裂解物(CL)样品中存在的bFGF的蛋白免疫印迹试验结果,其中每个泳道上样5μl细胞裂解物。图4B:细胞活性和bFGF的定量,表示检测到的bFGF水平;CFU是指菌落形成单位,活细胞计数分别在普通琼脂平板和添加卡那霉素的平板上测定,分别以和表示。转化子生长试验重复3次,并显示标准误差棒。
图5示出了根据本发明的一个实施方案的来源于pECBS1-H6-DnaE-bFGF构建体的纯化bFGF样品的质谱测定结果(分子大小)。
图6示出了根据本发明的一个实施方案的bFGF蛋白的促有丝***活性实验结果。来源于pECBS1-H6-DnaE-bFGF构建体的不同浓度的纯化bFGF蛋白样品对成纤维细胞增殖的影响被示出。
图7示出了构建体pECBS1-H6-DnaE-bFGF的酶切鉴定结果。
图8示出了分别使用H6和CBD亲和标签的bFGF蛋白表达的WB结果。泳道0h、4h、8h:表示分别从诱导后0h、4h、8h的培养物中收集的样品;泳道+ve和泳道-ve分别表示阳性对照和阴性对照。
图9示出了分别使用H6和GST亲和标签的bFGF蛋白表达的WB结果。泳道0h、4h、8h:表示分别从诱导后0h、4h、8h的培养物中收集的样品;泳道+ve和泳道-ve分别表示阳性对照和阴性对照。
图10示出了仅采用肝素-琼脂糖色谱进行纯化的结果。
具体实施方式
以下提供对可用于表达多种外源多肽、尤其是天然外源多肽的表达***和方法的描述。这些***和方法满足了本领域中存在的至少一项需求。
本文中所用章节标题仅用于组织目的,不应理解为以任何方式限制所述主题。
除非另有明确定义,否则本文中所用术语应根据其在本领域中的通常含义来理解。除非文中另有规定或指示,否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
标准技术和流程通常根据本领域的常规方法和多种一般参考文献来进行(通常可参见,Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
在一个实施方案中,本发明提供了一种核酸构建体,其包含***物,所述***物从5’端到3’端包含编码短肽亲和标签、来源于鱼腥藻属的反式剪接内含肽、以及外源多肽的多核甘酸序列,其中所述短肽亲和标签作为所述反式剪接内含肽的N-端外显肽,并且所述外源多肽作为所述反式剪接内含肽的C-端外显肽。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施方案及实施方案中的特征可以相互组合。
内含肽
内含肽是能够从宿主蛋白上自切割并催化侧翼序列通过肽键连接的蛋白质元件。
可用于本发明的内含肽可以是来源于鱼腥藻属的反式剪接内含肽。在一个实施方式中,内含肽可以是源自鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽(Asp DnaE)。
如本文所使用,术语“反式剪接内含肽”是指具有反式剪切活性的内含肽。根据其存在形式,内含肽可分为整体内含肽和分离内含肽。前者的两个剪接区域共同存在于同一多肽片段上,而后者的两个剪接区域存在于不同的多肽片段上,从而被称为分离内含肽。整体内含肽进行顺式剪接作用,而分离内含肽进行反式剪接作用。分离内含肽也可称为反式剪接内含肽。
如本文所使用,术语“鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽”是指来源于鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽。在一个方面中,编码本发明的内含肽的核苷酸可具有或包含SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列,或者可具有或包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或以上的序列同一性的序列或其互补序列,或者可以由上述核苷酸序列组成。在一个方面中,所述内含肽可具有或包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,或者可具有或包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或以上的序列同一性的氨基酸序列,或者可以由上述氨基酸序列组成。
外源多肽
如本文所使用,术语“外源多肽”、“外源蛋白”、“异源多肽”和“异源蛋白”可互换使用,其是指非宿主细胞天然表达、而是人工加入或通过基因转染等技术来使得宿主细胞表达的多肽或蛋白质。
在一些实施方式中,异源多肽可以是,例如,酶、细胞因子(例如成纤维细胞生长因子)、激素(例如降钙素、红细胞生成素、促血小板生成素、人类生长激素、表皮生长因子等)、干扰素,或者其它具有治疗、营养医学、农业或工业用途的蛋白质。另外的异源多肽可以是抗体、抗体片段和药物蛋白。异源多肽也可以是多肽片段。
在一个实施方式中,可用于本发明的异源多肽可以是成纤维细胞生长因子(FGF)。成纤维细胞生长因子是一类由约150-200氨基酸组成的多肽,以两种密切相关的形式存在,即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。
在一个实施方式中,可用于本发明的异源多肽可以是碱性成纤维细胞生长因子,尤其是人bFGF,更具体是天然人bFGF。在一个方面,本发明的bFGF可具有或包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,或者可具有或包含与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或以上的序列同一性的核苷酸序列,或者可以由上述核苷酸序列组成。
在一个方面中,本发明的bFGF可具有或包含可具有或包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,或者可具有或包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或以上的序列同一性的氨基酸序列,或者可以由上述氨基酸序列组成。
亲和标签
如本文所使用,术语“亲和标签”、“纯化标签”和“蛋白标签”可互换使用,其是指重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽。亲和标签可用于促进目的蛋白的可溶性和稳定性,便于目的蛋白被检测和纯化。
不意图受理论的束缚,本发明意外地发现,分子量相对较小的短肽亲和标签低于获得成熟和生物相同的(天然的)外源蛋白或多肽是有益的。
在一些实施方式中,可用于本发明的亲和标签可以是短肽亲和标签,其可具有约4-15个例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的长度。在一些实施方式中,短肽亲和标签包括但不限于:HIS标签、HA标签(例如YPYDVP)、FLAG标签(例如DYKDDDDK)、HSV标签(例如QPELAPEDPED)、MYC标签(例如ILKKATAYIL或EQKLISEEDL)、V5标签(例如GKPIPNPLLGLDST)、Xpress标签(例如DLDDDDK或DLYDDDDK)、Thrombin标签(例如LVPRGS)、BAD(生物素受体域)(例如GLNDIFEAQKIEWHE)、因子Xa标签(例如IEGR或IDGR)、VSVG标签(例如YTDIEMNRLGK)、SV40 NLS标签(例如PKKKRKV或PKKKRKVG)、蛋白C标签(例如EDQVDPRLIDGK)、S标签(例如KETAAAKFERQHMDS)、SB1标签(例如PRPSNKRLQQ)等。在一个方面中,亲和标签可以是5-15x His标签,更具体地可以是6x His标签(H6)。
在一些实施方案中,本发明的短肽亲和标签作为反式剪接内含肽的N-端外显肽,并且外源多肽作为反式剪接内含肽的C-端外显肽。在一个示例中,H6标签被融合至AspDnaE内含肽的N末端,而bFGF被融合至Asp DnaE内含肽的C末端。
bFGF编码序列被首次设计来融合于内含肽的C端,而短肽亲和标签作为表达后蛋白纯化的锚点。从实验结果看,将具有较大尺寸的GST或CBD标签融合到DnaE内含肽的N端仅得到前体聚集形式,而将N-段外显肽替换为具有较小尺寸的短肽亲和标签例如H6标签则获得令人惊讶的结果。所表达的bFGF不仅是溶解形式而且是成熟态,并且具有高的产量(参见图2、3A和3B)。不意图受到理论的束缚,将N-端外显肽替换为相对较小的短肽亲和标签可能改变了整个融合蛋白的总体构象,从而有利于C-端外显肽的分离,避免包涵体的形成。
表达载体
在一个实施方案中,本发明了提供了一种表达载体,其包含本发明的核酸构建体。
如本文所使用,术语“载体”、“表达载体”、“重组载体”和“重组***”可互换使用,其用来指运载体,通过它可对多核苷酸或DNA分子进行操作或导入宿主细胞。载体可以是线性或环状多核苷酸,或者可以是大尺寸多核苷酸或任意其它类型的构建体,例如来自病毒基因组、病毒体或任意其它生物学构建体的DNA或RNA,其允许对DNA进行操作或将其导入细胞。
本领域技术人员将会理解,对可用的载体类型并无限制,只要所述载体可以是适于增殖,能够获得充足的多核苷酸或基因构建体的克隆载体,或在不同异源生物中适于纯化融合蛋白质的表达载体。在一个实施方式中,根据本发明的合适载体包括原核生物中的表达载体,诸如原核表达载体,包括但不限于:pET14、pET21、pET22、pET28、pET42、pMAL-2c、pTYB2、pGEX-4T-2、pGEX-6T-1、pQE-9、pBAD-his、pBAD-Myc、pECB系列载体、pRB系列载体等,例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pBR374、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4、噬菌体和“穿梭”载体(例如pSA3和pAT28)。
在一个实施方式中,本发明还考虑穿梭载体。如本文所使用,术语“穿梭载体”是一类可以在两种不同宿主细胞(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)中复制和扩增的载体,从而使得能够将同一表达载体转化入不同的宿主细胞。本发明涉及的穿梭载体可以包括并不限于pECBS1。
载体组分通常可包括但不限于如下的一种或更多种表达控制元件:启动子、增强子、操纵子、核糖体结合位点以及转录终止序列等。
可用于本发明的示例性启动子可包括在原核生物中具有活性的启动子,例如T7启动子、phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子***、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子***、以及杂合启动子如tac启动子。
可用于本发明的示例性操纵子包括但不限于乳糖操纵子、***糖操纵子、色氨酸操纵子等。乳糖操纵子是参与乳糖分解的一个基因群,由乳糖***的阻遏物和操纵序列组成,使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。
如本文所使用,术语“核糖体结合位点”(ribosome binding site,简称RBS),是指位于mRNA的起始密码子上游,在翻译起始时可用于结合核糖体的一段序列。
根据本发明的表达载体还可包含编码标记蛋白的多核苷酸。适于本发明的标记蛋白包括具有抗生素抗性或对其他毒性化合物具有抗性的蛋白。具有抗生素抗性的标记蛋白的实例包括磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸转移酶,或磷酸化潮霉素的hpt,或赋予对例如博莱霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、大观霉素或杀稻瘟菌素抗性的蛋白。在一个实例中,蛋白质赋予对氯霉素的抗性。例如,该蛋白质是一个来自大肠杆菌的基因,命名为CmR,如Nilsen et al,J.Bacteriol,178:3188-3193,1996中所述。
可使用本领域技术人员公知的标准技术,将编码目标多肽的多核苷酸克隆入本发明的载体。例如,利用聚合酶链反应(PCR)产生编码目标多肽的多核苷酸。PCR操作方法是本领域已知的。
在一些实施方案中,本发明的核酸构建体可进一步包含位于***物上游的第一克隆位点和位于***物下游的第二克隆位点,其中第一克隆位点和第二克隆位点允许核酸构建体***表达载体。
克隆位点允许克隆编码异源性多肽的多核苷酸。优选地,克隆位点组合在一起形成多克隆位点。如本文所使用,术语“多克隆位点”指包含一系列两个或更多个彼此相邻定位的限制内切核酸酶靶序列的核酸序列。多克隆位点包含限制内切核酸酶靶位,其允许具有平末端、黏性5’末端或黏性3’末端的片段***。使用标准分子生物学方法进行目标多核苷酸的***,例如,如Sambrook et al.(Sambrook et al.Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989)和/或Ausubel etal.(Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988)所描述。
如本文所使用,术语“限制性内切酶”或“限制性核酸内切酶”是指可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列,并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。切割方法是将糖类分子与磷酸之间的键结切断,进而于两条DNA链上各产生一个切口,且不破坏核苷酸与碱基。切割形式有两种,分别是可产生具有突出单股DNA的黏状末端,以及末端平整无凸起的平滑末端。由于断开的DNA片段可由DNA连接酶连接,因此染色体或DNA上不同的限制片段,得以经由剪接作用而结合在一起。可用于本发明的限制性内切酶可包括但不限于:EcoRI、PstI、XbaI、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinfI、Sau3A、PovII、SmaI、HaeIII、AluI、SalI、Dra等。
连接核酸的方法对本领域技术人员是显而易见的,并描述于例如Sambrook etal.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour LaboratoryPress,1989和/或Ausubel et al.(编者),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates以及Wiley-Interscience(1988)中。在一个实例中,利用连接酶(例如T4DNA连接酶)连接核酸。
宿主细胞
在一些实施方案中,本发明提供了一种转化的宿主细胞,其包含本发明的表达载体。由于枯草芽孢杆菌不含内毒素而被认为是“公认安全”的,在本发明的一个实施方式中采用枯草芽孢杆菌作为宿主细胞。本发明的发明人惊讶地发现,采用本发明的核酸构建体结构,枯草芽孢杆菌能够促进内含肽和外显肽的自动切割,并且可获得令人满意的天然外源多肽/蛋白的表达水平,从而解决了采用枯草芽孢杆菌表达外源多肽/蛋白的低表达水平的问题。
在一些方面中,本发明提供了一种获得转化的枯草芽孢杆菌的方法,其包括将枯草芽孢杆菌与本发明的表达载体在允许表达载体转化入枯草芽孢杆菌的条件下接触。本领域技术人员知晓并可根据表达载体和宿主细胞的类型调整合适的条件。
如本文所使用,术语“转化”意为将DNA作为染色体外元件或者通过染色体整合引入原核宿主中,以使DNA可以复制。取决于所使用的宿主细胞,使用对于此类细胞合适的标准技术进行转化。通常将使用氯化钙的钙处理用于含坚固的细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法使用聚乙二醇/DMS0。还使用的另一技术是电穿孔。
将用于产生本发明的外源多肽的原核宿主细胞培养于本领域已知的并且适合用于该宿主细胞培养的培养基中。合适的培养基的实例可包括添加了必需营养补充物的Luria-Bertani(LB)培养基。在一些实施方案中,培养基还含有选择剂,基于构建的表达载体进行选择,以选择性地允许含表达载体的原核细胞生长。例如,将氨苄青霉素和/或卡那霉素加入到用于细胞生长的培养基中,所述细胞表达氨苄青霉素和/或卡那霉素抗性基因。还可以以合适的浓度包括除碳、氮和无机磷源之外的任何必需补充物,其可以单独地或者以与另一补充物或培养基如复合氮源的混合物的形式引入。
产生外源多肽的方法
在一些实施方案中,本发明提供了一种产生外源多肽的方法,其包括在允许所述外源多肽表达的条件下培养本发明的转化的枯草芽孢杆菌。
对于表达基因产物的聚积,在足以聚积基因产物的条件下培养宿主细胞。此类条件可包括例如,允许细胞表达和聚积蛋白质的温度、营养和细胞密度条件。此外,如本领域技术人员已知,此类条件是这样的条件,在该条件下细胞可以进行基本细胞功能,如转录、翻译,以及细胞内表达。
在合适的温度培养原核宿主细胞。对于枯草芽孢杆菌培养,例如,一般的温度为约20℃至约39℃。在一个实施方案中,温度为约25℃至约37℃,如37℃。
对于诱导,通常培养细胞直到达到确定的光密度,例如约80-100的A55tl,在此时开始诱导(例如,通过添加诱导物,通过耗竭阻遏物、抑制剂或培养基组分等),以诱导编码异源多肽的基因的表达。
产物聚积后,可以使用本领域已知的任何机械方法机械地裂解培养物中存在的细胞,以从宿主细胞中释放所述蛋白质。可选的,还可采用其它裂解法,包括但不限于碱裂解法、SDS裂解法等。用于裂解细胞的细胞裂解液可包括但不限于Tris-HCl、EDTA、NaCl、葡萄糖、溶菌酶等。任选地在产物回收之前,将裂解物温育足够的时间,以使细胞中含有的异源多肽释放。
裂解物可进行进一步处理,例如用水稀释、添加缓冲液或絮凝剂、PH调节,或者改变或维持用于后续回收步骤的制备物中裂解物/匀浆的温度。
在后续的步骤中,以最小化共回收的细胞碎片和产物的方式,从裂解物中回收异源多肽。可以通过任何方法进行回收。在一个实施方案中,可以包括沉降含异源多肽的可折射颗粒或者收集含可溶性产物的上清液。沉降的实例可以是离心。可以在吸附或者沉降之前,在破坏外层细胞壁以增加渗透性并允许回收更多固体的试剂存在的情况下,进行回收。此类试剂的实例包括螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或者兼性离子例如偶极离子去垢剂如ZWITTERGENT 316TM去垢剂。在一个实施方案中,在EDTA存在的情况下进行回收。
在一个实施方案中,在需要时,可进一步包括分离聚集的异源多肽,然后同时进行多肽的增溶和再折叠。备选地,可通过如下所述的标准技术回收可溶性产物:免疫亲或离子交换柱上分级分离;乙醇沉淀;反相HPLC;二氧化硅上或阳离子交换树脂例如DEAE上层析;层析聚焦;SDS-PAGE;硫酸铵沉淀;以及使用例如SEPHADEXTMG-75的凝胶过滤;肝素-琼脂糖(HA)色谱等。
在一个实施方案中,本发明的产生外源多肽的方法进一步包括通过顺序采用阳离子交换色谱法和肝素-琼脂糖(HA)色谱从所述细胞裂解液纯化所述外源多肽。发明人惊讶地发现,在使用肝素-琼脂糖层析之前先采用阳离子交换层析,以除去大部分管家蛋白,然后通过透析除去高浓度的盐,可获得了预料不到的高纯度的bFGF蛋白。
虽然枯草芽孢杆菌由于其不包含内毒素而成为蛋白质生产有吸引力的宿主***,但是目前的研究已经证明难以获得高水平的可溶性异源蛋白的细胞内表达。很多研究人员已经开展内含肽及其在蛋白质表达中的应用,然而内含肽的作用机理在不同的宿主***中仍不完全清楚。发明人尝试在细菌宿主***中表达无内毒素的重组蛋白,以用于研究和商业目的。与其他方法相比,采用内含肽表达蛋白是生产具有生物同一性结构的重组蛋白最简单、最经济可行的方法,并可确保高生物活性并防止在动物受试者上发生不利的免疫应答。
为了克服现有技术的缺陷,提高内含肽介导的蛋白纯化***的可预测性和有效性,发明人构建了全新的蛋白表达纯化***。该***利用来源于鱼腥藻属(Anabaenaspecies)、尤其是DNA聚合酶III单元的内含肽(Asp DnaE),以促进枯草芽孢杆菌中外源蛋白如人bFGF蛋白的胞内表达,并通过在融合蛋白的N-末端添加短肽亲和标签例如6xHis标签提高蛋白纯化的效率并获得具有活性的天然外源蛋白如人bFGF蛋白。采用本发明提供的构建体表达外源蛋白如人bFGF,能够显著提高具有生物活性的外源蛋白如人bFGF蛋白的表达效率,减少包涵体的产生,简化了纯化步骤,大幅度降低纯化成本。发明人还通过实验证实了本发明的构建体和蛋白纯化***在4L规模发酵实验中,与摇瓶培养相比,外源蛋白如人bFGF蛋白的总产量显著增加,而细胞活力在整个诱导期间也保持稳定,特别适合规模化培养使用,取得了预料不到的技术效果。
本发明中的示例性序列示于下表。
实施例
本文中通过以下实施例对本发明进行描述,其仅旨在举例说明,对本发明的范围并无限制。
大肠杆菌菌株DH5α购自New England Biolabs(Ipswich,MA)。如先前报道中所述获得枯草芽孢杆菌菌株W800[13]。合成的DNA片段、限制性内切酶和针对bFGF的抗体购自Thermo Fisher Scientific(Ipswich,MA)。除非另有说明,否则所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
实施例1:表达载体构建和宿主细胞转化
大肠杆菌/枯草芽孢杆菌表达穿梭载体的构建与设计
pRB374和pBR322分别用作大肠杆菌/枯草芽孢杆菌表达穿梭载体的起始载体[14]。具体而言,通过以下修饰步骤构建pECBS1:首先,用EcoRI和PstI消化pRB374(5.9kb)。释放的片段被用EcoRI和PstI消化pBR322(4.3kb)得到的片段替换,从而形成pECBSi载体。pECBSi进一步被SalI和Dra消化,并且两个位点被T4 DNA聚合酶补平。最后,将这两个位点连接在一起形成pECBS1穿梭载体。
bFGF表达载体的构建
大肠杆菌/枯草杆菌表达穿梭载体(pECBS1-H6-DnaE-bFGF)的构建方法如下:通过Thermo Fisher Scientific合成了一个编码EcoRI-lac-operator(LacO)-核糖体结合位点(RBS)-T7启动子(T7)-6x-His标签(H6)-Asp-DnaE int-c(DnaE)-bFGF-XbaI序列的DNA片段,如SEQ ID NO:5所示。用EcoRI和XbaI消化前述合成的DNA片段,然后用同样的两种限制性内切酶消化枯草杆菌/大肠杆菌穿梭载体pECBS1连接。最终获得pECBS1-H6-DnaE-bFGF构建体(参见图1)。所获得的构建体的酶切鉴定结果如图7所示。
枯草芽孢杆菌的转化
枯草芽孢杆菌菌株W800在25mL LB培养基中于37℃培养直到OD600=1,然后在室温下通过高速离心收集W800,并弃去培养上清液。将W800重悬于25mL基本培养基A(3.8mM(NH4)2SO4、0.03mM组氨酸,0.06mM色氨酸,20mM K2HPO4、11mM KH2PO4、0.02mM酪蛋白氨基酸、0.1%酵母提取物、1mM柠檬酸钠、0.5%葡萄糖、1mM MgSO4)并在37℃下生长直至OD600=3,然后将10mL W800继代培养到90mL基本培养基B(3.8mM(NH4)2SO4、0.03mM组氨酸、0.06mM色氨酸、20mM K2HPO4、11mM KH2PO4、0.02mM酪蛋白氨基酸、0.1%酵母提取物、1mM柠檬酸钠、0.5%葡萄糖、1mM MgSO4、0.5mM CaCl2、0.5mM MgCl2)并在37℃下生长直到OD600=1。将5mMEGTA添加到培养基中,并继续培养10分钟。然后在室温下通过高速离心收集W800,并将其重悬于5mL培养物上清液中。将从大肠杆菌中提取的100μl质粒DNA加入0.5mL感受态W800,并在37℃下继续生长2小时。转化的W800涂布在抗性平板上。
实施例2:bFGF的表达
摇瓶培养
枯草芽孢杆菌转化子在添加25μg/ml卡那霉素的200ml 2x LB培养基中于37℃(250rpm)生长[15]。当A600值达到1.0时,添加最终浓度为0.2mM IPTG,随后每3小时间隔收集1ml培养样品用于bFGF表达分析。将细胞沉淀重悬于200μl重悬缓冲液(50mM Tris-Cl,200mM EDTA,pH 8.0)中,然后在冰上孵育5分钟。然后将混合物在37℃下用120μl溶菌酶溶液(10mg/mL)处理20分钟。然后加入80μl裂解缓冲液(10mM EDTA,10%Triton X-100和50mMTris-Cl,pH 8.0)。将装有溶液的试管轻轻倒置,然后以14,800rpm离心5分钟。通过蛋白质印迹分析细胞裂解物样品的bFGF蛋白的表达情况。
为了成功表达可溶性bFGF蛋白,发明人还通过实验检测了不同内含肽和外源多肽的组合,最终发现Asp DnaE内含肽是有益的。选择将bFGF融合到Asp DnaE内含肽C末端,因为在DnaE的C端的体外切割可通过pH改变或还原剂处理来控制。此外,发明人尝试了几种不同的表达标签,包括GST、几丁质结合结构域(CBD)和H6亲和标签。采用前两种表达标签,构建体仅产生不溶形式的前体(参见图8和图9),而采用尺寸相对较小的H6标签,实验结果给出了成熟且生物学上相同的bFGF的阳性表达结果(具体参见表1)。摇瓶培养实验的结果表明(参见图2):构建体pECBS1-H6-DnaE-bFGF在诱导下表达的最终产物bFGF的水平令人满意,而从蛋白质印迹中未检测到前体形式(参见图8和图9)。
表1:通过液相色谱-质谱联用分析纯化的bFGF。
a.胰蛋白酶部分消化纯化的bFGF之后,通过Mascot搜索引擎识别N端和C端序列
b.肽的理论质荷比
c.肽的实验质荷比
分批补料发酵
枯草芽孢杆菌转化子在添加了25μg/ml卡那霉素的200ml 2x LB培养基中,37℃(转速250rpm)下生长,直到A600=1.0。然后将50ml培养物转移到2L烧瓶中(含有添加了25μg/ml卡那霉素的450ml 2x LB培养基,在温度为37℃(旋转250rpm)条件下继续培养,直到A600值达到1.0。将整个培养物接种到装有添加了25μg/ml卡那霉素的3.5L 2x LB培养基的5L发酵罐中,添加1M NaOH使培养物的pH保持在7.0。培养物中的pO2值(氧分压)设置为1.5vvm。此外,当pH开始升高时,添加50%的葡萄糖进料溶液以将培养物的pH维持在7.0。当A600=8时,随后加入最终浓度为0.2mM IPTG进行诱导培养。用1M H2SO4维持pH调节。以2小时的间隔收集培养物样品用于bFGF表达的分析。
结果表明:枯草芽孢杆菌的bFGF蛋白表达量和细胞量均显著增加。具体而言,从摇瓶培养(图3)到大规模培养(图4),bFGF蛋白总产量和表达构建体的最终菌落形成单位(CFU)分别提高了2倍(从64mg/L增加到113mg/L)和6倍。由此可见,本发明获得的构建体在摇瓶培养和大规模的发酵培养中均获得预料不到的技术效果。
实施例3:bFGF蛋白的纯化和结构测定
阳离子交换色谱和肝素-琼脂糖色谱被用于纯化bFGF。首先,利用NanodropMicrovolume分光光度计测量洗脱级分的蛋白质浓度。此外,合并具有显著性意义读数(约1mg/ml)的洗脱级分,并用0.1x PB进行透析。之后,用考马斯亮蓝R-250染色的10%SDS-PAGE凝胶电泳获得纯化的bFGF条带。将SDS-PAGE凝胶中含有bFGF蛋白的条带回收,用于后续通过LC-MS进行分析。
蛋白印迹的分析结果表明:从裂解液中提取的可溶性bFGF蛋白与从ThermofisherScientific购买的bFGF蛋白具有相同的分子量(图4)。纯化的bFGF蛋白样品经LC-MS进行N末端和C末端蛋白测序和和MALDI-TOF质量测定。结果表明:从H6-DnaE-bFGF构建体表达中获得的bFGF蛋白最终产物具有146个氨基酸的生物结构(表1),大小为16.4kda(图5),与天然人bFGF蛋白一致。与仅采用肝素-琼脂糖色谱进行纯化(图10)相比,本发明采用阳离子交换色谱和肝素-琼脂糖色谱进行纯化获得了高纯度的bFGF蛋白。
实施例4:bFGF蛋白的生物学活性检测
通过MTT法(又称MTT比色法)检测纯化的bFGF蛋白对NIH/3T3成纤维细胞增殖的影响。具体步骤如下:将NIH/3T3细胞(密度为2×104细胞)接种于96孔板中,在37℃、5%CO2、添加1.5%胎牛血清的DMEM培养基中饥饿培养24小时,然后用不同浓度的bFGF处理细胞3天。将最终浓度为0.5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)添加到孔板的每个孔中,并在37℃、5%CO2下孵育4h。然后将所有溶液从板孔中去除,加入150μl DMSO溶解紫色晶体。平板在黑暗中持续摇晃10分钟,并在570nm处用酶标仪读取吸光度。
结果表明:在枯草芽孢杆菌中表达的纯化bFGF蛋白能够诱导NIH/3T3细胞的细胞增殖(图6),也能够诱导人间充质干细胞增殖(数据未显示)。由此可见,本发明获得的纯化bFGF蛋白具有生物学活性(促有丝***活性)。
以上结果表明,本发明纯化的bFGF蛋白具有与野生蛋白相同的146个氨基酸的一级序列,为成熟可溶性的蛋白形式,而且在诱导NIH/3T3细胞增殖方面具有很高的生物学活性。此外,发明人同时尝试了不同规模的发酵培养,在bFGF蛋白表达量和细胞量方面均获得预料不到的技术效果。
本领域技术人员将进一步认识到,在不脱离其精神或中心特征的情况下,本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案,应该理解的是,其他变化被认为是在本发明的范围内。因此,本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反,应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
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序列表
<110> 梦芊科技知识产权有限公司
<120> 利用枯草芽孢杆菌和核酸内切酶制备人碱性成纤维细胞生长因子
<130> GWWD1191078ID
<141> 2020-03-10
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aaaaatgcat catcaccatc accacatgat taaaattgcg agccgcaaat ttctgggcgt 180
ggaaaacgtg tatgatattg gcgtgcgccg cgatcataac ttttttatta aaaacggcct 240
gattgcgagc aacccagcct tgccagagga tggcggcagc ggcgccttcc cgccaggcca 300
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tatccttttt cttccaatgt ctgctaagag ctaataataa tctaga 706
Claims (13)
1.一种核酸构建体,其包含***物,所述***物从5’端到3’端包含编码短肽亲和标签、来源于鱼腥藻属(Anabaena sp.)的反式剪接内含肽、以及外源多肽的多核甘酸序列,其中所述短肽亲和标签作为所述反式剪接内含肽的N-端外显肽,并且所述外源多肽作为所述反式剪接内含肽的C-端外显肽。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体,其中所述内含肽为鱼腥藻属DNA聚合酶III单元的内含肽(Asp DnaE)。
3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体,其中所述内含肽包含与SEQ ID NO:2具有至少75%序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的核酸构建体,其中所述内含肽由SEQ ID NO:2所示的序列组成。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸构建体,其中所述外源多肽是成纤维细胞生长因子(FGF),例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),尤其是人bFGF。
6.根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体,其中所述短肽亲和标签具有约4-15个氨基酸的长度,例如是5-15x His标签,尤其是6x His标签。
7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸构建体,其进一步包含以下元件的一种或多种:启动子、操纵子、增强子和核糖体结合位点。
8.根据权利要求1-7任一项所述的核酸构建体,从5’端到3’端,包含编码乳糖操纵子-核糖体结合位点(RBS)-T7启动子-6x His标签-Asp DnaE内含肽-bFGF的核苷酸序列。
9.根据权利要求1-8任一项所述的核酸构建体,其进一步包含位于所述***物上游的第一克隆位点和位于所述***物下游的第二克隆位点,其中所述第一克隆位点和第二克隆位点允许所述核酸构建体***表达载体。
10.一种表达载体,其包含权利要求1-9任一项所述的核酸构建体。
11.一种转化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其包含权利要求10所述的表达载体。
12.一种产生外源多肽的方法,其包括在允许所述外源多肽表达的条件下培养权利要求11所述的转化的枯草芽孢杆菌。
13.根据权利要求12所述的产生外源多肽的方法,其进一步包括分离经培养的所述枯草芽孢杆菌并使其裂解以获得细胞裂解液,然后通过顺序采用阳离子交换色谱法和肝素-琼脂糖(HA)色谱从所述细胞裂解液纯化所述外源多肽。
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