CN110408562B

CN110408562B - 一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂的制备方法及应用

Info

Publication number: CN110408562B
Application number: CN201910627755.7A
Authority: CN
Inventors: 陈晨; 赵启明; 徐希辉; 陈静; 陈亚华; 夏妍; 沈振国
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110408562A

Abstract

本发明涉及一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂的制备方法及应用，首先在原位污染土壤中利用堆肥将所制备的复合微生物菌肥添加至土壤中，种植植物，通过常规培养，浇水、保湿，利用促生菌的促生特性和有机肥的营养物质促进植物生长以及产有机酸特性活化污染土壤中镉从而强化植物高效积累污染土壤镉，利用植物‑微生物的互作作用，充分发挥植物和微生物修复技术的优势，改善单一植物修复中修复效率较低、植株生物量小、修复周期较长等缺点，增加菌剂在土壤中的效用，达到修复土壤镉污染的目的。

Description

一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂的制备方法及应用

技术领域

本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂的制备方法和应用。

背景技术

重金属污染问题日益严重，来自各种工业流程中的污染物中有着大量的重金属，通过食物链的富集放大作用危害人体的健康。自20世纪90年代以来，我国的工业化和城市化发展给土壤安全和农业生产带来了巨大的压力来自各种工业流程中的污染物中有着大量的重金属。土壤中的重金属浓度越来越高，极大的污染了自然土壤生态***，并改变了或者破坏了土壤质地，降低了土壤肥力和养分。现如今土壤重金属污染已经成为了世界性的环境问题，由于土壤重金属污染其生物积累性，持久性和高毒性，修复土壤重金属污染一直为国内外所研究的热点。

植物修复法对于修复污染土壤是一种经济有效且环保的重金属污染修复方法，可以利用与重金属污染土壤的修复。利用微生物与植物联合修复的方法，将微生物的活化作用和促生作用结合在重金属积累植物上。此外利用有机肥丰富的有机质和养分，在为微生物创造良好的生长环境的同时，也达到修复土壤重金属污染的目的。

发明内容

本发明的目的是针对现存微生物修复技术的不足，提供一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂。

本发明的另一目的是提供一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂的制备方法。

本发明的又一目的是提供修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂的应用。

本发明的目的可以通过以下的技术方案来实现：

一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂，其特征在于，所述的复合微生物菌剂含有泛菌属菌株Pantoea sp.PGP6及芽孢杆菌属菌株Bacillus sp.PGP5，其中Bacillus sp.PGP5、Pantoea sp.PGP6均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期分别为2018年10月19日、2019年5月27日，菌种保藏号分别为CCTCC NO：M2018695、CCTCC NO：M2019398。

通过传统的摇瓶液体发酵共同培养Bacillus sp.PGP5(菌种保藏号CCTCC NO：M2018695)、Pantoea sp.PGP6(CCTCC NO：M2019398)可制备液体复合微生物菌剂。具体步骤为：将两株目标菌株Bacillus sp.PGP5、Pantoea sp.PGP6分别按照百分之一的接菌量一同加入液体LB培养基中，活化18-20h，按接种量1％v/v接入pH＝8的LB培养基并于25℃，250pm/min摇床培养24h，8000rpm离心，用无菌水清洗三次后将悬浮液OD值调至OD600＝1，即得液体复合菌剂。

该复合微生物菌剂可以为固体制剂，菌种保藏号分别为CCTCC NO：M2018695、CCTCC NO：M2019398的两株菌株的总有效活菌数为10⁹个每克以上。制备过程为：通过传统的摇瓶液体发酵共同培养Bacillus sp.PGP5、Pantoea sp.PGP6以制得复合微生物液体菌剂；使用冷冻干燥技术，将所制得的复合微生物液体菌剂制备成固体菌粉，即得到固体菌剂(含量大于10⁹CFU/g)。将固体菌粉放入玛瑙研钵中磨碎，并均匀混入草木灰有机肥，获得菌肥，混合比例为固体菌粉：有机肥＝1：1000(m：m，m为质量)。施用时，将菌肥按照与土壤比例1：50(v/v)的配比进行施肥。

一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂的应用，具体步骤为：在原位污染土壤种植植物，并在种植前在土壤中接种前述的一种强化植物修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌剂，利用复合微生物菌剂强化植物修复镉污染土壤并促进植物生长。所述植物为镉积累植物龙葵；植物的制备和种植过程为：龙葵种子用0.5％的次氯酸钠消毒20-30min，均匀撒在灭菌蛭石上，待种子露白后浇Hoagland营养液，待长至四叶一心时，移苗至原位污染土壤中。所述的原位污染土壤从南京栖霞山铅锌矿区采集获得，其土壤为铅、锌、镉复合污染土壤，其中土壤重金属含量为：Pb：201.69mg/Kg、Zn：421.79mg/Kg、Cd:3.82mg/Kg。

植物根际细菌PGP5是从中国湖北房县铅锌污染矿区植物根际土壤中分离得到，经鉴定为芽孢杆菌属。主要生物学特性为观察到菌落在培养基上生长良好，单个菌落圆形，干燥，边缘整齐，白色，不透明，革兰氏阳性，有芽孢，无鞭毛。生物学实验中甲基红反应，淀粉水解，明胶水解，脲酶活性，H₂S产生实验，接触酶反应均呈阳性反应，且能够利用柠檬酸盐，但VP实验为阴性，综合鉴定菌株为芽孢杆菌属；植物根际细菌PGP6是从南京市栖霞区锰矿新村矿区植物根际土壤分离得到，经鉴定为泛菌属。主要生物学特性为观察到菌落在培养基上生长良号，单个菌落圆形，湿润，边缘整齐，黄色，透明，革兰氏阳性。生物学实验中，淀粉水解，H₂S产生实验，接触酶实验呈阳性反应，但是甲基红反应，VP实验为阴性，综合鉴定为泛菌属。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：PGP6对龙葵的生物量与未处理组相比有着显著的增加，同时PGP5对龙葵的镉积累量尤其是地下部提升效果明显。这也与前文研究的微生物的促生性和产酸性的效果一致。复合菌剂PGP5、PGP6与有机肥草木灰制备的微生物菌肥，并对镉积累植物龙葵进行堆肥处理，探索其对龙葵的生物量、镉积累量的影响。结果表明了在菌肥处理下，与未处理组相比镉的积累量有着增加的趋势，但是差异不显著，而镉含量明显增加，因此推测是菌肥能够有效的活化植物根系富集的镉，使得在菌肥处理下的龙葵镉含量明显增加。对于株高，可以看出菌肥处理下的龙葵与未处理组相比显著增加约1.38倍。此外，对于地上部的鲜重，菌肥处理下与未处理组相比同样增加2.48倍，对于地上部干重，与未处理组相比菌肥处理下增加约2.15倍，并且达到了显著水平，表明菌肥能够有效的增加地上部的生物量。同时，分析在菌肥，微生物菌剂处理下的土壤有效态可以看出，与未处理组相比土壤中镉的有效态显著增加，同时可以观察到复合菌剂和有机肥处理并未显著增加，表明了菌肥将复合菌剂和有机肥结合能够更加有效的发挥微生物在土壤中的活化作用和对植物的促生作用。同时菌肥处理下龙葵镉积累量较复合菌剂显著增加，且与单一菌株和有机肥处理差异显著。总之，本发明使得植物与微生物共同作用，有机肥加入使得微生物的养分更加充足，使得微生物能够有效地在土壤中生长。利用土壤一微生物植物的共存关系，充分发挥植物和微生物修复各自的优势，取长补短，可以起到克服植物修复周期长的缺点，从而提高植物修复效率，达到彻底修复土壤重金属污染的目的。因此，选用植物-微生物联合应用于重金属污染土壤治理领域，使这两种修复技术能够最大程度展现联合优势，在土壤重金属修复领域具有更大的修复潜力。

附图说明

图1为本发明的芽孢杆菌属PGP5在缺氮培养基上生长情况示意图；

Bacillus sp.PGP5保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期为2018年10月19日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018695，分类命名为Bacillus sp.PGP5。

Pantoea sp.PGP6保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期为2019年5月27日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2019398，分类命名为Pantoea sp.PGP6。

具体实施方式

以下所用的菌株是泛菌属PGP6与芽孢杆菌属PGP5。

本发明的复合微生物制剂的制备方法如下：两株目标菌株按照百分之一的接菌量一同加入液体LB培养基中，活化18-20h，按接种量1％(v/v)接入pH＝8的LB培养基于25℃，250pm摇床培养24h，8000rpm离心，用无菌水清洗三次后将悬浮液OD值调至OD600＝1，即得液体复合菌剂，有效活菌总数为9.154亿个/毫升。利用冷冻干燥技术奖复合菌剂制备固体菌粉，菌粉放入玛瑙研钵中磨碎，并均匀混入草木灰有机肥，获得菌肥，混合比例为固体菌粉：有机肥＝1：1000(m：m)。施用时，将菌肥按照与土壤比例1：50(v/v)的配比进行施肥。

实施例1芽孢杆菌PGP5，泛菌PGP6的筛选、鉴定及生物学特征(结果详见表1、表2、表3)

1)Bacillus sp.PGP5，Pantoea sp.PGP6均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期分别为2018年10月19日，2019年5月27日。菌种保藏号分别为CCTCC NO：M2018695；CCTCC NO：M2019398。

2)菌株筛选：取采集的植物根系土壤样品10g，放入含90mL无菌水的锥形瓶内，摇床中振荡20min，静置20-30s，制成菌悬液。无菌条件下取1mL菌悬液放入盛9mL无菌水试管中，混合匀均，依次用无菌水稀释制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6各种浓度稀释液。

取0.1mL上述浓度的稀释液分别涂布于富集培养基上，每个浓度分别设置三个重复。30℃倒置培养24h-36h，挑取不同形态的单菌落，经多次划线进行纯化。

3)耐镉性筛选：将经过多次划线分离纯化完全的菌株接种于耐镉培养基平板上，其中镉的浓度分别为0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1(单位为mM)。对菌株进行耐镉性的筛选。

菌株单菌落接入新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化16h，6000rpm离心6min，弃上清，收集菌体沉淀，加入无菌水振荡摇匀。调节菌悬液OD＝1.0，按5％的接菌量将菌液接入实验体系。实验体系为含20mL牛肉膏蛋白胨的50mL三角瓶，依次加入不同浓度的Cd溶液，每个浓度设置三个重复。Cd的浓度梯度为(mM)0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.2，1.5，不接菌的培养基为空白，以未加入Cd培养液为对照。30℃，150rpm培养24h后测定波长600处的吸光值。

表1为芽孢杆菌PGP5、泛菌属PGP6、复合菌剂6-A5对镉的耐受浓度研究，可见PGP5、泛菌属PGP6、复合菌剂6-A5均对镉耐受。

4)IAA产生实验：将色氨酸配成2.5mg·mL^–1的溶液，避光过滤除菌。将有氮液体培养基分装与于15cm×15mm的玻璃试管中，每管4mL，121℃高压蒸汽灭菌，冷却后，加入过滤除菌的色氨酸溶液1mL，使色氨酸的浓度为0.5mg·mL^–1。挑取纯化后的菌株接种于上述培养液中，摇床培养3d，用无菌枪头取出置于灭菌的10mL离心管中，6000r/min离心10min，用无菌枪头取出1ml上清液加50μL 10mM的正磷酸，并加入2mL的Sackowki^′s显色剂(250mL去离子水﹢150mL浓硫酸﹢7.5mL 0.5mol·L^–1的FeCl₃·6H₂O)充分混合，室温黑暗处显色30min，出现粉红色为阳性，说明有IAA产生。采用Salkowski^′s比色法测可定性测定菌株利用色氨酸产IAA的能力。暗处反应后取出立即用分光光度计测定530nm波长处的吸光值。以不接菌的培养基做对照调零。结果表明，PGP5和PGP6菌株均能产生IAA(表2)，其产量分别为52.92mg/L和45.06mg/L。

5)固氮能力检测：用灭菌的牙签将分离得到的细菌接种于低氮培养基中，28℃培养7d，转接三次观察是否生长，结果表明PGP5在缺氮培养基上生长良好(详见图1)。经验证PGP6菌株不具有固氮能力(表2)。

6)有机酸种类及含量测定

初筛：将具有镉耐性的菌株点接于含碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基。30℃恒温倒置培养36h观察各菌株周围是否出现透明圈，对产透明圈菌株进行复筛。

复筛：将初筛菌株按1％接种量接入含YN液体培养基的锥形瓶中，并设置三个重复。将三角瓶置于30℃摇床上，在150rpm转速下，培养56h-72h。8000rpm离心10min，用pH值测定仪测定这些菌株悬浮液的pH值。

选取可以产酸的菌株进一步培养，菌株在含不同Cd浓度的YN液体培养基中培养48h后4℃，6000rpm离心10min，上清液过阳离子树脂(Amberli te IR-120)去除重金属离子，过0.22μm的无菌水系滤膜，滤液于4℃保存，待测。同时收集离心菌体沉淀，烘干称重备用。

有机酸标曲的制备：准确称取草酸100mg、酒石酸100mg、苹果酸100mg、柠檬酸100mg、琥珀酸100mg、乳酸100mg、甲酸500mg、乙酸500mg，加超纯水定容至100mL得有机酸混合母液。取0、5、10、15、20和25mL母液，加水定容至50mL为梯度标准液，4度保存备用。有机酸的浓度用高效液相色谱仪测定，波长214mm，分离柱型号为C18Agilent Zorbax SB-AQ(4.6x250mm)5μm column，流动相为含甲醇的20mM KH2PO4(pH 2.60)缓冲液(KH₂PO₄:甲醇＝99:1)，流速为0.8mL/min，进样量20μL。

在复合菌剂6-A5中，苹果酸没有明显的变化趋势。PGP6在LD₂₅时只产生苹果酸和琥珀酸，而在复合了高效产酸菌A5后，复合菌剂6-A5在不同镉浓度处理后，除了乙酸和柠檬酸外，其他有机酸均在LD₂₅有所产生，这表明复合菌剂能够有效的增加有机酸的种类和产量。酒石酸在随着镉胁迫的浓度增高而增高，与单一菌株PGP6相比酒石酸的含量大幅增加，表明复合菌剂能够有效的提升有机酸的产量。复合菌剂6-A5在LD₂₅，LD₅₀均未产生乙酸，但是在MIC时产生了少量的乙酸，表明了菌株在镉胁迫的环境下能够刺激某些有机酸的合成(详见表3)。

7)ACC脱氨酶活性测定

将菌株接入新鲜的YN培养基中进行活化，过夜培养约16h后，按5％接种量接种至50ml锥形瓶中，比例为DF:YN＝20:1，摇床培养24h后将DF培养液中的菌株接种到ADF固体培养基上，28℃培养箱培养7天观察菌落生长情况(表2)。从表2可知，PGP6菌株具有ACC脱氨酶活性。

8)菌株鉴定：

通过16S rDNA序列分析法鉴定菌种，PCR扩增采用16S rDNA通用引物：

PCR扩增采用16S rDNA通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.1)

1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.2)

PCR反应体系(25μL)：Mix12.5μL、引物F 1μL、引物R1μL、基因组DNA 2μL、无菌水8.5μL。反应条件94℃预变性5min，94℃变形15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃充分延伸10min。扩增产物送南京金唯智生物技术有限公司测序。测序结果经NCBI网站上BLAST进行碱基序列比对，比对结果与芽孢杆菌和泛菌亲缘关系最近，但编码的氨基酸序列不同。植物根际细菌PGP5是从中国湖北房县铅锌污染矿区植物根际土壤中分离得到，经鉴定为芽孢杆菌属。主要生物学特性为观察到菌落在培养基上生长良好，单个菌落圆形，干燥，边缘整齐，白色，不透明，革兰氏阳性，有芽孢，无鞭毛。植物根系促生菌PGP5甲基红反应，淀粉水解，明胶水解，脲酶活性，H₂S产生实验，接触酶反应均呈阳性反应，且能够利用柠檬酸盐，但VP实验为阴性，综合鉴定菌株为芽孢杆菌属；植物根际细菌PGP6是从南京市栖霞区锰矿新村矿区植物根际土壤分离得到，经鉴定为泛菌属。主要生物学特性为观察到菌落在培养基上生长良号，单个菌落圆形，湿润，边缘整齐，黄色，透明，革兰氏阳性。生物学实验中，淀粉水解，H₂S产生实验，接触酶实验呈阳性反应，但是甲基红反应，VP实验为阴性，综合鉴定为泛菌属。

表1芽孢杆菌PGP5、泛菌属PGP6、复合菌剂6-A5对镉的耐受浓度研究

其中6-A5指的是PGP6、PGP5复合菌剂。

表2芽孢杆菌PGP5、泛菌属PGP6的植物促生特性研究

表3复合菌剂6-A5的有机酸测定

实施例2菌肥处理后龙葵的生长及重金属积累情况

将供试复合菌株的单一菌株分别接入LB培养基活化18-20h，按接种量1％(v/v)接入LB培养基于30℃，150rpm摇床培养24h，8000rpm离心，用无菌水清洗三次后将悬浮液OD值调至OD₆₀₀＝1，备用。

菌肥：有机肥经筛选采用草木灰，草木灰的外观为粉状，颜色为黑色，物理性质为不融化，无气味；养分含量N、P、K≥5％；水分质量分数≤30％；酸碱度7.0-7.5。施用方法：草木灰按照与土壤比例2％(v/v)的配比与土壤混合。菌粉放入玛瑙研钵中磨碎，按照10⁹CFU/g/kg(c/v)的比例与有机肥混合后与土壤混合，堆肥过程中要求与土壤搅拌均匀。

通过在南京栖霞山铅锌矿采集重金属复合污染农田土壤，风干磨碎过筛后，装入塑料盆钵，每盆0.8Kg，加水使其含水量为田间持水量的60％，保持2天，龙葵种子和/或土荆芥用0.5％的次氯酸钠消毒20-30min后，均匀撒在灭菌蛭石上，待种子露白后可浇Hogland营养液，待长至四叶一心时，移苗至原位污染土壤中，每盆播入2株苗。接种含节杆菌PGP5的液体生物制剂30-50mL/Kg土壤，分1-2次接种，对照接等量无菌水。植株生长期间每天以称重法加入去离子水，保持土壤湿度为田间持水量的60％，种植30天收苗。将盆钵内植株小心取出，并收集根际土壤，将植株用清水冲洗三遍，用去离子水冲洗三遍已去除植物表明残留的土壤杂质，小心擦干植株表面水分，用剪刀将其地上部地下部相连部位剪断，用带刻度直尺测量其长度并称重，记录数值。植株在105℃下杀青30min，80℃烘干至恒重后称其地上部及根系干重。同时收集植物表面根际土壤，35℃烘干至恒重(表4)。

植物重金属含量测定：烘干的植物样品用玛瑙研钵磨碎混匀，称取植物干样0.2000g置于消煮管中，用HNO₃–HClO₄(V：V＝87：13)混合液消煮，ICP测定Cd含量(表5-6)。

土壤有效态的测定：用pH为4.8的1mol/L的乙酸铵溶液提取有效态重金属。具体为取4g过20目筛的风干土样于100mL锥形瓶中，加入20mL的乙酸铵溶液，在水平摇床上以150rpm/min的速度震荡15min，然后静置10min，用双层定量滤纸过滤，取5ml滤液加入5ml5％的硝酸，混匀。用ICP-OES来测定提取液中重金属Cd的含量(表7)。

结果表明在菌肥处理下，龙葵的根系镉含量明显增加，因此推测是菌肥能够有效的活化植物根系富集的镉，使得在菌肥处理下的龙葵镉含量明显增加。对于株高，可以看出菌肥处理下的龙葵与未处理组相比显著增加约1.38倍。此外，对于地上部的鲜重，菌肥处理下与未处理组相比同样增加2.48倍，对于地上部干重，与未处理组相比菌肥处理下增加约2.15倍，并且达到了显著水平，表明菌肥能够有效的增加地上部的生物量。同时，分析在菌肥，微生物菌剂处理下的土壤有效态可以看出，与未处理组相比土壤中镉的有效态显著增加，同时可以观察到复合菌剂和有机肥处理并未显著增加，表明了菌肥将复合菌剂和有机肥结合能够更加有效的发挥微生物在土壤中的活化作用和对植物的促生作用。

表4龙葵在菌肥处理下生物量变化

其中A5指的是PGP5；6指的是PGP6；6-A5指的是复合菌剂6-A5。

表5龙葵在菌肥处理下镉含量变化

表6龙葵在菌肥处理下镉积累量变化

表7龙葵在菌肥处理后土壤镉有效态变化

附录1

菌株PGP5基因序列

CCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACGAGCAGTTACTCTCGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGCCCATCTGTAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTCAATCATCTCCCATGAAGGAGAAGATCCTATCCGGTATTAGCTTCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCATAGAAGCAAGCTTCTAATCAGTTCGCTCGAC(SEQ ID NO.3)

菌株PGP6基因序列

GGTAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGGAGTCGAGTTGCAGACTCCGATCCGGACTACGACGCACTTTGTGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGCGTTCCCGAAGGCACCAAGGCATCTCTGCCAAGTTCGCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACGAGACTCAAGCCTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCGACGCGGTTATTAACCACATCGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGGGCCATTACCCCGCCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTTCATCCGATAGTGAGAGGCCCGAAGGTCCCCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCCACCGTTTCCAGTGGTTATCCCCCTCTATCGGGCAGATCCCCAGACATTACTCACCCGTCC(SEQ ID NO.4)

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种修复镉污染土壤并促进植物生长的复合微生物菌肥的制备方法及应用

<130> xhx2019071201

<141> 2019-07-12

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1405

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<400> 3

ccttacggtt actccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt 60

gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca 120

gcttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aatggtttta tgggattggc 180

ttgacctcgc ggtcttgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt 240

cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc 300

accttagagt gcccaactaa atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga 360

cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgtc 420

ccccgaaggg gaacgctcta tctctagagt tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt 480

cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540

ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca 600

gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca 660

gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt acagaccaaa 720

aagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga 780

attccgcttt tctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc cacggttgag 840

ccgtgggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgcg cgctttacgc ccaataattc 900

cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt 960

tctggttagg taccgtcaag gtacgagcag ttactctcgt acttgttctt ccctaacaac 1020

agagttttac gacccgaaag ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt 1080

ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc 1140

agtgtggccg atcaccctct caggtcggct atgcatcgtt gccttggtga gccgttacct 1200

caccaactag ctaatgcacc gcgggcccat ctgtaagtga tagccgaaac catctttcaa 1260

tcatctccca tgaaggagaa gatcctatcc ggtattagct tcggtttccc gaagttatcc 1320

cagtcttaca ggcaggttgc ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac gtcatagaag 1380

caagcttcta atcagttcgc tcgac 1405

<210> 4

<211> 1360

<212> DNA

<213> Pantoea

<400> 4

ggtagcgccc tcccgaaggt taagctacct acttcttttg caacccactc ccatggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgtg gcattctgat ccacgattac 120

tagcgattcc gacttcacgg agtcgagttg cagactccga tccggactac gacgcacttt 180

gtgaggtccg cttgctctcg cgaggtcgct tctctttgta tgcgccattg tagcacgtgt 240

gtagccctac tcgtaagggc catgatgact tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttat 300

caccggcagt ctcctttgag ttcccgaccg aatcgctggc aacaaaggat aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatttcac aacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420

tgtctcagcg ttcccgaagg caccaaggca tctctgccaa gttcgctgga tgtcaagagt 480

aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc atttgagttt taaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtc gacttaacgc 600

gttagctccg gaagccactc ctcaagggaa caacctccaa gtcgacatcg tttacggcgt 660

ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctga gcgtcagtct 720

tcgtccaggg ggccgccttc gccaccggta ttcctccaga tctctacgca tttcaccgct 780

acacctggaa ttctaccccc ctctacgaga ctcaagcctg ccagtttcaa atgcagttcc 840

caggttaagc ccggggattt cacatctgac ttaacagacc gcctgcgtgc gctttacgcc 900

cagtaattcc gattaacgct tgcaccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag 960

ccggtgcttc ttctgcgggt aacgtcaatc gacgcggtta ttaaccacat cgccttcctc 1020

cccgctgaaa gtactttaca acccgaaggc cttcttcata cacgcggcat ggctgcatca 1080

ggcttgcgcc cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tggaccgtgt 1140

ctcagttcca gtgtggctgg tcatcctctc agaccagcta gggatcgtcg cctaggtggg 1200

ccattacccc gcctactagc taatcccatc tgggttcatc cgatagtgag aggcccgaag 1260

gtccccctct ttggtcttgc gacgttatgc ggtattagcc accgtttcca gtggttatcc 1320

ccctctatcg ggcagatccc cagacattac tcacccgtcc 1360

Claims

1.一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法，其特征在于，将复合微生物菌剂与草木灰混合后与土壤搅拌均匀；所述的复合微生物菌剂含有泛菌属（Pantoea sp.）菌株PGP6及芽孢杆菌属（Bacillus sp.）菌株PGP5，其中PGP5、PGP6均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期分别为2018年10月19日、2019年5月27日，菌种保藏号分别为CCTCC NO：M2018695、CCTCC NO：M2019398；所述植物为龙葵。

2.根据权利要求1所述一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法，其特征在于，该复合微生物菌剂为液体制剂；菌种保藏号分别为CCTCC NO：M2018695、CCTCC NO：M2019398的两株菌株的总有效活菌数为9.154亿个每毫升以上。

3.根据权利要求1所述一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法，其特征在于，该复合微生物菌剂为固体制剂，菌种保藏号分别为CCTCC NO：M2018695、CCTCC NO：M2019398的两株菌株的总有效活菌数为10⁹个每克以上。

4.根据权利要求2所述的一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法，其特征在于，通过传统的摇瓶液体发酵共同培养PGP5、PGP6以制备复合微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法，其特征在于，将两株目标菌株Bacillus sp.PGP5、Pantoea sp.PGP6分别按照百分之一的接菌量一同加入液体LB培养基中，活化18-20 h，按接种量1 % v/v接入pH=8的LB培养基并于25℃，250pm/min摇床培养24 h，8000 rpm离心，用无菌水清洗三次后将悬浮液OD值调至OD600 = 1，即得液体复合菌剂。

6.根据权利要求3所述的一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法，其特征在于，通过传统的摇瓶液体发酵共同培养PGP5、PGP6以制得复合微生物液体菌剂；使用冷冻干燥技术，将所制得的复合微生物液体菌剂制备成固体菌粉，即得到固体菌剂。

7.根据权利要求6所述的一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法，其特征在于，所述的固体菌粉放入玛瑙研钵中磨碎，并均匀混入草木灰有机肥，获得菌肥，混合比例为固体菌粉：有机肥=1：1000 m：m；施用时，将菌肥按照与土壤比例1：50 v/v的配比进行施肥。

8.一种权利要求1所述修复镉污染土壤并促进植物生长的方法的应用，其特征在于，在原位污染土壤种植植物，将权利要求1所述的复合微生物菌剂与草木灰混合后与土壤搅拌均匀；利用复合微生物菌剂和草木灰强化植物修复镉污染土壤并促进植物生长；所述植物为镉积累植物龙葵；植物的制备和种植过程为：龙葵种子用0.5%的次氯酸钠消毒20-30min，均匀撒在灭菌蛭石上，待种子露白后浇Hoagland营养液，待长至四叶一心时，移苗至原位污染土壤中。

9.根据权利要求8所述的一种修复镉污染土壤并促进植物生长的方法的应用，其特征在于，所述的原位污染土壤为铅、锌、镉复合污染土壤。