CN111235014B - 一种培养皿及利用其快速检验抑菌物质抑菌能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种培养皿及利用其快速检验抑菌物质抑菌能力的方法。具体技术方案为：一种培养皿，包括皿板，皿板周围向上延伸形成侧壁、构成容纳内容物的空间，空间内由隔板分为数个互不连通的培养区间；隔板高度为皿板侧壁高度的1/2～4/5；培养皿还包括皿盖，皿盖高度为皿板侧壁高度的1.3～2倍；皿盖盖住皿板时，与皿板侧壁间隙配合，皿盖远离皿板一侧底面贯穿设置带密封盖的开口，开口与中空的移液管间隙配合，移液管可将皿板的内容物在不同区间之间进行转移。本发明提供了一种全新的培养皿，可实现在相同试验条件下、在同一培养皿内进行多组对照试验；还可实现无揭盖便捷操作，极大降低了操作中的污染可能性。

Description

一种培养皿及利用其快速检验抑菌物质抑菌能力的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种培养皿及利用其快速检验抑菌物质抑菌能力的方法。

背景技术

细胞培养皿是实验室常用器皿，通常由皿板和皿盖两部分构成。具体操作时，先将接种物接种到皿板上，再将皿盖盖上，进行培养。现有的培养皿存在如下缺陷：单次培养基用量较大；在单个培养皿不同区域接种不同的接种物以形成对照时，各接种物间可能发生信息交流，存在污染的可能性。另外，现有培养皿在接种完成后，如果需要进行后续操作，则只能揭开皿盖进行，该步骤虽然在无菌台等无菌环境中进行，但仍然存在较大的污染的可能性。因此，提供一种克服上述缺陷的培养皿，将极大便利细胞/细菌实验。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养皿及利用其快速检验抑菌物质抑菌能力的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种培养皿，包括透明材质制备的培养皿皿板，所述皿板周围向上延伸形成侧壁、构成容纳内容物的空间，所述空间内由隔板分为数个互不连通的培养区间；所述隔板高度为皿板侧壁高度的1/2～4/5；

所述培养皿包括透明材质制备的、可盖住皿板的皿盖，皿盖高度为皿板侧壁高度的1.3～2倍；所述皿盖呈秃宝盖形，内部空腔形状与皿板适配，所述皿盖盖住皿板时，与皿板侧壁间隙配合，所述皿盖远离皿板一侧底面贯穿设置带密封盖的开口，所述开口与中空的移液管间隙配合，所述移液管可将皿板的内容物在不同区间之间进行转移。

优选的，所述隔板在皿板内部对称设置，各所述隔板在皿板中央汇合，形成隔离柱。

优选的，所述皿盖盖住皿板时，皿盖上设置的开口位于隔离柱正上方。

优选的，所述移液管包括穿过皿盖开口的贯穿部，所述贯穿部为弹性材质，所述贯穿部下方固接可直接与皿板内容物接触的吸取部；

当移液管穿过开口时，所述贯穿部的中心轴与皿板侧壁平行，所述吸取部相对于皿板侧壁倾斜，倾斜角度为可保证吸取部吸取到皿板各区间内容物的角度。

优选的，所述移液管的贯穿部外管壁上固接限位块，所述限位块与贯穿部对应部位的宽度之和大于皿盖上开口直径；所述皿盖上对应贯穿设置可供限位块通过的限位槽，所述限位槽由可开合的密封盖封闭。

优选的，所述移液管贯穿部的悬端与旋转钮可拆卸连接，所述旋转钮直径大于皿盖上的开口。

优选的，所述旋转钮与限位块间的间距大于吸取部悬端到皿板内容物表面间的最大距离。

优选的，所述旋转钮与限位块之间、所述贯穿部侧壁上，贯穿设置带密封盖的进液口。

相应的，一种检验抑菌蛋白抑菌能力的方法，利用所述培养皿进行检验，包括如下步骤：

(1)将所述抑菌蛋白的基因转入待抑制的细菌中；

(2)向所述培养皿皿板的各区间内分别加入适合步骤(1)所述细菌生长的培养基，其中至少包括1个液体培养基和1个固体培养基；

(3)向皿板的所述装有液体培养基的区间内接种步骤(1)所述细菌，摇床培养；

(4)利用移液管向已含有细菌的液体培养基中加入抑菌蛋白诱导表达剂，摇床培养；

(5)使用移液管，吸取步骤(4)液体培养基内的内容物，分别接种至皿板其它区间的固体培养基上，继续培养；

(6)观察各区间固体培养基上细菌的生长情况。

优选的，在细菌生长对数期时进行步骤(4)。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种全新的培养皿，通过对培养皿的分区设计，可以实现在相同试验条件下、在同一培养皿内进行多组对照试验。通过移液管和皿盖的配合设计，实现了无揭盖便捷操作，极大降低了操作中的污染可能性。

2、采用本发明提供的培养皿和方法验证抑菌蛋白的抑菌效果，极大地节省了原材料：使用既往一个培养皿的原材料即可完成整个验证试验。且操作方便，旋转移液管即可操作；污染风险低，在试验过程中无需频繁揭开培养皿进行操作。同时，本发明极大地缩短了试验时间，一般验证物质是否具有抑菌活性的思路为：将该物质的基因转入某个细菌中，诱导表达该物质，将该物质分离提纯后，再单独使用该物质进行抑菌试验。而本发明将表达和验证结合起来，节省了试验时间和操作环节。本发明还可以节省试验空间，并最大可能地保证试验条件的统一性。另外，如果抑菌蛋白具有抑菌活性，那么细菌在试验过程中即已死亡或者处于低活性状态，后续的无害化处理难度也极大降低。

附图说明

图1为本发明培养皿结构示意图；

图2为图1的A-A视图；

图3为含pET32a质粒的大肠杆菌生长情况示意图；

图4为含pET32a-BNBD4重组质粒的大肠杆菌生长情况示意图。

具体实施方式

如图1、2所示的，一种培养皿，包括透明材质制备的培养皿皿板10。所述皿板10一般为透明的玻璃材质或塑料材质，成本低，且便于清洗、消毒和观察。所述皿板10周围向上延伸形成侧壁、构成容纳内容物的空间。所述空间内由隔板11分为数个互不连通的培养区间；所述隔板11高度为皿板10侧壁高度的1/2～4/5。优选的方案为：所述隔板11在皿板10内部对称设置，各所述隔板11在皿板10中央汇合，形成隔离柱12。所述皿板10呈底部平坦、向上开口的碗状。如图2所示，以皿板10中设置6块隔板11为例，皿板10内设置6块隔板11和一个位于皿板10中央的隔离柱12。在隔板11和隔离柱12的作用下，皿板10内分为相互独立、互不连通的6个区间。向皿板10中装内容物时，应当注意内容物不要装太满。尤其是盛放液体内容物时，为避免摇床培养或培养皿移动时，液体振荡、跨越隔板11进入其它区间，其盛放量不能超过各区间体积的4/5，优选盛放体积为对应区间体积的1/2～2/3。

所述培养皿还包括透明材质制备的、可盖住皿板10的皿盖20，所述皿盖20材质与皿板10材质保持一致。所述皿盖20高度为皿板10侧壁高度的1.3～2倍。所述皿盖20整体呈秃宝盖形，内部空腔形状与皿板10适配，所述皿盖20盖住皿板10时，与皿板10侧壁间隙配合。应当理解的是，如图1所示，从宽度来说，所述皿盖20刚好可以盖住皿板10；从高度来说，所述皿盖20盖住皿板10后，皿板10与皿盖20间还留有一定的操作空间，该空间由皿板10与皿盖20侧壁间的高度差提供。

所述皿盖20远离皿板10一侧底面贯穿设置带密封盖的开口(图中未示意出密封盖)，该开口供移液管30进出。所述开口与中空的移液管30间隙配合，所述移液管30可将皿板10的内容物在不同区间之间进行转移。优选的方案为：所述隔板11对称设置时，所述皿盖20盖住皿板10后，皿盖20上设置的开口刚好位于隔离柱12正上方。

在无需进行培养皿内各区间的内容物相互移动时，可以直接使用密封盖封住皿盖20上的开口，在适宜条件下进行培养即可，使用方法与普通培养皿相同。当需要进行内容物移动时，开启密封盖，移液管30从开口处***皿盖20与皿板10间预留的操作空间内。因移液管30与开口间隙配合，故移液管30可以在开口内进行自转和上下位移。操作员控制移液管30转至所需移动的内容物上方，进行取液，再旋转移液管30至需要接种处的区间即可。

如果将移液管30设置为笔直的结构，虽然移液管30一般为有一定韧性的软性材质(例如PVC)，工作部分可以发生一定程度的弯曲和倾斜，以进行取液、移液和接种等工作。但这种方式存在操作难度，而且移液管30发生倾斜或变形时，也增加了菌污染的风险。因此，更优选的方案为：所述移液管30由贯穿部35和吸取部34两部分组合而成。工作时，所述贯穿部35穿过皿盖20开口，所述贯穿部35为弹性材质(例如橡胶)；所述贯穿部35下方固接可以直接与皿板10内容物接触的吸取部34。需要说明的是，上述说法只是为了便于描述，并非指移液管30在结构上实际分为相互独立贯穿部35与吸取部34这两个部分。事实上，为了避免漏液、便于工作，贯穿部35和吸取部34为一体成型的一个整体。

当移液管30穿过皿盖20上的开口时，所述贯穿部35的中心轴与皿板10侧壁平行，所述吸取部34相对于皿板10侧壁倾斜，倾斜角度为可保证吸取部34吸取到皿板10各区间内容物的角度。还需要注意，倾斜角度不易过大，以免增加将移液管30从皿盖20上取出的难度；倾斜角度优选为30～45°。

在这种设置方式下，转动贯穿部35位于皿盖20外侧的部分，即可轻松将吸取部34转动到皿板10对应的区间上方；再将贯穿部35向下移动至吸取部34与区间内的内容物接触，然后挤压或放松贯穿部35，即可完成内容物的吸取或释放。

更优选的方案为：所述移液管30的贯穿部35外管壁上固接限位块33，所述限位块33与贯穿部35对应部位的宽度之和大于皿盖20上开口直径。所述皿盖20上对应贯穿设置可供限位块33通过限位槽(图中未示出)，所述限位槽由可开合的密封盖封闭。在这种设置方式下，整个培养和转移内容物的过程中均无需揭开皿盖20，也无需开合皿盖20上放置移液管30的开口。在皿板10对应区间内灌装好对应的内容物后，盖上皿盖20、安装好移液管30(或盖上已安装有移液管30的皿盖20)，即可开始试验。优选的操作方式为，先将移液管30安装到皿盖20上，再一并进行消毒，避免消毒后再安装移液管30而带来的污染风险。

此时，移液管30在限位块33的作用下，固定限位在皿盖20上，盖住皿盖20上的开口；移液管30的吸取部34悬空、不与皿板10各区间内的内容物接触。当需要进行内容物转移时，打开限位槽上的密封盖，旋转移液管30，使限位块33穿过限位槽，从而移液管30可相对于皿盖20进行上下往复运动和自转运动，以实现物质转移。

更优选的方案为：为了便于操作，所述移液管30贯穿部35的悬端(顶端)与旋转钮31可拆卸连接，所述旋转钮31直径大于皿盖20上的开口。操作时，直接旋拧旋转钮31即可。移液管30与旋转钮31可拆卸连接，也可便于移液管30的更换。具体可拆卸连接的方式为成熟的现有技术，例如：旋转钮31底部设置容纳移液管30的孔，移液管30与该孔过盈配合，因为移液管30的贯穿部35为弹性材质，可通过挤压等方式卡入孔中；也可在旋转钮31底部的孔内设置螺纹，贯穿部35与之对应部分也设置对应的螺纹，直接将贯穿部35旋转拧入即可。

所述旋转钮31与限位块33间的间距大于吸取部34悬端到皿板10内容物表面间的最大距离，以保证吸取部34可顺利与内容物接触。

更优选的方案为：所述旋转钮31与限位块33之间、所述贯穿部35侧壁上，贯穿设置带密封盖的进液口32。当需要向培养皿指定区间内添加物质时，可以通过进液口32进行。

本发明还提供了一种基于上述培养皿进行的检验抑菌蛋白抑菌能力的方法，具体包括如下步骤：

(1)将所述抑菌蛋白的基因转入待抑制的细菌中。

(2)向所述培养皿皿板10的各区间内分别加入适合步骤(1)所述细菌生长的培养基，其中至少包括1个液体培养基和1个固体培养基，具体数量根据实际需要进行反应设置。

(3)向皿板10的装有液体培养基的区间内分别接种等量的步骤(1)所述细菌，摇床培养。

(4)向其中一个装有液体培养基的区间内加入抑菌蛋白诱导表达剂，继续摇床培养。

(5)使用移液管30，吸取液体培养基内的内容物，分别接种至皿板10其它区间的固体培养基上，继续培养。

(6)观察各区间固体培养基上细菌的生长情况。如果加入了抑菌蛋白诱导表达剂的组别对应的固体培养基上，细菌没有生长，或生长明显弱于对照组(观察菌落大小等)，则初步证明抑菌蛋白对该细菌有抑菌能力。随后可根据实际试验需要，提取对应液体培养基的内容物，分离纯化抑菌蛋白，进行进一步的其它试验。

上述方法以图2(6个区间)为例，具体包括如下步骤：

(1)将所述抑菌蛋白的基因转入待抑制的细菌中，培养以获得重组菌株的种子液。

(2)在皿板10内设置6个区间，分别为a区间～f区间。其中2个区间装有液体培养基(a、b区间)，2个区间装有固体培养基(c、d区间)，1个区间作为废液区(e区间)，1个区间为液体混匀区(f区间)。

(3)向皿板10的所述装有液体培养基的区间(a、b区间)内接种等量的步骤(1)所述细菌的种子液，在适宜条件下摇床培养。

(4)利用移液管30上的进液口32，向其中一个装有液体培养基的区间(b区间，对照组)加入适量液体培养基；随后将移液管30移到废液区(e区间)，通过进液口32加入少量纯水，清洗移液管30，洗液排入e区间；再将移液管30转到另一个装有液体培养基的区间(a区间)，通过进液口32加入适量抑菌蛋白诱导表达剂。再将移液管30移到废液区(e区间)，通过进液口32加入少量纯水，清洗移液管30，洗液排入e区间。继续摇床培养。

因为本步操作无需移液管30与内容物接触(最好也不要接触，避免污染)，所以本步无需开启限位槽，移液管30悬空操作即可。通过设置废液区，一方面最大可能地实现封闭操作，另一方面也将试验可能产生的有毒害废弃物都集中在培养皿内，便于后续集中处理。

因为抑菌蛋白可能对细菌的生长产生一定的抑制作用甚至毒害作用，所以本步(添加抑菌蛋白诱导表达剂)选择在菌株生长至对数期、生长旺盛时进行。

(5)培养一定时间后，使用移液管30分别吸取a、b区间的内容物，分别接种至皿板10的c、d区间，继续培养。

步骤(5)的c、d区间也可以均接种a区间的内容物。在接种前，先将内容物稀释至不同浓度，各浓度间形成对照。具体稀释方法为：将移液管30移至a区间，吸取一定量的内容物后，将其转移至f区间(液体混匀区)，再通过进液口32加入适量的稀释液体(例如液体培养基)，通过移液管30将f区间内的液体重复吸起、释放数次，混匀液体后，转移至c区间进行接种。随后使用相同的方法，在d区间接种另一稀释浓度的菌株即可。因稀释液体和菌株成分相同，只是浓度比例不同，所以稀释过程可都在f区间进行。为了便于操作，优选的方案为：f区间侧壁上印有刻度(图中未示出)。因本发明为初步验证抑菌效果的试验，稀释浓度无需特别精确，各浓度间构成明显区别即可。

当然，步骤(5)的操作还可以为：在c区间接种两个或多个a区间的内容物，d区间接种两个或多个b区间的内容物，相互之间形成对照。具体根据试验需要进行设置即可。

(6)观察各区间固体培养基上细菌的生长情况。

下面结合具体实施例，验证本发明方法的可行性。

实施例

1、随机选取2.5岁健康的四川阿坝州红原麦洼牦牛，屠宰后使用无菌工具采取其肺脏组织样品，于DEPC水中除去血渍，于液氮中进行保存。采用RNAiso Plus试剂对肺脏组织进行充分研磨，然后根据总RNA提取试剂盒说明书提取组织总RNA。根据反转录试剂盒说明书合成cDNA。

参考Genebank中黄牛BNBD4基因序列(NM_174775.1)设计PCR引物，引物信息如下：F:TCTTCTCCAGCATCAGCC；R:CTGGTTACGCCTCAGTCT。

以麦洼牦牛肺组织cDNA为模板，进行PCR扩增反应。反应体系为25μL，PCR反应程序为：98℃、2min；98℃、2min；55.6℃、10s；72℃、10s,共35个循环；72℃、2min；4℃保存。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，得到250bp左右的扩增片段。

2、用NCBI的ORF Finder程序对开放阅读框进行分析，并用DNAMAN将麦洼牦牛β-防御素4基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列。β-防御素4基因的开放阅读框为195bp，可编码64个氨基酸。所述氨基酸序列为：MRLHHLLLALLFLVLSAGSGFTQVVRNPQSCRWNMGVCIPFLCRVGMRQIGTCFGPRVPCCRRW。

3、重组质粒pET-32a-BNBD4在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达。

根据大肠杆菌表达***优化基因序列，构建表达载体。用KpnI和EcoRI对pET-32a(+)载体质粒和目的片段进行双酶切，连接转化到大肠杆菌TOP10当中，挑选阳性克隆子，用酶切进行验证之后，测序鉴定成功后返回重组质粒。全基因合成于北京擎科新业生物技术有限公司完成。使用DEPC H2O将重组质粒pET32a-BNBD4稀释为4ng/μL的质粒溶液。取2μL质粒溶液化学转化于100μL BL21(DE3)感受态中，获得转化后的菌株。取菌液200μL均匀涂板于LB平板(含50mg/ml Amp)，37℃培养12h。随后挑取单菌落接种于LB液体培养基(含50mg/ml Amp)，37℃、180r/min下摇床培养6～8h，获得种子液。

4、向50mL LB液体培养基中加入1500μL步骤3所述种子液，在37℃、180r/min下培养过夜。随后加入0.5mmol/L的IPTG诱导表达6h。随后使用LB液体培养基、按10倍的倍比稀释获得5个梯度(10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL)，每梯度取5μL涂布于LB平板(含100μg/mL Amp、0.5mmol/L IPTG)，37℃培养过夜，作为处理组。以含pET32a空载质粒的大肠杆菌在相同条件下进行培养，作为对照组。对照组结果如图3所示，实验组结果如图4所示。从图3、4可以看出，实验组10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL4个浓度的菌落明显少于对照组，证明重组蛋白β-防御素4对大肠杆菌具有明显的抑菌作用，证明本发明提供的检验方法快速、可行、有效。

Claims (5)

1.一种培养皿，其特征在于：包括透明的培养皿皿板（10），所述皿板（10）周围向上延伸形成侧壁、构成容纳内容物的空间，所述空间内由隔板（11）分为数个互不连通的培养区间；所述隔板（11）高度为皿板（10）侧壁高度的1/2～4/5；

所述培养皿还包括透明的、可盖住皿板（10）的皿盖（20），皿盖（20）高度为皿板（10）侧壁高度的1.3～2倍；所述皿盖（20）内部空腔形状与皿板（10）适配，所述皿盖（20）盖住皿板（10）时，与皿板（10）侧壁间隙配合，所述皿盖（20）远离皿板（10）一侧底面贯穿设置带密封盖的开口，所述开口与中空的移液管（30）间隙配合，所述移液管（30）可将皿板（10）的内容物在不同区间之间进行转移；所述隔板（11）在皿板（10）内部对称设置，各所述隔板（11）在皿板（10）中央汇合，形成隔离柱（12），所述隔离柱（12）与隔板（11）等高；所述移液管（30）包括穿过皿盖（20）开口的贯穿部（35），所述贯穿部（35）为弹性材质，所述贯穿部（35）下方固接可直接与皿板（10）内容物接触的吸取部（34）；

当移液管（30）穿过开口时，所述贯穿部（35）的中心轴与皿板（10）侧壁平行，所述吸取部（34）相对于皿板（10）侧壁倾斜，倾斜角度为可保证吸取部（34）吸取到皿板（10）各区间内容物的角度；

所述移液管（30）的贯穿部（35）外管壁上固接限位块（33），所述限位块（33）与贯穿部（35）对应部位的宽度之和大于皿盖（20）上开口直径；所述皿盖（20）上对应贯穿设置可供限位块（33）通过的限位槽，所述限位槽由可开合的密封盖封闭；

当需要进行内容物转移时，打开限位槽上的密封盖，旋转移液管（30），使限位块（33）穿过限位槽，从而移液管（30）可相对于皿盖（20）进行上下往复运动和自转运动，以实现物质转移。

2.根据权利要求1所述的培养皿，其特征在于：所述皿盖（20）盖住皿板（10）时，皿盖（20）上设置的开口位于隔离柱（12）正上方。

3.根据权利要求1所述的培养皿，其特征在于：所述移液管（30）贯穿部（35）的悬端与旋转钮（31）可拆卸连接，所述旋转钮（31）直径大于皿盖（20）上的开口口径。

4.根据权利要求3所述的培养皿，其特征在于：所述旋转钮（31）与限位块（33）间的间距大于吸取部（34）悬端到皿板（10）内容物表面间的最大距离。

5.根据权利要求4所述的培养皿，其特征在于：所述旋转钮（31）与限位块（33）之间、所述贯穿部（35）侧壁上，贯穿设置带密封盖的进液口（32）。

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