CN109593842A - 一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒及方法，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1～18所示的9对引物用于检测包括23sRNA、PBP1、PORD、OORD、16s rRNA、GYRA、rdxA六种基因型的共41个位点的突变，对目前主流的六种幽门螺旋杆菌耐药基因的突变位点进行全方位解析,根据位点找出对应的基因型，从而判断对克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮、四环素、左氧氟沙星、甲硝唑的耐药性，测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％，对指导幽门螺旋杆菌患者的个性化治疗有非常重大的意义。

Description

一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药基因的试剂盒和方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种革兰氏阴性菌，主要分布在胃粘膜组织中，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。据统计，全世界人群中幽门螺旋杆菌的感染率达50％，我国的感染率高达60％-90％。幽门螺旋杆菌感染可导致慢性胃炎、胃溃疡、胃癌和和胃淋巴瘤等消化道疾病，因此众多患者的幽门螺旋杆菌早期根除非常必要。目前若干种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、呋喃唑酮、四环素、甲硝唑等)作为根除Hp3-4联治疗的手段被广泛应用。但是幽门螺旋杆菌对抗生素会产生耐药性，并且目前国际国内的抗生素耐药性普遍逐年升高，而根除率大幅度下降，从最初的95％降至65％，预计在未来耐药性会越来越成为全面阻碍Hp根除的主要因素。因此，专家意见及最新共识均认为，已有耐药迹象的患者在治疗前，应先做耐药性试验，以便指导合适药物的选择。
目前已有针对个别抗生素(例如克拉霉素)耐药基因的检测方法及PCR试剂盒，但是尚缺乏对于所有主流抗生素的耐药位点进行全面检测的检测手段和试剂盒。本发明致力于从技术上填补这一空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药基因的方法和试剂盒，能够全面地鉴定出针对克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、呋喃唑酮、四环素、甲硝唑目前常用的6种幽门螺旋杆菌感染治疗药物的耐药基因的具***点情况，解读出该型菌株的耐药性，从而指导幽门螺旋杆菌感染患者的个性化治疗。且本方法可扩展性强，即随着幽门螺杆菌耐药基因组学研究的进一步深入，未来若发现新的耐药基因或耐药位点，一旦生物学功能明确，可以随时扩充到本发明的基因及位点列表中。
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒，包括引物混合液和PCR扩增试剂；所述引物混合液包含：
检测克拉霉素耐药基因23sRNA的G1939A位点和/或T1942C位点突变的正向引物1和反向引物1，检测克拉霉素耐药基因23sRNA的A2142G位点、A2143G位点、A2144G位点、C2147G位点、C2182T位点、C2245T位点和/或C2289T位点突变的正向引物2和反向引物2，
检测阿莫西林耐药基因PBP1的320Ala/Val位点、366Leu/Phe位点、369Ala/Thr位点、374Leu/Val位点、414Arg/Ser位点和/或423Leu/Phe位点突变的正向引物3和反向引物3，检测阿莫西林耐药基因PBP1的556Ser/Thr位点、562Asn/Tyr位点、593Ala/Thr位点和/或595Gly/Ser位点突变的正向引物4和反向引物4；
检测呋喃唑酮耐药基因PORD的G353A位点、A356G位点和/或C357T位点突变的正向引物5和反向引物5，检测呋喃唑酮耐药基因OORD的A41G位点、A122G位点、A335G位点、C349A/G位点、C156T位点和/或C165T位点突变的正向引物6和反向引物6；
检测四环素耐药基因16s rRNA的AGA926-928TTC/AGC/TGC/GGA/CGA位点突变的正向引物7和反向引物7，
检测盐酸左氧氟沙星耐药基因GYRA的87Asn/Lys/Ile/Thr/Tyr位点和/或91Asp/Asn/Gly/Tyr位点突变的正向引物8和反向引物8；
检测甲硝唑耐药基因rdxA的A61G位点、T62C位点、A91G位点、C92A位点、G392A位点、A610G位点、A614C位点和/或G175A位点突变的正向引物9和反向引物9；
其中，引物序列分别为：
正向引物1：AGCCTCTAAGCATATCCATAG(如SEQ ID NO.1所示)；
反向引物1：AATGGCGTAACGAGATGG(如SEQ ID NO.2所示)；
正向引物2：GAATTGAAGCCCGAGTAAACG(如SEQ ID NO.3所示)；
反向引物2：TCAAGCAGAGACGAAAGTCGG(如SEQ ID NO.4所示)；
正向引物3：AGGCGGTTGTATTCTTTAGGC(如SEQ ID NO.5所示)；
反向引物3：CACTGACCAACAAAACGATGTCAA(如SEQ ID NO.6所示)；
正向引物4：TACGGCACCATGCTCAAACC(如SEQ ID NO.7所示)；
反向引物4：ATAGGGACTTTCACATCGCTG(如SEQ ID NO.8所示)；
正向引物5：CCATTACACCGAGCAAAGCTA(如SEQ ID NO.9所示)；
反向引物5：GCCTATCCTATCACCCCATCA(如SEQ ID NO.10所示)；
正向引物6：CATGCTTTCAGCGCGACTTAT(如SEQ ID NO.11所示)；
反向引物6：GCGTATCTTTAGGGGCAAGC(如SEQ ID NO.12所示)；
正向引物7：GCGACCTGCTGGAACATTAC(如SEQ ID NO.13所示)；
反向引物7：TCGTGTCGTGAGATGTTGGG(如SEQ ID NO.14所示)；
正向引物8：GGCGTATTTTGTATGCGATGC(如SEQ ID NO.15所示)；
反向引物8：GAAAGTGCGGGCCAAAGTG(如SEQ ID NO.16所示)；
正向引物9：CATGGGTTGCTGATTGTGGTT(如SEQ ID NO.17所示)；
反向引物9：GGTGTTTTCAAGCGTTTCATTAAG(如SEQ ID NO.18所示)；
具体的，所述PCR扩增试剂可采用试剂2xHieff PCR Master Mix(With Dye)，是即用型的PCR预混合溶液，只需加入引物和模板即可进行扩增简化实验的操作步骤，提高了高通量操作和实验结果的重现性。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法，包括步骤：
1)提取和扩增：提取样本DNA，利用设计的引物和PCR扩增试剂进行PCR扩增；
2)纯化：对PCR扩增产物进行纯化，纯化后的样本进行荧光染料定量；
3)测序：建立反应文档，将孔板每孔所对应的测序信息制作成表格，输入电脑并转化为测序仪输入的格式；根据表格的信息将孔板每孔所需添加的样品、引物进行对照添加，加入MIX酶，封上PCR膜，放入PCR仪上进行PCR扩增；PCR扩增产物经EDTA处理，离心；再加酒精处理，离心；加入高度去离子甲酰胺处理，离心；进行PCR变性处理，上测序仪检测；测序结果与各基因突变参考阳性菌株序列比对，根据相对应突变点位来判读其基因型；
所述步骤1)中，所引物包含：
检测克拉霉素耐药基因23sRNA的G1939A位点和/或T1942C位点突变的正向引物1(如SEQ ID NO.1所示)和反向引物1(如SEQ ID NO.2所示)；检测克拉霉素耐药基因23sRNA的A2142G位点、A2143G位点、A2144G位点、C2147G位点、C2182T位点、C2245T位点和/或C2289T位点突变的正向引物2(如SEQ ID NO.3所示)和反向引物2(如SEQ ID NO.4所示)；
检测阿莫西林耐药基因PBP1的320Ala/Val位点、366Leu/Phe位点、369Ala/Thr位点、374Leu/Val位点、414Arg/Ser位点和/或423Leu/Phe位点突变的正向引物3(如SEQ IDNO.5所示)和反向引物3(如SEQ ID NO.6所示)，检测阿莫西林耐药基因PBP1的556Ser/Thr位点、562Asn/Tyr位点、593Ala/Thr位点和/或595Gly/Ser位点突变的正向引物4(如SEQ IDNO.7所示)和反向引物4(如SEQ ID NO.8所示)；
检测呋喃唑酮耐药基因PORD的G353A位点、A356G位点和/或C357T位点突变的正向引物5(如SEQ ID NO.9所示)和反向引物5(如SEQ ID NO.10所示)，检测呋喃唑酮耐药基因OORD的A41G位点、A122G位点、A335G位点、C349A/G位点、C156T位点和/或C165T位点突变的正向引物6(如SEQ ID NO.11所示)和反向引物6(如SEQ ID NO.12所示)；
检测四环素耐药基因16s rRNA的AGA926-928TTC/AGC/TGC/GGA/CGA位点突变的正向引物7(如SEQ ID NO.13所示)和反向引物7(如SEQ ID NO.14所示)；
检测盐酸左氧氟沙星耐药基因GYRA的87Asn/Lys/Ile/Thr/Tyr位点和/或91Asp/Asn/Gly/Tyr位点突变的正向引物8(如SEQ ID NO.15所示)和反向引物8(如SEQ ID NO.16所示)；
检测甲硝唑耐药基因rdxA的A61G位点、T62C位点、A91G位点、C92A位点、G392A位点、A610G位点、A614C位点和/或G175A位点突变的正向引物9(如SEQ ID NO.17所示)和反向引物9(如SEQ ID NO.18所示)。
具体的，所述步骤1)中，样本来源为受检前停止服用抗生素一个月以上，质子泵抑制剂二周以上，中药二周以上，且经尿素呼气试验验证为阳性的幽门螺旋杆菌阳性患者的胃粘膜样本。该胃粘膜样本先经过菌株分离提取，对提取的幽门螺旋杆菌菌株进行平板培养(微需氧)4-5天，接种后通过镜检和尿素酶实验挑选单克隆菌落再次培养到足够的量。
具体的，所述步骤1)中，提取样本DNA采用Magen HiPure Bacterial DNA Kits。
具体的，步骤1)中，所述PCR扩增试剂可采用试剂2xHieff PCR Master Mix(WithDye)，是即用型的PCR预混合溶液，只需加入引物和模板即可进行扩增简化实验的操作步骤，提高了高通量操作和实验结果的重现性。
具体的，步骤1)中，PCR扩增的反应体系为：5ng总量的DNA定容在21ul的ddH2O里，加入25ul 2xHieff PCR Master Mix(With Dye)，检测某单个基因的2ul正向引物(浓度10uM)与2ul反向引物(浓度10uM)，总共定容在50ul体系。
具体的，步骤1)中，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃终延伸30sec，1个循环；然后4℃终止。PCR扩增反应结束后，将PCR产物放入4℃冰箱保存。
具体的，步骤2)中，采用磁珠法进行纯化。
具体的，步骤3)中，PCR扩增的程序为：96℃预变性2min，1个循环；96℃变性10sec，50℃退火10sec，60℃延伸100sec，30个循环；然后4℃终止，16℃保温。
具体的，步骤3)中，EDTA处理是将PCR产物取出加入2.6ul EDTA溶液，19ul冻于-20度冰箱的100％乙醇(AR)，封上PCR膜，震荡2分钟。
具体的，步骤3)中，酒精处理是加酒精(70％AR)50ul，盖上封板膜，进离心机。
具体的，步骤3)中，高度去离子甲酰胺处理是在上机前向孔板每孔加高度去离子甲酰胺(HiDi Formanide)，封上PCR膜，上离心机。
具体的，步骤3)中，PCR变性处理是在96℃变性2分钟，做完后取出，冷却，500转瞬离5秒，得到的最终可上机测序样品。
具体的，步骤3)中，各基因突变参考阳性菌株序列为：23sRNA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.19～20所示；PBP1基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.21～22所示；PORD基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.23所示；OORD基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.24所示；16s rRNA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.25所示；GYRA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.26所示；rdxA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.27所示。
本发明提供的方法能对关联基因23sRNA(9个位点)、PBP1(10个位点)、PORD(3个位点)、OORD(6个位点)、16s rRNA(3个位点)、GYRA(2个位点)、rdxA(8个位点)共41个位点进行检测并比对突变位点，用于判定幽门螺旋杆菌耐药性。其判定依据为：如23sRNA发生突变，则该菌株对克拉霉素敏感性强，对该类抗生素耐药；如PBP1发生突变，则该菌株对阿莫西林敏感性强，对该类抗生素耐药；如PORD和/或OORD发生突变，则该菌株对呋喃唑酮敏感性强，对该类抗生素耐药；如16s rRNA发生突变，则该菌株对四环素敏感性强，对该类抗生素耐药；如GYRA发生突变，则该菌株对盐酸左氧氟沙星敏感性强，对该类抗生素耐药；如rdxA发生突变，则该菌株对甲硝唑敏感性强，对该类抗生素耐药。
本发明提供的方法利用9对引物可同时完成对7个基因的41个位点的突变检测，测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％。
本发明提供的方法针对目前主流的六种幽门螺旋杆菌耐药基因的突变位点进行全方位解析,根据位点找出对应的基因型，从而判断对哪种抗生素药物耐药，对指导幽门螺旋杆菌患者的个性化治疗有非常重大的意义。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1幽门螺旋杆菌菌株体外提取及培养
1.取样
1)确认病人受检前停止服用抗生素一个月以上，质子泵抑制剂二周以上，中药二周以上，且经尿素呼气试验(UBT)验证为阳性。
2)确认采样的胃黏膜组织标本新鲜无污染，无食物残渣遗留。
3)在胃镜活检取样时尽量取胃窦与胃体病变部位双份样本，各两块，共四块标本分别放入二个运送培养基试管内，并确认组织样本浸入运送培养基的液体中，拧紧试管盖，48小时内2-8度冷藏运输。
4)初治患者的幽门螺旋杆菌多分布于胃窦距幽门2-5cm处，补救治疗患者的幽门螺旋杆菌会从胃窦转移到胃体和胃底，因此对后者要同时采集胃底和胃体处样本。
5)多次根除治疗失败的患者，建议距上次治疗结束至少3个月，甚至更长(共识建议2个月)。
2.体外提取及培养
1)使用保存管配套一次性接种棒将胃黏膜标本分别直接接种在二块哥伦比亚血琼脂培养基上，并进行标识胃窦与胃体，接种时直接将胃粘液面与培养基接触，小面积将胃黏膜涂匀，并倒入少许保存液，进行旋转涂匀，再将胃黏膜样本取出加入至尿素酶管里，进行尿素酶反应，观察试剂颜色发生变化时间，24h内若由正常的淡黄色变为粉红色即为阳性，表示有幽门螺旋杆菌存在，否则为阴性。
2)哥伦比亚血琼脂平板盖上平板盖后，倒置放入三气培养箱内，在微需氧环境(5％O2，10％CO2，85％N2)温度在37℃培养3-4天。细菌然后通过形态观察(革兰氏染色)以及生化反应如尿素酶、氧化酶及触酶等来鉴定。培养4天后观察平板，进行氧化酶试验，用氧化酶滤纸条分别蘸取平板菌落，滤纸顶端如立刻出现紫色，继而逐渐加深，证明该菌落为幽门螺旋杆菌，阴性不变色。挑取饱满及清晰的幽门螺旋杆菌转接至另一块哥伦比亚血琼脂平板内在三气培养箱内进行二代培养2-3天，将所有生长在哥伦比亚血琼脂平板二代的菌落进行收集加入至冻存保存液，选取一些进行尿素酶实验并涂于玻片上进行革兰氏染色，确认其幽门螺旋杆菌生长状态与形态，将菌株冻于-80℃冰箱内进行保存，以备后面测序使用。
实施例2幽门螺旋杆菌的耐药基因检测
1.DNA提取
使用Magen HiPure Bacterial DNA Kits进行细菌DNA抽提。
1)吸取500ul菌株冻存液至1.5ml离心管中，10,000x g离心1分钟收集细菌，缓慢吸取400ul上清液丢弃。
2)加入200μl Buffer STE和10μl Lysozyme至1.5ml离心管中，充分震荡重悬细菌，在37℃反应10分钟。
3)加入220μl Buffer DL和10μl Proteinase K至1.5ml离心管中，充分震荡混匀，在65℃消化反应30分钟。
4)加入5μl RNase Solution至1.5ml离心管中，充分震荡混匀，室温25℃反应30分钟。
5)加入220μl无水乙醇至1.5ml离心管中，充分震荡混匀30秒。
6)把HiPure gDNA Micro Column装在2ml收集管中，将1.5ml离心管内液体全部加入，10,000x g离心1分钟。
7)倒弃废液，把柱子装回收集管中。加入500μl Buffer GW1至柱子上。10,000x g离心1分钟。
8)倒弃废液，把柱子装回收集管中。加入650μl Buffer GW2至柱子中。10,000x g离心1分钟。
9)倒弃废液，把柱子装回收集管中。加入650μl Buffer GW2至柱子中。10,000x g离心1分钟。
10)倒弃废液，把柱子装回收集管中。10,000×g离心2分钟，丢弃2ml收集管。
11)将柱子装在新的1.5ml离心管中。加入30μl预热至65℃Buffer TE至柱子膜中央。放置1分钟，10,000×g离心1分钟。
12)丢弃柱子，将1.5ml离心管保存在4℃冰箱。
13)使用Yeason dsDNA HS Assay Kit for在Thermo Qubit 3.0仪器上进行荧光染料定量。
2.扩增
1)取5ng总量的DNA定容在21ul的ddH2O里，加入25ul 2xHieff PCR Master Mix(With Dye)，2ul正向引物(浓度10uM)与2ul反向引物(浓度10uM)，总共定容在50ul体系于0.2ml离心管内，盖上离心管盖。
组分 体积(ul)
DNA模板 21
正向引物(10uM) 2
反向引物(10uM) 2
2xHieff PCR Master Mix(With Dye) 25
总共 50
具体耐药药物检测对应添加引物情况如下表所示：
2)使用振荡器进行样本混匀10秒钟，再使用小型离心机进行瞬间离心，使反应液离心到管底，准备上PCR仪进行扩增。
3)打开PCR仪进行板盖加热，放入0.2ml离心管，盖上板盖，选择扩增程序
4)反应结束后，将PCR产物放入4℃冰箱保存。
3.纯化
1)充分振荡混匀AMPURE BEADS XP，并在室温孵育30分钟以上。
2)加入45ul的已振荡好的磁珠到PCR产物里，使用振荡器混匀。
3)室温放置5分钟，然后放入磁力架上进行吸附，时间为5分钟，丢弃废液。
4)加入200ul 75％乙醇，盖上离心管盖，180度缓慢旋转离心管，使磁珠吸附到离心管另一侧，再旋转180度至原位，使其磁珠在乙醇内空间穿梭，达到洗涤作用，时间为30秒。
5)待磁珠吸附后丢弃废液，重复步骤4，并丢弃废液。
6)放入37度金属浴内，待1-2分钟拿出观察磁珠群有无开裂状态，略微有开裂现象即可，不宜太过干燥。
7)加入22ul保存液或水，充分震荡，室温放置1分钟，***磁力架上。
8)另取1.5ml离心管，吸取步骤7)的样本20ul至管内，放入4度冰箱保存用于测序样本准备。
9)使用Yeason dsDNA HS Assay Kit for在Thermo Qubit 3.0仪器上进行荧光染料定量。
4.测序
1)建立反应文档，96孔板每孔所对应的测序信息制作成表格，输入电脑并转化为测序仪输入的格式。打印一份。
2)板孔加样，根据表格的信息将每个孔所需添加的样品、引物进行对照添加，一定注意孔板的位置与表格内的位置相对应。
3)根据下列表格混匀样本与引物至96孔PCR板内。
加好后瞬离一下、震荡后再瞬离一下，进入下一步PCR预变性，96度2分钟，取出置于冰水中，加入1ul MIX酶(dGTP BigDye Teminator)，封上PCR膜，震荡后瞬间离心，放入PCR仪上进行扩增。
4)打开PCR仪进行板盖加热，选择扩增程序
5)将PCR产物取出加入2.6ul EDTA溶液，19ul冻于-20度冰箱的100％乙醇(AR)，封上PCR膜，震荡2分钟。
6)放于低温离心机10度4000转离心30分钟，完成离心后冰水中静置1分钟，在温离心机4000转离心1分钟。
7)取出后开盖、倒置于卫生纸上、放入离心机瞬离5秒700转。
8)取出放正，加酒精(70％AR)50ul，用卫生纸擦干板上溅出的酒精、盖上封板膜，进离心机。
9)4000转10度离心10分钟。
10)取出后撕开封口膜、倒置于卫生纸上、放入离心机瞬离5秒700转。
11)取出放正，置于空气中15分钟让酒精挥发(或进PCR仪加热5分钟，不要加盖，或用真空干燥箱干燥2分钟)一定要保证酒精挥发干净。
12)上机前加HiDi，将干燥好的96孔板取下，加HiDi Formanide 10ul每孔，封上PCR膜，上离心机700转瞬离5秒。
13)取出后进PCR做变性反应，96度2分钟，做完后取出，冷却一会，500转瞬离5秒，得到的最终可上机。
14)上ABI 3730测序仪，将做好的96孔板上机，需记住A12这个孔对着机器的内的缺角，导入第一步做的文档进机器，进入程序运行。
5.分析判定
1)根据测序结果得出突变位点情况，其各基因突变参考阳性菌株序列如下：
2)根据相对应突变点位来判读其基因型
3)根据基因型得出对应的耐药药物
突变位点及对应抗生素药物参照表
使用本发明对南京市第一医院某一病例的胃粘膜样本进行检测，该病例需对6种抗生素耐药情况进行检测，其结果如下所示：
检测结果说明：突变提示该菌株对克拉霉素、盐酸左氧氟沙星、甲硝唑耐药。
从上表可以看出，采用本发明对幽门螺旋杆菌耐药基因进行检测和判定，可以有针对性的鉴定出耐药基因位点突变的具体情况，有助于解读出该型菌株的耐药性，对指导幽门螺旋杆菌感染患者个性化治疗有非常重大的意义。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海芯超医学检验所有限公司
<120> 一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒和方法
<130> CPC-NP-18-101217
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
agcctctaag catatccata g 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
aatggcgtaa cgagatgg 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gaattgaagc ccgagtaaac g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
tcaagcagag acgaaagtcg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
aggcggttgt attctttagg c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
cactgaccaa caaaacgatg tcaa 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
tacggcacca tgctcaaacc 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
atagggactt tcacatcgct g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
ccattacacc gagcaaagct a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
gcctatccta tcaccccatc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
catgctttca gcgcgactta t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
gcgtatcttt aggggcaagc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
gcgacctgct ggaacattac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
tcgtgtcgtg agatgttggg 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
ggcgtatttt gtatgcgatg c 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
gaaagtgcgg gccaaagtg 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
catgggttgc tgattgtggt t 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 18
ggtgttttca agcgtttcat taag 24
<210> 19
<211> 379
<212> DNA
<213> 23sRNA基因突变参考阳性菌株序列1(23sRNA基因突变参考阳性菌株序列1)
<400> 19
atgagtattc taaggcgcgt gaaagaactc tggttaagga actctgcaaa ctagcaccgt 60
aagttcgcga taaggtgtgc cgcagcaatg cggtctcagc aaagagtccc tcccgactgt 120
ttaccaaaaa cacagcactt tgccaactcg taagaggaag tataaggtgt gacgcctgcc 180
cggtgctcga aggttaagag gatgcgtcag tcgcaagatg aagcgttgaa ttgaagcccg 240
agtaaacggc ggccgtaact ataacggtcc taaggtagcg aaattccttg tcggttaaat 300
accgacctgc atgaatggca aacgagatgg aaaacggagg cttgcagagg ttggctcatt 360
gcggttggaa atcgcaagt 379
<210> 20
<211> 398
<212> DNA
<213> 23sRNA基因突变参考阳性菌株序列2(23sRNA基因突变参考阳性菌株序列2)
<400> 20
cgtaacgaga tgggagctgt ctcaaccaga gattcagtga aattgtagtg gaggtgaaaa 60
ttcctcctac ccgcggcaag acggaaagac cccgtggacc tttactacaa cttagcactg 120
ctaatgggaa tatcatgcgc aggataggtg ggaggctttg aagtaagggc tttggctctt 180
atggagccat ccttgagata ccacccttga tgtttctgtt agctaactgg cctgtgttat 240
ccacaggcag gacaatgctt ggtgggtagt ttgactgggg cggtcgcctc ctaaaaagta 300
acggaggctt gcaaaggttg gctcattgcg gttggaaatc gcaagttgag tgtaatggca 360
caagccagcc tgactgtaag acatacaagt caagcaga 398
<210> 21
<211> 785
<212> DNA
<213> PBP1基因突变参考阳性菌株序列1(PBP1基因突变参考阳性菌株序列1)
<400> 21
tgaagtgcca atcgtctata accaaacttc cacgcaaaat atcgctccct atgtcgtgga 60
tgaagtgttg aagcaattgg atcaattaga cgggttaaaa actcaaggct ataccataaa 120
gctcacgata gatttggatt accaacgctt agcgttagag tccttgcgtt ttgggcatca 180
aaaaatctta gaaaaaatcg ctaaagaaaa gccaaaaact aacgcctctg atgaagatga 240
agacaacttg aacgccagca tgatagttac agacacgagc accggtaaga ttttagcttt 300
agtggggggg attgattata aaaaaagcgc tttcaatcgc gccacgcaag ccaaacggca 360
gtttgggagc gcgataaagc cttttgtgta tcaaatcgct tttgataatg gctattccac 420
cacttccaaa atccctgata ccgcgcgaaa ctttgaaaat ggcaattata gtaaaaacag 480
cgaacaaaac cacgcatggc accccagcaa ttattctcgc aagtttttag ggcttgtaac 540
cttgcaagaa gccttaagcc attcgttaaa tctagccacg atcaatttaa gcgatcagct 600
tggctttgaa aaaatttatc aatctttaag cgatatgggg tttaaaaacc tccctaagga 660
cttgtctatc gtgttaggga gctttgctat ctcacccatt gatgcggctg aaaagtattc 720
tttattttct aattacggca ccatgctcaa acccatgctc attgaaagca tcactgacca 780
acaac 785
<210> 22
<211> 471
<212> DNA
<213> PBP1基因突变参考阳性菌株序列2(PBP1基因突变参考阳性菌株序列2)
<400> 22
aaaactttca cgcctatgga aaccaaaaag atcacctcca aagaacaggc ttttttaacc 60
ctttcagtgc tgataaatgc ggtagaaaac ggcacagggc gtttggctcg cactaaaggt 120
ttagaaatcg ccggtaaaac cgggacttct aacaacaata ttgacgcttg gttcattggc 180
tttaccccca ccttgcaaag cgtgatctgg tttgggagag acgataacac gcctattagc 240
aaaggagcga caggaggcgt tgtgagtgca cctgtgtatt cgtatttcat gcgtaatatt 300
ttagcgattg aaccttcttt aaaaagaaag tttgatgtcc ccaaaggctt gcgtaaagaa 360
atcgtggata aaatccccta ctactcaact cctaattcca tcacccccac ccccaaaaga 420
acagacgata gtgaggaacg cttgttgttc taatcctaca tggctatagg g 471
<210> 23
<211> 372
<212> DNA
<213> PORD基因突变参考阳性菌株序列(PORD基因突变参考阳性菌株序列)
<400> 23
ggcgcgtggc taagcctgtg cataacaata atatttgcat caattgcttt aattgttggg 60
tttattgccc agacgctgct attctttcaa gagagggtaa gttaaagggc gtggattatt 120
ctcattgtaa aggctgtggc gtgtgcgtgg atgtctgccc taccaaccct aaatcgctat 180
ggatgtttga agaacaaatt gagcccgcta ccgctctcac tcaatggccc caaaaacaag 240
aaaagaaaaa atcataagga aaaaatatgg caaaaagtat tgaattgcaa gagatagaag 300
tgtgggatgg caacaccgct agttctaacg ctttaagaca ggctcaaatt gatgtcatcg 360
cagcctatcc ta 372
<210> 24
<211> 481
<212> DNA
<213> OORD基因突变参考阳性菌株序列(OORD基因突变参考阳性菌株序列)
<400> 24
gccgtttggg tgaatgaaga caggtgtaag ggttgtgata tttgcgtatc ggtatgccct 60
gctggggttc ttggcatggg gattgaaaaa gaaagggtgc ttggaaaagt ggccaaagta 120
gcctacccag agagttgtat cggttgcgtg caatgcgagt tgcactgccc ggattttgcg 180
atttatgtgg ctgacagaaa ggatttcaaa ttcgctaaag tttctaaaga agcccaagaa 240
agaagcgaaa aggttaaggc caataaatac atgctcttag aagagactat tttagaaggg 300
agaggcaaat aatgcgtgag attatttctg atgggaatga attagtcgct aaagcggcga 360
ttgaagtggg gtgtcggttt tttgggggct atcctattac gccagttcgg atattatgca 420
tgcaatgagc gtggctttgc ccaaatgcgg cggccatttt atccaaatgg aagatgaaat 480
c 481
<210> 25
<211> 302
<212> DNA
<213> 16s rRNA基因突变参考阳性菌株序列(16s rRNA基因突变参考阳性菌株序列)
<400> 25
gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatggatg ctagttgttg gagggcttag 60
tctctccagt aatgcagcta acgcattaag catcccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 120
taaaactcaa aggaatagac ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 180
agatacacga agaaccttac ctaggcttga cattgagaga atccgctaga aatagtggag 240
tgtctagctt gctagacctt gaaaacaggt gctgcacggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 300
ag 302
<210> 26
<211> 541
<212> DNA
<213> GYRA基因突变参考阳性菌株序列(GYRA基因突变参考阳性菌株序列)
<400> 26
tcgcttataa aaaaagcgct aggatcgtgg gtgatgtgat cggtaaatac cacccccatg 60
gcgataatgc ggtttatgat gcgctagtga gaatggcgca agatttttct atgcgtttgg 120
aattagtgga tgggcagggc aactttggct ctattgatgg cgataacgct gcagcgatgc 180
gttacactga agccagaatg actaaggcga gtgaagaaat tttaagggat attgataaag 240
acaccattga ttttgtgcct aattatgatg acaccttaaa agagccagat attttaccaa 300
gccgtctgcc taacctttta gtcaatgggg ctaatgggat cgctgtgggg atggcgactt 360
ctatcccccc tcataggatt gatgaaatca tagacgcttt agtgcatgtc ttagaaaacc 420
ctaacgctga attagatgaa attttggaat ttgtcaaagg gcctgatttt cccaccggtg 480
ggatcattta tggcaaggcg ggcattattg aagcctataa aacggggcga gggcgcgtga 540
a 541
<210> 27
<211> 691
<212> DNA
<213> rdxA基因突变参考阳性菌株序列(rdxA基因突变参考阳性菌株序列)
<400> 27
tgcggatttt acagagagcc agacagccaa atgggggttt attttttgaa tttgagcatg 60
gggcagattt taagcttatt tatggtaatt gtttcgttag ggattttatt gtatgctaca 120
aaaaattcta aaaaaataaa ggaaaatcaa tgaaattttt ggatcaagaa aaaagaagac 180
aattactaaa ggagcgccat tcttgcaaga tgtttgatag ccattatgag ttttctagcg 240
aggaattaga agaagtcgct gaaatcgcca ggctatcgcc aagctcttac aacacgcagc 300
catggcattt tgtgatagtt actaataagg atttaaacca cccaagcaga aatcccaaac 360
atctttagtg tttgggatga atgctgctaa tttgtagtat aatatctcca tacatttgta 420
tctagcgtag gaagtacgca aagttacgcc tttggagata tgatgtgtga gacctgtagg 480
gaatgcgttg gagatcaaac tctgtaaaat ccctatgatt agggacacaa agtgagaacc 540
aaactttccc tatgggcaac atcagccgag gaagcccaat cgctttagcg tttgggtgct 600
tcacctataa tcaaacctaa attaaagttt aaggagtggc attttgttta aaagaatggt 660
tttaatcgct cttttagggg tgttttcaag c 691

Claims (10)

1.一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒，其特征在于，包括引物混合液和PCR扩增试剂；所述引物混合液包含：
检测克拉霉素耐药基因23sRNA的G1939A位点和/或T1942C位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物1；检测克拉霉素耐药基因23sRNA的A2142G位点、A2143G位点、A2144G位点、C2147G位点、C2182T位点、C2245T位点和/或C2289T位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物2和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物2；
检测阿莫西林耐药基因PBP1的320Ala/Val位点、366Leu/Phe位点、369Ala/Thr位点、374Leu/Val位点、414Arg/Ser位点和/或423Leu/Phe位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物3和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物3；检测阿莫西林耐药基因PBP1的556Ser/Thr位点、562Asn/Tyr位点、593Ala/Thr位点和/或595Gly/Ser位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物4和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物4；
检测呋喃唑酮耐药基因PORD的G353A位点、A356G位点和/或C357T位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物5和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物5，检测呋喃唑酮耐药基因OORD的A41G位点、A122G位点、A335G位点、C349A/G位点、C156T位点和/或C165T位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物6和核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示的反向引物6；
检测四环素耐药基因16s rRNA的AGA926-928TTC/AGC/TGC/GGA/CGA位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的正向引物7和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的反向引物7；
检测盐酸左氧氟沙星耐药基因GYRA的87Asn/Lys/Ile/Thr/Tyr位点和/或91Asp/Asn/Gly/Tyr位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的正向引物8和核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示的反向引物8；
检测甲硝唑耐药基因rdxA的A61G位点、T62C位点、A91G位点、C92A位点、G392A位点、A610G位点、A614C位点和/或G175A位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的正向引物9和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物9。
2.如权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂为试剂2xHieff PCRMaster Mix。
3.一种检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法，其特征在于，包括步骤：
1)提取和扩增：提取样本DNA，利用设计的引物和PCR扩增试剂进行PCR扩增；
2)纯化：对PCR扩增产物进行纯化，纯化后的样本进行荧光染料定量；
3)测序：建立反应文档，将孔板每孔所对应的测序信息制作成表格，输入电脑并转化为测序仪输入的格式；根据表格的信息将孔板每孔所需添加的样品、引物进行对照添加，加入MIX酶，封上PCR膜，放入PCR仪上进行PCR扩增；PCR扩增产物经EDTA处理，离心；再加酒精处理，离心；加入高度去离子甲酰胺处理，离心；进行PCR变性处理，上测序仪检测；测序结果与各基因突变参考阳性菌株序列比对，根据相对应突变点位来判读其基因型；
所述步骤1)中，所引物包含：
检测克拉霉素耐药基因23sRNA的G1939A位点和/或T1942C位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物1；检测克拉霉素耐药基因23sRNA的A2142G位点、A2143G位点、A2144G位点、C2147G位点、C2182T位点、C2245T位点和/或C2289T位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物2和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物2；
检测阿莫西林耐药基因PBP1的320Ala/Val位点、366Leu/Phe位点、369Ala/Thr位点、374Leu/Val位点、414Arg/Ser位点和/或423Leu/Phe位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物3和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物3；检测阿莫西林耐药基因PBP1的556Ser/Thr位点、562Asn/Tyr位点、593Ala/Thr位点和/或595Gly/Ser位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物4和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物4；
检测呋喃唑酮耐药基因PORD的G353A位点、A356G位点和/或C357T位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物5和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物5，检测呋喃唑酮耐药基因OORD的A41G位点、A122G位点、A335G位点、C349A/G位点、C156T位点和/或C165T位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物6和核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示的反向引物6；
检测四环素耐药基因16s rRNA的AGA926-928TTC/AGC/TGC/GGA/CGA位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的正向引物7和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的反向引物7；
检测盐酸左氧氟沙星耐药基因GYRA的87Asn/Lys/Ile/Thr/Tyr位点和/或91Asp/Asn/Gly/Tyr位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的正向引物8和核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示的反向引物8；
检测甲硝唑耐药基因rdxA的A61G位点、T62C位点、A91G位点、C92A位点、G392A位点、A610G位点、A614C位点和/或G175A位点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的正向引物9和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物9。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，样本来源为受检前停止服用抗生素一个月以上，质子泵抑制剂二周以上，中药二周以上，且经尿素呼气试验验证为阳性的幽门螺旋杆菌阳性患者的胃粘膜样本。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，提取样本DNA采用MagenHiPure Bacterial DNA Kits。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃终延伸30sec，1个循环；然后4℃终止。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用磁珠法进行纯化。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，PCR扩增的程序为：96℃预变性2min，1个循环；96℃变性10sec，50℃退火10sec，60℃延伸100sec，30个循环；然后4℃终止，16℃保温。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，EDTA处理是将PCR产物取出加入2.6ul EDTA溶液，19ul冻于-20度冰箱的100％乙醇(AR)，封上PCR膜，震荡2分钟；酒精处理是加70％酒精50ul，盖上封板膜，进离心机；高度去离子甲酰胺处理是在上机前向孔板每孔加高度去离子甲酰胺，封上PCR膜，上离心机；PCR变性处理是在96℃变性2分钟，做完后取出，冷却，500转瞬离5秒，得到的最终可上机测序样品。
10.如权利要求3所述的方法，步骤3)中，各基因突变参考阳性菌株序列分别为：23sRNA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.19～20所示；PBP1基因参考阳性菌株序列如SEQ IDNO.21～22所示；PORD基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.23所示；OORD基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.24所示；16s rRNA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.25所示；GYRA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.26所示；rdxA基因参考阳性菌株序列如SEQ ID NO.27所示。
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