CN105154405B

CN105154405B - 一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法

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Publication number: CN105154405B
Application number: CN201510647527.8A
Authority: CN
Inventors: 赵增仁; 翟从劼; 张峰; 姜霞; 唐宇杰
Original assignee: FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY
Current assignee: FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2015-10-09
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2035-10-09
Also published as: CN105154405A

Abstract

本发明涉及一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其包括如下步骤：（1）组织前处理：将结直肠癌组织经抗生素处理；（2）切块；（3）培养：将切好的组织块放入含抗生素的培养基中进行初期培养和正常培养，至细胞贴壁。本发明的方法对细胞损伤小、细胞存活率高、操作简便易培养。

Description

一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法。

背景技术

结直肠癌是常见的消化***恶性肿瘤，近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。多数结直肠癌患者就诊时已属中晚期，治疗花费大、效果差、远期生存率低。同时给患者、家庭及社会带来了沉重的负担。结直肠癌具有较明显的癌前及癌症早期病变，且时间长达十余年。这为结直肠癌及癌前病变的早期发现和早期治疗提供了机会。肿瘤标志物的测定在肿瘤的诊断、疗效评估、检测复发和推测预后等方面起到重要的作用，对提高临床肿瘤诊疗水平具有重要的意义。

结直肠癌的发生是多基因变化过程，单一标志物筛查特异性和敏感性较低，难以应对大样本人群的筛查。国内外针对结直肠癌肿瘤标志物方面的研究虽然很多，但是目前应用于临床的结直肠癌肿瘤标志物——CEA、CA199、CA125、CA724等仍缺乏足够的灵敏性和特异性，寻找新的与结直肠癌发展进程密切相关的肿瘤标记物，对早期诊断及干预结直肠癌具有重要意义。但是迄今为止，尚未发现既灵敏又特异的肿瘤标志物可应用于临床结直肠癌的检测。因此，寻找有效肿瘤标志物作为初筛手段、进行结直肠癌早期筛查、早期诊治对阻断或延缓结直肠癌进展、改善患者预后和延长生存期具有重要意义。

通过对结直肠癌组织细胞与正常结直肠粘膜细胞表达蛋白的高通量筛选，有可能发现肿瘤组织与正常黏膜组织细胞蛋白表达谱的差异，进而发现新的肿瘤标志物。高通量筛选肿瘤细胞表达的蛋白则需要涉及到肿瘤细胞的原代培养，并且这种研究方法对原代培养细胞的培养要求很高，要尽量避免实验操作中导致的细胞破裂或细胞膜损伤。

原代培养即为直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，在结直肠癌的研究中，癌细胞的原代培养未见报道采用机械破碎法直接生长，均采用传统的酶消化法，其前期对结直肠癌组织进行机械剪碎，然后向剪碎的组织中加入酶消化，使其分散成为单个细胞。

传统的酶消化法具有以下缺陷：由于消化时间的原因（一个样本只能选定相同的处理时间，比如以将略大的组织块消化成单一细胞为标准制定消化时间，必然造成较小的组织块及游离细胞的消化过度），会造成细胞消化不均匀甚至消化过度，损伤细胞膜，破坏细胞，影响细胞活性，或者消化不彻底不利于高通量筛选实验的进行；酶的种类繁多，在消化时选择酶的种类和浓度具有多变性，不同的组织其对酶的要求也不一样，需要复杂的条件摸索。

发明内容

基于现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是，提供一种对细胞损伤小、细胞存活率高、操作简便易培养的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案为：一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其包括如下步骤：

（1）组织前处理：将结直肠癌组织经抗生素处理；

（2）切块；

（3）培养：将切好的组织块放入含抗生素的培养基中进行初期培养和正常培养，至细胞贴壁。

进一步的，步骤（1）将结直肠癌组织以无菌生理盐水冲洗，然后放入含抗生素的无血清培养基浸泡。

更进一步的，所述含抗生素的无血清培养基中抗生素为：500 U/mL 青霉素，500 μg/mL 链霉素，1.25 μg/mL 两性霉素B，80μg/mL 庆大霉素。

进一步的，步骤（2）切块为：将组织块放入细胞培养皿中，用无菌手术刀将组织切碎至体积1-50mm³，优选15-30mm³。

进一步的，步骤（3）所述初期培养采用初期培养基，其含有：体积分数为10%胎牛血清；100 U/mL 青霉素；100 μg/mL 链霉素；0.25 μg/mL 两性霉素B；80 μg/mL 庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺。

进一步的，步骤（3）所述正常培养采用正常培养基，其含有：体积分数为10%胎牛血清；100 U/mL 青霉素；100 μg/mL 链霉素；0.25 μg/mL 两性霉素 B；2 mmol/L谷氨酰胺。

进一步的，步骤（2）切块时使用-80℃预冷过的细胞培养皿；组织切块时，将细胞培养皿置于冰上，组织块置于细胞培养皿中，低温操作可以延缓细胞新陈代谢过程，从而较久地保存组织活力，有效避免组织离体后缺血、缺氧所导致的细胞。

进一步的，步骤（1）的组织经抗生素处理的同时，经白介素6抑制剂浸泡处理。

具体包括如下操作步骤：

（1）组织前处理：选取结直肠癌组织，无菌生理盐水冲洗30s以上，用带有4种高浓度抗生素及白介素6抑制剂的无血清RPMI-1640培养基浸泡；5-10min后，更换新鲜含高浓度抗生素的无血清RPMI-1640培养基后再浸泡5-10min。浸泡过程中，不时摇晃，颠倒摇晃，6次/分钟，以更好相互接触和清洁；浸泡液中白介素6抑制剂选用Siltuximab，浓度为1-15μg/mL，优选11μg/mL；

此步操作可以中和坏死组织中的白介素6，减少其介导的细胞损伤，同时此操作也降低了组织的取材标准；坏死组织小于标本总体积的三分之一即可，传统方法要求避开坏死组织，随着医学的进步，今后肿物的临床取材就易受到限制，降低取材标准无疑是为科研工作提供了前提和保障，大大提高了原代培养成功率；

步骤（1）中4种抗生素浓度：

500 U/mL 青霉素，

500 μg/mL 链霉素，

1.25 μg/mL 两性霉素 B，

80μg/mL 庆大霉素；

（2）切块：将组织块放入-80℃预冷过的细胞培养皿中，组织切块时，将细胞培养皿置于冰上，组织块置于细胞培养皿中，用无菌手术刀切碎组织至体积1-50mm³，优选15-30mm³；

（3）无培养基培养：纯血清润洗培养瓶，组织块直接放置到培养瓶中，组织培养起始的3h不添加培养基，目的是为了加快贴壁并且贴壁更加牢固，3h过后，待组织块粘到培养瓶上，再添加1mL纯血清进行培养，纯血清培养24h；

（4）初期培养：用含有体积分数为10%胎牛血清、4种低浓度抗生素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养基继续培养48-72h，其中4种低浓度抗生素：

100 U/mL 青霉素，

100 μg/mL 链霉素，

0.25 μg/mL 两性霉素 B，

80 μg/mL 庆大霉素；

（5）正常培养：用含有体积分数为10%胎牛血清、3种抗生素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养基换液普通培养，每5-7天换液；观察细胞贴壁情况；3种低浓度抗生素：

100 U/mL 青霉素，

100 μg/mL 链霉素，

0.25 μg/mL 两性霉素 B；

（6）确认细胞贴壁后，重点观察培养，依据具体情况换液。

本发明的RPMI-1640培养基为本领域常见培养基，具体可参见“E16.5小鼠胚胎胰腺组织移植治疗实验性糖尿病”，中华普通外科杂志，2013年9月，第28卷第9期。

本发明的有益效果在于：

（1）取材的时候，不需要刻意避免坏死组织，提高了取材效率，避免了材料浪费；

（2）将组织块放入细胞培养皿中，用无菌手术刀切碎组织，减少了对组织块的机械损伤，另外，对切碎的组织块大小要求不严格，传统方法要求切碎至1 mm³以下，本方法体积较大的组织块也能达到培养效果，且15-30mm³的组织块效果比1mm³更佳；

（3）根据结直肠癌组织的特殊发生环境，配置特定的抗生素浓度，并且根据癌细胞的生长周期特性改变浓度和种类，有利于抑制组织内的细菌繁殖，避免细胞染菌，提高了贴壁率；

（4）血清润洗培养瓶和3h无液体培养，促进快速贴壁；纯血清培养第一天加快组织对体外培养环境的适应；

（5）谷氨酰胺保证细胞***的原料供给。

本发明采用机械切块、配合特定的培养液对结直肠癌组织进行原代培养，避免了传统机械破碎方法染菌率高的风险，也避免了酶消化法对细胞的损伤，最大限度的保证了细胞的完整性，实现快速修复。发明人在试验中还意外的发现，培养开始阶段进行3h无液体培养，可以加快组织块贴壁的速度，并且使贴壁更牢固，组织块不易脱落，可加速细胞生长。结直肠癌组织中急性炎症和坏死组织情况复杂，白介素6抑制剂的加入可以允许取材时存在坏死组织。

附图说明

图1为实施例1显微镜下观察结果；

图2为对比例显微镜下观察结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的具体实施方式，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

实施例1一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其包括如下步骤：

（1）组织前处理：选取结直肠癌组织，无菌生理盐水冲洗30s以上，用带有4种高浓度抗生素及白介素6抑制剂的无血清RPMI-1640培养基浸泡；5-10min后，更换新鲜含高浓度抗生素的无血清RPMI-1640培养基后再浸泡5-10min；浸泡过程中，不时摇晃，颠倒摇晃，6次/分钟，以更好相互接触和清洁；浸泡液中白介素6抑制剂选用Siltuximab，白介素6抑制剂选用强生公司生产，浓度为11μg/mL；

4种抗生素浓度：

500 U/mL 青霉素，

500 μg/mL 链霉素，

1.25 μg/mL 两性霉素 B，

80μg/mL 庆大霉素。

（2）切块：将组织块放入-80℃预冷过的细胞培养皿中，组织切块时，将细胞培养皿置于冰上，组织块置于细胞培养皿中，用无菌手术刀切碎组织至体积15mm³。

（3）无培养基培养：纯血清润洗培养瓶，组织块直接放置到培养瓶中，组织培养起始的3h不添加培养基，目的是为了加快贴壁并且贴壁更加牢固，3h过后，待组织块粘到培养瓶上，再添加1mL纯血清进行培养，纯血清培养24h。

（4）初期培养：用含有体积分数为10%胎牛血清、4种低浓度抗生素和 2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养基继续培养48-72h，其中4种低浓度抗生素：

100 U/mL 青霉素，

100 μg/mL 链霉素，

0.25 μg/mL 两性霉素 B，

80 μg/mL 庆大霉素。

100 U/mL 青霉素，

100 μg/mL 链霉素，

0.25 μg/mL 两性霉素 B。

（6）确认细胞贴壁后，重点观察培养，依据具体情况换液。

实施例2

实施例2与实施例1不同之处在于步骤（1）组织前处理时，白介素6抑制剂Siltuximab的浓度为1μg/mL；步骤（2）切块至体积50mm³。

实施例3

实施例3与实施例1不同之处在于步骤（1）组织前处理时，白介素6抑制剂Siltuximab的浓度为15μg/mL；步骤（2）切块至体积1mm³。

实施例4

实施例4与实施例1不同之处在于步骤（2）切块至体积30mm³。

对比例

采用酶消化法进行结直肠癌组织的原代细胞培养，具体操作如下：

1、1-2cm³组织块，放到细胞培养皿中，加入10mL RPMI-1640培养基（无血清），用高压灭菌手术剪去除非肿瘤组织和坏死组织；

2、将组织转移至新培养皿中，切成小块。20mL RPMI-1640培养基（无血清）重悬组织块并转移至50mL 锥形管中。室温，1200rpm 6min，弃上清；

3、10mL Tumor Cell Digestion Solution 重悬组织，37℃ 消化4hr，伴搅拌；

4、加入10mL Tumor Cell Suspension Solution 吹熄混匀。100mm 过滤器过滤混悬液，收集滤液至一干净50mL 锥形管中；

5、室温，1200rpm 8min，弃上清。用20mL Tumor Cell Suspension Solution重悬沉淀，混匀，得到均值的细胞混合液；

6、加入20mL Tumor Cell Purification Solution 至一新50mL锥形管中，标记为管A，室温 1200rpm 2min；

7、将5中所得20mL 细胞悬液置于管A的溶液上层；

8、将管A在室温垂直静置6min；

9、小心将移液吸头伸入锥形管底，从底部吸走6mL Tumor Cell PurificationSolution，移至一新50mL 锥形管中，标为管B；

10、1200rpm 8min，弃上清；

11、5mL RPMI-1640培养基（体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素）重悬沉淀；

12、将细胞移至6孔板的一个孔，培养3-4天。

效果例

将同一结直肠癌组织，分别采用实施例1和对比例的方法进行原代培养，对比例经步骤12处理，培养3-4天未见细胞增殖，培养20天后与实施例1经正常培养20天后进行比较，结果如图1、图2和表1。

表1 实施例1和对比例的培养结果

通过对比发现：

试剂盒（酶消化法）对组织块要求较高，操作步骤繁琐，操作耗时较长，从组织离体到开始培养，需要6-7h，肿瘤组织长时间脱离适宜生长的环境。从最终结果看，酶消化时对组织的损伤非常大，最终所得细胞数量很少（小于5个/视野），远远不能达到细胞培养的数量，且所得细胞的结构有明显损伤，不能满足实验需求。

本发明的方法，只需对组织块初步进行剪碎，而且对组织块的大小要求并不严格，减少了剪切次数，减轻了对组织块的机械损伤程度，随后无需对剪切后的组织块进行酶消化，进一步减少了对细胞的损伤。初步浸泡剪切后，即可进行培养，从组织离体到开始培养，不会超过0.5h，最大限度的减少了肿瘤组织细胞在非适宜生长环境的时间。从最终结果看，重量相等的组织块处理后，相同视野下细胞数量比传统酶消化法多（多于70个/视野），可以满足下一步实验需求。

Claims

1.一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，其包括如下步骤：

（1）组织前处理：将结直肠癌组织经抗生素处理，同时经白介素6抑制剂浸泡处理；

（2）切块；

（3）培养：先进行无培养基培养，纯血清润洗培养瓶，组织块直接放置到培养瓶中，组织培养起始的3h，不添加培养基，3h过后，待组织块粘到培养瓶上，再添加1mL纯血清进行培养，纯血清培养24h；然后放入含抗生素的培养基中进行初期培养和正常培养，至细胞贴壁；

步骤（3）所述初级培养采用初级培养基，初级培养基为含有体积分数为10%胎牛血清、4种低浓度抗生素和2mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养基，其中4种低浓度抗生素为100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.25 μg/mL 两性霉素B、80 μg/mL 庆大霉素；

步骤（3）所述正常培养采用正常培养基，正常培养基为含有体积分数为10%胎牛血清、3种抗生素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养基，其中3种抗生素为100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.25 μg/mL 两性霉素 B。

2.根据权利要求1所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，步骤（1）将结直肠癌组织以无菌生理盐水冲洗，然后放入含抗生素的无血清培养基浸泡。

3.根据权利要求2所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，所述含抗生素的无血清培养基中抗生素为：500 U/mL 青霉素，500 μg/mL 链霉素，1.25 μg/mL 两性霉素B，80μg/mL 庆大霉素。

4.根据权利要求1所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，步骤（2）切块为：将组织块放入细胞培养皿中，用无菌手术刀将组织切碎至体积15-30mm³。