CN111223734A - 使用电子显微镜对样品成像的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对样品成像的方法，所述样品安装在电子显微镜中的样品固持器上，所述电子显微镜包括用于沿着光轴产生高能电子束的电子源和用于聚焦和偏转光束以便用所述电子束照射所述样品的光学元件。所述样品固持器能够相对于所述电子束定位和倾斜所述样品。所述方法包括以下步骤：通过用所述电子束照射所述样品来获取一系列倾斜的图像，且在获取所述图像期间同时改变所述样品的位置，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。

Description

使用电子显微镜对样品成像的方法
技术领域
本发明涉及一种使用电子显微镜对样品成像的方法。
这种方法的实例从2003年12月31日发布的FEI公司的“技术说明：Tecnai™断层扫描软件的功能说明（Technical note: Functional description of Tecnai™Tomography Software）”中可知。
背景技术
在电子显微镜（例如透射电子显微镜（TEM））中，电子源会产生高能电子束，其可选择的能量例如在80到300 keV之间，尽管已知会使用更高和更低的能量。所述光束被光学元件（电子透镜，偏转器，多极）操纵（聚焦，偏转），并照射放置于样品支持器中的样品。样品支持器安置样品，所述支持器通常显示三个平移自由度（x，y，z）和一个旋转自由度（α）或更多旋转自由度。样品足够薄以对电子透明：一些电子被吸收，但是许多电子在散射或未散射的同时通过样品。通常，对于生物样品，样品的厚度在50 nm到1 μm之间（对于低温样品，样品的厚度在50到200 nm之间），且对于半导体样品，其厚度小于100 nm。另一组光学元件在检测器上形成样品的放大图像，所述检测器例如是CMOS相机、CCD相机、荧光屏或荧光屏与通过光纤连接的相机的组合。
如技术说明中所描述，检测器上形成的图像是样品的2D投影。为了获得3D图像，以所谓的倾斜系列来获取样品在不同旋转方向上的一系列图像。通常，倾斜系列涵盖从-70到+70度的倾斜范围，规则间隔为1或2度。然后将倾斜系列的图像彼此对齐，并使用适当的软件进行3D重建，然后进行可视化。
对于倾斜系列的每个图像，样品必须朝向另一个倾斜角度。由于TEM的高分辨率，样品应稳定在例如1 nm内或更小。因此，通常使用1秒或更长的弛豫时间来抑制平台的漂移。结果，获取倾斜系列是一个耗时的过程。
在以本申请人的名义的美国专利第US 9,147,551 B2号中描述了一种获取倾斜系列的方法，其中，样品支持器在获取倾斜系列的同时连续改变倾斜角，并且样品的位置连续变化以将样品保持在光轴上。通过更快的获取时间和平滑的倾斜机制的发展而成为可能的这种所谓的“运行中断层扫描（tomo-on-the-fly）”减少了获得倾斜系列所需的时间。
期望进一步改进用于获取倾斜系列的方法。特别感兴趣的是提高获得的图像的分辨率，和/或增加可获得倾斜系列的速度。
发明内容
为此，提供了一种对样品成像的方法，其中所述方法是根据权利要求1所定义。根据所述方法，使用了能够相对于电子束定向和倾斜样品的样品固持器。所述方法包括以下步骤：通过用电子束照射样品来获取一系列倾斜的图像，以读出速度将图像记录在相机上，其中在获取一系列倾斜的图像的同时连续改变倾斜角。
根据第一方面，所述方法进一步包括在获取倾斜系列的同时改变样品的位置的并行步骤。特别地，在获取一系列倾斜的图像的同时，连续改变所述位置。这意味着样品的位置随着倾斜角的改变同时变化。结果是，以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。
注意，在如上文引用的US 9,147,551 B2中描述的方法中，样品的位置连续变化以将样品保持在光轴上。因此，实际上，样品位置没有实际的并行变化，因为所描述的方法的明确意图是在获取倾斜系列期间维持固定位置。因此，此现有技术方法导致以相关联的独特倾斜角和单个固定位置获取每个图像。然而，根据本发明的上述方面，在样品连续倾斜期间位置连续变化以提供一组独特的倾斜角和一组对应的独特位置。因此，样品的位置变化，从而在所获取的图像集中产生额外的样品信息。由此，实现了本发明的目的。
注意，改变位置可能包括增加样品的成像部分的步骤，尤其是在获取倾斜系列的过程中。这样，在保持所需的成像分辨率的同时，对样品的较大部分进行成像。在这方面可以想到，借助于样品与电子束之间的相对运动来改变位置。举例来说，样品可以相对于光轴移动。例如，可以通过相对于电子束机械地移动样品来连续改变样品的位置。在另一个实施例中，电子束相对于样品移动。
在这方面，还注意到，众所周知的是，执行第一个倾斜系列，随后将样品移至新位置，然后在此新位置执行第二个倾斜系列。以这样的方式选择新位置，使得与先前位置存在一些重叠，使得针对不同倾斜系列的所得图像具有一些重叠并且可以被拼接在一起成为一个或多个最终图像。根据所述已知方法，样品的运动与倾斜系列的获取不是同时的。实际上，样品的移动是在第一倾斜与第二倾斜系列之间的中间步骤。
根据本文中所公开的方法，位置的改变与倾斜角的改变是同步的。因此，不会浪费时间来将样品支持器的位置移动和稳定到新的位置。另外，相机正在连续获取图像，从而使得本文中所公开的方法还适用于快速变化的样品。另一个优点是，用于照射样品并撞击相机的所有电子都用于成像，且因此不会发生无用的样品劣化。在这方面，已知特别是生物样品由于由电子照射引起的辐照损伤而劣化。
根据另一个方面，一种方法是根据权利要求5所定义。根据这一方面，所述方法包括以下步骤：在获取倾斜系列的同时并行地改变样品的另一倾斜角，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特另一倾斜角来获取每个图像。所述另外的倾斜角可以相对于所述倾斜角正交。使用此方法可在单个倾斜系列期间产生有关样品的更多信息，因为它减少了所谓的漏楔现象。由此，实现了本发明的目的。
因此，从上面可以得出，在获取样品的一系列倾斜的图像的同时，分别连续地改变样品的倾斜角和位置，或者进一步改变样品的倾斜角，会导致更快的获取时间和/或关于样品的更多信息。因此，获得了一种用于对样品成像的改进方法。由此，实现了本发明的目的。
下面将讨论其它有利的实施例。
在实施例中，样品成像于像素化相机上，且以度每秒表示的倾斜角的速度、分别以米每秒或度每秒表示的位置或另一倾斜角的并行变化的速度和以帧每秒表示的相机的速度相匹配，使得在一个帧期间由于倾斜变化而导致的图像位移例如小于一个像素，并且优选地小于½像素。通过这样匹配倾斜速度和读出速度，最佳地使用相机的分辨率。用于这些目的的已知相机包括例如4096×4096像素。相机的读出速度可能受到相机的可能性或一个图像中需要足够数目的电子的限制。注意，有可能集成多个图像，其各自具有低电子数目，但与一个照明时间较长且在集成的图像集中可用的检测电子数目相同的图像相比，这会引起信噪比降低。因此，相比于具有较低帧时间的多个图像的集成，优选具有较长帧时间的一个图像的获取。因此，这可能会导致选择相机的读出速度和样品固持器的倾斜速度，其中每一帧包括足够的电子，不管是对于图像所需（例如用于形成3D重建（断层照片））的多个电子还是用于获取使图像相对于彼此移位（使用例如相关技术）所需的数据。然而，实际上，相机的读出速度是限制因素。因此，选择最高可能的帧速率，并且使剂量率和倾斜速度适应于所述读出速度/帧速率。
在实施例中，使用了样品的频闪照明。样品以频闪方式被照明，并且照明脉冲的频率可以与相机帧读出同步。优选地，在每个帧的读出开始时提供单个脉冲。脉冲的持续时间指定了剩余的运动模糊量，并且优选地，选择在技术上尽可能小的持续时间。由于频闪照明，有可能以高速度获取具有任意多个角度的高质量倾斜系列，同时减少因倾斜增量和/或在单个获取的图像的曝光时间期间重新定位而导致的图像的运动模糊所引起的“拖尾”效应。
在实施例中，倾斜的速度被调制。样品的旋转导致图像的变化。此变化是倾斜角的函数：Δ= d·sinα，其中Δ是旋转引起的像点位移，d是样品点相对于倾斜轴的距离，且α是倾斜轴。对于图像之间的相同位移，在小倾斜角（垂直于光轴的样品）下，倾斜速度可能因此比大倾斜角大。
在实施例中，相对于彼此应用形成倾斜系列的图像的移位和/或旋转校正。形成倾斜系列的图像应移位和旋转布置，使得倾斜轴上的一个点作为所有图像的参考。这可以包含成对校正。然而，如果对于所使用的算法来说，图像包括的每图像的信息太少，那么可使用使用两个或更多个图像集的算法，其中，举例来说，移位和/或旋转校正是基于各自包括两个图像的两个集的信息。此外，可以想到的是，样品包括标记，并且这些标记用于移位和/或旋转校正。通过使用例如金标记的直径为例如10至20 nm的标记，可以更容易地找到每个图像的位置和取向。优选地，使用多于一个标记不仅能够实现移位校正，而且还能够实现形成倾斜系列的图像的旋转校正。同样，倾斜角可以从一组标记的相对位置得出。
根据一个方面，提供了一种用于对样品成像的电子显微镜，其中所述电子显微镜包括：
-电子源，其配置成沿所述电子显微镜的光轴产生电子束；
-样品固持器；
-用于获取图像的相机***；和
-可编程控制器，其配置成控制所述样品固持器和所述相机***，其中所述可编程控制器被编程为控制所述样品固持器和所述相机***，使得在所述样品固持器连续倾斜时所述相机可获取所述样品固持器上的样品的一系列倾斜的图像，且在获取所述倾斜系列的同时并行地改变样品位置，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。在实施例中，样品固持器能够使样品倾斜并且并行地相对于电子束移动样品。这允许在样品倾斜期间改变样品的位置。尤其是，这允许在样品倾斜期间增加样品的成像部分。
根据另一方面，提供了一种用于对样品成像的电子显微镜，其中，所述电子显微镜包括：
-电子源，其配置成沿所述电子显微镜的光轴产生电子束；
-样品固持器；
-用于获取图像的相机***；和
-可编程控制器，其配置成控制所述样品固持器和所述相机***，其中所述可编程控制器被编程为控制所述样品固持器和所述相机***，使得在所述样品固持器围绕第一倾斜轴连续地以及围绕第二倾斜轴连续地倾斜时所述相机可获取所述样品固持器上的样品的一系列倾斜的图像，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的另一独特倾斜角获取每个图像。这允许样品围绕两个不同的倾斜轴倾斜：第一轴和第二轴。这两个轴可以相对于彼此正交。这两个轴可以限定基本上平行于样品限定的平面的平面。与第二倾斜角的改变相比，控制器可以布置成以不同的速度改变第一倾斜角。还可能分配相互不同的幅度。
注意，根据如上所描述的两个方面的电子显微镜可以组合。换句话说，可编程控制器可以配置成使样品围绕第一轴线倾斜，同时并行地改变另一倾斜角并且并行地改变样品相对于电子束的位置。
在电子显微镜的所有实施例中，可以想象用软件对电子显微镜进行编程，并且所述软件使电子显微镜能够执行本文所描述的对样品成像的方法。
附图说明
接下来将参考附图说明本文中所公开的方法和电子显微镜的实施例，其中：
图1-示意性地描绘透射电子显微镜；
图2-示出用于制作样品图像的典型工作流程，所述图像可能是断层照片；
图3a到3b-示出根据本文中所公开的方法的第一方面的示意性扫描图案的实施例，其中连续应用倾斜角和位置运动；
图4a到4c-示出根据所述方法的扫描图案的更多实施例；
图5-示出根据所述方法的另一扫描模式；
图6-示出如本文中所公开的方法的另一方面的曲线图，其中应用第一倾斜角周期和另一倾斜角周期。
具体实施方式
图1（不按比例）是根据本发明的实施例的带电粒子显微镜M的实施例的高度示意性描绘。更具体地说，其示出透射型显微镜M的实施例，在这种情况下，所述透射型显微镜是TEM/STEM。注意，在本发明的上下文中，举例来说，其可以同样有效地为SEM或基于离子的显微镜。
在图1中，在真空外壳2内，电子源4产生电子束B，电子束B沿着电子光轴B'传播并穿过电子光学照明器6，从而用于将电子引导/聚焦到标本S的选定部分上（例如，可以（局部地）薄化/平面化）。还描绘了偏转器8，其可用于实现电子束B的扫描运动。
标本S固持在标本固持器H上，所述标本固持器可通过定位装置/平台A以多个自由度定位，所述定位装置/平台移动其上连接有固持器H的托架A'。标本固持器H可包括可以在XY平面上移动的手指（参见图1中的笛卡尔坐标***），并且通常，平行于Z的运动和围绕X和/或Y倾斜将也是可能的。这种移动允许标本S的不同部分被（在Z方向上）沿轴B'行进的电子束B照明/成像/检查。作为光束扫描的替代方案，移动还允许执行扫描运动。如果需要，可将（未描绘的）可选冷却装置与标本固持器H进行密切的热接触，以便将其（以及其上的标本S）维持在低温下。
电子束B将与标本S相互作用，使得各种类型的“受激”辐射从标本S放射，包含（例如）二次电子、背散射电子、X射线和光学辐射（阴极发光）。可以研究穿过标本S并继续沿轴B'传播的电子。这种传输的电子通量进入成像***24，所述成像***通常将包括各种静电/磁性透镜，偏转器和/或校正器。在正常（非扫描）TEM模式中，这种成像***24可将透射的电子通量聚焦到荧光屏26上，视需要，荧光屏可缩回/收回（如箭头26'所示意性指示）以使其离开轴线B'。将通过屏幕26上的成像***24形成标本S（的部分）的图像（或衍射图），并且这可以通过位于外壳2的壁的适当部分中的观察端口28来查看。例如，屏幕26的缩回机制本质上是机械和/或电气的，且在此处没有描绘。
作为在屏幕26上查看图像的替代方案，可以替代地利用离开成像***24的电子通量的聚焦深度通常非常大（例如，约1米）的事实。因此，可以在屏幕26的下游使用各种其它类型的分析设备，例如：
-TEM相机30。在相机30处，电子通量可以形成静态图像（或衍射图），其可由控制器/处理器20处理且显示在显示装置14上，如例如，平板显示器上。当不需要时，相机30可被缩回/收回（如箭头30'所示意性指示），以使其离开轴B'；
-STEM检测器32。来自检测器32的输出可以被记录为标本S上的电子束B的（X,Y）扫描位置的函数，并且可以构建图像，所述图像是作为X,Y的函数的来自检测器32的输出的“映射”。检测器32可以包括直径为例如20 mm的单个像素，与相机30中特征性地存在的像素矩阵相反。此外，检测器32通常将具有比相机30（例如，每秒102个图像）高得多的采集速率（例如，每秒106个点）。同样，当不需要时，检测器32可被缩回/收回（如箭头32'所示意性指示），以使其远离轴B'。
-作为使用相机30/检测器32成像的替代方案，还可以调用光谱设备34，其可以是例如EELS模块。
应注意，物品30、32和34的顺序/位置不严格，并且可以设想许多可能的变化。举例来说，光谱设备34也可以集成到成像***24中。
在所示出的实施例中，显微镜M还包括可伸缩计算断层扫描（CT）模块，通常由附图标记40指示。在计算断层扫描（也称为断层扫描成像）中，使用源（径向相对的）检测器沿不同的视线观察标本，以便从各种角度获得标本的穿透性观察。可以通过获取倾斜系列（检测每个倾斜处的（S）TEM图像和/或X射线图）来完成CT。可以用检测器22和/或40来检测X射线，区别在于检测器40收集更大的立体角，且因此更快。
注意，控制器（计算机处理器）20经由控制线（总线）20'连接到各种所说明的组件。所述控制器20可以提供各种功能，例如同步动作，提供设定值，处理信号，执行计算，并在显示装置（14）上显示消息/信息。不用说，（示意性地描绘的）控制器20可以（部分地）在外壳2的内部或外部，并且可以根据需要具有整体或复合结构。
注意，图1中所描绘的电子显微镜包括许多组件，许多组件仅出于澄清目的而描述。鉴于本公开，如图1中所示的电子显微镜1被配备用于例如使用电子断层摄影术对样品成像，并且包括：
-电子源4，其配置成沿着电子显微镜1的光轴B'产生电子束B；
-样品固持器H；
-用于获取图像的相机***30；和
-可编程控制器20，其配置成控制样品固持器H和相机***，其中可编程控制器20被编程为控制样品固持器H和相机***30，使得在样品固持器H连续地倾斜时相机可获取样品固持器H上的样品S的一系列倾斜的图像，且在获取倾斜系列的同时并行地改变样品位置，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。作为改变位置的替代方案，可以在获取倾斜系列的同时并行地改变另一倾斜角，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的另一独特倾斜角获取每个图像。在另一实施例中，位置和另一倾斜角并行地改变，以获得倾斜系列，使得以相关联的独特倾斜角、相关联的另一独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。
在实施例中，电子显微镜是透射型电子显微镜，且TEM相机30被用作相机***。然而，在其它实施例中，可以想到，STEM检测器32代替地被用作相机***。
因此，图1示意性地示出了TEM 1。粒子源4沿着光轴B'产生电子束。电子具有通常在80到300 keV之间的可选能量，尽管可以使用较高的能量，例如400 keV到1 MeV，或较低的能量，例如50 keV。电子束由聚光器***6操纵以形成撞击在样品S上的平行束，所述样品定位在样品固持器H上。样品固持器H可以使样品S相对于光轴B'定位，并且可以在垂直于光轴B'的平面（即XY平面）中使样品移位，且使样品相对于垂直于光轴B'的至少一个倾斜轴（即X和/或Y）倾斜。成像***24布置成在像素化检测器32上形成样品的放大图像，从而揭示例如0.1 nm的样品细节。检测器32可以采取例如CCD或CMOS相机的形式。
样品固持器H和相机***32由控制器20控制，并且所述控制器可以被配备为将倾斜系列转换为3D断层照片且使屏幕14上的断层照片可视化。注意，对于可视化，使用了专用软件，例如前面提到的技术说明“Tecnai™断层扫描软件的功能说明”中所述。
控制器126被编程为将经由相机***124获取的图像存储在存储器中，同时控制样品固持器110以受控制的倾斜速度绕倾斜轴114倾斜，且同时控制电子显微镜以改变样品S的取向。样品台能够将样品倾斜较大角度（通常−80到+80度），以便获得足够的数据来重建样品的3D图像。在一个实施例中，样品台H能够通过使样品围绕另一倾斜轴倾斜来改变样品的取向，所述另一倾斜轴特别地垂直于前述倾斜轴。因此，在实施例中，样品台H可以围绕X轴和Y轴倾斜。
在实施例中，所述控制器能够控制样品S相对于光轴B’的位置，以便相对于所述光轴重新定位样品S。这可以通过控制一个或多个偏转器8或通过相应地控制样品固持器H相对于固定光轴B'机械地移动样品S来完成。
根据本文中所公开的方法，在获取一系列倾斜的图像时并行地改变样品的取向，以使得每个图像以相关联的独特倾斜角和相关联的独特取向获取。稍后将参考图2和图3更详细地解释这一点。
图2示出利用如本文中所公开的方法的实施例制作样品的图像的典型工作流程。
在步骤301中，将样品置于TEM中。
在步骤302中，确定感兴趣的体积。这可能涉及标记的位置。TEM可以最优地聚焦在感兴趣的体积上。设置散焦以获得对比度和分辨率之间的最优值。
在步骤303中，将样品置于起始位置，在所述位置中，对感兴趣体积的一部分进行成像。将样品旋转到其第一（极端）倾斜角，例如，-70度。然后样品准备好进行倾斜系列，且可以开始采集。当然还可以有其它起始角度，例如零倾斜。
在步骤304中，开始倾斜系列，并将倾斜逐渐但连续地更改为其另一极端倾斜角度，例如+70度。在步骤305中，在执行步骤304的同时，连续改变样品的位置。这样，感兴趣体积的互不相同的子部分可以被成像。成像的部分可以通过（附加）x/y/z平移保持（散焦）。可以重复步骤304和305（如所指示），直到在步骤306中达到最终位置为止。在改变样品的位置的同时，倾斜度可能会来回逐渐变化，即从-70度改变到+70度，然后再次改变回为-70度。因此，可以在从起始位置到最终位置的并行位置改变期间执行多个倾斜周期。
在步骤307中，一旦获取了所有图像，就将形成倾斜系列的图像对齐。注意，在获取图像时这可能已经开始。
在步骤308中，倾斜系列用于计算断层照片。注意，在仍然获取信息的同时，所述步骤已经开始，从而缩短了所需的总时间。
在步骤309中，基于用户输入（所需的切片平面，角度，厚度，对比度等）显现断层照片。
对本领域技术人员显而易见的是，这只是工作流程的许多实施方案中的一种。举例来说，可以修改工作流程，或者可以添加其它步骤。
作为实例，可以设想，在连续变化倾斜角期间，聚焦设置的序列被并行施用。特别地，这意味着在连续改变倾斜角的期间，焦点也可以连续改变。优选地，与聚焦设置的改变速度相比，倾斜角的改变速度相对较低，使得在相对较小的倾斜范围内，可以应用聚焦设置的周期。然后，在下一个相对较小的倾斜范围内，再次应用另一个聚焦设置的周期。通过在每个（相对较小的）样品倾斜角度范围内捕获对应的分量图像序列，可以确保给定倾斜角度范围内的后续图像具有样品的多个部分，这些部分具有所需的给定聚焦状态（例如，焦点或给定程度的散焦）。本领域技术人员已知，原则上，对于在给定聚焦状态下的倾斜样品，样品上只有一个y坐标将具有所述状态（参见图1中所示的坐标）。因此，在现有技术的透射层析成像中，样品的给定（表面）“层”或“水平”的数学重建图像通常将会表现出欠佳的分辨率和不稳定的功率谱（基本上是由于通过使用混合程度的“模糊”处理数据）。然而，如果在连续倾斜样品的同时改变了焦点设置，那么可以捕获3D成像立方体，所述立方体将允许重建样品上的多个y坐标以选择焦点状态。注意，从以申请人的名义的US 8,912,491 B2中已知，以固定的倾斜角获取聚焦设置的序列，并且在离散的倾斜角间隔的范围内针对每个固定的倾斜角重复所述序列。
尤其可以考虑将位置和倾斜角度互换。这意味着，就像之前一样，在步骤303中选择了起始倾斜角度和起始位置，并且在步骤305中连续更改此倾斜角度，直到在步骤306中达到结束倾斜角度为止。同时，将样品位置从起始位置更改为结束位置，然后再次回到起始位置，以从起始位置到结束位置进行一个或多个其它循环。因此，可以在倾斜角的并行改变期间执行多个位置移动的循环，其可以是从例如-70度到+70度的单个循环，或者也可以是多个循环。
图3至图6给出根据本文中所公开的方法的扫描模式的可能实施例。
图3a示出具有相关的倾斜角和相对于电子束的样品位置的示意性扫描模式。图3b示出与图3a中所示的一部分扫描模式相对应的样品固持器的位置（或时间）和倾斜角的图。
在图3a中，V表示要成像的样品的感兴趣体积。感兴趣体积V（实心正方形）的大小大于相机的可用视场C（虚线）。在此，感兴趣体积V大约等于视场C的九倍。根据现有技术的方法，每个子部分C被访问一次，并且针对相应子部分C获得一系列倾斜的图像。在子部分之间需要一些重叠，以便能够将后续图像拼接在一起。
根据本文中所公开的方法的一个方面，如图3a中所示，样品固持器的倾斜角从起始倾斜位置ts到中间倾斜位置tm以及结束倾斜位置te连续变化。一旦到达结束倾斜位置te，样品被移动返回以再次开始倾斜角ts。在所示的实施例中（图3b），向后倾斜以非常快的速度发生，但是实际上所述速度受到平台的可能性的限制。
同时，在连续改变倾斜角度的同时，样品相对于电子束的位置也发生变化，在起始位置Ps开始并以锯齿形朝向结束位置Pe移动，如图3a中的实例中所示。在此选择样品的倾斜速度和相对运动，以使所有倾斜位置在单个子部分中可见。在实践中，这意味着样品的特定特征将以例如倾斜角度ts进入左侧部分的图像，并以移动速度逐渐移动通过图像，直到其例如以倾斜角te离开右侧部分的图像为止。对于倾斜的多个周期，当然可以增加倾斜速度，以使得特定特征在图像中可见。
如图3a和图3b所示的定位和倾斜运动的效果是，每个图像都是以相关联的独特倾斜角度和相关联的独特位置获取的，并且样品的感兴趣体积V可以快速成像，同时保留与特定视场C相关联的细节。
当然本领域技术人员将清楚的是，所述定位图案和倾斜图案可以根据需要进行修改。图4a和图4b示出两个实施例，其中使用了不同的运动模式（从起始位置Ps到结束位置Pe），且其中摇摆的来回运动用于倾斜角度（另参见图4c，其示出时间或位置与倾斜角的图。
图5示出其中定位运动与倾斜速度相比相对较快的实施例。因此，从起始位置Ps至结束位置Pe，倾斜角以量Δα从ts改变到t2。然后，将样品再次重新放置到起始位置Ps上，并形成另一条轨迹，其中样品以额外的Δα量倾斜。重复所述过程，直到达到从ts到te的期望倾斜范围为止，所述范围可以是例如-70度到+70度。当然也可以想到其它范围。
图6示出的其中第一（固定）倾斜角连续地变化（虚线），且同时第二（固定）倾斜角同样发生变化（实线）的实施例。第二倾斜轴可相对于第一倾斜轴基本上正交。可针对第一和第二倾斜角选择相同变化速度，但在所示出的实施例中，第一倾斜角的变化速度（虚线）与第二倾斜角的变化速度（实线）相比非常低。对于第一倾斜角，倾斜范围可以是-70度至+70度，且对于第二倾斜角，可以是-10度至+10度。其它值也是可以想到的。对于第一角度的相对较小的倾斜范围，可以完成第二倾斜角的整个运动范围。举例来说，第二倾斜角的-10度到+10度的变化可以完成，而第一角度改变大约5度。因此，在-70度至+70度的给定范围内，第二倾斜角的范围完成（140除以5等于）14次。在图6中所示的实施例中，对于第一倾斜角从-70度到+70度的单个周期，第二倾斜角总共完成了25次。将理解的是，其它值也是可以想到的。注意，另外，还可以应用位置的改变（如关于先前的图3至图5所论述）。实现这种倾斜运动的阶段本身是本领域技术人员已知的。
所需保护由所附权利要求书确定。
非专利文献
[-1-]技术说明：“Tecnai™断层扫描软件的功能说明”，FEI公司，2003年12月31日版本。

Claims (13)

1. 一种对样品成像的方法，所述样品安装在电子显微镜中的样品固持器上，所述电子显微镜包括用于沿着光轴产生高能电子束的电子源和用于聚焦和偏转光束以便用所述电子束照射所述样品的光学元件，所述样品固持器能够相对于所述电子束定位和倾斜所述样品，所述方法包括：
- 通过用所述电子束照射所述样品来获取一系列倾斜的图像，以读出速度将所述图像记录在相机上，其中在获取所述系列倾斜的图像的同时连续地改变所述倾斜角；及
- 在获取所述倾斜系列的同时改变所述样品的位置，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的独特位置获取每个图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中改变所述位置包括增加所述样品的成像部分。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述位置是通过所述样品与所述电子束之间的相对运动而改变的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品的所述位置通过相对于所述电子束机械地移动所述样品而连续地改变。
5. 一种对样品成像的方法，所述样品安装在电子显微镜中的样品固持器上，所述电子显微镜包括用于沿着光轴产生高能电子束的电子源和用于聚焦和偏转光束以便用电子束照射所述样品的光学元件，所述样品固持器能够相对于所述电子束定位和倾斜所述样品，所述方法包括：
- 通过用所述电子束照射所述样品来获取一系列倾斜的图像，以读出速度将所述图像记录在相机上，其中在获取所述系列倾斜的图像的同时连续地改变所述倾斜角；及
- 在获取所述系列倾斜的图像的同时改变所述样品的另一倾斜角，使得以相关联的独特倾斜角和相关联的另一独特倾斜角获取每个图像。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述另一倾斜角相对于所述倾斜角正交。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在像素化相机上成像，且以度每秒表示的所述倾斜角的速度、分别以米每秒或度每秒表示的位置或另一倾斜角的所述分别并行改变的速度和以帧每秒表示的所述相机的所述读出速度相匹配，使得在一个帧期间由于倾斜变化而导致的所述图像的位移小于一个像素。
8. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中使用了所述样品的频闪照明。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
相对于彼此应用形成倾斜系列的图像的位移和/或旋转校正。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述位移和/或旋转校是基于以下内容中的一个或多个：
- 使用来自多于两个图像的数据同时校正多个图像的相对位置的算法；
- 基于使用两个图像的数据的算法的成对校正；
- 图像中一个或多个标记的位置。
11.一种被配备用于对样品成像的电子显微镜，所述电子显微镜包括：
- 电子源，其配置成沿所述电子显微镜的光轴产生电子束；
- 样品固持器；
- 用于获取图像的相机***；和
- 可编程控制器，其配置成控制所述样品固持器和所述相机***，其中所述可编程控制器被编程为控制所述样品固持器和所述相机***，使得在所述样品固持器连续倾斜时所述相机能够获取所述样品固持器上的样品的一系列倾斜的图像，且在获取所述倾斜系列的同时改变样品位置，使得以相关联独特倾斜角和相关联独特位置获取每个图像。
12.一种被配备用于对样品成像的电子显微镜，所述电子显微镜包括：
- 电子源，其配置成沿所述电子显微镜的光轴产生电子束；
- 样品固持器；
- 用于获取图像的相机***；和
- 可编程控制器，其配置成控制所述样品固持器和所述相机***，其中所述可编程控制器被编程为控制所述样品固持器和所述相机***，使得在所述样品固持器围绕第一倾斜轴连续地以及围绕第二倾斜轴连续地倾斜时所述相机能够获取所述样品固持器上的样品的一系列倾斜的图像，使得以相关联独特倾斜角和相关联另一独特倾斜角获取每个图像。
13.根据权利要求11或12所述的电子显微镜，其中所述电子显微镜用软件编程，并且其中所述软件使所述电子显微镜能够执行如在权利要求1至9中一或多项中所定义的对样品成像的方法。
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