JP6977287B2 - 複数の蛍光物質を用いた標識方法 - Google Patents
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Description
標的粒子を、最大蛍光波長が互いに異なる3以上の蛍光物質で標識する工程と、
前記標的粒子に励起光を照射する工程と、
前記標的粒子に標識した前記蛍光物質由来の蛍光を、マルチバンドパスフィルタを通して、デジタルカラーカメラで測定する工程と、
を含む前記標的粒子の測定方法であって、
最大蛍光波長が最も短い蛍光物質の最大蛍光波長が、前記マルチバンドパスフィルタの最も短波長側の透過帯の下限よりも短いことを特徴とする測定方法である。
(1−1)がん細胞株PC−9を培養ディッシュで培養し、培養したがん細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液による固定処理およびエタノールによる膜透過処理を行った後、一次抗体としてAnti−Pan CK(サイトケラチン)抗体(マウス由来、自家製)を、二次抗体としてAlexa Fluor 405標識抗マウスIgG抗体(Abcam製)又はAlexa Fluor 350標識抗マウスIgG抗体(Thermo Fisher Scientific製)を、それぞれ用いて細胞質内のCKに対し蛍光物質を標識した。なお、Alexa Fluor 405の最大蛍光波長は421nmであり、Alexa Fluor 350の最大蛍光波長は442nmである(本実施例で用いた蛍光物質の蛍光スペクトルを図1に示す)。
(2−1)がん細胞株PC−9を培養ディッシュで培養し、培養したがん細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液による固定処理およびエタノールによる膜透過処理を行なった後、細胞核、核膜、細胞質内のCKに対し、それぞれ以下に示す方法で蛍光物質を標識した。なお、本実施例で用いた蛍光物質の蛍光スペクトルを図5に示す。
細胞核:SYTOX Green(最大蛍光波長:523nm、Thermo Fisher Scientific製)による染色
核膜:一次抗体Anti−SUN2抗体(ウサギ由来、Sigma Life Science製)を添加後、二次抗体Alexa Fluor 633(最大蛍光波長:633nm)標識抗ウサギ抗体(Thermo Fisher Scientific製)を添加することで標識
細胞質(CK):一次抗体Anti−Pan CK(サイトケラチン)抗体(マウス由来、自家製)を添加後、二次抗体Alexa Fluor 405標識抗マウスIgG抗体(Abcam製)を添加することで標識
(2−2)(1−2)と同様の蛍光顕微鏡、マルチバンドパスフィルタおよびカラーカメラを用いて、蛍光像を取得した。
Claims (2)
- 標的粒子を、最大蛍光波長が互いに異なる3以上の蛍光物質で標識する工程と、
前記標的粒子に励起光を照射する工程と、
前記標的粒子に標識した前記蛍光物質由来の蛍光を、マルチバンドパスフィルタを通して、デジタルカラーカメラで測定する工程と、
を含む前記標的粒子の蛍光輝度を定量的に測定する方法であって、
最大蛍光波長が最も短い蛍光物質の最大蛍光波長が、前記マルチバンドパスフィルタの最も短波長側の透過帯の下限よりも短いことを特徴とする測定方法。 - 前記標的粒子が細胞であって、細胞核を染色するのに、蛍光スペクトルの最大蛍光波長が短波長側から数えて2番目以降となる蛍光物質を用いることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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