CN111197072A - 一种dna的快速提取方法及其在检测低频嵌合基因中的应用 - Google Patents

一种dna的快速提取方法及其在检测低频嵌合基因中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DNA的快速提取方法极其在检测低频嵌合基因中的应用。本发明首先保护一种DNA提取方法，包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理。本发明还保护一种检测嵌合基因的方法，包括如下步骤：(1)DNA提取；DNA提取包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，进行嵌合基因检测。所述进行嵌合基因检测的方法具体可为数字PCR。根据数字PCR的结果，统计嵌合率。本发明可以实现低频嵌合基因检测，简单、快速、准确性高，无局限性。

Description

一种DNA的快速提取方法及其在检测低频嵌合基因中的应用
技术领域
本发明涉及一种DNA的快速提取方法及其在检测低频嵌合基因中的应用。
背景技术
提取DNA的纯度和结构完整性是开展基因组学研究的前提条件，随着分子生物学研究的不断深入，简便有效的DNA提取方法日渐重要。动物的血液DNA含有全基因组的DNA信息，然而血液需要用采血针和专业的医学从业人员抽取，是一种有创的抽取方法。1960年Guthrie运用干血斑检测苯丙酮尿症实验并取得了成功，从而开启了血斑运用于疾病检测的开端。血斑的采集常为足跟或手指的尾血，采集时创伤性相对小，且制成的血斑在存储和运输方面方便。虽然在采集和储存样本方面具有明显的优势，然而生物分析和检验分析要比标准的血浆分析复杂得多，且卡片的添加成分对下游实验会造成一定的干扰。
血斑是血液滴制而成，而血液是由血浆和血细胞组成，血浆内含血浆蛋白(白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原)、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、激素、酶、抗体和细胞代谢产物等，而血细胞有红血球、白血球和血小板。制成血斑后原血液中的蛋白、脂类、无机盐等仍在上面。
嵌合基因是通过重组由来源与功能不同的基因序列剪接而形成的杂合基因，产生的来源通常分为两种，即拷贝数变异(copy number variations，CNV)和单核苷酸变异(single nucleotide variants，SNV)。SNV嵌合是嵌合基因中的一种，在一个相同的个体中，同时存在两种遗传物质不同的细胞，嵌合体的临床表型较杂合突变者轻，甚至可以无症状。
目前检测嵌合基因的方法有主要有两种，第一种为PCR后Sanger检测的方法，第二种为NGS测序的方法。PCR后sanger检测的方法，大致流程为(原理示意图见图1)：提取模板DNA，之后用PCR的方法扩增嵌合基因突变区域，经琼脂糖胶电泳检测合格后以该产物为模板再进行Sanger测序处理，最后根据测序的峰图信息进行嵌合的判断和比例的计算。NGS测序法，大致流程为(原理示意图见图2)：提取模板DNA，进行浓度和纯度的鉴定，样本合格(1μg以上，样本无明显降解)再进行文库的构建，得到的文库质检合格后再进行高通量测序，测序完后再进行信息分析及嵌合比例的计算。提取模板DNA的方法通常为：从血斑中打取5孔血斑，用TE(Tris-EDTA，pH＝8.0)洗清2遍，然后加入蛋白酶K和组织总蛋白裂解液，在55℃孵育1小时，然后加入碱性裂解液在70℃孵育15分钟，然后加入无水乙醇进行沉淀，然后用离心柱进行纯化和回收DNA。PCR后Sanger检测的方法和NGS测序的方法存在如下问题：在血斑处理方面较复杂，需要蛋白酶消化、裂解液、无水乙醇沉淀和过纯化柱纯化等操作，且耗时久；对血斑DNA质量要求较高(尤其是NGS测序的方法)，PCR后Sanger检测的方法中如果DNA纯度不够，含有PCR抑制物的话会存在扩增不出的问题，从而导致无法检测出嵌合基因的现象，NGS测序需要进行文库构建，文库构建需要较高的DNA起始量，存在血斑DNA不达标问题；检测嵌合基因方面流程复杂，尤其是NGS测序法，需要用到提取、文库构建、高通量测序及信息分析等，耗时长且成本高；在检测嵌合基因方面准确度不高，PCR后Sanger的检测方法对嵌合率低于20％的无法准确检出，而NGS测序的方法对嵌合比率低于10％的存在漏检现象。
近年来，随着二代测序(NGS)的发展，一些高频的嵌合基因被检测到，这些嵌合基因的频率在10％-30％之间，且需要较高的测序深度(测序深度100X及以上)，该方法对嵌合基因的检测成本较高，且对低频(小于10％)的嵌合基因存在漏检现象。在疾病家系研究中，把先证者携带突变，其父母不携带突变的称之为De Novo突变。目前De Novo的判断依据是Sanger验证的结果，Sanger测序的方法对嵌合率在20％以上的有准确的检出，而对20％以下的嵌合基因有较低的检出率，从而造成家系研究中遗传于父母嵌合基因的被漏检，使得真正的发病原因被忽视，造成再生再育时出生缺陷患儿再度出现。
现有技术对10％以下的低频嵌合基因无法达到准确的检出。所以亟需一种快速准确的检测低频嵌合基因突变的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA的快速提取方法极其在检测低频嵌合基因中的应用。
本发明首先保护一种DNA提取方法(方法甲)，包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理。
本发明还保护所述方法甲在DNA文库构建中的应用。
本发明还保护所述方法甲在DNA测序中的应用。所述测序具体可为高通量测序。
本发明还保护所述方法甲在嵌合基因检测中的应用。所述嵌合基因具体可为SNV嵌合。所述嵌合基因具体可为疾病相关嵌合基因。所述嵌合基因具体可为遗传性疾病相关嵌合基因。所述嵌合基因可为高频嵌合基因(频率在10％-30％之间)或者低频嵌合基因(频率小于10％)。
本发明还保护一种DNA文库构建的方法(方法乙)，包括如下步骤：
(1)DNA提取；
DNA提取包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理；
(2)末端修复；
(3)核酸片段两端加接头；
(4)扩增反应获得测序文库。
本发明还保护一种DNA测序的方法(方法丙)，包括如下步骤：
(1)DNA提取；
DNA提取包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理；
(2)末端修复；
(3)核酸片段两端加接头；
(4)扩增反应获得测序文库；
(5)进行高通量测序。
本发明还保护一种检测嵌合基因的方法(方法丁)，包括如下步骤：
(1)DNA提取；
DNA提取包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，进行嵌合基因检测。
所述进行嵌合基因检测的方法具体可为数字PCR。根据数字PCR的结果，统计嵌合率。进行嵌合基因检测时，模板DNA的用量具体可为10ng。所述方法中，步骤(1)和步骤(2)之间还包括如下步骤：用磁珠(例如Agencourt AMPure XP磁珠)纯化DNA，然后用1×TE溶液溶解DNA。用磁珠纯化DNA的方法具体可为：静置孵育5分钟，然后用75％乙醇溶液洗涤2次。
数字PCR具体包括如下步骤：
①制备反应体系，然后置于微滴生成仪中进行微滴生成；
②进行数字PCR；
③置于微滴分析仪中，依次进行数据采集和读取。
反应体系中，具有模板DNA。反应体系中具体含有10ng模板DNA。反应体系具体可为22微升体系。反应体系中具有序列表的序列1所示的上游引物，序列表的序列2所示的下游引物，序列表的序列3所示的野生型探针和序列表的序列4所示的突变型探针。反应体系具体见表2。
反应程序具体见表3。
所述嵌合基因具体可为SNV嵌合。所述嵌合基因具体可为疾病相关嵌合基因。所述嵌合基因具体可为遗传性疾病相关嵌合基因。所述嵌合基因可为高频嵌合基因(频率在10％-30％之间)或者低频嵌合基因(频率小于10％)。
本发明提供的检测嵌合基因的方法的原理示意图见图3。
以上任一所述方法中，所述碱性试剂具体可为NaOH。
以上任一所述方法中，所述样本具体可为血斑样本。
以上任一所述方法中，所述样本具体可为具有DNA的样本。以上任一所述方法中，所述样本具体可为具有微量DNA的样本。以上任一所述方法中，所述样本具体可为具有微量目标DNA的样本。以上任一所述方法中，所述样本具体可为具有微量病毒DNA的样本。
以上任一所述方法中，所述碱性试剂处理具体可为采用NaOH水溶液处理。以上任一所述方法中，所述碱性试剂处理具体可为采用10-20mM NaOH水溶液处理。以上任一所述方法中，所述碱性试剂处理具体可为采用15mM NaOH水溶液处理。所述处理的条件具体可为：50℃孵育25分钟。
以上任一所述方法中，所述碱性试剂处理和所述随机打断酶处理之间包括如下步骤：吸弃液体，加入1×TE溶液，混匀后静置，吸弃上清。
以上任一所述方法中，所述随机打断酶处理具体按照表1配制反应体系。反应条件具体可为：37℃15min；65℃10min。
以上任一所述方法中，所述扩增反应可为PCR反应。
本发明还保护一种用于DNA提取的试剂盒，包括碱性试剂和随机打断酶。所述试剂盒还可包括采血卡。
本发明还保护一种用于DNA文库构建的试剂盒，包括用于DNA提取的试剂和用于文库构建的试剂；所述用于DNA提取的试剂包括碱性试剂和随机打断酶。
本发明还保护一种用于DNA测序的试剂盒，包括用于DNA提取的试剂、用于文库构建的试剂和用于高通量测序的试剂；所述用于DNA提取的试剂包括碱性试剂和随机打断酶。
本发明还保护一种用于检测嵌合基因的试剂盒，包括用于DNA提取的试剂和进行嵌合基因检测的试剂；所述用于DNA提取的试剂包括碱性试剂和随机打断酶。所述进行嵌合基因检测的试剂具体可为进行数字PCR的试剂。
以上任一所述试剂盒中，碱性试剂与打断酶的配比可为：1-10000μl碱性试剂：2μl打断酶溶液。以上任一所述试剂盒中，碱性试剂与打断酶的配比可为：10-1000μl碱性试剂：2μl打断酶溶液。以上任一所述试剂盒中，碱性试剂与打断酶的配比可为：100μl碱性试剂：2μl打断酶溶液。
以上任一所述试剂盒中，所述碱性试剂具体可为NaOH。
以上任一所述试剂盒中，所述碱性试剂具体可为NaOH水溶液。以上任一所述试剂盒中，所述碱性试剂具体可为10-20mM NaOH水溶液。以上任一所述试剂盒中，所述碱性试剂具体可为15mM NaOH水溶液。
随机打断酶，是一种对DNA进行随机切割的酶，对位点的切割不具有特异性。随机打断酶可为Vvn(Vibrio vulnificus nuclease)酶、NEBNext dsDNA Fragmentase或DNaseI酶等。以上任一所述随机打断酶具体可为NEB公司的dsDNA Fragmentase。
血斑样本可取自血卡。
以上任一所述血卡既可以是商业的采血卡(如FTA卡)，也可以是普通的采血卡，或是普通的滤纸片。利用低浓度NaOH对血斑中的蛋白等杂质进行变性处理从而从血斑上脱落释放到溶液中，而DNA仍保留在纸片上。用随机打断酶进行切割DNA，是利用随机打断酶随机打断的DNA，使纸片上的DNA释放到溶液中，最后用移液器实现DNA和纸片的分离。NaOH也可替换为其它碱性试剂。
嵌合基因检测具体可采用数字PCR。把一份疑似含低频嵌合的基因的样本分成几万份，分配到不同的反应单元，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，计算出嵌合比率。数字PCR具体采用taqman-MGB探针法，采用一对检测引物和两个探针(分别是野生型探针和突变型探针)。数字PCR也可采用其它方法，例如染料法(SBYgreen试剂)。
本发明提供的方法能够实现嵌合基因的检测，并不局限于某一种特定嵌合基因的检测。
本发明提供的DNA快速提取方法，简便快捷，不需要经历蛋白酶K消化、裂解、沉淀、过柱纯化等步骤。本发明提供的DNA提取方法还可能用于二代文库的构建方面，也可能在应该定量方面存在一定的应用，还可能在分子克隆载体构建方面存在一定的应用，在法医学痕量DNA检测方面也可能存在一定的应用，可能在辅助生殖方面存在一定的应用。
本发明提供的快速检测低频嵌合基因的方法，方法简单，流程快，用时短，极大的提高了检测效率。
实施例中是检测SNV的低频嵌合基因，也可以用于CNV领域低频嵌合基因的检测。CNV领域低频嵌合基因的检测的方法与SNV的低频嵌合基因的检测方法类似，也是通过野生型探针和突变型探针实现定量检测。
本发明可以解决如下问题：
(1)处理方法省去了蛋白酶消化、裂解、沉淀、过柱纯化等步骤，简单快捷，只需两步即可，用时短；
(2)对样本DNA的质量要求不高，不易受PCR抑制物等干扰物的影响；
(3)在检测嵌合基因方面流程简单，只需简单提取DNA和ddPCR检测两个实验步骤，总共用时2小时左右，方便快捷；
(4)在检测嵌合基因方面准确度高，检测频率可达0.01％水平，不存在低水平嵌合漏检现象，使之前被忽视的嵌合现象得到了检出,从而为遗传咨询提供支持。
本发明可以实现基于血斑的低频嵌合基因检测，简单、快速、准确性高，无局限性，可对低水平父母嵌合遗传机制进行精准的检测，从而避免出生缺陷的发生，为再生再育提供有力支持。
附图说明
图1为PCR后sanger检测的方法的大致流程原理示意图。
图2为NGS测序法的大致流程原理示意图。
图3为本发明的检测嵌合基因的方法的大致流程原理示意图。
图4为实施例1中SZCH052、SZCH052F、SZCH052M、空白对照和阴性对照的1D图。
图5为实施例1中SZCH052的2D图。
图6为实施例1中SZCH052F的2D图。
图7为对比例1中SZCH052、SZCH052F、SZCH052M、空白对照和阴性对照的1D图。
图8为对比例1中SZCH052的2D图。
图9为对比例1中SZCH052F的2D图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中所用的水均为Nuclease-Free Water。实施例中，各项检测均是在受试者知情同意的前提下进行的。
本发明中用于示例的为SNV嵌合。实施例中的孩子为已经验证的De novo突变，嵌合点及其在基因组上的周边序列如序列表的序列5所示，嵌合点位于序列5的第113位,野生型为G，突变型为A。
QX200微滴式数字PCR***为bio-rad公司产品，包括微滴生成仪和微滴分析仪。微滴生成仪按照《微滴自动生成仪操作手册》进行操作(https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10043138.pdf)。微滴分析仪按照《QX200微滴读取仪操作手册》进行操作(https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/AW16000573.pdf)。采用Bio-rad公司的QuantaSoft软件查看读取的数据(进行初步质控，包括微滴数目是否异常，燥值是否异常，1D图像是否异常，2D图像是否可靠等，如有异常则需要手工校正)。
实施例中的1×TE缓冲液为AMBION公司的TE缓冲液(pH8.0)。2×ddPCRTM Supermixfor Probes(No dUTP)：BIO-RAD公司，货号1863025。打孔器：HOMESING公司，型号为H809。
实施例1、
受试者：1个家系的父亲、母亲和孩子，孩子编号为SZCH052，父亲编号为SZCH052F,母亲编号为SZCH052M。此家系为结节性硬化疾病相关，全基因组测序(whole genomesequencing，WGS，测序深度30X)后Sanger验证，结果显示，孩子为De novo突变(基因及坐标信息为：TSC2，NM_000548.4:c.3284+1G>A，对应基因组坐标(人类基因组hg19)NG_005895.1：2129430)。因此，本实施例通过1个嵌合点(基因及坐标信息为：TSC2，NM_000548.4:c.3284+1G>A，NG_005895.1：2129430)来验证本发明方法的可行性。实施例中，第一探针为与参考基因组序列信息一致的探针，第二探针为含嵌合基因突变的探针。
1、获得血斑样本
采集受试者的指尖血，滴至采集卡上形成血斑，每个采集卡上设有同一受试者的3-5个血斑，风干后，得到血斑样本。
2、提取DNA
(1)取血斑样本，用打孔器打孔，获得血斑。
(2)向0.2ml的EP管中加入3个步骤(1)获得的血斑，然后加入100μl 15mM NaOH水溶液,轻微震荡，然后50℃孵育25分钟，然后吸弃液体，然后加入100μl 1×TE溶液，混匀后静置，吸弃上清。
(3)完成步骤(2)后，取所述EP管，按照表1加入各个试剂，然后进行反应，然后吸取上清液至新的EP管中。
表1
试剂 加入量
10×缓冲溶液 5μl
打断酶 2μl
200mM氯化镁水溶液 1.5μl
水 41.5μl
表1中采用的打断酶为NEB公司的dsDNA Fragmentase，10×缓冲溶液为该打断酶商购时的配套缓冲液。
反应条件：37℃15min；65℃10min。
(4)取步骤(3)得到的装有上清液的EP管，加入60μl Agencourt AMPure XP磁珠(AGENCOURT，货号A63881)，静置孵育5分钟，然后用75％乙醇溶液洗涤2次，然后用30μl 1×TE溶液溶解DNA，然后置于磁力架上，吸取上清液(该上清液即为DNA溶液)至一新的EP管中。
(5)取步骤(4)得到的DNA溶液，检测DNA浓度。
SZCH052得到的DNA溶液的DNA浓度为3.46ng/μl。
SZCH052F得到的DNA溶液的DNA浓度为4.6ng/μl。
SZCH052M得到的DNA溶液的DNA浓度为2.06ng/μl。
3、检测嵌合基因检测
①制备反应体系(反应体系见表2)，然后置于微滴生成仪中进行微滴生成，然后从微滴自动生成仪中取出盛有微滴的96孔板，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜。
表2
组分 体积(μl)
2×ddPCR<sup>TM</sup> Supermix for Probes(No dUTP) 10
上游引物(10pmol/μl) 0.9
下游引物(10pmol/μl) 0.9
第一探针(2.5pmol/μl) 1
第二探针(2.5pmol/μl) 1
模板溶液 8.2
共计 22
模板溶液：取步骤2得到的DNA溶液，用水稀释，得到模板溶液；每8.2μl模板溶液含10ng DNA。
上游引物(序列表的序列1)：5’-ACCTGGCTGGTTGGGAACAAG-3’；
下游引物(序列表的序列2)：5’-CACGCACAGGGTGGACTTAGT-3’；
第一探针(序列表的序列3)：5’-(HEX)-AGTCGAGGTGACTGCACC-(MGB)-3’；
第二探针(序列表的序列4)：5’-(6-FAMA)-GTCGAGATGACTGCACC-(MGB)-3’。
用等体积水代替模板溶液，作为空白对照。
阴性对照为检测区域内无嵌合突变的正常男性样本，该样本为亚洲人基因组样本样本(标准数据集样本)。
②取步骤①得到的96孔板，置于PCR仪中，进行数字PCR(反应程序见表3)。
表3
Figure BDA0001870543920000081
③完成步骤②后，取所述96孔板，置于微滴分析仪中，依次进行数据采集和读取。
SZCH052、SZCH052F、SZCH052M、空白对照和阴性对照进行上述步骤后的1D图见图4。图4为5例血斑DNA样本的1D图；D04为空白对照，D03为SZCH052，F03为SZCH052F，E03为SZCH052M,C04为阴性对照；黑色的横线为划定的阈值线，阈值线以上为有效微滴，阈值线以下为燥值；上图为突变型荧光检测结果；下图为野生型荧光检测结果。
SZCH052进行上述步骤后的2D图见图5。图5为SZCH052样本的2D图，分为4个象限，左上角为突变型阳性微滴，左下角为燥值微滴，右上角为双阳性微滴，右下角为野生型阳性微滴。图中左上角存在大量的阳性微滴。
SZCH052F进行上述步骤后的2D图见图6。图6为SZCH052F样本的2D图，分为4个象限，左上角为突变型阳性微滴，左下角为燥值微滴，右上角为双阳性微滴，右下角为野生型阳性微滴。图中左上角存在1个阳性微滴。
④计算嵌合率。
嵌合率＝突变型微滴数/(突变型微滴数+野生型微滴数)。
嵌合率的结果见表4。
表4
样本 阳性微滴数 阴性微滴数 嵌合率
空白对照 0 0 0
SZCH052 181 178 50.41％
SZCH052F 1 268 0.37％
SZCH052M 0 120 0
阴性对照 0 199 0
对比例1、
受试者即为实施例1中的受试者。
1、采集受试者的外周血样本。
2、采用试剂盒(DNA Blood mini kit，qiagen，货号51106)，从外周血样本中提取DNA，得到DNA溶液。
3、检测嵌合基因检测
8.2μl模板溶液含20ng DNA。其他同实施例1的步骤3。
SZCH052、SZCH052F、SZCH052M、空白对照和阴性对照进行上述步骤后的1D图见图7。图7为5例外周血样本的1D图；F01为空白对照，G01为SZCH052，H01为SZCH052F，A02为SZCH052M,B02为阴性对照；黑色的横线为划定的阈值线，阈值线以上为有效微滴，阈值线以下为燥值；上图为突变型荧光检测结果；下图为野生型荧光检测结果。
SZCH052进行上述步骤后的2D图见图8。图8为SZCH052样本的2D图，分为4个象限，左上角为突变型阳性微滴，左下角为燥值微滴，右上角为双阳性微滴，右下角为野生型阳性微滴。图中左上角存在大量的阳性微滴。
SZCH052F进行上述步骤后的2D图见图9。为SZCH052F样本的2D图，分为4个象限，左上角为突变型阳性微滴，左下角为燥值微滴，右上角为双阳性微滴，右下角为野生型阳性微滴。图中左上角存在3个阳性微滴。
嵌合率的结果见表5。
对比例1和实施例1的检测结果基本一致,SZCH052F样本均存在低水平嵌合。表5
样本 阳性微滴数 阴性微滴数 嵌合率
空白对照 0 0 0
SZCH052 1487 1500 49.78％
SZCH052F 3 2036 0.14％
SZCH052M 0 2614 0
阴性对照 0 2312 0
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种DNA的快速提取方法及其在检测低频嵌合基因中的应用
<130> GNCYX182008
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
acctggctgg ttgggaacaa g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cacgcacagg gtggacttag t 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
agtcgaggtg actgcacc 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gtcgagatga ctgcacc 17
<210> 5
<211> 240
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
aaaacctggc tggttgggaa caagcttgtc actgtgacga caagcgtggg aaccgggacc 60
cggtcgttac taggcctgga ctcgggggag ctgcagtccg gcccggagtc gaggtgactg 120
caccttcctt tcctccgcgc ctgccagcct cgacaccggc tgtcccgagc ccaggcccac 180
gtggcaccct cgtaccagcc tggggactaa gtccaccctg tgcgtgggat tctcttctca 240

Claims (10)

1.一种DNA提取方法，包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述碱性试剂为NaOH。
3.权利要求1或2所述方法在DNA文库构建中的应用。
4.权利要求1或2所述方法在DNA测序中的应用。
5.权利要求1或2所述方法在嵌合基因检测中的应用。
6.一种DNA文库构建的方法，包括如下步骤：
(1)DNA提取；
DNA提取包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理；
(2)末端修复；
(3)核酸片段两端加接头；
(4)扩增反应获得测序文库。
7.一种DNA测序的方法，包括如下步骤：
(1)DNA提取；
DNA提取包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理；
(2)末端修复；
(3)核酸片段两端加接头；
(4)扩增反应获得测序文库；
(5)进行高通量测序。
8.一种检测嵌合基因的方法，包括如下步骤：
(1)DNA提取；
DNA提取包括如下步骤：取样本，依次进行碱性试剂处理和随机打断酶处理；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，进行嵌合基因检测。
9.一种试剂盒，包括碱性试剂和随机打断酶。
10.一种用于检测嵌合基因的试剂盒，包括用于DNA提取的试剂和进行嵌合基因检测的试剂；所述用于DNA提取的试剂包括碱性试剂和随机打断酶。
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