CN109536588A - 检测ffpe样本氧化状态的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测FFPE样本氧化状态的方法及装置。其中，该方法包括以下步骤：S1，获取待检测FFPE样本的目的基因的序列信息；以及S2，对序列信息进行分析，筛选出体细胞位点变异信息，通过计算其中特定类型突变比例确定待检测FFPE样本的氧化状态。应用本发明的技术方案，基于测序数据进行样本氧化状态的判定，由于可以节省阳性参考品和阴性参考品，因此，节约了成本，并且具有高灵敏性和高特异性的特点。

Description

检测FFPE样本氧化状态的方法及装置
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测FFPE样本氧化状态的方法及装置。
背景技术
在肿瘤样本中，常常由于各种体细胞变异导致肿瘤的发生发展，准确地评估体细胞变异对于指导患者治疗具有重要的作用。然而，FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE，***固定石蜡包埋)肿瘤样本由于保存时间较长及条件有限等原因常常出现氧化，然而氧化也会导致碱基的变异，这种氧化导致的变异及体细胞变异不易区分，所以，使得人们无法准确评估FFPE样本的体细胞变异。因此，准确地判定FFPE样本氧化状态对于体细胞变异的检测具有重要的作用。
现有方法常常不会直接判定FFPE样本氧化状态，而是根据二代测序通用技术指导原则，在每个批次设计阳性参考品和阴性参考品。然而在真实的临床实践中，往往由于成本优先的考量，忽略了参考品的购买与设置，存在样本氧化状态不能够准确识别的风险。
因此，亟待解决无参考品的样本氧化检测存在的不能够准确识别的问题。
发明内容
本发明旨在提供一种检测FFPE样本氧化状态的方法及装置，以解决现有技术中无参考品的样本氧化检测存在的不能够准确识别的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测FFPE样本氧化状态的方法。该方法包括以下步骤：S1，获取待检测FFPE样本的目的基因的序列信息；以及S2，对序列信息进行分析，筛选出体细胞位点变异信息，通过计算其中特定类型突变比例确定待检测FFPE样本的氧化状态。
进一步地，S1包括：通过目标区域捕获技术从DNA中获取目的基因的扩增产物，然后通过高通量测序方法得到序列信息。
进一步地，S2中筛选体细胞位点变异信息包括对重复区附近突变进行过滤。
进一步地，S2中筛选体细胞位点变异信息还包括对链偏好性位点及低频变异进行过滤。
进一步地，特定类型突变比例为胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤。
进一步地，通过计算其中特定类型突变比例确定待检测FFPE样本的氧化状态包括：根据已知氧化状态的FFPE样本和未氧化的FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例设定阈值；将待检测FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例与阈值进行比较进而确定待检测FFPE样本的氧化状态。
进一步地，已知氧化状态的FFPE样本和未氧化的FFPE样本分别为多个样本。
进一步地，S1中对进行高通量测序后包括数据处理的步骤，数据处理的步骤包括：利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因上，未比对上的序列形成软截断，然后根据比对的位置进行排序，并用samtools软件建立index；使用VarScan软件输入比对后文件进行变异检出。
进一步地，利用BWA-mem比对软件将高通量测序序列比对到参考基因上。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测FFPE样本氧化状态的装置。该装置用于储存或运行模块，或者模块为装置的组成部分；其中，模块为多个，模块用于执行上述任一种方法。
应用本发明的技术方案，基于测序数据进行样本氧化状态的判定，由于可以节省阳性参考品和阴性参考品，因此，节约了成本，并且具有高灵敏性和高特异性的特点。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本发明一实施方式的检测FFPE样本氧化状态的方法的流程示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对背景技术中记载的技术问题，本发明基于测序数据进行样本氧化状态判定，利用样本中检测到的所有体细胞变异，辅之自行设计的过滤流程及阈值设定等方法来确定样本的氧化状态，提出了以下技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种检测FFPE样本氧化状态的方法。该方法包括以下步骤：S1，获取待检测FFPE样本的目的基因的序列信息；以及S2，对序列信息进行分析，筛选出体细胞位点变异信息，通过计算其中特定类型突变比例确定待检测FFPE样本的氧化状态。
应用本发明的技术方案，基于测序数据进行样本氧化状态的判定，由于可以节省阳性参考品和阴性参考品，因此，节约了成本，并且具有高灵敏性和高特异性的特点。
优选的，S1包括：通过目标区域捕获技术从DNA中获取目的基因的扩增产物，然后通过高通量测序方法得到序列信息。结合目标区域捕获的高通量测序技术，进一步提高了该方法的灵敏性和特异性。
根据本发明一种典型的实施方式，S2中筛选体细胞位点变异信息包括对重复区附近突变进行过滤，进一步降低后续用于计算特定类型突变比例的体细胞位点变异的假阳性。优选的，S2中筛选体细胞位点变异信息还包括对链偏好性位点及低频变异进行过滤，有利用提高后续待检测FFPE样本的氧化状态判定的准确性。
优选的，特定类型突变比例为胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤，采用这种比例能够很好的对FFPE样本的氧化状态进行判定。通常，氧化状态的FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例高于60％；未氧化的FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例低于40％。
根据本发明一种典型的实施方式，通过计算其中特定类型突变比例确定待检测FFPE样本的氧化状态包括：根据已知氧化状态的FFPE样本和未氧化的FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例设定阈值；将待检测FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例与阈值进行比较进而确定待检测FFPE样本的氧化状态。例如，可以将已知氧化状态的FFPE样本和未氧化的FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例的中间值设定为阈值，当待检测FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例偏向氧化状态的FFPE样本的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例时，则判定待检测FFPE样本为氧化状态，反之，为未氧化样本。
为了提高所设定阈值的准确性，优选的，已知氧化状态的FFPE样本和未氧化的FFPE样本分别为多个样本。
根据本发明一种典型的实施方式，S1中对进行高通量测序后包括数据处理的步骤，数据处理的步骤包括：利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因上，未比对上的序列形成软截断，然后根据比对的位置进行排序，并用samtools软件建立index；使用VarScan软件输入比对后文件进行变异检出。优选的，利用BWA-mem比对软件将高通量测序序列比对到参考基因上。
在本发明一种典型的实施方式中，用于检测FFPE癌症样本氧化状态的主要步骤如下：1)样本预处理并提取DNA；2)目标区域捕获原理使用特定序列的探针捕获样本的体细胞变异位点；3)通过高通量的方法进行测序，得到序列；4)过滤掉低质量的序列，利用本发明的判定流程进行检测。
具体步骤如下(参见图1)：
在本实施方式中，具体操作主要分为两大部分，第一部分为检测程序外完成部分，第二部分为检测程序内完成部分。
第一部分：样本处理
Step1：样本DNA提取、打断、加接头、杂交捕获、洗脱、富集、测序。
第二部分：数据处理，如图1所示的流程，包括检测程序外完成和检测程序内完成两部分。其中，检测程序外完成主要包括：下机数据利用BWA-mem比对软件将高通量测序序列比对到人类参考基因上，未比对上的序列形成软截断；然后根据比对的位置进行排序，并用samtools软件建立index。检测程序内完成主要包括：肿瘤样本比对后序列及对照样本比对后序列使用VarScan2软件对比对上的序列进行变异检测；判定体细胞变异中发生单核苷酸位点的变异，对以上变异中重复区附近突变进行过滤；对链偏好性位点及低频变异进行过滤；最后，使用过滤后得到的体细胞变异计算氧化导致变异所占比例，即胞嘧啶转换为胸腺嘧啶/鸟嘌呤转换为腺嘌呤(C>T/G>A)变异所占比例，确定该例FFPE样本的氧化状态。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种检测FFPE样本氧化状态的装置。该装置用于储存或运行模块，或者模块为装置的组成部分；其中，模块为多个，模块用于执行上述任一种方法。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果，在本实施例中没有明确限定的方法、标准或试剂均可采用本领域的常规方法、本领域认可的标准或常规试剂来实现而不会对检测结果造成实质性的影响。
实施例1
在本实施例中，具体操作主要分为两大部分，第一部分为检测程序外完成部分，第二部分为检测程序内完成部分。
在本实施例中，第一部分中待检的样本是已知发生强氧化的肺癌FFPE病理样本及相应的对照样本。本实施例中，覆盖的目的基因包含多癌种相关基因，共计549个。主要基因有：EGFR、ALK、ROS1、ERBB2、BRAF、KRAS、NRAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3等。
在本发明的实施例中，主要试剂用品是市售的，信息如下表1：
表1
具体操作步骤如下：
1.样本预处理并提取DNA，利用荧光定量计(Qubit)进行定量，其浓度为3.8ng/μl，体积为130μl；利用超声破碎仪(Covaris)对样品进行片段化，使DNA片段大小在200～400bp之间，然后利用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合要求。
2.先将片段化的样品进行磁珠纯化，然后进行末端修复和3’端腺苷化，体系配置见下表2，基本步骤如下：先在20℃温浴30min，其次在65℃温浴30min结束反应。
表2
末端修复和3’端腺苷化缓冲液 7μl
末端修复和3’端腺苷化酶混合液 3μl
DNA 50μl(500ng)
3.将上述修复后的DNA进行接头(通用商业接头：NEXTflex DNA Barcodes-24)连接，接头连接体系详见下表3，在20℃温浴15min。
表3
试剂 体积
带标签的接头 2.5μl
DNA样品 60μl
连接反应液 30μl
连接酶 10μl
无核酸酶的水 7.5μl
4.将上述接头连接后的产物进行磁珠纯化，然后进行PCR扩增，得到足量的带接头的DNA片段，基本步骤如下：先在98℃预变性45s，其次在98℃变性15s，然后在60℃退火30s，72℃延伸30s；重复变性退火延伸过程7次；最后在72℃延伸1min，结束反应。扩增体系见下表4：
表4：
5.对PCR扩增产物进行磁珠纯化后，利用Qubit定量得到浓度后，取出500ng扩增产物(P5接头端引物，SEQ ID NO.1：aatgatacggcgaccaccgaga，P7接头端引物，SEQ ID NO.2：caagcagaagacggcatacgag)，使用浓缩仪将扩增产物体积浓缩到4.4μl，然后进行封闭和探针(商购自安捷伦)杂交，杂交反应体系如下表5所示。
表5
试剂 体积
封闭试剂混合液 5.6μl
P5、P7封闭试剂 2μl
快速封闭试剂 5μl
RNA酶封闭试剂 2μl
针对目标区域的生物素探针 2μl
杂交缓冲液 6μl
无核酸酶的水 3μl
PCR扩增产物 4.4μl
杂交反应条件如下表6所示：
表6
6.使用链霉亲合素磁珠对探针结合的样品进行捕获，步骤如下：将50μl磁珠加入1.5ml离心管，置于磁力架上，弃上清，用200μl连接缓冲液清洗三遍后，使用200μl连接缓冲液重悬磁珠，将与探针杂交的样品加入磁珠，混匀仪上颠倒混匀30min，置于磁力架上，弃上清，用清洗液1清洗1遍，然后用预热到65℃的清洗液2清洗3遍，期间保证磁珠和缓冲液2的温度在65℃。最后置于磁力架上，弃上清，加入38μl无核酸酶的水，重悬磁珠。
7.将磁珠捕获到的DNA片段进行PCR扩增，扩增体系见下表7，得到足量的加上接头(通用商业接头：NEXTflex DNA Barcodes-24)的DNA片段，基本步骤如下：先在98℃预变性2min，其次在98℃变性30s，然后在60℃退火30s，72℃延伸1min；重复变性退火延伸过程14次；最后在72℃延伸5min，结束反应。
表7
试剂 体积
高保真DNA聚合酶 1μl
扩增引物(P5接头端引物和P7接头端引物) 1μl
高保真DNA聚合酶反应混和液 10μl
单核苷酸混合液 0.5μl
磁珠上的目标区域DNA 37.5μl
8.将得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，然后利用qPCR定量，利用2100进行片段大小检测。
9.测序，在基因测序仪上完成测序，测序平台将得到的光信号转化为碱基序列下机数据为fq文件存储所有测序片段结果。
在本实施例的第二部分中，将下机数据fq文件比对上参考基因组，去除低质量序列，使用本实施例的检测流程进行检测。
流程参见图1，主要包括以下步骤：肿瘤样本比对后序列及对照样本比对后序列使用VarScan2软件对比对上的序列进行变异检测；判定体细胞变异中发生单核苷酸位点的变异，对以上变异中重复区附近突变进行过滤；对链偏好性位点及低频变异进行过滤；最后，使用过滤后得到的体细胞变异计算氧化导致变异所占比例，即胞嘧啶转换为胸腺嘧啶/鸟嘌呤转换为腺嘌呤(C>T/G>A)变异所占比例，确定该例FFPE样本的氧化状态。
样本检测结果为：该例样本氧化状态分值为0.7，大于目前设定的阈值0.55。高于该阈值被判定为样本氧化，与样本真实状态一致。
使用10例已知氧化状态的FFPE样本进行检测，所有样本均可以正确判定，具体见表8。
表8
样本编号 样本类型 真实状态 氧化评分 氧化判定 是否一致
S1 肺癌样本 氧化 0.92 氧化 一致
S2 肺癌样本 氧化 0.81 氧化 一致
S3 肺癌样本 氧化 0.76 氧化 一致
S4 肺癌样本 氧化 0.66 氧化 一致
S5 肺癌样本 氧化 0.85 氧化 一致
S6 肺癌样本 未氧化 0.33 未氧化 一致
S7 肺癌样本 未氧化 0.32 未氧化 一致
S8 肺癌样本 未氧化 0.41 未氧化 一致
S9 肺癌样本 未氧化 0.28 未氧化 一致
S10 肺癌样本 未氧化 0.34 未氧化 一致
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：与设置阳性和阴性参考品的方法相比，本方法检测的精度更高，可以得到明确的判定阈值。除此之外，发展的检测流程可以很好地利用病理样本和对照样本的测序数据，辅之自行设计的过滤流程，能够准确地进行样本氧化状态识别，使得在参考品缺失的情况下识别样本氧化状态成为可能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京优迅医学检验实验室有限公司
<120> 检测FFPE样本氧化状态的方法及装置
<130> PN102118YXYX
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<223> P5接头端引物
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<223> P7接头端引物
<400> 2
caagcagaag acggcatacg ag 22

Claims (10)

1.一种检测FFPE样本氧化状态的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，获取待检测FFPE样本的目的基因的序列信息；以及
S2，对所述序列信息进行分析，筛选出体细胞位点变异信息，通过计算其中特定类型突变比例确定所述待检测FFPE样本的氧化状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1包括：通过目标区域捕获技术从DNA中获取所述目的基因的扩增产物，然后通过高通量测序方法得到所述序列信息。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中筛选体细胞位点变异信息包括对重复区附近突变进行过滤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2中筛选体细胞位点变异信息还包括对链偏好性位点及低频变异进行过滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定类型突变比例为胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述通过计算其中特定类型突变比例确定所述待检测FFPE样本的氧化状态包括：
根据已知氧化状态的FFPE样本和未氧化的FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例设定阈值；
将所述待检测FFPE样本中胞嘧啶突变为胸腺嘧啶/鸟嘌呤突变为腺嘌呤的比例与所述阈值进行比较进而确定所述待检测FFPE样本的氧化状态。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述已知氧化状态的FFPE样本和未氧化的FFPE样本分别为多个样本。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1中对进行高通量测序后包括数据处理的步骤，所述数据处理的步骤包括：利用比对软件将高通量测序序列比对到参考基因上，未比对上的序列形成软截断，然后根据比对的位置进行排序，并用samtools软件建立index；使用VarScan软件输入比对后文件进行变异检出。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用BWA-mem比对软件将高通量测序序列比对到参考基因上。
10.一种检测FFPE样本氧化状态的装置，其特征在于，所述装置用于储存或运行模块，或者所述模块为所述装置的组成部分；其中，所述模块为多个，所述模块用于执行如权利要求1至9中任一项所述的方法。
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