CN111187339A - 一种从发酵液中提取fr901379的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从发酵液中提取FR901379的方法，该方法通过将米卡芬净前体化合物FR901379发酵液进行固液分离，经萃取、浓缩、盐析、硅藻土吸附和过滤，得到米卡芬净前体化合物FR901379和硅藻土混合物。本发明在米卡芬净前体化合物FR901379的纯化步骤避免了柱层析纯化，减少了有机溶剂的使用量，简化了制备过程，适合于米卡芬净前体化合物FR901379的大规模工业化生产。

Description

一种从发酵液中提取FR901379的方法
技术领域
本文明涉及生物制药领域，具体涉及一种从发酵液中提取米卡芬净前体的工业化制备方法。
背景技术
米卡芬净(Micafungin)是通过对Coleophoma empetri的天然产物进行改造，化学合成得到的新型棘白菌素类抗真菌药物；它对念珠菌如白念珠菌、光滑念珠菌、热代念珠菌、克柔念珠菌和***滑念珠菌有较好的抑制活性，对于曲霉也有良好的体外抑制活性。米卡芬净(Micafungin)由日本藤泽公司开发，于2002年12月在日本上市，商品名为Fungusrd，2005年3月通过美国FDA认证，目前仅被批准用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS患者中性粒细胞减少症的预防治疗。米卡芬净是继卡泊芬净后获批的第二个棘白菌素类抗真菌药物，米卡芬净可以特异性抑制真菌细胞壁的组成成分β(1,3)-D-葡聚糖的合成，破坏真菌细胞结构，使之溶解。
近年来，深部真菌感染的发病率开始呈现明显的上市趋势，且随着抗真菌药物的运用，真菌的耐药性也越来越强，因此，抗深部真菌感染的药物已成为抗感染药的研究热点之一。迄今为止，主要有三类药物可用于***的抗真菌治疗：多烯类，如两性霉素B及其脂质体；唑类，如伏立康唑；棘球白素，如卡泊芬净、米卡芬净。自1958年至今，两性霉素B由于严重的输液反应、肾毒性及贫血等不良反应而限制了它在临床中的广泛应用。二唑类药物也因对肾脏及视网膜的副作用以及与其他药物间的相互作用而使用受限。棘球白素类，特别是米卡芬净因其副作用小，安全性较高，日益引起人们的关注。
米卡芬净(Micafungin,FK463)是一种半合成的棘白菌素类抗深部真菌感染化合物。米卡芬净的合成，首先由真菌Coleophoma empetri发酵生产环脂肽化合物FR901379，然后FR901379由酰化酶水解切除边链，获得FR179642，再通过化学修饰制备米卡芬净。
Figure BDA0002275479620000021
目前国内对于从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺几乎没有报道，国外主要是一些大的制药公司进行了相关研究，但主要是集中在实验室小规模的提取，而且提取工艺路线较长，产品的收率很低，用到的溶剂种类比较多，有些溶剂对人体及环境的影响比较大，不适合大规模工业化生产。
WO2011/121599A1从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用溶剂从发酵液中把棘白菌素类化合物萃取出来；再进行液液萃取除去部分杂质；活性炭脱色后，利用吸附剂进行吸附，最后经过解析、浓缩、沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；对发酵液进行液液萃取、对含目标组分的萃取液进行液液萃取的过程中，都会产生混合溶剂层，而且水相中会不同程度溶解有机相，直接排放会造成污染，回收又会增大成本；使用的吸附剂价格贵，不容易彻底再生，使用寿命有限。
US5194377和US5202309从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用第一种溶剂从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；再进行多次液液萃取，使棘白菌素类化合物在两相中进行转移除去部分杂质；含有棘白菌素类化合物的萃取液再经过多种不同的色谱柱进行层析，最后经过解析、浓缩、溶剂沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；对发酵液进行液液萃取、对含目标组分的萃取液进行液液萃取的过程中，都会产生混合溶剂层，而且水相中会不同程度溶解有机相，直接排放会造成污染，回收又会增大成本；同时使用的吸附剂种类多，价格贵，不容易彻底再生，使用寿命有限；工艺路线长，最后总收率比较低。
US661082282和US2008/0108806A1从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用异丁醇从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；含棘白菌素类化合物的异丁醇浓缩后进行水洗，再加入甲醇-正庚烷进行液液萃取，形成两相：有机相(异丁醇-正庚烷)和水相(甲醇-水)，棘白菌素类化合物转入水相中；水相浓缩除去甲醇后再加入异丁醇进行液液萃取，棘白菌素类化合物转入异丁醇中；浓缩除去异丁醇后，加入乙腈进行沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；对含目标组分的异丁醇萃取液进行水洗，以及及加入甲醇-正庚烷进行液液萃取的过程中，会产生混合溶剂层，而且水相中会不同程度溶解有机相，直接排放会造成污染，回收又会增大成本；提取过程中液液萃取使用的有机相是混合溶剂，回收难度比较大。
US2010/0249371A1中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用第一种溶剂从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；然后真空浓缩除去部分溶剂后，加入金属盐类吸附剂(例如磷酸钙)得到棘白菌素类化合物-磷酸钙复合物；再用第二种溶剂从该复合物中把棘白菌素类化合物溶解出来，浓缩除去第二种溶剂后，加入第三种溶剂进行沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；提取过程中加入了金属盐类化合物，不可避免的会在产品中有残留，需要进一步纯化来去除金属离子。
CN101659693和CN101659692A中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用第一种溶剂从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；浓缩除去第一种溶剂后，用第二种溶剂再次进行萃取；浓缩除去第二种溶剂后，重新用第一种溶剂溶解棘白菌素类化合物，依次用酸性氧化铝柱、吸附树脂柱、反相树脂柱进行层析操作；解析液浓缩后，加入溶剂沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，溶剂的使用量比较大；提取的路线较长，要经过多次层析，总收率会比较低；吸附剂种类多，再生过程会使用不同种类的溶剂，增大回收难度，提高了提取成本。
WO9611210中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用丙酮从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；浓缩除去丙酮后，用乙酸乙酯萃取后再用正丁醇萃取；浓缩除去部分正丁醇后，依次经过两次硅胶柱层析、离心色谱层析，再两次硅胶柱层析，最后解析液浓缩至干，加入少量水溶解后再调pH至7.0，冻干得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；用乙酸乙酯及正丁醇萃取液过程中，会产生混合溶剂层，回收，回收难度比较大；层析步骤多，最后收率比较低，再加上中间有一步离心色谱层析，不适合工业化生产使用；层析介质种类多，再生过程会使用不同种类的溶剂，增大回收难度，进一步提高了提取成本。
US4024245、US4024246和US4288549中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用甲醇对发酵液进行萃取，再用氯仿对甲醇萃取液进行液液萃取，浓缩除去氯仿后，加入***使棘白菌素类化合物生成沉淀；沉淀重新溶解后，经过反相树脂柱层析，解析液用氯仿萃取后再次浓缩除去氯仿，再加入叔丁醇溶解，然后冻干得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，提取步骤多，最后收率比较低；提取过程中使用了氯仿之类危险化学溶剂，不适合大规模生产使用。
发明内容
本发明的目的在于开发一种操作简便，所用溶剂毒性低，适于工业化生产米卡芬净前体化合物FR901379的方法，实现米卡芬净前体化合物FR901379的规模化生产，降低生产成本，减少制备难度。
本发明公开了从发酵液中提取米卡芬净前体化合物FR901379的方法，包括将米卡芬净前体化合物FR901379发酵液进行固液分离，经萃取、浓缩、盐析、硅藻土吸附和过滤制得。
优选方案为，萃取步骤萃取剂选自有机溶剂或有机溶剂水溶液，优选有机溶剂水溶液。
在一种优选方案中，包括以下步骤：
1)将米卡芬净前体化合物FR901379发酵液进行固液分离，得到发酵菌体；
2)发酵菌体中加入极性溶剂水溶液萃取，得到米卡芬净前体化合物FR901379萃取液；
3)将萃取液浓缩，得到米卡芬净前体浓缩液，加入无机盐搅拌盐析，加入硅藻土吸附，过滤得米卡芬净前体化合物FR901379和硅藻土的混合物。
优选的方案为，所述步骤1)中可以加入助滤剂进行固液分离，助滤剂优选为珍珠岩或硅藻土，更优选硅藻土。
在一种优选方案中，包括以下步骤：
1)在米卡芬净前体化合物FR901379发酵液中加入硅藻土进行固液分离，得到发酵菌体；
2)发酵菌体中加入极性溶剂水溶液萃取，得到米卡芬净前体化合物FR901379萃取液；
3)将萃取液浓缩，得到米卡芬净前体浓缩液，加入无机盐搅拌盐析，加入硅藻土吸附，过滤得米卡芬净前体化合物FR901379和硅藻土的混合物。
其中，步骤1硅藻土的加入量为每立方米发酵液8-12kg，优选10kg。
在一种优选的方案中，步骤2萃取时间为6～15小时，优选10-12小时；步骤2所用极性溶剂水溶液，极性溶剂与水的体积比选自60-80％，优选70％；所述极性溶剂选自C1-C4醇或C1-C4酮中的一种或多种，优选丙酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇中的一种或多种，优选丙酮、异丙醇或乙醇的一种或多种，更优选丙酮或异丙醇。
在一种优选的方案中，步骤3米卡芬净前体浓缩液加入无机盐后，浓缩液中无机盐的浓度为3-8mol/L，还可以是4mol/L；所述无机盐选自氯化钠，氯化钾或(NH4)2SO4的一种或多种，优选氯化钠。
在一种优选的方案中，步骤3硅藻土的加入量为每立方米米卡芬净前体浓缩液80-120kg，优选100kg。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明开创性的使用盐析与硅藻土吸附的方法，避免使用层析柱等复杂纯化工艺，简化了前体化合物FR901379的纯化分离过程，化合物FR901379的回收率高达95％以上，极大减少了有机溶剂的用量，适用于米卡芬净前体化合物FR901379的大规模生产。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的实施方案进行详细描述。下面实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例一
发酵菌种制备Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)
参照文献Scale-up fermentation of echinocandin type antibioticFR901379(Journal of Bioscience and Bioengineering，VOL 109No.2，138-144，2010)中种子的培养方法制备Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)的种子液，以备FR901379发酵之用。
斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其组成为：马铃薯30％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。
种子培养基组成：蔗糖1％，棉籽饼粉2％，干酵母1％蛋白胨1％，KH2PO40.2％，CaCO3 0.2％，消泡剂0.05％。
菌株Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)于25℃斜面上培养6-10天后即成熟，挑取成熟的菌丝体或孢子接入种子培养基，然后于25℃在摇床上以转速280RPM培养2-4天。
实施例二
发酵菌种制备(诱变菌株CGMCC 4129)
参照文献Scale-up fermentation of echinocandin type antibioticFR901379(Journal of Bioscience and Bioengineering，VOL 109No.2，138-144，2010)中种子的培养方法制备诱变菌株CGMCC 4129的种子液，以备FR901379发酵之用。
斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其组成为：马铃薯30％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。
种子培养基组成：蔗糖1％，棉籽饼粉2％，干酵母1％蛋白胨1％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.2％，消泡剂0.05％。
菌株CGMCC 4129于25℃斜面上培养6-10天后即成熟，挑取成熟的菌丝体或孢子接入种子培养基，然后于25℃在摇床上以转速280RPM培养2-4天。
实施例三
制备FR901379发酵液
在250ml摇瓶中，加入50ml含有甘露醇浓度5％，酵母提取物浓度0.5％，L-脯氨酸浓度1％，棉籽饼粉浓度1％，硫酸铵浓度0.1％，硫酸镁浓度0.06％，微量元素溶液浓度0.1％，MES浓度2％的培养基，调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例1中获得的种子1ml(2％)接种到该培养液中，25℃280r/m培养240小时结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2200cp，其中FR901379的含量为0.5g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl20.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例四
取按实施例三等比放大所得FR901379的发酵液1立方米，加入硅藻土10kg，搅拌30分钟，过滤，得到菌体约100kg，加入体积比70％的丙酮水混合溶液400升，搅拌萃取10-12小时，过滤，滤液减压浓缩除去丙酮，得FR901379浓缩液50升，按4mol/L的量加入氯化钠，搅拌3-6小时后静置析晶，析晶完毕，加入硅藻土5kg，过滤，得到FR901379与硅藻土混合物。取样检测，FR901379回收率96.8％,纯度93.0％。
实施例五
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，600g棉籽饼粉(浓度2％)，1800g甘露醇(浓度6％)，600g L-脯氨酸(浓度2％)，240g酵母提取物(浓度0.8％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，12g硫酸镁(浓度0.04％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，用实施例2中获得的种子液，接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±2℃，培养至50小时，每天补加甘露醇1％，L-脯氨酸0.5％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2300cp，其中FR901379的含量为2.5g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl20.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例六
取按实施例五所得FR901379的发酵液1立方米，加入硅藻土10kg，搅拌30分钟，过滤，得菌体约100kg，加入体积比70％的丙酮水混合溶液400升，搅拌萃取10-12小时，过滤，滤液减压浓缩除去丙酮，得FR901379浓缩液50升，按4mol/L的量加入氯化钠，搅拌3-6小时后静置析晶，析晶完毕，加入硅藻土5kg，过滤，得到FR901379与硅藻土混合物。取样检测，FR901379回收率97.0％，94.2％。
实施例七
取按实施例五所得FR901379的发酵液1立方米，加入硅藻土10kg，搅拌30分钟，过滤，得菌体约100kg，加入乙醇溶液400升，搅拌萃取10-12小时，过滤，滤液加入100L纯化水后减压浓缩除去乙醇，得FR901379浓缩液50升，按4mol/L的量加入氯化钠，搅拌3-6小时后静置析晶，析晶完毕，加入硅藻土5kg，过滤，得到FR901379与硅藻土混合物。取样检测，FR901379回收率82.0％，纯度78.0％。
实施例八
取按实施例五所得FR901379的发酵液1立方米，加入硅藻土10kg，搅拌30分钟，过滤，得菌体约100kg，加入体积比60％的异丙醇水混合溶液400升，搅拌萃取10-12小时，过滤，滤液减压浓缩除去异丙醇，得FR901379浓缩液50升，按4mol/L的量加入氯化钠，搅拌3-6小时后静置析晶，析晶完毕，加入硅藻土5kg，过滤，得到FR901379与硅藻土混合物。取样检测，FR901379回收率95.0％，纯度91.8％。
实施例九
取按实施例五所得FR901379的发酵液1立方米，加入硅藻土10kg，搅拌30分钟，过滤，得菌体约100kg，加入体积比70％的丙酮水混合溶液400升，搅拌萃取10-12小时，过滤，滤液减压浓缩除去丙酮，得FR901379浓缩液50升，按3mol/L的量加入氯化钠，搅拌3-6小时后静置析晶，析晶完毕，加入硅藻土5kg，过滤，得到FR901379与硅藻土混合物。取样检测，FR901379回收率96.0％，纯度93.2％。
实施例十
取按实施例五所得FR901379的发酵液1立方米，加入硅藻土10kg，搅拌30分钟，过滤，得菌体约100kg，加入体积比70％的丙酮水混合溶液400升，搅拌萃取10-12小时，过滤，滤液减压浓缩除去丙酮，得FR901379浓缩液50升，按8mol/L的量加入氯化钠，搅拌3-6小时后静置析晶，析晶完毕，加入硅藻土5kg，过滤，得到FR901379与硅藻土混合物。取样检测，FR901379回收率95.0％，纯度92.5％。

Claims (13)

1.一种米卡芬净前体化合物FR901379的制备方法，包括将米卡芬净前体化合物FR901379发酵液进行固液分离，经萃取、浓缩、盐析、硅藻土吸附和过滤制得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述萃取步骤萃取剂选自有机溶剂或有机溶剂水溶液，优选有机溶剂水溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将米卡芬净前体化合物FR901379发酵液进行固液分离，得到发酵菌体；
2)发酵菌体中加入极性溶剂水溶液萃取，得到米卡芬净前体化合物FR901379萃取液；
3)将萃取液浓缩，得到米卡芬净前体浓缩液，加入无机盐搅拌盐析，加入硅藻土吸附，过滤得米卡芬净前体化合物FR901379和硅藻土的混合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中可以加入助滤剂进行固液分离，助滤剂优选为珍珠岩或硅藻土，更优选硅藻土。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)在米卡芬净前体化合物FR901379发酵液中加入硅藻土进行固液分离，得到发酵菌体；
2)发酵液中加入极性溶剂水溶液萃取，得到米卡芬净前体化合物FR901379萃取液；
3)将萃取液浓缩，得到米卡芬净前体浓缩液，加入无机盐搅拌盐析，加入硅藻土吸附，过滤得米卡芬净前体化合物FR901379和硅藻土的混合物。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2萃取时间为6～15小时，优选10-12小时。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述极性溶剂选自C1-C4醇或C1-C4酮中的一种或多种，优选丙酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇中的一种或多种，更优选丙酮、异丙醇或乙醇的一种或多种，进一步优选丙酮或异丙醇。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，极性溶剂与水的体积比为60-80％，优选70％。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述无机盐选自氯化钠，氯化钾或(NH4)2SO4中的一种或多种，优选为氯化钠。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3米卡芬净前体浓缩液加入无机盐后，浓缩液中无机盐的浓度为3-8mol/L。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，无机盐的浓度为4mol/L。
12.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3硅藻土的加入量为每立方米米卡芬净前体浓缩液80-120kg，优选100kg。
13.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤1硅藻土的加入量为每立方米发酵液8-12kg，优选10kg。
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