CN109053638A - 一种烟曲霉素的提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟曲霉素的提取纯化方法，包括甲基叔丁基醚(MTBE)或乙基叔丁基醚(ETBE)发酵液萃取、MTBE或ETBE沉淀和结晶纯化等步骤。该方法操作简单、收率高、成本低廉、可大规模工业化生产，对烟曲霉素的产业化生产及后续烟曲霉素衍生物的开发具有重大意义。

Description

一种烟曲霉素的提取纯化方法

技术领域

本发明涉及制药领域。具体的说，本发明涉及一种烟曲霉素的提取纯化方法。

背景技术

烟曲霉素(Fumagillin，式I)是从烟曲霉(Aspergillus Fumigatus)的发酵培养液中首次分离得到的具有多种生物活性的代谢产物。最初，烟曲霉素被用来杀死蜜蜂的微孢子虫寄生虫，后来发现可以用于治疗人肠道感染引起的微孢子虫病和(或)隐孢子虫病，而这种疾病对于免疫缺陷患者是相当致命的。另外，烟曲霉素几乎不溶于水，而且光照易降解，极大地影响了其生物利用，而研究人员发现烟曲霉醇等衍生物性质稳定，且效果好于烟曲霉素，而烟曲霉醇等相关衍生物是以烟曲霉素为原料制备而成。因此，如何大规模工业化生产纯度较高的烟曲霉素，对烟曲霉素及其衍生物产品的研究具有重大意义。

通过文献调研，目前，制备烟曲霉素的方法主要是通过发酵培养烟曲霉Aspergillus fumigatus，然后经过提取纯化得到烟曲霉素(Eble and Hanson,1951；McCowen et al.,1951)。公开的提取方法主要针对烟曲霉(产物主要在菌体的胞外，胞内也有一定的单位)的发酵产物获得，其提取方法都是先通过过滤去除菌体滤渣并获得滤液，然后对滤液进行进一步纯化获得烟曲霉素。

US2898268公开了发酵培养物经过过滤后得到滤液，滤液通过加入supercel助滤剂并调酸获得沉淀，沉淀用丙酮提取并浓缩至一定体积后再沉淀，然后将丙酮沉淀物用氯仿进行提取并浓缩至半固体状态，再溶解在甲醇中，将溶解液转入零下四十摄氏度中冷却过夜，收集粗的晶体，最后，将粗晶型溶解在热甲醇中，过滤并冷藏结晶，过滤并在真空下干燥，获得晶体。上述操作复杂且收率极低，仅为15.5％，不利于进行烟曲霉素的大规模工业化生产。

CN201610104785.6公开了一种使用大孔吸附树脂从烟曲霉的发酵液中提取纯化烟曲霉素的方法，该方法通过大孔吸附树脂及纯化，然后经过冷冻干燥获得针状晶体。其中一步树脂层析能够获得81.2％色谱纯度的晶体，需要二步树脂层析才能够获得95.2％色谱纯度晶体，操作步骤复杂；同时，烟曲霉素的水溶性非常差、对光和热极不稳定，层析周期长，易产生较多杂质；大孔吸附树脂需采用含水的溶剂洗脱，且需要较多的洗脱液，成本较高；综上可知上述方法不利于烟曲霉素的大规模工业化生产。

此外，上述所有工艺都是针对胞外烟曲霉素的提取工艺，没有考虑胞内烟曲霉素的提取情况。

综上，现有工艺都不能很好的满足烟曲霉素的大规模工业化生产的需求。因此，寻找一种操作简便、周期短、成本低、收率高、可大规模工业化生产的烟曲霉素的制备方法非常迫切。

发明内容

本发明保护了一种烟曲霉素的提取纯化方法，其特征在于，包括下述步骤:

步骤a):烟曲霉素发酵液经MTBE(甲基叔丁基醚)或ETBE(乙基叔丁基醚)搅拌、静置、分液，得到MTBE或ETBE萃取相；

步骤b):将步骤a)得到的MTBE或ETBE萃取相浓缩至原体积的1/30～1/40，然后降温、搅拌，过滤得到烟曲霉素湿固体；

步骤c):将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用有机溶剂①溶解、过滤得滤液①，滤液①在减压下搅拌，同时向滤液①中加入C₁-C₂醇，结晶8-12h过滤得到烟曲霉素粗品；优选地，所加入C₁-C₂醇的体积为滤液①体积的3～10倍；

步骤d):将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用有机溶剂②溶解、过滤得滤液②，滤液②在减压下搅拌，同时向滤液②中加入C₁-C₂醇，结晶8-12h后过滤、干燥得到烟曲霉素成品；优选地，所加入C₁-C₂醇的体积为滤液②体积的3～10倍；

所述步骤c)中有机溶剂①或步骤d)中有机溶剂②为氯代烃或氯代烃与C₁-C₂醇的混合溶剂，所述氯代烃为二氯甲烷或三氯甲烷，所述C₁-C₂醇为甲醇或乙醇；所述步骤a)、步骤b)、步骤c)和步骤d)均在避光下进行。

在优选的实施方案中，所述步骤a)中MTBE或ETBE与烟曲霉素发酵液的体积比为1.5：1～3：1。

在优选的实施方案中，所述步骤a)中静置的时间为5～10h。

在优选的实施方案中，所述步骤a)中搅拌的时间为1～5h。

在优选的实施方案中，所述步骤b)中搅拌的时间8～12h。

在优选的实施方案中，所述步骤b)中降温是指温度降到0～15℃。

在优选的实施方案中，本发明所述步骤b)中浓缩的温度控制在40℃以下。

在优选的实施方案中，所述步骤c)中烟曲霉素湿固体与有机溶剂①的质量体积比为1：4～1：8(单位为kg/L)；所述步骤d)中烟曲霉素粗品与有机溶剂②的质量体积比为1：4～1：8(单位为kg/L)。

在优选的实施方案中，所述步骤c)中加入C₁-C₂醇的方式为滤液①减压搅拌1h后加入0.3～0.5倍滤液①体积的C₁-C₂醇，之后每1h加入0.3～0.5倍滤液①体积的C₁-C₂醇；所述步骤d)中加入C₁-C₂醇的方式为滤液②减压搅拌1h后加入0.3～0.5倍滤液②体积的C₁-C₂醇，之后每1h加入0.3～0.5倍滤液②体积的C₁-C₂醇。

在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中氯代烃与C₁-C₂醇的混合溶剂中C₁-C₂醇的体积不超过氯代烃的体积。

在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中减压时压力为-0.08～-0.1MPa。

在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中结晶的温度为-10～8℃。

在优选的实施方案中，所述步骤c)或步骤d)中搅拌的速率为100～250r/min。

在优选的实施方案中，本发明所述步骤d)中干燥为真空干燥。

在优选的实施方案中，所述步骤d)中真空干燥的压力为-0.08～-0.1MPa，干燥的时间为20～40h，干燥的温度为10～30℃。

在优选的实施方案中，所述烟曲霉素发酵液是烟曲霉素产生菌经过有氧发酵制得的，所述烟曲霉素产生菌优选青霉(Penicillium sp.)HS-NF-684Z，其保藏编号为CGMCCNo.14144。

本发明所述的青霉HS-NF-684Z的微生物菌种于2017年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14144，分类名为青霉(Penicillium sp.)，并登记在册，证明存活。

应当强调的是，本发明技术方案中所涉及的数值或数值端点，其含义或意义的保护范围并不局限于该数字本身，本领域技术人员能够理解，它们包含了那些已被本领域广为接受的可允许误差范围，例如实验误差、测量误差、统计误差和随机误差等等，而这些误差范围均包含在本发明的范围之内。

本发明相对于现有技术，提供了一种新的可大规模工业化生产烟曲霉素原料的技术方案，其针对胞内和胞外的烟曲霉素都能得到很好的分离和纯化。本发明通过MTBE或ETBE发酵液萃取、MTBE或ETBE沉淀、结晶纯化可以得到含量在96.5％以上的烟曲霉素产品，且总收率在55％以上；该工艺操作简单、收率高、成本低、制得的烟曲霉素纯度高、可大规模化工业生产，对烟曲霉素及其它衍生物产品的研究具有重大意义。

本发明较现有技术的有益效果在于：

①与现有技术制备烟曲霉素的收率仅为15％相比，本发明制备烟曲霉素的收率在55％以上，且制得的烟曲霉素的含量也较高，为96.5％以上，可大规模工业化生产。

②本发明所使用的菌株为一种新的烟曲霉素生产菌，该菌为青霉(Penicilliumsp.)HS-NF-684Z，其保藏编号为CGMCC No.14144，主要为胞子内产生烟曲霉素，胞内和胞外总的效价可高达1000mg/L；现有技术中，烟曲霉素生产工艺主要基于曲霉菌属菌株Aspergillus Fumigatus，Aspergillus Fumigatus是胞外产生烟曲霉素，而且AspergillusFumigatus本身是致病菌株，能够引起支气管肺曲霉菌病(ABPA)和侵袭性肺曲霉病等疾病，产生的烟曲霉素的效价也较低。

③本发明工艺简单，周期短，成本低廉、收率高，杂质少，工艺可控。另外，可同时针对胞内和胞外烟曲霉素进行分离和纯化，也适用于现已公开的胞外烟曲霉素的提取。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步解释说明，但是，它们并不构成对本发明保护范围限制和限定。

本发明所涉及的烟曲霉素的效价、MTBE或ETBE萃取相中的烟曲霉素浓度、烟曲霉素含量均是通过高效液相色谱检测的，含量是采用液相色谱外标法测定，检测条件如下：

标准品配制：精确称取10mg纯度99.99％的烟曲霉素标准品(浙江海正药业股份有限公司，P170901)溶解于20ml乙腈；

仪器及色谱条件为：液相色谱仪型号为安捷伦1100；色谱柱为HALO C18，规格4.6mm*150mm，粒径为2.7μm；紫外检测波长为340nm；流速为0.8mL/min；进样量：5μL；柱温：25℃；时间40min；流动相A:0.1％的甲酸水溶液(v/v)，流动相B:乙腈与0.1％的甲酸(v/v)，梯度条件：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	65	35
12	48	52
			20	44	56
30	0	100
			34	0	100
34.6	65	35

实施例1烟曲霉素发酵液的制备

本发明实施例中发酵培养所用的菌种为一种新的烟曲霉素生产菌，该菌为青霉(Penicillium sp.)HS-NF-684Z，其保藏编号为CGMCC No.14144。

青霉HS-NF-684Z的微生物菌种于2017年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14144，分类名为青霉(Penicillium sp.)，并登记在册，证明存活。

本发明烟曲霉素发酵液培养过程如下：

(1)斜面菌落的制备与培养

斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(g/L)：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蒸馏水1000mL，自然pH。

高压蒸汽灭菌121℃，20min，待培养基冷却至50-60℃摆放斜面，在超净工作台使用无菌接种环接种一环孢子，涂布均匀后置于25℃避光培养3-5天。

(2)种子培养基的制备与培养

种子培养基配方(g/L)：葡萄糖10g/L，淀粉10g/L，黄豆饼粉10g/L，酵母抽提粉5g/L，碳酸钙15g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸二氢钾1g/L，加水定容至1000mL，pH 6.0±0.1。摇瓶装液量为30mL/瓶，高压蒸汽121℃灭菌，20min。孢子接种量为10⁵-10⁶c.f.u/mL，培养温度为25±1℃，250rpm，摇床振荡培养24h。

(3)种子罐种子液的制备与培养

在15L种子罐中投入9L的种子培养基(种子培养基配比见步骤(2)，并添加0.1％(体积百分比)泡敌作为消泡剂)，蒸汽121℃灭菌，20min，待冷却至25℃后，接入30mL摇瓶种子液，培养温度为25±1℃，搅拌转速100-600rpm，通氧量0.5-2.0vvm，培养24h。

(4)发酵罐发酵液的制备与培养

在50L发酵罐中投入30L的发酵培养基(发酵培养基配方：蔗糖80g/L，糊精20g/L，甘油40g/L，酵母抽提粉5g/L，酵母粉10g/L，酵母膏10g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸二氢钾1g/L，碳酸钙30g/L，加水定容至1000mL，pH 6.0±0.1)，并添加0.05％(体积百分比)泡敌作为消泡剂)，蒸汽121℃灭菌，20min，待冷却至25℃后，移入3L种子罐种子液，培养温度为25±1℃，搅拌转速100-600rpm，通氧量0.5-2.0vvm，培养120h后得烟曲霉素发酵液。

实施例2烟曲霉素提取纯化(在避光下进行)

步骤a)：取烟曲霉素发酵液(按照实施例1所述的方法制得)30L，烟曲霉素胞内和胞外总的效价为1010mg/L(胞外烟曲霉素效价为216mg/L)，加入45L MTBE(甲基叔丁基醚)，搅拌1h，静置8h，分液，收集MTBE萃取相42L，取MTBE萃取相经HPLC分析，烟曲霉素浓度为584.5mg/L，萃取收率为81.0％；

步骤b)：将步骤a)得到的MTBE萃取相浓缩至1.1L，浓缩温度为30℃，然后降温至0℃，搅拌8h，过滤得到烟曲霉素湿固体50.0g；

步骤c)：将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂200ml(二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1)溶解，过滤得220mL滤液，滤液在温度-10℃，压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入66ml的甲醇，之后每1h加入66ml的甲醇，8h后过滤得到烟曲霉素粗品41.1g；

步骤d)：将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂165ml(二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1)溶解，过滤得180mL滤液，滤液在温度-10℃，压力-0.08Mpa搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入54ml的甲醇，之后每1h加入54ml的甲醇，8h后过滤得到烟曲霉素晶体38.4g，烟曲霉素晶体在温度10℃，压力-0.08MPa条件下干燥20h，得到烟曲霉素成品17.9g。经HPLC检测，烟曲霉素成品含量为97.2％，总收率为59.1％。

实施例3烟曲霉素提取纯化(在避光下进行)

步骤a)：取烟曲霉素发酵液(按照实施例1所述的方法制得)30L，烟曲霉素胞内和胞外总的效价为1032mg/L(胞外烟曲霉素效价为180mg/L)，加入90L ETBE(乙基叔丁基醚)，搅拌5h，静置10h，分液，收集ETBE萃取相84L，取ETBE萃取相经HPLC分析，烟曲霉素浓度为310.2mg/L，萃取收率为84.2％；

步骤b)：将步骤a)得到的ETBE萃取相浓缩至2.8L，浓缩温度为30℃，然后降温至15℃，搅拌12h，过滤得到烟曲霉素湿固体52.6g；

步骤c)：将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂420ml(二氯甲烷与甲醇的体积比为5：1)溶解，过滤得430ml滤液，滤液在温度8℃、压力-0.1Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，，1h后向滤液中加入215ml甲醇，之后每1h加入215ml甲醇，12h后过滤得到烟曲霉素粗品42.8g；

步骤d)：将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂342ml(二氯甲烷与甲醇的体积比为5：1)溶解，过滤得362ml滤液，滤液在温度8℃，压力-0.1Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入181ml甲醇，之后每1h加入181ml甲醇，12h后过滤得到烟曲霉素晶体39.2g，烟曲霉素晶体在温度30℃、压力-0.1MPa条件下干燥30h，得到烟曲霉素成品18.1g。经HPLC检测，烟曲霉素成品含量为96.8％，总收率为58.4％。

实施例4烟曲霉素提取纯化(在避光下进行)

步骤a)：取烟曲霉素发酵液(按照实施例1所述的方法制得)30L，烟曲霉素胞内和胞外总的效价为1065mg/L(胞外烟曲霉素效价为267mg/L)，加入45L MTBE(甲基叔丁基醚)，搅拌5h，静置8h，分液，收集MTBE萃取相42L，取MTBE萃取相经HPLC分析，烟曲霉素浓度为623.7mg/L，萃取收率为82.0％；

步骤b)：将步骤a)得到的MTBE萃取相浓缩至1.1L，浓缩温度为30℃，然后降温至0℃，搅拌8h，过滤得到烟曲霉素湿固体51.4g；

步骤c)：将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用二氯甲烷230ml溶解，过滤得240ml滤液，滤液在温度0℃，压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入100ml甲醇，之后每1h加入100ml甲醇，8h后过滤得到烟曲霉素粗品42.1g；

步骤d)：将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用二氯甲烷190ml溶解，过滤得204ml滤液，滤液在温度0℃、压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入85ml甲醇，之后每1h加入85ml甲醇，8h后过滤得到40.4g烟曲霉素晶体，烟曲霉素晶体在温度10℃，压力-0.08MPa条件下干燥20h，得到烟曲霉素成品18.2g。经HPLC检测，烟曲霉素成品含量为97.2％，总收率为57.1％。

实施例5烟曲霉素提取纯化(在避光下进行)

步骤a)：取烟曲霉素发酵液(按照实施例1所述的方法制得)30L，烟曲霉素胞内和胞外总的效价为1087mg/L(胞外烟曲霉素效价为220mg/L)，加入45L ETBE(乙基叔丁基醚)，搅拌1h，静置8h，分液，收集ETBE萃取相42L，取ETBE萃取相经HPLC分析，烟曲霉素浓度为627.3mg/L，萃取收率为80.8％；

步骤b)：将步骤a)得到的ETBE萃取相浓缩至1.4L，浓缩温度为30℃，然后降温至0℃，搅拌12h，过滤得到烟曲霉素湿固体51.4g；

步骤c)：将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用三氯甲烷400ml溶解，过滤得410ml滤液，滤液在温度0℃、压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入170ml甲醇，之后每1h加入170ml甲醇，8h后过滤得到烟曲霉素粗品42.1g；

步骤d)：将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用三氯甲烷330ml溶解，过滤得344ml滤液，滤液在温度0℃，压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入143ml甲醇，之后每1h加入143ml甲醇，8h后过滤得到烟曲霉素晶体39.5g，烟曲霉素晶体在温度10℃、压力-0.08MPa条件下干燥20h，得到烟曲霉素成品18.6g。经HPLC检测，烟曲霉素成品含量为97.3％，总收率为57.0％。

实施例6烟曲霉素提取纯化(在避光下进行)

步骤a)：取烟曲霉素发酵液(按照实施例1所述的方法制得)30L，烟曲霉素胞内和胞外总的效价为1092mg/L(胞外烟曲霉素效价为178mg/L)，加入90L MTBE(甲基叔丁基醚)，搅拌5h，静置8h，分液，收集MTBE萃取相84L，取MTBE萃取相经HPLC分析，烟曲霉素浓度为324.1mg/L，萃取收率为83.1％；

步骤b)：将步骤a)得到的MTBE萃取相浓缩至2.5L，浓缩温度为30℃，然后降温至0℃，搅拌8h，过滤得到烟曲霉素湿固体49.8g；

步骤c)：将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用二氯甲烷200ml溶解，过滤得220ml滤液，滤液在温度0℃，压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入70ml乙醇，之后每1h加入70ml乙醇，8h后过滤得到烟曲霉素粗品41.3g；

步骤d)：将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用二氯甲烷165ml溶解、过滤得179ml滤液，滤液在温度0℃，压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入57ml乙醇，之后每1h加入57ml乙醇，8h后过滤得到烟曲霉素晶体39.5g，烟曲霉素晶体在温度10℃，压力-0.08MPa条件下干燥20h，得到烟曲霉素成品18.6g。经HPLC检测，烟曲霉素成品含量为97.0％，总收率为56.9％。

实施例7烟曲霉素的放大生产(在避光下进行)

烟曲霉素发酵液的制备：

(1)斜面菌落的制备与培养：具体条件同实施例1步骤(1)；

(2)种子培养基的制备与培养：具体条件同实施例1步骤(2)；

(3)种子罐种子液的制备与培养

在500L种子罐中投入300L的种子培养基(种子培养基配比见实施例1步骤(2)，并添加0.1％(体积百分比)泡敌作为消泡剂)，蒸汽121℃灭菌，20min，待冷却至25℃后，接入1L摇瓶种子液，培养温度为25±1℃，搅拌转速100-600rpm，通氧量0.5-2.0vvm，培养24h。

(4)发酵罐发酵液的制备与培养

在5000L发酵罐中投入3000L的发酵培养基(发酵培养基配比见实施例1步骤(4))，并添加0.05％(体积百分比)泡敌作为消泡剂)，蒸汽121℃灭菌，20min，待冷却至25℃后，移入300L种子罐种子液，培养温度为25±1℃，搅拌转速100-600rpm，通氧量0.5-2.0vvm，培养120h制得烟曲霉素发酵液。

烟曲霉素的提取纯化：

步骤a)：取上述制备的烟曲霉素发酵液3000L，烟曲霉素胞内和胞外总的效价为1001mg/L(胞外烟曲霉素效价为258mg/L)，加入4500L MTBE(甲基叔丁基醚)，搅拌5h，静置10h，分液，收集MTBE萃取相4250L，取MTBE萃取相经HPLC分析，烟曲霉素浓度为568.8mg/L，萃取收率为80.5％；

步骤b)：将步骤a)得到的MTBE萃取相浓缩至110L，浓缩温度为30℃，然后降温至0℃，搅拌8h，过滤得到烟曲霉素湿固体6.4kg；

步骤c)：将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂26L(二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1)溶解，过滤得28L滤液，滤液在温度-10℃、压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入9L的甲醇，之后每1h加入9L的甲醇，8h后过滤得到烟曲霉素粗品4.7kg；

步骤d)：将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂19L(二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1)溶解，过滤得22L滤液，滤液在温度-10℃，压力-0.08Mpa，搅拌速率100rmp条件下搅拌，1h后向滤液中加入7L的甲醇，之后每1h加入7L的甲醇，8h后过滤得到烟曲霉素晶体4.5kg，烟曲霉素晶体在温度10℃、压力-0.08MPa条件下干燥20h，得到烟曲霉素成品1.7kg。经HPLC检测，烟曲霉素成品含量为97.0％，总收率为56.7％。

Claims (10)

1.一种烟曲霉素的提取纯化方法，其特征在于，包括下述步骤:

步骤a):烟曲霉素发酵液经甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚搅拌、静置、分液，得到甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚萃取相；

步骤b):将步骤a)得到的甲基叔丁基醚或乙基叔丁基醚萃取相浓缩至原体积的1/30～1/40，然后降温、搅拌，过滤得到烟曲霉素湿固体；

步骤c):将步骤b)得到的烟曲霉素湿固体用有机溶剂①溶解、过滤得滤液①，滤液①在减压下搅拌，同时向滤液①中加入C₁-C₂醇，结晶8-12h，过滤得到烟曲霉素粗品；优选地，所加入C₁-C₂醇的体积为滤液①体积的3～10倍；

步骤d):将步骤c)得到的烟曲霉素粗品用有机溶剂②溶解、过滤得滤液②，滤液②在减压下搅拌，同时向滤液②中加入C₁-C₂醇，结晶8-12h后过滤、干燥得到烟曲霉素成品；优选地，所加入C₁-C₂醇的体积为滤液②体积的3～10倍；

所述步骤c)中有机溶剂①或步骤d)中有机溶剂②为氯代烃或氯代烃与C₁-C₂醇的混合溶剂，所述氯代烃为二氯甲烷或三氯甲烷，所述C₁-C₂醇为甲醇或乙醇；所述步骤a)、步骤b)、步骤c)和步骤d)均在避光下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中MTBE或ETBE与烟曲霉素发酵液的体积比为1.5：1～3：1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中搅拌的时间为1～5h，所述步骤b)中搅拌的时间8～12h。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中降温是指温度降到0～15℃。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中烟曲霉素湿固体与有机溶剂①的质量体积比为1：4～1：8(单位为kg/L)；所述步骤d)中烟曲霉素粗品与有机溶剂②的质量体积比为1：4～1：8(单位为kg/L)。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中加入C₁-C₂醇的方式为滤液①减压搅拌1h后加入0.3～0.5倍滤液①体积的C₁-C₂醇，之后每1h加入0.3～0.5倍滤液①体积的C₁-C₂醇；所述步骤d)中加入C₁-C₂醇的方式为滤液②减压搅拌1h后加入0.3～0.5倍滤液②体积的C₁-C₂醇，之后每1h加入0.3～0.5倍滤液②体积的C₁-C₂醇。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤c)或步骤d)中氯代烃与C₁-C₂醇的混合溶剂中C₁-C₂醇的体积不超过氯代烃的体积。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤c)或步骤d)中减压时压力为-0.08～-0.1MPa。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤c)或步骤d)中结晶的温度为-10～8℃。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述烟曲霉素发酵液是烟曲霉素产生菌经过有氧发酵制得的，所述烟曲霉素产生菌优选青霉(Penicillium sp.)HS-NF-684Z，其保藏编号为CGMCC No.14144。