CN103304640B - 一种从发酵液中提取棘白菌素类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从发酵液中提取棘白菌素类化合物的方法，所述方法包括以下步骤：a)发酵液用微滤膜设备进行错流过滤，过滤过程中先用水清洗，再加入萃取剂进行萃取，过滤后得到含目标物的滤液；b)含目标物的滤液用大孔树脂进行吸附，然后用第二种溶剂预洗、解析，得到含目标物的解析液；c)浓缩含目标物的解析液，除去第二种溶剂；d)加入第三种溶剂析出目标物后，得到含目标物的固液混合物；e)对析出目标物的固液混合物进行过滤，干燥后得到目标物干粉。本发明方法，工艺流程短，使用的溶剂体系简单，经过简单的纳滤浓缩步骤，萃取剂可返回到微滤膜中继续萃取，实现了萃取剂的循环套用，大大减少了溶剂使用量，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工业化生产方法。
背景技术
真菌对于健康人体而言是条件致病菌，正常情况下对人体无害；但当机体抵抗力降低时，就有可能造成局部或全身真菌感染。近年来由于临床上滥用细胞毒性药物、免疫抑制剂、广谱抗生素及激素类药物，不仅患者机体的免疫力受到抑制，而且体内的微生态平衡受到破坏，使得原本不致病的真菌变为优势菌，从而诱发真菌感染；再加上现代医疗中器官移植、介入治疗、插管技术等开放性治疗手段的开展，更增大了真菌感染的发病机率。
按照国际医学界的通行标准，真菌感染可分为浅表性真菌感染、皮下真菌感染和***性真菌感染。其中前两种真菌感染最为常见，但并不致命，最为严重的是***性真菌感染，即深部真菌感染，染病后如果不能得到及时有效的控制，往往会危及生命。自从第一个抗真菌药两性霉素B问世以来，人类与真菌感染疾病的斗争已经持续了半个多世纪，现在，人类在预防和治疗浅表性真菌感染方面已取得突破，但对于皮下真菌感染和***性真菌感染，由于其治疗的难度、真菌的抗药性和现有药物的毒副作用等因素的存在，尚未取得显著进展。现代临床上治疗真菌感染使用的药物主要有两性霉素B和唑类抗真菌药物(如氟康唑、伊曲康唑和伏力康唑等)，但它们在安全性、药代动力学或抗菌谱等方面都存在一定的问题，因此临床上亟待高效、低毒的新型广谱抗真菌药物的出现。
棘白菌素(Echinocandins)，又称棘球白素，是一类新型抗真菌药，属于乙酰六环类，为葡聚糖合成酶抑制剂，可以非竞争性地抑制真菌细胞壁的β-1，3-D-葡聚糖的合成，从而破坏细胞壁的完整性并使其渗透压发生变化而发挥杀菌作用，而哺乳动物细胞无细胞壁，故对哺乳动物细胞无影响。棘白菌素类药物通过抑制真菌体内的葡聚糖合成酶以杀灭真菌，对细胞色素P450无作用，不良反应少，与两性霉素B和唑类抗真菌药物无交叉耐药性，对人体的毒性低，主要作用于念珠菌属(Candidas)和曲霉菌属(Aspergillus)，也可以作用于寄生虫类病原体如卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)等。
棘白菌素类化合物基本结构类似，都是在乙酰六环的结构上结合有不同的取代基，但不同取代基的化合物抗真菌活性有所不同，经过有针对性的筛选，研究人员发现有些化合物抗真菌活性较强，包括肺念菌素B0(PneumocandinB0)，WF11899A和棘白菌素B(EchinocandinB)，它们均通过发酵的方法得到，以其作为中间体进行半合成，分别可以得到抗真菌药物卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。肺念菌素B0(PneumocandinB0)由Zalerionarboricola菌体发酵进行生物合成产生，默克公司以其作为中间体进行半合成，得到了抗真菌药物醋酸卡泊芬净，于2001年2月在美国上市，用于治疗白色念珠菌和烟曲霉菌的感染；WF11899A由ColeophomaempetriF-11899菌体发酵进行生物合成产生，藤泽公司以其作为中间体进行半合成，得到了抗真菌药物米卡芬净，于2002月在日本上市，主要用于白色念珠菌和曲霉菌感染，抗白色念珠菌感染作用更好，尤其对耐氟康唑的念珠菌活性较强；棘白菌素B(EchinocandinB)由Aspergilusnidulans或与新昌实际在用的菌相同名称Aspergillusrugulovalvus菌体发酵生物合成产生，以其作为中间体，经过礼来公司和VicuronPharmaceuticals公司联合研制开发得到抗真菌药物阿尼芬净，2006年上市，其抗真菌活性对烟曲霉菌更强，对白色念珠菌相对较弱。
目前国内对于从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺几乎没有报道，国外主要是一些大的制药公司进行了相关研究，但主要是集中在实验室小规模的提取，而且提取工艺路线较长，产品的收率很低，用到的溶剂种类比较多，有些溶剂对人体及环境的影响比较大，不适合大规模工业化生产。
WO2011/121599A1从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用溶剂从发酵液中把棘白菌素类化合物萃取出来；再进行液液萃取除去部分杂质；活性炭脱色后，利用吸附剂进行吸附，最后经过解析、浓缩、沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；对发酵液进行液液萃取、对含目标组分的萃取液进行液液萃取的过程中，都会产生混合溶剂层，而且水相中会不同程度溶解有机相，直接排放会造成污染，回收又会增大成本；使用的吸附剂价格贵，不容易彻底再生，使用寿命有限。
US5194377和US5202309从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用第一种溶剂从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；再进行多次液液萃取，使棘白菌素类化合物在两相中进行转移除去部分杂质；含有棘白菌素类化合物的萃取液再经过多种不同的色谱柱进行层析，最后经过解析、浓缩、溶剂沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；对发酵液进行液液萃取、对含目标组分的萃取液进行液液萃取的过程中，都会产生混合溶剂层，而且水相中会不同程度溶解有机相，直接排放会造成污染，回收又会增大成本；同时使用的吸附剂种类多，价格贵，不容易彻底再生，使用寿命有限；工艺路线长，最后总收率比较低。
US661082282和US2008/0108806A1从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用异丁醇从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；含棘白菌素类化合物的异丁醇浓缩后进行水洗，再加入甲醇-正庚烷进行液液萃取，形成两相：有机相(异丁醇-正庚烷)和水相(甲醇-水)，棘白菌素类化合物转入水相中；水相浓缩除去甲醇后再加入异丁醇进行液液萃取，棘白菌素类化合物转入异丁醇中；浓缩除去异丁醇后，加入乙腈进行沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；对含目标组分的异丁醇萃取液进行水洗，以及及加入甲醇-正庚烷进行液液萃取的过程中，会产生混合溶剂层，而且水相中会不同程度溶解有机相，直接排放会造成污染，回收又会增大成本；提取过程中液液萃取使用的有机相是混合溶剂，回收难度比较大。
US2010/0249371A1中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用第一种溶剂从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；然后真空浓缩除去部分溶剂后，加入金属盐类吸附剂(例如磷酸钙)得到棘白菌素类化合物-磷酸钙复合物；再用第二种溶剂从该复合物中把棘白菌素类化合物溶解出来，浓缩除去第二种溶剂后，加入第三种溶剂进行沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；提取过程中加入了金属盐类化合物，不可避免的会在产品中有残留，需要进一步纯化来去除金属离子。
CN101659693和CN101659692A中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用第一种溶剂从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；浓缩除去第一种溶剂后，用第二种溶剂再次进行萃取；浓缩除去第二种溶剂后，重新用第一种溶剂溶解棘白菌素类化合物，依次用酸性氧化铝柱、吸附树脂柱、反相树脂柱进行层析操作；解析液浓缩后，加入溶剂沉淀得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，溶剂的使用量比较大；提取的路线较长，要经过多次层析，总收率会比较低；吸附剂种类多，再生过程会使用不同种类的溶剂，增大回收难度，提高了提取成本。
WO9611210中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用丙酮从菌丝体中把棘白菌素类化合物萃取出来；浓缩除去丙酮后，用乙酸乙酯萃取后再用正丁醇萃取；浓缩除去部分正丁醇后，依次经过两次硅胶柱层析、离心色谱层析，再两次硅胶柱层析，最后解析液浓缩至干，加入少量水溶解后再调pH至7.0，冻干得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，萃取过程中溶剂的使用量比较大；用乙酸乙酯及正丁醇萃取液过程中，会产生混合溶剂层，回收，回收难度比较大；层析步骤多，最后收率比较低，再加上中间有一步离心色谱层析，不适合工业化生产使用；层析介质种类多，再生过程会使用不同种类的溶剂，增大回收难度，进一步提高了提取成本。
US4024245、US4024246和US4288549中从发酵液中提取棘白菌素类化合物的工艺，主要方法为：先用甲醇对发酵液进行萃取，再用氯仿对甲醇萃取液进行液液萃取，浓缩除去氯仿后，加入***使棘白菌素类化合物生成沉淀；沉淀重新溶解后，经过反相树脂柱层析，解析液用氯仿萃取后再次浓缩除去氯仿，再加入叔丁醇溶解，然后冻干得到棘白菌素类化合物。该工艺的主要问题是，提取步骤多，最后收率比较低；提取过程中使用了氯仿之类危险化学溶剂，不适合大规模生产使用。
发明内容
目前对于从发酵液中棘白菌素类化合物的方法，国内外主要是几个大的制药公司进行了相关研究，但主要是集中在实验室小规模的提取，而且提取工艺路线较长，产品的收率很低，用到的溶剂种类比较多，有些溶剂对人体及环境的影响比较大，不适合大规模工业化生产。
本发明公开一种新的提取棘白菌素类化合物的方法，通过使用膜技术，提取工艺路线短，使用的溶剂种类也相对较少，而且提取过程中经过简单的纳滤浓缩步骤，萃取剂就可以返回到微滤膜中继续萃取，实现了在提取过程中溶剂的循环套用，大大减少了溶剂的使用量，降低了溶剂回收的成本；同时，使用膜浓缩技术，实现了低温浓缩，不仅去除小分子杂质，还减少了真空减压加热浓缩时温度偏高而产生新杂质的问题，提高了产品质量。本发明工艺，对目标物提取纯化后得到的产物纯度高，收率高，使用溶剂量少，而且溶剂的循环利用率高，适合大规模工业化生产。
本发明提供了一种从棘白菌素类化合物发酵液中提取棘白菌素类化合物的方法，该方法包括以下步骤：a)采用微滤设备对棘白菌素类化合物发酵液进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，然后加入调节至pH＝3.0～8.0的水对菌丝体悬浮液进行清洗，微滤后得到清洗后的菌丝体悬浮液，然后在5℃～50℃温度下加入萃取剂对清洗后的菌丝体悬浮液进行萃取，微滤后得到含有棘白菌素类化合物的滤液；其中，所述萃取剂为第一种溶剂与水的混合溶剂，所述第一种溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮；b)用大孔树脂吸附所述滤液中的棘白菌素类化合物，然后用第二种溶剂预洗、解析，得到含有棘白菌素类化合物的解析液；其中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂或弱极性大孔吸附树脂，所述第二种溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮；c)先用纳滤浓缩所述解析液，继续减压浓缩以除去第二种溶剂；d)加入第三种溶剂析出棘白菌素类化合物后，得到含有棘白菌素类化合物的固液混合物；其中，所述第三种溶剂为丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、己烷、***或水；以及e)对所述固液混合物进行过滤，湿粉干燥后得到棘白菌素类化合物干粉。
优选地，所述棘白菌素类化合物包括肺念菌素B0(PneumocandinB0)、WF11899A(FR901379)和棘白菌素B(EchinocandinB)。
优选地，在步骤a)中，分别使用磷酸、草酸、盐酸或氨水调节水至pH＝3.0～8.0，所述磷酸、草酸、盐酸或氨水浓度均为10wt.％～30wt.％。
优选地，在步骤a)中，所述微滤采用陶瓷膜、不锈钢膜、超滤膜中的一种微滤膜过滤、或者陶瓷膜、不锈钢膜、超滤膜中的多种微滤膜串联混合过滤；所述微滤膜为孔径为0.05～0.5μm的陶瓷膜或不锈钢膜、或者截留分子量为30KDalton～3000KDalton的超滤膜。
优选地，在步骤a)中，所述混合溶剂中所述第一种溶剂的体积比例为20％～90％，优选40～60％，更优选20％～50％。
优选地，在步骤a)中，在20～40℃温度下加入萃取剂对清洗后的菌丝体悬浮液进行萃取。
优选地，在步骤a)中，在用大孔树脂吸附所述滤液中的棘白菌素类化合物前，使用截留分子量为200Dalton～800Dalton的纳滤膜进行浓缩，纳滤透过液返回到溶剂萃取步骤中，纳滤浓缩液则进行步骤b)操作。
优选地，在步骤b)中，所述弱极性大孔吸附树脂为AmberliteXAD-7HP或DiaionSP-207；所述非极性大孔吸附树脂为AmberliteXAD-1180N、AmberliteXAD-1600、AmberliteXAD-2、AmberliteXAD-4、DiaionHP-20、或DiaionSP-825。
优选地，在步骤b)中，在萃取液经过大孔树脂吸附所述滤液中的棘白菌素类化合物后，大孔树脂吸附废液先用纳滤膜浓缩后，纳滤透过液作为萃取剂，并返回到步骤a)再次循环进行萃取。
优选地，在步骤b)中，在大孔树脂进行预洗、解析操作之前，先用水洗树脂柱。
优选地，在步骤b)中，在大孔树脂进行预洗操作时，预洗剂为有机溶剂与水的混合溶剂，其中有机溶剂体积比例控制在20％～50％。
优选地，在步骤b)中，在大孔树脂进行解析操作时，解析剂为有机溶剂与水的混合溶剂，其中有机溶剂体积比例控制在50％～90％。
优选地，在步骤c)中，在所述解析液进行浓缩前，或者解析液经过部分浓缩，但棘白菌素类化合物沉淀未析出时，加入脱色剂在0℃～30℃温度下进行脱色，所述脱色剂为活性炭、氧化铝或脱色树脂，加入的脱色剂比例为待脱色料液中棘白菌素类化合物总重量的0.5～5倍。
优选地，在步骤c)中，在20℃～60℃温度下解析液进行真空减压浓缩。
优选地，在步骤e)中，对所述固液混合物直接进行过滤，得到棘白菌素类化合物湿粉。
优选地，在步骤e)中，对所述棘白菌素类化合物湿粉进行干燥，所述干燥采用真空减压加热干燥或者真空减压冷冻干燥。
优选地，在步骤e)中，所述真空减压加热干燥在20℃～60℃温度下进行干燥。
优选地，在步骤d)中，在所述解析液经过浓缩除去第二种溶剂后，再加入第三种溶剂为水时，析出棘白菌素类化合物沉淀后，将所述固液混合物直接进行真空减压冷冻干燥。
本发明的方法通过使用膜技术，提取工艺路线短，使用的溶剂种类也相对较少，而且提取过程中经过简单的纳滤浓缩步骤，萃取剂就可以返回到微滤膜中继续萃取，实现了在提取过程中的溶剂循环套用，大大减少了溶剂的使用量，降低了溶剂回收的成本；同时，使用膜浓缩技术，实现低温浓缩，不仅去除小分子杂质，还减少了真空减压加热浓缩时温度偏高而产生新杂质的问题，提高了产品质量。本发明工艺，对目标物提取纯化后得到的产物纯度高，收率高，使用溶剂量少，而且溶剂的循环利用率高，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制。
实施例1～实施例3举例说明通过微生物发酵，得到肺念菌素B0(PneumocandinB0)、WF11899A(FR901379)、棘白菌素B(EchinocandinB)三种产品发酵液的具体实施方式。
实施例1：肺念菌素B0(PneumocandinB0)发酵液的制备
菌株：Zalerionarboricola(HCCB30111，CGMCCNo.5412)(参见中国专利申请第201210041247.9号申请)；
斜面培养基：PDA；
斜面培养条件：28℃，5天；
种子培养基(％)：葡萄糖2.5，KH2PO40.9，酵母粉0.5，药媒1.0，85％乳酸0.2ml，微量元素0.1ml，pH6.0；
种子培养条件：挖块接种，25℃，220rpm，3天；
发酵培养基(％)：蔗糖12.5，谷氨酸钠0.8，酵母粉0.8，脯氨酸1.5，KH2PO40.15，七水合硫酸镁0.04，微量元素1ml，MES缓冲盐1.5，pH5.3；
发酵条件：转种量10％，25℃，220rpm，发酵培养7天；
微量元素组成(g/L)：七水硫酸亚铁1.0，一水硫酸锰0.2，二水氯化钙0.1，硼酸0.056，二水氯化铜0.025，四水钼酸铵0.019，12N盐酸50ml。
肺念菌素B0(PneumocandinB0)的产品确认：经过HPLC检测，发酵液中肺念菌素B0(PneumocandinB0)含量为4.5g/L。
实施例2：WF11899A(FR901379)发酵液的制备
菌株：ColeophomaempetriWF11899A(FR901379)(参见“improvementofFR901379productionbymutantselectionandmediumoptimizationbyMunekazuKandapublishedinVol.107No.5，530-534，2009，JournalofBioscienceandBioengineering”)
斜面培养基：PDA；
斜面培养条件：28℃，7天；
种子培养基(％)：蔗糖1.0，药媒2.0，酵母粉1.0，蛋白胨1.0，KH2PO40.2，CaCO30.2，Tween800.1，pH6.5；
种子培养条件：挖块接种，25℃，220rpm，发酵培养5天；
发酵培养基(％)：淀粉3.0，葡萄糖1.0，小麦胚芽0.2，药媒2.0，玉米蛋白粉0.5，KH2PO42.0，NaHPO41.5，ZnSO4.7H2O0.001，pH6.7；
发酵条件：转种量10％，25℃，220rpm，7天。
WF11899A(FR901379)的产品确认：经过HPLC检测，发酵液中WF11899A(FR901379)含量为1.03g/l。
实施例3：棘白菌素B(EchinocandinB)发酵液的制备
菌株：Aspergillusrugulovalvus(HCCB30110，CGMCCNo.5413)(参见中国专利申请第201210041876.1号申请)；
斜面培养基：PDA；
斜面培养条件：28℃，5天；
种子培养基(％)：葡萄糖1.0，甘油1.0，棉籽粉2.5，pH6.3；
种子培养条件：挖块接种，25℃，220rpm，发酵培养8天；
发酵培养基(％)：麦芽糖6.0，糊精2.0，棉籽粉3.0，酵母粉1.5，豆油0.2，谷氨酸0.3，KH2PO40.1，pH7.0；
发酵条件：转种量10％，25℃，220rpm，7天。
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，发酵液中棘白菌素B(EchinocandinB)含量为0.87g/l。
实施例4～实施例27举例说明分别以实施例1～实施例3中三种微生物发酵得到的发酵液为原料，提取肺念菌素B0(PneumocandinB0)、WF11899A(FR901379)、棘白菌素B(EchinocandinB)三种产品的具体实施方式。
实施例4：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的陶瓷膜管)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液30L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.05μm陶瓷膜中利用10％磷酸调节pH至3.0的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用甲醇(20％)和水混合萃取剂在陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在5℃，同时完成萃取-过滤操作。含有肺粘菌素B0的萃取液用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取。纳滤浓缩液直接用3LXAD-1180N大孔树脂进行吸附，吸附后的废液返回到陶瓷膜中再次进行萃取，树脂柱先用水洗，再用浓度为20％的甲醇预洗后，60％的甲醇解析。含肺粘菌素B0的解析液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再加入有效组分0.5倍重量的活性炭，温度保持在0℃进行脱色；脱色后的料液40℃真空浓缩，除去甲醇后加入水进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物直接真空冷冻干燥，得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为84.3％。
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝78.9％。
实施例5：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液20L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.5μm不锈钢膜中利用20％磷酸调节pH至6.3的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用90％的乙醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在50℃，同时完成萃取-过滤操作；含肺粘菌素B0的萃取液用400Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至乙醇浓度为45％后，用2.5LXAD-1600大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为45％的乙醇预洗后，90％的乙醇解析；含棘肺粘菌素B0的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分2倍重量的氧化铝，温度保持在30℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去乙醇后加入乙酸乙酯进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，60℃真空减压干燥，得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为82.7％。
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝79.0％。
实施例6：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液21L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为30KDalton的超滤膜中利用20％草酸调节pH至4.6的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用80％的正丙醇-水混合萃取剂在超滤膜中直接进行萃取，温度控制在20℃，同时完成萃取-过滤操作；含肺粘菌素B0的萃取液用800Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/4后，纳滤透过液作为萃取剂返回到超滤膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至正丙醇浓度为40％后，用2LXAD-7HP大孔树脂进行吸附，树脂柱先用水洗，再用浓度为40％的正丙醇预洗后，80％的正丙醇解析；含肺粘菌素B0的解析液加入有效组分3倍重量的脱色树脂，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再60℃真空浓缩，除去正丙醇后加入丙酮进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，20℃真空减压干燥，得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为85.1％。
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝80.1％。
实施例7：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液25L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为3000KDalton的超滤膜中利用30％草酸调节pH至5.8的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至12L后，用80％的异丙醇-水混合萃取剂在超滤膜中直接进行萃取，温度控制在40℃，同时完成萃取-过滤操作；含肺粘菌素B0的萃取液用600Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到超滤膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至异丙醇浓度为40％后，用2LHP-20大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为40％的异丙醇预洗后，80％的异丙醇解析；含肺粘菌素B0的解析液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再加入有效组分5倍重量的活性炭，温度保持在10℃进行脱色；脱色后的料液60℃真空浓缩，除去异丙醇后加入乙腈进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，30℃真空减压干燥，得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为85.9％。
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝79.5％。
实施例8：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的陶瓷膜管)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液23L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.5μm陶瓷膜中利用20％氨水调节pH至8.0的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用30％的丙酮-水混合萃取剂在陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在25℃，同时完成萃取-过滤操作；含肺粘菌素B0的萃取液直接用2.5LSP-207大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为30％的丙酮预洗后，50％的丙酮解析；含肺粘菌素B0的解析液加入有效组分4倍重量的氧化铝，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液30℃真空浓缩，除去丙酮后加入乙酸异丁酯进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，30℃真空减压干燥，得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为84.9％
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝75.7％。
实施例9：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的陶瓷膜管)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液32L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.2μm陶瓷膜中利用10％草酸调节pH至3.6的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用30％的甲醇-水混合萃取剂在陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在10℃，同时完成萃取-过滤操作；含肺粘菌素B0的萃取液用400Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/7后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液直接用3LSP-825大孔树脂进行吸附，吸附废液用纳滤膜浓缩，纳滤透过液返回到不锈钢膜中进行萃取，树脂柱先用水洗，再用浓度为30％的甲醇预洗后，60％的甲醇解析；含肺粘菌素B0的解析液加入有效组分1倍重量的活性炭，温度保持在10℃进行脱色；脱色后的料液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再50℃真空浓缩，除去甲醇后加入乙酸正丁酯进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物过滤后得到湿粉，45℃真空减压干燥得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为86.6％。
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝75.5％。
实施例10：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液26L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.1μm不锈钢膜中利用20％盐酸调节pH至5.0的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至13L后，用60％的乙醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在40℃，同时完成萃取-过滤操作；含肺粘菌素B0的萃取液用600Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/4后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至乙醇浓度为30％后，用2.5LXAD-2大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为30％的乙醇预洗后，70％的乙醇解析；含肺粘菌素B0的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分2.5倍重量的氧化铝，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液40℃真空浓缩，除去乙醇后加入***进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，35℃真空减压干燥，得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为86.3％。
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝78.7％。
实施例11：肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例1制得的棘白菌素类化合物发酵液27L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为500KDalton的超滤膜中利用10％氨水调节pH至7.5的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，料液放入0.1um的陶瓷膜中，用50％的正丙醇-水混合萃取剂中直接进行萃取，温度控制在30℃，同时完成萃取-过滤操作；含肺粘菌素B0的萃取液用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/4后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液用3LXAD-4大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为50％的正丙醇预洗后，90％的正丙醇解析；含肺粘菌素B0的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分3倍重量的活性炭，温度保持在15℃进行脱色；脱色后的料液60℃真空浓缩，除去正丙醇后加入己烷进行沉淀；含肺粘菌素B0沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，40℃真空减压干燥，得到肺粘菌素B0干粉，产品收率为85.1％。
肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：LichrocartSilica5μm250×4.6mm
检测波长：278nm
流动相：乙酸乙酯∶甲醇∶水＝86∶8∶6
流速：1mL/min
柱温：30℃
PneumocandinB0(肺念菌素B0)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中肺粘菌素B0(PneumocandinB0)的含量＝75.9％。
实施例12：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液20L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为1000KDalton的超滤膜中利用10％盐酸调节pH至4.8的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至I0L后，料液放入0.2um的不锈钢膜中，用90％的异丙醇-水混合萃取剂直接进行萃取，温度控制在30℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用600Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到不锈钢膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至异丙醇浓度为45％后，用2LHP-20大孔树脂进行吸附，树脂柱先用水洗，再用浓度为45％的异丙醇预洗后，80％的异丙醇解析；含WF11899A的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分1.5倍重量的活性炭，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去异丙醇后加入乙腈进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，30℃真空减压干燥，得到WF11899A干粉，产品收率为87.9％。
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝73.0％。
实施例13：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的陶瓷膜管)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液25L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.2μm陶瓷膜中利用10％草酸调节pH至4.0的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至12L后，用30％的甲醇-水混合萃取剂在陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在35℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液直接用2.5LXAD-1600大孔树脂进行吸附，吸附废液用纳滤膜浓缩，纳滤透过液返回到陶瓷膜中进行萃取，树脂柱用浓度为30％的甲醇预洗后，60％的甲醇解析；含WF11899A的解析液先加入有效组分0.5倍重量的氧化铝，温度保持在0℃进行脱色；脱色后的料液纳滤浓缩至原体积1/10后，再40℃真空浓缩，除去甲醇后。加入乙酸正丁酯进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，50℃真空减压干燥，得到WF11899A干粉，产品收率为83.5％
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝74.6％。
实施例14：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液23L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.2μm不锈钢膜中利用30％磷酸调节pH至5.3的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用80％的乙醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在50℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至乙醇浓度为40％后，用2LXAD-1180N大孔树脂进行吸附，树脂柱先用水洗，再用浓度为40％的乙醇预洗后，80％的乙醇解析；含WF11899A的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分2倍重量的活性炭，温度保持在25℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去乙醇后加入水进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物直接真空冷冻干燥，得到WF11899A干粉，产品收率为81.3％。
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝76.7％。
实施例15：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液28L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.3μm不锈钢膜中利用10％盐酸调节pH至3.5的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用50％的乙醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在30℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用600Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/4后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液用3LXAD-2大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为50％的乙醇预洗后，80％的乙醇解析；含WF11899A的解析液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再加入有效组分2.5倍重量的脱色树脂，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液40℃真空浓缩，除去乙醇后加入己烷进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，30℃真空减压干燥，得到WF11899A干粉，产品收率为87.1％。
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝76.3％。
实施例16：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液20L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为300KDalton的超滤膜中利用25％草酸调节pH至5.1的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用90％的正丙醇-水混合萃取剂在超滤膜中直接进行萃取，温度控制在35℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用600Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/4后，纳滤透过液作为萃取剂返回到超滤膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至正丙醇浓度为45％后，用2LXAD-7HP大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为45％的正丙醇预洗后，80％的正丙醇解析；含WF11899A的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分3倍重量的氧化铝，温度保持在25℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去正丙醇后加入丙酮进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，25℃真空减压干燥，得到WF11899A干粉，产品收率为85.6％。
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝80.6％。
实施例17：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的陶瓷膜管)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液30L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.3μm陶瓷膜中利用20％磷酸调节pH至4.9的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用40％的甲醇-水混合萃取剂在陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在40℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用800Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/6后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液直接用3LSP-825大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为40％的甲醇预洗后，60％的甲醇解析；含WF11899A的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分2倍重量的活性炭，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液45℃真空浓缩，除去甲醇后加入乙酸异丁酯进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物过滤后得到湿粉，45℃真空减压干燥得到WF11899A干粉，产品收率为83.6％。
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝79.5％。
实施例18：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液25L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.05μm不锈钢膜中利用10％草酸调节pH至5.3的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用80％的乙醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在35℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用400Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至乙醇浓度为40％后，用2.5LXAD-2大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为40％的乙醇预洗后，85％的乙醇解析；含WF11899A的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分2.5倍重量的活性炭，温度保持在30℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去乙醇后加入乙酸乙酯进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，60℃真空减压干燥，得到WF11899A干粉，产品收率为83.7％。
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝77.3％。
实施例19：WF11899A(FR901379)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例2制得的棘白菌素类化合物发酵液24L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为100KDalton的超滤膜中利用20％氨水调节pH至7.4的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用45％的正丙醇-水混合萃取剂在超滤膜中直接进行萃取，温度控制在40℃，同时完成萃取-过滤操作；含WF11899A的萃取液用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到超滤膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液用2.5LXAD-4大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为45％的正丙醇预洗后，90％的正丙醇解析；含WF11899A的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分1.5倍重量的活性炭，温度保持在15℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去正丙醇后加入***进行沉淀；含WF11899A沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，40℃真空减压干燥，得到WF11899A干粉，产品收率为86.1％。
WF11899A的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
WF11899A的产品确认：经过HPLC检测，干粉中WF11899A(FR901379)的含量＝76.9％。
实施例20：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液27L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.1μm不锈钢膜中利用10％磷酸调节pH至3.3的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用20％的甲醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在35℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用400Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/6后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液用2.5LXAD-1600大孔树脂进行吸附，吸附废液返回到不锈钢膜中进行萃取，树脂柱先用水洗，再用浓度为20％的甲醇预洗后，75％的甲醇解析；含棘白菌素B的解析液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再加入有效组分1.5倍重量的脱色树脂，温度保持在30℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去甲醇后加入乙酸正丁酯进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，50℃真空减压干燥，得到棘白菌素B干粉，产品收率为83.9％。
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝64.1％。
实施例21：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液30L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为2000KDalton的超滤膜中利用25％盐酸调节pH至5.8的水对发酵液进行水洗；过滤至15L后，用80％的异丙醇-水混合萃取剂在超滤膜中直接进行萃取，温度控制在35℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用600Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到超滤膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至正丙醇浓度为40％后，用2.5LXAD-4大孔树脂进行吸附，树脂柱先用水洗，再用浓度为40％的正丙醇预洗后，80％的正丙醇解析；含棘白菌素B的解析液先加入有效组分3倍重量的活性炭，温度保持在15℃进行脱色；脱色后的料液纳滤浓缩至原体积1/15后，再50℃真空浓缩，除去异丙醇后加入丙酮进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，35℃真空减压干燥，得到棘白菌素B干粉，产品收率为82.6％。
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝68.3％。
实施例22：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液28L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.3μm不锈钢膜中利用20％草酸调节pH至6.3的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用80％的乙醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在40℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用400Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至乙醇浓度为40％后，用2LXAD-7HP大孔树脂进行吸附，树脂柱先用水洗，再用浓度为40％的乙醇预洗后，80％的乙醇解析；含棘白菌素B的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分2.5倍重量的氧化铝，温度保持在25℃进行脱色；脱色后的料液40℃真空浓缩，除去乙醇后加入乙腈进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，35℃真空减压干燥，得到棘白菌素B干粉，产品收率为83.9％。
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝71.6％。
实施例23：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液31L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为1500KDalton的超滤膜中利用20％草酸调节pH至5.2的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用90％的异丙醇-水混合萃取剂在超滤膜中直接进行萃取，温度控制在30℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到超滤膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液加水稀释至异丙醇浓度为45％后，用3LSP-207大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为45％的异丙醇预洗后，80％的异丙醇解析；含棘白菌素B的解析液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再加入有效组分1.5倍重量的活性炭，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液60℃真空浓缩，除去异丙醇后加入水进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物直接真空冷冻干燥，得到棘白菌素B干粉，产品收率为84.9％。
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝70.1％。
实施例24：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的陶瓷膜管)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液25L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.2μm陶瓷膜中利用10％草酸调节pH至4.6的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用35％的甲醇-水混合萃取剂在陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在35℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/6后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液直接用2.5LXAD-1180N大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为35％的甲醇预洗后，60％的甲醇解析；含棘白菌素B的解析液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再加入有效组分0.5倍重量的活性炭，温度保持在10℃进行脱色；脱色后的料液40℃真空浓缩，除去甲醇后，加入***进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，50℃真空减压干燥，得到棘白菌素B干粉，产品收率为83.5％
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝72.0％。
实施例25：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(超滤膜设备：三达膜科技有限公司，型号SMRXM-100)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液28L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在截留分子量为200KDalton的超滤膜中利用15％氨水调节pH至7.2的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用50％的正丙醇-水混合萃取剂在超滤膜中直接进行萃取，温度控制在40℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用400Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到超滤膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液用3LHP-20大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为50％的正丙醇预洗后，85％的正丙醇解析；含棘白菌素B的解析液先纳滤浓缩至原体积1/15后，再加入有效组分1倍重量的活性炭，温度保持在15℃进行脱色；脱色后的料液50℃真空浓缩，除去正丙醇后加入乙酸异丁酯进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，40℃真空减压干燥，得到棘白菌素B干粉，产品收率为87.3％。
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝71.4％。
实施例26：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的不锈钢膜管)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液20L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.3μm不锈钢膜中利用15％草酸调节pH至3.9的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至10L后，用45％的乙醇-水混合萃取剂在不锈钢膜中直接进行萃取，温度控制在35℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用400Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/4后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液用2LXAD-2大孔树脂进行吸附，树脂柱先用水洗，再用浓度为45％的乙醇预洗后，70％的乙醇解析；含棘白菌素B的解析液先加入有效组分1.5倍重量的活性炭，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液纳滤浓缩至原体积1/10后，再40℃真空浓缩，除去乙醇后加入己烷进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物过滤得到湿粉，30℃真空减压干燥，得到棘白菌素B干粉，产品收率为85.4％。
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝66.4％。
实施例27：棘白菌素B(EchinocandinB)的提取
采用微滤膜设备(陶瓷膜设备：三达膜科技有限公司定制，装有两根φ3cm×100cm的陶瓷膜管)对由实施例3制得的棘白菌素类化合物发酵液23L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，在0.1μm陶瓷膜中利用20％盐酸调节pH至4.3的水对菌丝体悬浮液进行水洗；过滤至15L后，用40％的甲醇-水混合萃取剂在陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在40℃，同时完成萃取-过滤操作；含棘白菌素B的萃取液用800Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取；纳滤浓缩液直接用2LSP-825大孔树脂进行吸附，树脂柱用浓度为40％的甲醇预洗后，70％的甲醇解析；含棘白菌素B的解析液先纳滤浓缩至原体积1/10后，再加入有效组分2.5倍重量的氧化铝，温度保持在20℃进行脱色；脱色后的料液45℃真空浓缩，除去甲醇后加入乙酸乙酯进行沉淀；含棘白菌素B沉淀的固液混合物过滤后得到湿粉，45℃真空减压干燥得到棘白菌素B干粉，产品收率为84.6％。
棘白菌素B(EchinocandinB)的HPLC检测条件如下：
色谱柱：PhenomenexLuna5μmC18(2)250×4.6mm
检测波长：275nm
流动相：乙腈∶水＝45∶55(添加0.3％的甲酸-甲酸铵缓冲盐)
流速：1mL/min
柱温：30℃
棘白菌素B(EchinocandinB)的产品确认：经过HPLC检测，干粉中棘白菌素B(EchinocandinB)的含量＝68.2％。
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。
Claims (18)
1.一种从棘白菌素类化合物发酵液中提取棘白菌素类化合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)采用微滤设备对棘白菌素类化合物发酵液进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液，然后加入调节至pH＝3.0～8.0的水对菌丝体悬浮液进行清洗，微滤后得到清洗后的菌丝体悬浮液，然后在5℃～50℃温度下加入萃取剂对清洗后的菌丝体悬浮液进行萃取，微滤后得到含有棘白菌素类化合物的滤液；其中，所述萃取剂为第一种溶剂与水的混合溶剂，所述第一种溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮；所述微滤采用陶瓷膜、不锈钢膜、超滤膜中的一种微滤膜过滤、或者陶瓷膜、不锈钢膜、超滤膜中的多种微滤膜串联混合过滤；所述微滤膜为孔径为0.05～0.5μm的陶瓷膜或不锈钢膜、或者截留分子量为30KDalton～3000KDalton的超滤膜；
b)用大孔树脂吸附所述滤液中的棘白菌素类化合物，然后用第二种溶剂预洗、解析，得到含有棘白菌素类化合物的解析液；其中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂或弱极性大孔吸附树脂，所述弱极性大孔吸附树脂为AmberliteXAD-7HP；所述非极性大孔吸附树脂为AmberliteXAD-1180N、AmberliteXAD-2、AmberliteXAD-4、或DiaionSP-825；所述第二种溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇；
c)先用纳滤浓缩所述解析液，继续减压浓缩以除去第二种溶剂；
d)加入第三种溶剂析出棘白菌素类化合物后，得到含有棘白菌素类化合物的固液混合物；其中，所述第三种溶剂为丙酮、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、己烷、***或水；以及
e)对所述固液混合物进行过滤，湿粉干燥后得到棘白菌素类化合物干粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棘白菌素类化合物包括肺念菌素BO(PneumocandinBO)、WF11899A(FR901379)和棘白菌素B(EchinocandinB)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，分别使用磷酸、草酸、盐酸或氨水调节水至pH＝3.0～8.0，所述磷酸、草酸、盐酸或氨水浓度均为10wt.％～30wt.％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述混合溶剂中所述第一种溶剂的体积比例为20％～90％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述混合溶剂中所述第一种溶剂的体积比例为40～60％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述混合溶剂中所述第一种溶剂的体积比例为20％～50％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，在20～40℃温度下加入萃取剂对清洗后的菌丝体悬浮液进行萃取。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，在用大孔树脂吸附所述滤液中的棘白菌素类化合物前，使用截留分子量为200Dalton～800Dalton的纳滤膜进行浓缩，纳滤透过液返回到溶剂萃取步骤中，纳滤浓缩液则进行步骤b)操作。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，在萃取液经过大孔树脂吸附所述滤液中的棘白菌素类化合物后，大孔树脂吸附废液先用纳滤膜浓缩后，纳滤透过液作为萃取剂，并返回到步骤a)再次循环进行萃取。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，在大孔树脂进行预洗、解析操作之前，先用水洗树脂柱。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，在大孔树脂进行预洗操作时，预洗剂为有机溶剂与水的混合溶剂，其中有机溶剂体积比例控制在20％～50％。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，在大孔树脂进行解析操作时，解析剂为有机溶剂与水的混合溶剂，其中有机溶剂体积比例控制在50％～90％。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，在所述解析液进行浓缩前，或者解析液经过部分浓缩，但棘白菌素类化合物沉淀未析出时，加入脱色剂在0℃～30℃温度下进行脱色，所述脱色剂为活性炭、氧化铝或脱色树脂，加入的脱色剂比例为待脱色料液中棘白菌素类化合物总重量的0.5～5倍。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，在20℃～60℃温度下解析液进行真空减压浓缩。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，对所述固液混合物直接进行过滤，得到棘白菌素类化合物湿粉。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，对所述棘白菌素类化合物湿粉进行干燥，所述干燥采用真空减压加热干燥或者真空减压冷冻干燥。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，所述真空减压加热干燥在20℃～60℃温度下进行干燥。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤d)中，在所述解析液经过浓缩除去第二种溶剂后，再加入第三种溶剂为水时，析出棘白菌素类化合物沉淀后，将所述固液混合物直接进行真空减压冷冻干燥。
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