CN111183973A - 唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111183973A
CN111183973A CN202010063435.6A CN202010063435A CN111183973A CN 111183973 A CN111183973 A CN 111183973A CN 202010063435 A CN202010063435 A CN 202010063435A CN 111183973 A CN111183973 A CN 111183973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
saliva
preservation
days
dna
preservation solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010063435.6A
Other languages
English (en)
Inventor
梁玉姣
耿彪
曹健荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Denogen Beijing Bio Sci&tech Co ltd
Original Assignee
Denogen Beijing Bio Sci&tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Denogen Beijing Bio Sci&tech Co ltd filed Critical Denogen Beijing Bio Sci&tech Co ltd
Priority to CN202010063435.6A priority Critical patent/CN111183973A/zh
Publication of CN111183973A publication Critical patent/CN111183973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用。本发明提供的保存液，包括：Tris‑HCl 10‑50mmol/L，尿素0.2‑1mol/L，SDS 0.3‑1w/v％，EDTA‑Na2 1‑8mmol/L，褐藻酸钠2‑8w/v％和左旋肉碱3‑8w/v％，pH为7‑10。在本发明中，保存液各组分通过有效的配比与之间的协同作用，使得唾液或口腔拭子样本可以长时间保存，特别是在35℃以上的高温环境中，也可以实现样本的良好保存。该保存液使得唾液或口腔拭子提取基因组DNA的应用更为广泛，降低了环境和操作要求，从而降低了操作成本，同时有利于后续的PCR试验操作。

Description

唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用。
背景技术
人体组织及体液中提取得到的基因组DNA样本在基因工程和分子生物学研究等领域应用广泛。通常用于PCR反应和其他测试的基因组DNA主要从抗凝血中提取，然而抗凝血保存时间长后，会形成血块，给提取带来了不便。而且通过采血提取DNA还需专业的人员进行抽血、有些人对抽血有抵触的心理，该方式具有无法大量随时采集样本的缺点。
唾液及口腔基因组DNA提取相对于抗凝血采集基因组DNA的方式来说，是一种无伤害、无痛苦、操作简单获得基因组DNA的方法，由于其室温条件下保存时间较长时仍可获得完整的基因组DNA，近年来逐渐被采用。
人体内唾液中99％是水，含钠、钾、钙、镁、氯、碳酸氢根、磷酸根等电解质，粘多糖、糖蛋白、淀粉酶、舌酯酶、抗菌酶、富脯氨酸蛋白等有机物，同时含有多种细菌和口腔脱落细胞。众所周知，DNA在高温环境中容易发生降解，而现有技术中并没有对高温环境保DNA提供一个有效的保存试剂。因此如何在高温环境下长时间保证基因组DNA的完整成为唾液、口腔拭子保存液的关键所在。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种唾液或口腔拭子的保存液，该保存液缓解了现有技术中保存液不能在高温环境中长时间保存唾液或口腔拭子，从而保证基因组DNA不降解的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种唾液或口腔拭子的保存液的制备方法，该方法简单易操作，成本低。
本发明的第三目的在于提供上述保存液在唾液或口腔拭子提取基因组DNA中的应用。
本发明的第四目的在于提供上述保存液在保存唾液或口腔拭子中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括：Tris-HCl 10-50mmol/L，尿素0.2-1mol/L，SDS 0.3-1w/v％，EDTA-Na2 1-8mmol/L，褐藻酸钠2-8w/v％和左旋肉碱3-8w/v％，保存液pH为7-10。
进一步地，包括：Tris-HCl 15-45mmol/L，尿素0.3-0.9mol/L，SDS0.3-0.8w/v％，EDTA-Na2 1-6mmol/L，褐藻酸钠3-7w/v％和左旋肉碱3-7w/v％，保存液pH为7-9。
进一步地，包括：Tris-HCl 20-40mmol/L，尿素0.3-0.7mol/L，SDS0.4-0.7w/v％，EDTA-Na2 2-5mmol/L，褐藻酸钠4-6w/v％和左旋肉碱3-5w/v％，保存液pH为7-8。
进一步地，包括：Tris-HCl 30mmol/L，尿素0.6mol/L，SDS 0.5w/v％，EDTA-Na23mmol/L，褐藻酸钠5w/v％和左旋肉碱4w/v％，保存液pH为7.5。
上述保存液的制备方法，按配比将Tris-HCl，尿素，SDS，EDTA-Na2，褐藻酸钠和左旋肉碱用水混匀，调整pH，得到保存液。
进一步地，调整pH后还包括除菌的步骤。
上述保存液在从唾液或口腔拭子提取基因组DNA中的应用。
上述保存液在保存唾液或口腔拭子中的应用。
进一步地，保存的温度为-80℃-50℃。
进一步地，所述唾液为人体唾液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的唾液或口腔拭子的保存液，包括：Tris-HCl 10-50mmol/L，尿素0.2-1mol/L，SDS 0.3-1w/v％，EDTA-Na2 1-8mmol/L，褐藻酸钠2-8w/v％和左旋肉碱3-8w/v％，保存液pH为7-10。其中，尿素和SDS作为变性剂可以抑制或减少微生物的生长；SDS和褐藻酸钠作为抑菌剂，可以杀灭或减少唾液或口腔拭子中的微生物，褐藻酸钠作为天然抑菌剂，可以有效抑制真菌和细菌的滋生，延长保存时间；EDTA-Na2作为螯合剂可以螯合镁离子等核酸酶的激活剂，抑制核酸酶对DNA的降解；左旋肉碱可以有效地保护唾液或口腔拭子中获取细胞的活性，延长保存时间；同时，Tris-HCl作为缓冲试剂，使得保存液相对稳定，一定范围的pH环境有利于样本的保存。在本发明中，保存液各组分通过有效的配比与各组分之间的协同作用，共同构成了一个相对稳定的保存环境，使得唾液或口腔拭子样本可以长时间保存，特别是在35℃以上的高温环境中，也可以实现样本的良好保存。该保存液使得唾液或口腔拭子提取基因组DNA的应用更为广泛，降低了环境和操作要求，从而降低了操作成本，同时有利于后续的PCR试验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试验例1中唾液样本采用实施例1的保存液室温下保存不同时间后提取的DNA基因组电泳图，M代表Trans 15K DNA Maker，1-8分别代表8个不同的人员样本；
图2为本发明试验例1中口腔拭子样本采用实施例1的保存液室温下保存不同时间后提取的DNA基因组电泳图，M代表Trans 15K DNA Maker，1-8分别代表8个不同的人员样本；
图3为本发明试验例2中唾液样本采用不同保存液50℃高温下保存7天提取的DNA基因组电泳图，M代表Trans 15K DNA Maker，1为实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图4为本发明试验例2中唾液样本采用不同保存液50℃高温下保存21天提取的DNA基因组电泳图，M代表Trans 15K DNA Maker，1为实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图5为本发明试验例2中口腔拭子样本采用不同保存液50℃高温下保存7天提取的DNA基因组电泳图，M代表Trans 15K DNA Maker，1为实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图6为本发明试验例2中口腔拭子样本采用不同保存液50℃高温下保存21天提取的DNA基因组电泳图，M代表Trans 15K DNA Maker，1为实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图7为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1的保存液常温保存7天提取的基因组DNA扩增结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1和2分别代表2个不同的人员样本；
图8为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1的保存液常温保存21天提取的基因组DNA扩增结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1和2分别代表2个不同的人员样本；
图9为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液常温保存7天提取的基因组DNA扩增结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1和2分别代表2个不同的人员样本；
图10为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液常温保存21天提取的基因组DNA扩增结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1和2分别代表2个不同的人员样本；
图11为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1和对比例1-10的保存液50℃保存7天提取的基因组DNA扩增产物1结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图12为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1和对比例1-10的保存液50℃保存7天提取的基因组DNA扩增产物2结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图13为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1和对比例1-10的保存液50℃保存7天提取的基因组DNA扩增产物3结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图14为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1和对比例1-10的保存液50℃保存21天提取的基因组DNA扩增产物1结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图15为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1和对比例1-10的保存液50℃保存21天提取的基因组DNA扩增产物2结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图16为本发明试验例3中唾液样本采用实施例1和对比例1-10的保存液50℃保存21天提取的基因组DNA扩增产物3结果，M代表GeneRuler High Range DNA Ladder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图17为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液和对比例1-10的保存液50℃保存7天提取的基因组DNA扩增产物1结果，M代表GeneRuler High Range DNALadder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图18为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液和对比例1-10的保存液50℃保存7天提取的基因组DNA扩增产物2结果，M代表GeneRuler High Range DNALadder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图19为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液和对比例1-10的保存液50℃保存7天提取的基因组DNA扩增产物3结果，M代表GeneRuler High Range DNALadder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图20为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液和对比例1-10的保存液50℃保存21天提取的基因组DNA扩增产物1结果，M代表GeneRuler High Range DNALadder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图21为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液和对比例1-10的保存液50℃保存21天提取的基因组DNA扩增产物2结果，M代表GeneRuler High Range DNALadder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本；
图22为本发明试验例3中口腔拭子样本采用实施例1的保存液和对比例1-10的保存液50℃保存21天提取的基因组DNA扩增产物3结果，M代表GeneRuler High Range DNALadder，1代表实施例1保存的样本，2-11为对比例1-10保存的样本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括：Tris-HCl 10-50mmol/L，尿素0.2-1mol/L，SDS 0.3-1w/v％，EDTA-Na2 1-8mmol/L，褐藻酸钠2-8w/v％和左旋肉碱3-8w/v％，保存液pH为7-10。
在本发明中，保存液各组分通过有效的配比与之间的协同作用，共同构成了一个相对稳定的保存环境，使得唾液或口腔拭子样本可以长时间保存，特别是在35℃以上的高温环境中，也可以实现样本的良好保存。该保存液使得唾液或口腔拭子提取基因组DNA的应用更为广泛，降低了环境和操作要求，从而降低了操作成本，同时有利于后续的PCR试验操作。
尿素和SDS作为变性剂可以抑制或减少微生物的生长；SDS和褐藻酸钠作为抑菌剂，可以杀灭或减少唾液或口腔拭子中的微生物，褐藻酸钠作为天然抑菌剂，可以有效抑制真菌和细菌的滋生，延长保存时间；EDTA-Na2作为螯合剂可以螯合镁离子等核酸酶的激活剂，抑制核酸酶对DNA的降解；左旋肉碱可以有效地保护唾液或口腔拭子中获取细胞的活性，延长保存时间；同时，Tris-HCl作为缓冲试剂，使得保存液相对稳定，一定范围的pH环境有利于样本的保存。
需要说明的是，本发明中“w/v％”是指每100mL的保存液中含有的物质质量g，例如，“SDS 0.3-1w/v％”是指每100mL保存液中含有SDS 0.3-1g；“褐藻酸钠2-8w/v％”是指每100mL保存液中含有褐藻酸钠2-8g；“左旋肉碱3-8w/v％”是指每100mL保存液中含有左旋肉碱3-8g。
Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)的含量可以但不限于10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L；尿素的含量可以但不限于0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L；SDS(十二烷基硫酸钠)的含量可以但不限于0.3w/v％、0.4w/v％、0.5w/v％、0.6w/v％、0.7w/v％、0.8w/v％、0.9w/v％或1w/v％；EDTA--Na2的含量可以但不限于1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L或8mmol/L；褐藻酸钠的含量可以但不限于2w/v％、3w/v％、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％或8w/v％；左旋肉碱的含量可以但不限于3w/v％、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％或8w/v％。保存液pH可以但不限于7、8、9或10。
在一些实施方式中，保存液包括：Tris-HCl 15-45mmol/L，尿素0.3-0.9mol/L，SDS0.3-0.8w/v％，EDTA-Na2 1-6mmol/L，褐藻酸钠3-7w/v％和左旋肉碱3-7w/v％，保存液pH为7-9。
在优选地实施方式中，保存液包括：Tris-HCl 20-40mmol/L，尿素0.3-0.7mol/L，SDS 0.4-0.7w/v％，EDTA-Na2 2-5mmol/L，褐藻酸钠4-6w/v％和左旋肉碱3-5w/v％，保存液pH为7-8。
在更优选地实施方式中，保存液包括：Tris-HCl 30mmol/L，尿素0.6mol/L，SDS0.5w/v％，EDTA-Na2 3mmol/L，褐藻酸钠5w/v％和左旋肉碱4w/v％，保存液pH为7.5。
通过对保存液中组分的配比进行进一步的优选，使得保存液的性能更加稳定，保存效果更好。
本发明还保护上述保存液的制备方法，按配比将Tris-HCl，尿素，SDS，EDTA-Na2，褐藻酸钠和左旋肉碱用水混匀，调整pH，得到保存液。
在优选地实施方式中，调整pH后还包括除菌的步骤。除菌可以优选为过滤膜过滤除菌。
本发明还保护保存液在从唾液或口腔拭子提取基因组DNA中的应用。对于已经取样的唾液或口腔拭子，不能马上提取基因组DNA的样本可以采用本申请提供的保存液进行保存，便于后期的提取。
本发明还保护保存液在保存唾液或口腔拭子中的应用。其中，保存的温度可以为-80℃-50℃。进一步优选为35-50℃。本发明提供的保存液适用于在高温环境下唾液或口腔拭子样本的保存，效果好。
在优选地实施方式中，唾液为人体唾液。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括以下组分和含量：Tris-HCl30mmol/L，尿素0.6mol/L，SDS 0.5w/v％，EDTA-Na2 3mmol/L，褐藻酸钠5w/v％，左旋肉碱4w/v％。
本实施例的唾液、口腔拭子保存液的制备方法如下：
分别称取30.06g尿素、5g SDS、50g褐藻酸钠、40g左旋肉碱至800ml无菌水中溶解，然后加入30ml 1M Tris-HCl，6ml 0.5M EDTA-Na2，用玻璃棒搅拌均匀后用稀盐酸调节pH至7.5后定容至1000ml。然后用一次性滤膜过滤后放置于蓝盖瓶中。
实施例2
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 10mmol/L，尿素1mol/L，SDS 0.3w/v％，EDTA-Na2 8mmol/L，褐藻酸钠2w/v％和左旋肉碱8w/v％，保存液pH为7。
实施例3
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 50mmol/L，尿素0.2mol/L，SDS 1w/v％，EDTA-Na2 1mmol/L，褐藻酸钠8w/v％和左旋肉碱3w/v％，保存液pH为10。
实施例4
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 15mmol/L，尿素0.9mol/L，SDS0.3w/v％，EDTA-Na2 6mmol/L，褐藻酸钠3w/v％和左旋肉碱7w/v％，保存液pH为7。
实施例5
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 45mmol/L，尿素0.3mol/L，SDS0.8w/v％，EDTA-Na2 1mmol/L，褐藻酸钠7w/v％和左旋肉碱3w/v％，保存液pH为9。
实施例6
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 20mmol/L，尿素0.7mol/L，SDS0.4w/v％，EDTA-Na2 5mmol/L，褐藻酸钠4w/v％和左旋肉碱5w/v％，保存液pH为7。
实施例7
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 40mmol/L，尿素0.3mol/L，SDS0.7w/v％，EDTA-Na2 2mmol/L，褐藻酸钠6w/v％和左旋肉碱3w/v％，保存液pH为8。
对比例1
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 5mmol/L，尿素0.15mol/L，SDS0.2w/v％，EDTA-Na2 0.5mmol/L，褐藻酸钠1w/v％和左旋肉碱2w/v％，保存液pH为7。
对比例2
一种唾液或口腔拭子的保存液，包括Tris-HCl 60mmol/L，尿素1.5mol/L，SDS1.5w/v％，EDTA-Na2 10mmol/L，褐藻酸钠10w/v％和左旋肉碱10w/v％，保存液pH为8。
对比例3
一种唾液或口腔拭子的保存液，以实施例1中保存液为基础，缺少0.6mol/L尿素。
对比例4
一种唾液或口腔拭子的保存液，以实施例1中保存液为基础，缺少0.5w/v％SDS。
对比例5
一种唾液或口腔拭子的保存液，以实施例1中保存液为基础，缺少3mmol/L EDTA-Na2。
对比例6
一种唾液或口腔拭子的保存液，以实施例1中保存液为基础，缺少5w/v％褐藻酸钠。
对比例7
一种唾液或口腔拭子的保存液，以实施例1中保存液为基础，缺少4w/v％左旋肉碱。
对比例8
一种唾液保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.67mol/L，Tris-HCl33mmol/L，尿素0.67mol/L，SDS 0.6％(w/v)，EDTA 3.3mmol/L，乙醇30％(v/v)，体系pH为7.5。
对比例9
一种唾液或口腔拭子的保存液，以实施例1中保存液为基础，pH值为5。
对比例10
一种唾液或口腔拭子的保存液，以实施例1中保存液为基础，pH值为11。
试验例1
唾液和口腔拭子样本采集和保存的方法：
采样前要求：采样前30min漱口以除去食物残渣及残留微生物，漱口后30min内不要饮食、吸烟，也不要大量饮水，以免影响脱落细胞的回收数量。
唾液样本采集：开始吐唾液前，放松脸颊，吐出唾液后将其与实施例1中的保存液按1：1的比例颠倒混匀，每个人各采唾液3ml，共采样8人，将唾液与保存液充分混匀后放置于室温保存，分别于0天、7天、21天提取样本中的DNA。
口腔拭子样本采集：准备无菌医用棉签，从口腔内侧左右脸颊反复擦拭15次，取出棉签，将其放置于400μl实施例1中的保存液中，使拭子充分浸泡。每人收集3个样本，共采样8人，放置于室温保存，分别于0天、7天、21天提取样本中的DNA。
唾液样本DNA的提取方法：
取500μl唾液与保存液的混合样本加入500μl LB、25μl pk，56℃水浴20min；
磁吸去上清后加入750μl Binding Buffer、30μlMB混匀10min；
磁吸去上清后加入500μl WB1洗涤一次；
磁吸去上清后加入500μl WB2洗涤两次；
磁吸去上清后加入500μl WB3洗涤一次，加入50μl EB56℃水浴10min；
将离心管置于磁力架上，将液体转移至新的离心管中。
将唾液0天、7天、21天提取后的DNA进行电泳检测，结果如图1所示，其中，M为maker，1-8泳道分别为8个人的唾液样本。
口腔拭子样本DNA的提取方法：
向400μl口腔拭子样本中加入400μl LB、20μl PK，56℃水浴20min；
然后将液体取出至新的离心管中，加入600μlBD、30μlMB混匀10min；
磁吸去上清后加入500μl WB1洗涤一次；
磁吸去上清后加入500μl WB2洗涤两次；
磁吸去上清后加入500μl WB3洗涤一次，加入50μl EB56℃水浴10min；
将离心管置于磁力架上，将液体转移至新的离心管中。
将口腔拭子0天、7天、21天提取后的DNA进行电泳检测，结果如图2所示，其中M为maker，1-8泳道分别为8个人的唾液样本。
从上述结果可以看出唾液样本室温保存7天、21天与0天提取得到的DNA相比条带清晰，没有降解；口腔拭子样本室温保存7天、21天与0天提取得到的DNA相比条带清晰，没有降解。因此本发明的保存液可以用于唾液及口腔拭子的在室温下保存。
此外，按照上述试验流程，将实施例2-7中的保存液也进行了相同的试验，经测试表明，本发明提供的保存液对唾液样本或口腔拭子样本在室温下保存均具有良好的效果。
试验例2
唾液和口腔拭子样本采集和保存的方法：
唾液样本采集：按照试验例1中唾液样本采集的方法进行采集并提取DNA。采集1个人的唾液16.5ml，混匀离心后，分装成每管1.5ml，共分11管，分别与实施例1和对比例1-10的保存液按1：1混合，混匀后放置于50℃保存，分别于7天、21天提取样本中的DNA。
口腔拭子样本采集：按照试验例1中口腔拭子样本采集的方法进行采集并提取DNA。采集1个人的口腔拭子22个，分成11组，分别放置于实施例1和对比例1-10的保存液中，同时放置于50℃保存，分别于7天、21天提取样本中的DNA。
通过检测发现，唾液样本中，实施例1保存液样本在7天可使DNA不降解，对比例1-10保存液保存的样本7天时产生了不同程度的降解；21天后对比例中的样本降解更为严重了，呈弥散状态。
其中，实施例1和对比例1-10，如图3(保存7天)、图4(保存21天)所示，其中，M为maker，1为实施例1的样本，2-11为对比例1-10的样本。
口腔拭子样本中，实施例1中保存液样本在7天可使DNA不降解，对比例1-10保存液保存的样本7天时产生了不同程度的降解；21天后对比例中的样本降解更为严重了，呈弥散状态。
其中，实施例1和对比例1-10，如图5(保存7天)、图6(保存21天)所示，其中，M为maker，1为实施例1的样本，2-11为对比例1-10的样本。
上述结果表明，本发明提供的保存液在50℃的高温保存21天仍能很好的保护基因组DNA的完整性，本发明提供的保存液组分及配方更加优良，能够长时间对基因组DNA在高温中进行保护。
试验例3
本试验例研究提取的基因组DNA对12号染色体GRCh38.p13中的一段(NC_000012.12)目标片段进行PCR扩增效果，所用的PCR试剂来自Takara，保存液采用的是实施例1及对比例1-10中的保存液，基因组DNA分别采用试验例1中得到保存7天、21天的两个室温样本，试验例2中得到保存7天、21天的50℃样本。以DNA作为扩增模板进行实验，验证提取后的基因组DNA是否可以进行后续的PCR。
产物1基因引物(购自上海生工)
F：5’-AGCCTCGGTCTGTTTTCCAG-3’(SEQ ID NO.1)；
R：5’-TGTTCAGGTGCATGACATTTTG-3’(SEQ ID NO.2)；
产物1length：48638bp；
产物2基因引物(购自上海生工)
F：5’-AACAAAGGGACCACCGATCC-3’(SEQ ID NO.3)；
R：5’-CATCAAACCCCACATCATGGC-3’(SEQ ID NO.4)；
产物2length：39570bp；
产物3基因引物(购自上海生工)
F：5’-CAGCCCGAGGTCTTCTGCAA-3’(SEQ ID NO.5)；
R：5’-GTATAACTTGAGATCTGGCC-3’(SEQ ID NO.6)；
产物3length：31290bp；
PCR反应体系：
Figure BDA0002376116150000151
唾液样本，保存7天和21天的两个室温样本的基因组DNA结果如图7、图8所示，其中，M为maker，1和2分别代表2个不同的人员样本。
唾液样本，保存7天和21天的两个50℃样本的基因组DNA结果如图11-图16所示，其中，M为maker，1代表实施例1保存液保存的样本提取的基因组扩增产物1-3的结果，2-11代表对比例1-10保存液保存液提取后的基因组扩增产物1-3的结果。
口腔拭子样本，保存7天和21天的两个室温样本的基因组DNA结果如图9、图10所示，其中，M为maker，1和2分别代表2个不同的人员样本。
口腔拭子样本，保存7天和21天的两个50℃样本的基因组DNA结果如图17-图22所示，其中，M为maker，1代表实施例1保存液保存的样本提取的基因组扩增产物1-3的结果，2-11代表对比例1-10保存液保存液提取后的基因组扩增产物1-3的结果。
从上述结果可以看出，用实施例1保存的唾液和口腔拭子样本不论常温还是高温在21天时均能扩增出3段目的产物，而用对比例1-10保存的样本7天的时候能扩增出3段目的产物，21天时均不能扩增出3段目的产物，说明其保存的基因组已经断裂，不能进行后续的PCR实验。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 德诺杰亿（北京）生物科技有限公司
<120> 唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcctcggtc tgttttccag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgttcaggtg catgacattt tg 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacaaaggga ccaccgatcc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catcaaaccc cacatcatgg c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagcccgagg tcttctgcaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtataacttg agatctggcc 20

Claims (10)

1.一种唾液或口腔拭子的保存液，其特征在于，包括：Tris-HCl 10-50mmol/L，尿素0.2-1mol/L，SDS 0.3-1w/v％，EDTA-Na2 1-8mmol/L，褐藻酸钠2-8w/v％和左旋肉碱3-8w/v％，保存液pH为7-10。
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括：Tris-HCl 15-45mmol/L，尿素0.3-0.9mol/L，SDS 0.3-0.8w/v％，EDTA-Na2 1-6mmol/L，褐藻酸钠3-7w/v％和左旋肉碱3-7w/v％，保存液pH为7-9。
3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括：Tris-HCl 20-40mmol/L，尿素0.3-0.7mol/L，SDS 0.4-0.7w/v％，EDTA-Na2 2-5mmol/L，褐藻酸钠4-6w/v％和左旋肉碱3-5w/v％，保存液pH为7-8。
4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括：Tris-HCl 30mmol/L，尿素0.6mol/L，SDS 0.5w/v％，EDTA-Na2 3mmol/L，褐藻酸钠5w/v％和左旋肉碱4w/v％，保存液pH为7.5。
5.权利要求1-4任一项所述的保存液的制备方法，其特征在于，按配比将Tris-HCl，尿素，SDS，EDTA-Na2，褐藻酸钠和左旋肉碱用水混匀，调整pH，得到保存液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，调整pH后还包括除菌的步骤。
7.权利要求1-4任一项所述的保存液在从唾液或口腔拭子提取基因组DNA中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的保存液在保存唾液或口腔拭子中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，保存的温度为-80℃-50℃。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述唾液为人体唾液。
CN202010063435.6A 2020-01-20 2020-01-20 唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用 Pending CN111183973A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010063435.6A CN111183973A (zh) 2020-01-20 2020-01-20 唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010063435.6A CN111183973A (zh) 2020-01-20 2020-01-20 唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111183973A true CN111183973A (zh) 2020-05-22

Family

ID=70685997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010063435.6A Pending CN111183973A (zh) 2020-01-20 2020-01-20 唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111183973A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4362246A (en) * 1980-07-14 1982-12-07 Adair Edwin Lloyd Method of treating collected mammal semen and separating sperm into X Y components
CN102919218A (zh) * 2012-11-21 2013-02-13 湖北维达健基因技术有限公司 一种人体唾液保存用组合物及其制备方法
CN105368812A (zh) * 2014-08-19 2016-03-02 深圳华大基因股份有限公司 一种唾液保存液及其制备方法和用途
CN107897170A (zh) * 2017-11-17 2018-04-13 南京普维康生物科技有限公司 一种口腔拭子dna保存液及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4362246A (en) * 1980-07-14 1982-12-07 Adair Edwin Lloyd Method of treating collected mammal semen and separating sperm into X Y components
CN102919218A (zh) * 2012-11-21 2013-02-13 湖北维达健基因技术有限公司 一种人体唾液保存用组合物及其制备方法
CN105368812A (zh) * 2014-08-19 2016-03-02 深圳华大基因股份有限公司 一种唾液保存液及其制备方法和用途
CN107897170A (zh) * 2017-11-17 2018-04-13 南京普维康生物科技有限公司 一种口腔拭子dna保存液及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20070115874A (ko) Ｄｎａ 분석용 생물 시료를 보관 및 처리하는 시약 및 방법
CN105368812B (zh) 一种唾液保存液及其制备方法和用途
Baker et al. A silica-based mitochondrial DNA extraction method applied to forensic hair shafts and teeth
WO2004072230A2 (en) Real-time polymerase chain reaction using large target amplicons
CN103756998A (zh) 一种动物核酸样本常温保存试剂及其应用
CN108949748B (zh) 一种痰液液化及核酸保护试剂
WO2012155577A1 (zh) 从生物材料中分离纯化rna的方法
CN109691432A (zh) 一种口腔拭子保存液及其制备方法和应用
US20040126796A1 (en) Extraction of DNA from biological samples
CN106561631A (zh) 一种唾液保存液及其制备方法和应用
CN111378719A (zh) 用于保存人类唾液中核酸完整性的试剂组合物和方法
US20120171728A1 (en) Process for amplifying dna using tetratethylene glycol, kit of parts therefor and use thereof
Blood et al. Handbook for
CN109234271A (zh) 一种磁珠法口腔拭子基因组dna提取试剂盒
CN111850090B (zh) 一种有效保存病毒样品的病毒保存液
CN111183973A (zh) 唾液或口腔拭子的保存液及其制备方法和应用
CN104745584B (zh) 一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核酸分子及其制备方法
CN111454939A (zh) 一种桑树基因组dna的高效提取方法
Reid et al. Validation of buccal swabs for noninvasive DNA sampling of small‐bodied imperiled fishes
CN108841820B (zh) 高效提取植物基因组dna的无毒提取液组合gpr.1及提取方法
KR20220047118A (ko) 식물 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 염화소듐과 염화칼륨을 포함하는 시약 조성물 및 이를 포함하는 식물 시료용 핵산 추출 키트
AU2013205379B2 (en) Methods and compositions for obtaining amplifiable nucleic acids from tissues, cells, or viruses exposed to transport media
CN112063615A (zh) 一种基因组dna提取液、基因组dna提取方法及其应用
JP6733951B2 (ja) 核酸保存用組成物及び核酸保存方法
CN109762810A (zh) 用于高通量微卫星分析的鱼鳞dna快速提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200522

RJ01 Rejection of invention patent application after publication