CN111183159A - 靶向cd137的抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及特异性结合人CD137的分离的抗体，其药物组合物和使用方法，包含编码所述抗体的核苷酸序列的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，以及产生所述抗体的方法。

Description

靶向CD137的抗体及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种特异性结合人CD137的分离的抗体，及其药物组合物和使用方法。本发明还涉及编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的宿主细胞以及生产所述抗体的方法。
背景技术
肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)是受体的蛋白质超家族，其特征在于它们能够通过细胞外结构域中富含半胱氨酸的假重复序列(pseudorepeat)与肿瘤坏死因子(TNF)结合(Locksley等人,2001,Cell.104:487–501)。目前，已经鉴定出了27个TNF家族成员。TNFRSF成员及其配体主要在免疫细胞上表达，它们在T细胞介导的免疫应答中发挥免疫调节剂的作用。TNFRSF成员在增强树突状细胞的存活和T细胞的启动能力、效应T细胞的最佳生成、最佳抗体应答以及炎症反应的扩大中发挥作用。
CD137(4-1BB，TNF-受体超家族9，TNFRSF9)是TNFR超家族的表面糖蛋白。它是一种诱导型共刺激性T细胞受体。CD137表达是激活依赖性的，并且涵盖了广泛的免疫细胞子集，包括活化的NK和NKT细胞、调节性T细胞、树突细胞(DC)(包括滤泡DC)、刺激后的肥大细胞、分化髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞(Wang等人,Immunol Rev.229(1):192-215(2009))和活化的B细胞(Zhang等人,J Immunol.184(2):787-795(2010))。另外，还在肿瘤脉管***(Broil K等人,Am J Clin Pathol.115(4):543-549(2001)；Seaman等人,Cancer Cell 11(6):539-554(2007))和动脉粥样硬化内皮细胞(Olofsson等人,Circulation 117(10):1292 1301(2008))上证明了CD137表达。
CD137-配体(CD137L，4-1BBL或tnfsf9)，一种TNF家族的分子，是一种已知的CD137的细胞间天然配体(Alderson,M.R.等人,Eur.J.Immunol.24:2219–2227(1994)；Pollok K.等人,Eur.J.Immunol.24:367-374(1994)；Goodwin,R.G.等人,Eur.J.Immunol.23:2631–2641(1993))。CD137的配体形成同型三聚体，CD137信号传导从细胞表面的连接的分子发生，这些分子被三聚化的配体交联(Won,E.Y.等人,J.Biol.Chem.285:9202–9210(2010))。有人提出，CD137的高阶聚集是介导信号传导所必需的。CD137在其细胞质尾中与衔接子TRAF-2和TRAF-1缔合，导致共免疫沉淀，这在T细胞中CD137激活后有所增强(Saoulli,K.等人,J.Exp.Med.187:1849–1862(1998)；Sabbagh,L.等人,J.Immunol.180:8093–8101(2008))。CD137招募TRAF-1和TRAF-2会导致NFkB和丝裂原活化蛋白(MAP)激酶级联反应(包括ERK、JNK和p38 MAP激酶)的下游活化。NFkB激活导致Bcl-2家族的促存活成员Bfl-1和Bcl-XL上调。促凋亡蛋白Bim以TRAF-1和ERK依赖性方式下调(Sabbagh等人,J Immunol.180(12):8093-8101(2008))。有人提出，CD137的主要作用是将两个或更多个TRAF-2分子彼此紧密地放置(Sanchez-Paulete,A.R.等人,Eur.J.Immunology 46(3):513-522(2016))。基于此，推测驱动CD137信号传导的主要因素是细胞质膜的微片(micropatch)中TRAF-2组装的CD137部分的相对密度(Sanchez-Paulete,A.R.等人,Eur.J.Immunology 46(3):513-522(2016))。总体而言，多聚作用会促进CD137信号传导，有人提出，交联的CD137分子是CD137共刺激活性的关键因素。
CD137共同刺激T细胞以执行效应子功能，例如根除已建立的肿瘤、扩大原发性CD8+T细胞应答和增加抗原特异性CD8+T细胞的记忆库、诱导干扰素-γ(IFN-γ)合成。通过操纵CD137/CD137L功能可以将CD137刺激在CD8+T细胞功能和存活中的关键作用潜在地用于***。实际上，小鼠体内功效研究表明，抗CD137抗体治疗会导致多种肿瘤模型的的肿瘤消退。例如，已证明激动性抗小鼠CD137抗体会诱导针对P815肥大细胞瘤肿瘤和低免疫原性肿瘤模型Ag104的免疫应答(I.Melero等人,Nat.Med.,3(6):682-5(1997))。在一些研究中已经报道了CD137激动剂mAb在单一疗法和组合疗法的预防性和治疗性环境中以及抗肿瘤保护性T细胞记忆应答中的功效(Lynch等人,Immunol Rev.222:277-286(2008))。CD137激动剂还在多种自身免疫模型中抑制自身免疫反应(Vinay等人,J Mol Med 84(9):726-736(2006))。
已知多种抗CD137抗体(例如，参见WO 00/29445和WO 2004/010947)，目前临床上至少有两种抗CD137抗体：urelumab(Bristol-Myers Squibb)，其是一种完全人源化的IgG4mAb，和utomilumab(PF-05082566，Pfizer)，其是一种全人IgG2 mAb(Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。尽管利用激动CD137的治疗性抗体是非常有前途的治疗策略，但它还伴随着诸如抗CD137激动剂抗体的低功效、高毒性和不良反应等困难。已证明，CD137激动剂抗体可导致免疫***和器官功能改变，增加毒性风险。据报道，在幼稚荷瘤小鼠中高剂量的CD137激动剂抗体可诱导T细胞向肝细胞浸润以及天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶升高，这符合肝脏炎症(Niu L等人J Immunol 178(7):4194–4213(2007)；Dubrot J等人,Int J Cancer 128(1):105–118(2011))。针对CD137激动剂抗体的人类治疗用途的初步临床研究还证明了肝酶的升高和肝炎发病率的增加(SznolM.等人,J Clin Oncol 26(115S):3007(2008)；Ascierto PA等人,Semin Oncol 37(5):508–516(2010)；Chester C.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。在先前治疗过的III/IV期黑色素瘤的Bristol-Myers Squibb(BMS)II期抗CD137研究(国家临床试验(NCT)00612664)中，观察到了潜在的致命性肝炎。该研究及其他一些研究(NCT00803374、NCT00309023、NCT00461110、NCT00351325)因不良事件而终止(ChesterC.等人,Cancer Immunol Immunother Oct；65(10):1243-8(2016))。此类不良事件很可能是由于T细胞的全身过度刺激所致。
因此，在本领域中需要生产改进的治疗性抗人CD137抗体，其具有更高的功效而没有一般抗增殖药的固有副作用，特别是具有与目前可用的CD137抗体相当的较低毒性。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗体，其与人CD137蛋白特异性结合，并且具有用于治疗的有益性质，例如更高的亲和力、改善的功效、较低毒性和改善的生物物理性质，例如溶解性、可开发性(developability)和稳定性。特别地，尚未发现CD137抗体在结合后不会直接导致CD137信号传导而需要依赖于其他细胞表面分子。
一方面，本发明涉及一种新型CD137抗体。
一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的分离的抗体和药学上可接受的载体。
另一方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或本发明的组合物。
一方面，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者的癌症的本发明的抗体或本发明的组合物。
一方面，本发明涉及本发明的抗体或本发明的组合物在制备用于治疗有此需要的受试者中的癌症的药物中的用途。
另一方面，本发明涉及一种治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或本发明的组合物。
另一方面，本发明涉及编码本发明的抗体的核酸。另一方面，本发明涉及包含所述核酸的载体。另一方面，本发明涉及包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及一种生产本发明的抗体的方法，该方法包括以下步骤：培养包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。
分别单独地或组合地在以下各项中概述的本发明的方面、有利特征和优选实施方案进一步有助于解决本发明的目的：
1.对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含：(a)重链可变区CDR1，包含选自SEQ ID NO：1、4、5、8和11中任意之一，优选SEQ ID NO：1的氨基酸序列，优选由其组成；(b)重链可变区CDR2，包含选自SEQ ID NO：2、6、9和12中任意之一，优选SEQ ID NO：2的氨基酸序列，优选由其组成；(c)重链可变区CDR3，包含选自SEQ ID NO：3、7、10和13中任意之一，优选SEQ ID NO：3的氨基酸序列，优选由其组成；(d)轻链可变区CDR1，包含选自SEQ ID NO：18、21和24中任意之一，优选SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选由其组成；(e)轻链可变区CDR2，包含选自SEQ ID NO：19、22和25中任意之一，优选SEQ ID NO：19的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)轻链可变区CDR3，包含选自SEQ ID NO：20、23和26中任意之一，优选SEQ IDNO：20的氨基酸序列，优选由其组成。
2.根据项目1所述的抗体，其中所述抗体包含：(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(b)分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(c)分别为SEQ ID NO：5、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(d)分别为SEQ ID NO：8、9和10的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或(e)分别为SEQ ID NO：11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：24、25和26的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
3.根据项目1所述的分离的抗体，包含：(a)HCDR1，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由其组成。
4.根据项目1所述的分离的抗体，包含：(a)HCDR1，包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，优选由其组成。
5.根据前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变区(VH)，其中所述VH为VH3或VH4，优选VH3。
6.根据前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：轻链可变区(VL)，其中所述VL包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ IDNO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一所示的VλFR4，优选如SEQID NO：62或63所示的VλFR4，更优选如SEQ ID NO：62所示的VλFR4。
7.根据前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其包含与选自由SEQ ID NO：14、15、16和17组成的组，优选SEQ ID NO：14和17，更优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含与选自由SEQ ID NO：27、28、29和30组成的组，优选SEQ ID NO：27和30，更优选SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
8.根据前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：14、15、16和17中任意之一，优选SEQ ID NO：14和17，更优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO：27、28、29和30中任意之一，优选SEQ IDNO：27和30，更优选SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
9.根据前述项目中任一项所述的抗体，包含：(a)VH，其包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；(b)VH，其包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；(c)VH，其包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ IDNO：29的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；或(d)VH，其包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
10.根据前述项目中任一项所述的抗体，其包含：(a)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQID NO：27的VL序列；(b)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：28的VL序列；(c)SEQ ID NO：16的VH序列和SEQ ID NO：29的VL序列；或(d)SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：30的VL序列。
11.根据前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体：
a)与人CD137结合的解离常数(KD)小于10nM，特别是小于5nM，特别是小1nM，特别是如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv(单价亲和力)；
b)与人CD137结合的Koff速率为10-3s-1或更低，或10-4s-1或更低，或10-5s-1或更低，如通过SPR所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；
c)与人CD137结合的Kon速率为至少104M-1s-1或更高，至少105M-1s-1或更高，至少106M-1s-1或更高，如通过SPR所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；和/或
d)与食蟹猴CD137交叉反应，特别是与食蟹猕猴(食蟹猴)CD137结合的KD小于15nM，特别是小于10nM，特别是小于5nM，如通过SPR所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；和/或
e)不与人CD40和/或人OX40结合，特别是如通过SPR所测量的。
12.根据前述项目中任一项所述的抗体，其以小于5nM的KD与人CD137结合。
13.根据前述项目中任一项所述的抗体，其中所述抗体：
a)当为scFv形式时，其解链温度(Tm)(通过差示扫描荧光法测定)为至少50℃，优选至少55℃，更优选至少60℃，特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4、150mM NaCl的50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液中；
b)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃下储存至少2周，特别是至少4周后，所述抗体的单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％；和/或
c)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃下储存至少2周，特别是至少4周后，所述抗体的单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％。
14.根据前述项目中任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB和基于其他支架的结合结构域，所述基于其他支架的结合结构域包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的ModularAntibody TechnologyTM)，优选Fv或scFv。
15.根据前述项目中任一项所述的抗体，其是单链可变片段(scFv)。
16.根据项目15所述的抗体，其中所述scFv具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，优选SEQ ID NO：32和SEQID NO：35，更优选SEQ ID NO：35。
17.根据项目14所述的分离的抗体，其中所述抗体是选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的IgG，优选IgG4。
18.根据前述项目中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是嵌合的或人源化的。
19.一种抗体，其结合与项目1至18中任一项所述的分离的抗体基本相同的表位。
20.根据前述项目中任一项所述的抗体，其是多特异性分子，特别是具有至少第二功能分子的多特异性分子。
21.项目20所述的抗体，其中所述抗体的形式选自由以下组成的组：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞接合子(BiTE；串联双-scFv)、串联三-scFv、三抗体(Fab-(scFv)2)或双抗体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三抗体、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、scFv-HSA-scFv融合体、双双抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体例如bsAb(与轻链的C-末端连接的scFv)、Bs1Ab(与轻链的N-末端连接的scFv)、Bs2Ab(与重链的N-末端连接的scFv)、Bs3Ab(与重链的C-末端连接的scFv)、Ts1Ab(与重链和轻链的N-末端连接的scFv)、Ts2Ab(与重链的C-末端连接的dsscFv)、基于异二聚体Fc结构域的双特异性抗体例如Knob-into-Hole抗体(KiH)；与异二聚体Fc结构域或任何其他异二聚体结构域的任意一条链的N-和/或C-末端融合的Fv、scFv、scDb、串联双-scFv、串联三-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2、COVD、MATCH和DuoBody。
22.一种药物组合物其包含项目1-21中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
23.项目1-21中任一项所述的抗体，或项目22所述的组合物，其用作药物。
24.项目1-21中任一项所述的抗体，或项目22所述的组合物，其用于治疗有此需要的受试者的癌症。
25.项目1-21中任一项所述的抗体或项目22所述的组合物治疗有此需要的受试者的癌症的用途。
26.项目1-21中任一项所述的抗体或项目22所述的组合物在制备用于治疗有此需要的受试者的癌症的药物中的用途。
27.一种治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的项目1-21中任一项所述的抗体或项目22所述的组合物。
28.一种核酸，其编码项目1-21的抗体。
29.一种载体，其包含项目28的核酸。
30.一种宿主细胞，其包含项目28所述的核酸或项目29所述的载体。
31.一种生产项目1-21中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养包含项目28所述的核酸或项目29所述的载体的宿主细胞。
32.一种试剂盒，其包含项目1至21中任一项所述的抗体，或项目22所述的组合物。
附图说明
图1在竞争ELISA中，CD137与CD137L的结合没有抑制。在评估CD137L与CD137结合的竞争性ELISA中测量的吸光度分别以PRO885(A)或PRO951(B)的增加浓度的函数表示。抑制性抗体山羊抗人CD137用作参考。
图2PRO885和PRO951与urelumab和utomilumab的表位鉴定结果的热图。结合水平标准化为理论Rmax，以分析物分子(列)与固定分子(行)的百分比(％)表示。无结合(深灰色)表示相同的表位，亮灰色表示次级分子(分析物)可以结合并具有与固定分子不同的另一个表位。
图3PRO885的表位鉴定感应图谱。将PRO885固定在传感器芯片上，CD137在第一步被PRO885捕获(左侧)，然后注射4种不同的抗体(右侧)。PRO951和竞争剂能够与捕获的CD137结合，而注射PRO885则未显示任何结合。
图4PRO951的表位鉴定感应图谱。将PRO951固定在传感器芯片上，CD137在第一步被PRO951捕获(左侧)，然后注射4种不同的抗体(右侧)。PRO951和urelumab能够与捕获的CD137结合，而注射utomilumab和PRO951则没有显示进一步结合。
图5在NFkB-荧光素酶报告基因测定中评估的PRO885和PRO951对CD137的激活。在存在表达PDL1的细胞的情况下，PRO885和PRO951在Jurkat细胞中激活了CD137信号传导，而在测试CHO WT细胞时未观察到激活。urelumab激活CD137信号传导，而与PDL1表达无关。加入Jurkat报告细胞后6小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图6NFkB-荧光素酶报告基因测定中对PDL1和CD137具有不同亲和力的scDb对CD137的激活。在存在表达PDL1的CHO细胞的情况下，所有scDb在Jurkat细胞中都激活了CD137信号传导，而在测试CHO WT细胞时未观察到激活。urelumab激活CD137信号传导，而与PDL1表达无关。加入Jurkat报告细胞后6小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPadPrism)拟合数据。
图7NFkB-荧光素酶报告基因测定中对PDL1和CD137具有不同亲和力的scDb对CD137的激活。在存在表达PDL1的HCC827细胞的情况下，所有scDb在Jurkat细胞中都激活了CD137信号传导。使用urelumab作为参考分子来评估CD137信号传导相对活化。随着对CD137和PDL1亲和力的增强，效力略有增加。随着对CD137亲和力的增加，高浓度下的信号降低(钟形曲线)更加明显，而对PDL1的亲和力的增加却对此效果无影响。加入Jurkat报告细胞后6小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图8NFkB-荧光素酶报告基因测定中对PDL1和CD137具有不同亲和力的scDb对CD137的激活。在存在表达PDL1的HCC827细胞(将其用10ng/ml的IFNy刺激24小时)的情况下，STR移植的scDb在Jurkat细胞中激活了CD137信号传导。使用urelumab作为参考分子来评估CD137信号传导相对活化。随着对CD137和PDL1亲和力的增强，效力略有增加。随着对CD137亲和力的增加，高浓度下的信号降低(钟形曲线)更加明显，而对PDL1的亲和力的增加却对此效果无影响。加入Jurkat报告细胞后6小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图9在NFkB-荧光素酶报告基因测定中，6小时后，血清半衰期延长的分子对CD137的激活。在存在表达PDL1的CHO细胞的情况下，长半衰期分子在Jurkat细胞中激活了CD137信号传导，而在测试CHO WT细胞时未观察到激活。urelumab激活CD137信号传导，而与PDL1表达无关。有趣的是，尽管对两个靶标的亲和力相似，但PRO1057的最大信号却比PRO1058高得多。而且，单价scDb-scFv PRO1057显示出比相应的二价Morrison形式PRO1060更强的激活作用。加入Jurkat报告细胞后6小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图10在NFkB-荧光素酶报告基因测定中，24小时后，血清半衰期延长的分子对CD137的激活。在存在表达PDL1的CHO细胞的情况下，长半衰期分子在Jurkat细胞中激活了CD137信号传导，而在测试CHO WT细胞时未观察到激活。urelumab激活CD137信号传导，而与PDL1表达无关。有趣的是，尽管对两个靶标的亲和力相似，但PRO1057的最大信号却比PRO1058高得多，在24小时后甚至超过了scDb Pro885的活性。而且，单价scDb-scFvPRO1057显示出比相应的二价Morrison形式PRO1060强得多的激活作用。加入Jurkat报告细胞后24小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图11(A)24小时后，半衰期延长的分子对CD137的激活。在存在HCC827细胞(未被刺激，或用10ng/ml的IFNy刺激24小时)的情况下，长半衰期分子在Jurkat细胞中激活了CD137信号传导。使用urelumab作为参考分子来评估CD137信号传导相对活化。单价scDb-scFvPRO1057显示出比相应的二价Morrison形式PRO1060更高的最大激活作用。加入Jurkat报告细胞后24小时读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。(B)在IFNy(10ng/ml)刺激6小时和24小时的HCC827存在下在CD137活性测定中对三特异性scDb-scFv分子PRO1430、PRO1431、PRO1432、PRO1473、PRO1476、PRO1479和PRO1482进行了测试。在该实验中，使用PRO885作为参考分子来评估CD137信号传导相对活化。沿每个板取三特异性scDb-scFv分子PRO1186，并将其活性与其他scDb-scFv分子进行比较。在添加Jurkat报告细胞后6h或24h读取发光，并使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合仅具有增加的RLU值的被测分子的浓度。
图12离体T细胞活化。示出了PRO885对PDL1和CD137的共刺激作用，导致IL-2的产生明显高于背景IL-2水平。CHO-A2细胞是表达PDL1的转基因CHO细胞。
图13离体T细胞活化测定。将PBMC用10ng/ml SEA刺激，并用连续稀释的scFvPRO997或scDb PRO885处理96小时。通过ELISA定量收获的上清液中的IL-2来评估T细胞的活化。用PRO885和PRO997处理导致明显的IL-2分泌。PRO997显示出比阿维鲁单抗更高的效力。与阿维鲁单抗相比，PRO885的效应量(effect size)大大增加。使用S形曲线4PL拟合(GraphPad Prism)拟合数据。
图14使用免疫缺陷型NOG小鼠品系和同种异体人外周血单核细胞(hPBMC)在人HCC827 NSCLC异种移植物中进行抗CD137(PRO1138或urelumab)治疗的抗肿瘤活性。在第0、3、7和10天用抗CD137(PRO1138或urelumab)或溶媒静脉注射处理小鼠。每周两次测量肿瘤体积17或18天处死小鼠。将肿瘤体积相对于治疗开始时的肿瘤体积标准化(相对肿瘤体积)。(A)用来自两个供体的PBMC重建的小鼠的平均相对肿瘤体积(每组n＝8只小鼠)。虚线表示治疗时间。(B)用来自供体B的PBMC重建的小鼠的平均相对肿瘤体积(每组n＝4只小鼠)。(C)用来自两个供体的PBMC重建的小鼠的个体相对肿瘤体积。每个符号代表同一治疗组内的单个动物。(D)用来自供体B的PBMC重建的小鼠的个体相对肿瘤体积。每个符号代表同一治疗组内的单个动物。
图15用抗CD137(PRO1138或urelumab)或溶媒对照进行治疗后，hPBMC取代的NOG小鼠中HCC827异种移植物的体重。每周两次测量体重，直到在第17或18天处死小鼠。将体重相对于治疗开始时的体重标准化(相对体重)。
图16抗CD137抗体PRO1138(SEQ ID No：88和89)与抗PDL1抗体PRO1196(SEQ IDNo：154和155)的组合在植入了人脐带血来源的CD34+造血干细胞(UCB HSC)的NOG小鼠中的抗肿瘤功效的评估。将PRO1138与PRO1196(每种0.1mg)的组合的抗肿瘤活性与溶媒治疗Palivizumab(0.1mg)、抗PDL1 IgG1(0.1mg；PRO1196或阿维鲁单抗(avelumab))、抗CD137IgG4(0.1mg；urelumab)进行比较。在第0、5、10、15和20天(虚线)治疗小鼠。每周两次记录肿瘤生长和体重。将肿瘤体积相对于治疗开始时的肿瘤体积标准化(相对肿瘤体积，RTV)。
图17在抗CD137抗体PRO1138与抗PDL1抗体PRO1196的联合治疗后，植入了人脐带血来源的CD34+造血干细胞(UCB HSC)的NOG小鼠在第24天的相对肿瘤体积。每周记录两次肿瘤生长。将肿瘤体积相对于治疗开始时的肿瘤体积标准化(相对肿瘤体积，RTV)。所有统计数据均使用GraphPad Prism版本6计算。使用单向ANOVA测试采用Bonferroni校正确定统计显著性。图表显示95％CI(置信区间)的平均值。
图18第24天植入了人脐带血来源的CD34+造血干细胞(UCB HSC)的NOG小鼠对抗CD137抗体PRO1138与抗PDL1抗体PRO1196的组合疗法的响应分析。将肿瘤体积相对于治疗开始时的肿瘤体积标准化(相对肿瘤体积，RTV)。
具体实施方式
本发明提供了与人CD137蛋白特异性结合的抗体，以及药物组合物、生产方法以及使用此类抗体和组合物的方法。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另有说明，否则术语“包括”和“包含”在本文中以开放式且非限制性的含义使用。关于这些后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由......组成”。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的背景下(特别是在以下权利要求的背景下)，术语“一”和“一个”以及“该”和类似的引用应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当化合物、盐等使用复数形式时，这也被认为是指单一化合物、盐等。
在第一方面，本发明涉及与人CD137特异性结合的抗体。
如本文所用，术语“抗体”等包括：完全抗体或其单链；及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链；以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子(包括但不限于多特异性抗体)。天然存在的“完全抗体”是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链都由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链都由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL都由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等是指完整的完全抗体的一个或多个片段，其保留了与给定的抗原(例如CD137)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含两个Fab片段的二价片段，这两个Fab片段通过铰链区的二硫键连接；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；以及基于替代支架的结合结构域，所述基于其他支架的结合结构域包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)。
术语“互补决定区”(“CDR”)是具有边界的氨基酸序列，所述边界使用许多公知方案中的任何一种确定，包括以下描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteinsof Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)，以及Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670(“AHo”编号方案)描述的编号方案。例如，对于经典形式，在Kabat下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号大约为26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大约为27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR。在本发明的背景下，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun(“AHo”)建议的编号***(Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。此外，根据AHo编号方案，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。为了清楚起见，根据Honegger&Plückthun的编号***考虑了在天然存在的抗体中，在不同VH和VL亚家族两者中特别是在CDR中发现的长度多样性，并提供了序列中的缺口。因此，在给定的抗体可变结构域中，通常并非所有位置1至149都被氨基酸残基占据。
也可以将抗原结合部分纳入到大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、内抗体(intrabody)、双抗体、三抗体、四抗体、scDb-scFv、v-NAR和双-scFv中(参见，例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,1126-36)。可以将抗体的抗原结合部分移植到基于多肽(例如III型纤连蛋白(Fn3))的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗)。可以将抗原结合部分并入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995Protein Eng.8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体结合位点与一种抗原决定簇反应而不与不同的抗原决定簇反应的能力。如本文所用，术语“与……特异性结合”或“特异于”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其是在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下，存在靶标的决定因素。例如，与一个靶标(可以是表位)特异性结合的抗体是与该靶标结合比与其他靶标结合的亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体。以其最一般的形式(并且当未提及定义的标准时)，“特异性结合”是指抗体区分目标靶标和无关分子的能力，例如根据本领域已知的特异性测定方法所确定的。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过光密度(例如在450nm下)进行评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性分数之间的比可以是10倍或更高。在另一个实例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间有至少10倍，优选至少100倍的差异表明特异性结合。通常，使用一组约三至五个不相关分子例如奶粉、转铁蛋白等，而非使用单一参照分子，来进行结合特异性的确定。本发明的抗体对人CD137具有结合特异性。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体对人CD137具有结合特异性，并且不与人CD40结合和/或不与人OX40结合，特别是如通过SPR确定的。
合适地，本发明的抗体是分离的抗体。如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD137的分离的抗体基本上不含特异性结合除CD137以外的抗原的抗体)。但是，特异性结合CD137的分离抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的CD137分子)具有交叉反应性。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体对人CD137和食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(也称为食蟹猴(Cynomolgusmonkey)或“食蟹猴(Cynomolgus)”)CD137具有结合特异性。此外，分离的抗体可能基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
合适地，本发明的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指氨基酸序列基本相同或源自相同遗传来源的抗体。单克隆抗体组合物对一个具体表位显示结合特异性和亲和力，或对多个特定表位显示结合特异性和亲和力。
本发明的抗体包括但不限于嵌合的和人源化的。
术语“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区相连，或与一个完全不同的分子相连，该分子赋予嵌合抗体新的特性，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换为具有不同的或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过将小鼠抗体的恒定区替换为人免疫球蛋白的恒定区来对其进行修饰。由于被人恒定区替换，因此与原始小鼠抗体相比，嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时对人类的抗原性降低。
如本文所用，“人源化”抗体是保留了非人抗体的反应性，同时对人类的免疫原性较低的抗体。例如，这可以通过以下方法来实现：保留非人CDR区，并将抗体的其余部分替换为人类对应物(即恒定区和可变区的框架部分)。可以在人框架序列以及衍生自另一哺乳动物物种的种系的CDR序列内进行另外的框架区修饰。本发明的人源化抗体可包含非由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制备)。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison and Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人体工程技术的其他实例包括但不限于美国专利号5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“重组人源化抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如从转化为表达人源化抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤(transfectoma)中分离的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式而制备、表达、产生或分离的抗体。
合适地，本发明的抗体是人源化的。合适地，本发明的抗体是人源化的并且包含来源于兔的CDR。
术语“CD137”特别是指具有UniProt ID号Q07011的人CD137，在本文中以SEQ IDNO：61再现。合适地，本发明的抗体靶向CD137，特别是人CD137，如UniProt ID号Q07011所示，其在本文中以SEQ ID NO：61再现。合适地，本发明的抗体靶向人和食蟹猴(食蟹猕猴)CD137。本发明的抗体特异性结合CD137。特别地，本发明的抗体不与人OX40和/或人CD40结合，特别是如通过SPR测量的。优选地，本发明的抗体不阻断CD137/CD137L相互作用。
合适地，本发明的抗体是CD137激动剂。“活化剂”或“活化抗体”或“激动剂”或“激动剂抗体”是通过与其结合的抗原增强或引发信号传导的一种。在本发明的背景下，术语“CD137激动剂”涵盖能够在其CD137-抗原结合片段聚集时能够激活CD137信号传导的本发明的抗体，例如，其中至少两个所述CD137-抗原结合片段的结合允许结合的CD137分子的多聚化及其活化。在一些实施方案中，激动剂抗体在不存在天然配体的情况下激活信号传导。
本发明的抗体包括但不限于如本文(包括实施例中)所述的分离的人源化单克隆抗体。此类抗人CD137抗体的实例是其序列列于表1中的抗体。
实施例中提供了关于本文所述抗体的生成和表征的其他细节。
对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：(a)所述VH依次包含三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且(b)所述VL依次包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明提供了与CD137蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含VH CDR，所述VH CDR具有表1所列的VH CDR中任意之一的氨基酸序列。特别地，本发明提供了与CD137蛋白VHCDR的抗体，所述抗体包含一个、两个、三个或更多个VH CDR，所述VH CDR具有表1所列的VHCDR中任意之一的氨基酸序列。
本发明还提供了与CD137蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含VL CDR，所述VLCDR具有表1所列的VL CDR中任意之一的氨基酸序列。特别地，本发明提供了与CD137蛋白VLCDR的抗体，所述抗体包含一个、两个、三个或更多个VL CDR，所述VL CDR具有表1所列的VLCDR中任意之一的氨基酸序列。
本发明的其他抗体包括已突变、但仍与CD137特异性结合，并且在CDR区中与表1中描述的序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。一方面，本发明的其他抗体包括与CD137特异性结合的突变氨基酸序列，其中当与表1中描述的序列中描述的CDR区相比时，CDR区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“相同”或“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列。关于核酸、肽、多肽或抗体序列的“序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定核酸、肽或多肽序列中的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2或ALIGN软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定其他参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，这些算法分别在Altschul等人,Nucl.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述。可通过国家生物技术信息中心公开获得进行BLAST分析的软件。
也可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)的算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已被并入ALIGN程序(2.0版)，其使用PAM120重量残留表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已并入GCG软件包的GAP程序中(可www.gcg.com上找到)，其使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，间隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，否则特定的多肽序列也隐含涵盖其保守修饰的变体。
本发明提供了一种对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含：(a)重链可变区CDR1(HCDR1)，包含选自SEQ ID NO：1、4、5、8、11、39、42和45中任意之一，优选SEQ IDNO：1的氨基酸序列，优选由其组成；(b)重链可变区CDR2(HCDR2)，包含选自SEQ ID NO：2、6、9、12、40、43和46中任意之一，优选SEQ ID NO：2的氨基酸序列，优选由其组成；(c)重链可变区CDR3(HCDR3)，包含选自SEQ ID NO：3、7、10、13、41、44和47中任意之一，优选SEQ ID NO：3的氨基酸序列，优选由其组成；(d)轻链可变区CDR1(LCDR1)，包含选自SEQ ID NO：18、21、24、49、52和55中任意之一，优选SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选由其组成；(e)轻链可变区CDR2(LCDR2)，包含选自SEQ ID NO：19、22、25、50、53和56中任意之一，优选SEQ ID NO：19的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)轻链可变区CDR3(LCDR3)，包含选自SEQ ID NO：20、23、26、51、54和57中任意之一，优选SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由其组成；其中所述抗体特异性结合人CD137。合适地，对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含：(a)重链可变区CDR1，其与SEQ ID NO：1、4、5、8、11、39、42和45中任意之一，优选SEQ ID NO：1具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性；(b)重链可变区CDR2，其与SEQ ID NO：2、6、9、12、40、43和46中任意之一，优选SEQ ID NO：2具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性；(b)重链可变区CDR3，其与SEQ ID NO：3、7、10、13、41、44和47中任意之一，优选SEQ ID NO：3具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性；(d)轻链可变区CDR1，其与SEQ ID NO：18、21、24、49、52和55中任意之一，优选SEQ ID NO：18具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性；(e)轻链可变区CDR2，其与SEQ ID NO：19、22、25、50、53和56中任意之一，优选SEQ ID NO：19具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性；和(f)轻链可变区CDR3，其与SEQ ID NO：20、23、26、51、54和57中任意之一，优选SEQ ID NO：20具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(b)分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(c)分别为SEQ ID NO：5、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(d)分别为SEQ ID NO：8、9和10的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(e)分别为SEQ ID NO：11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：24、25和26的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(f)分别为SEQ IDNO：36、37和38的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：49、50和51的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(g)分别为SEQ ID NO：39、40和41的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：52、53和54的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(h)分别为SEQ ID NO：42、43和44的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：49、50和51的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(f)分别为SEQ ID NO：45、46和47的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：55、56和57的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一个优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
合适地，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)分别与SEQ ID NO：1、2和3具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：18、19和20具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(b)分别与SEQ ID NO：4、6和7具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：21、22和23具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(c)分别与SEQ ID NO：5、6和7具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：21、22和23具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(d)分别与SEQ ID NO：8、9和10具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：18、19和20具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(e)分别与SEQ ID NO：11、12和13具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：24、25和26具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(f)分别与SEQ ID NO：36、37和38具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：49、50和51具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(g)分别与SEQ ID NO：39、40和41具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：52、53和54具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(h)分别与SEQ ID NO：42、43和44具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ IDNO：49、50和51具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(i)分别与SEQ ID NO：45、46和47具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：55、56和57具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一个优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含分别与SEQID NO：1、2和3具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：18、19和20具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。合适地，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)HCDR1，包含与SEQ ID NO：1具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含与SEQ ID NO：2具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含与SEQ ID NO：3具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含与SEQ ID NO：18具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含与SEQ ID NO：19具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含与SEQ ID NO：20具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在另一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)HCDR1，包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含SEQID NO：6的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；(d)LCDR1，包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，优选由其组成。合适地，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)HCDR1，包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含与SEQ ID NO：6具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含与SEQ ID NO：7具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含与SEQ ID NO：21具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含与SEQ ID NO：22具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含与SEQ ID NO：23具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在又一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)HCDR1，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列，优选由其组成。合适地，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)HCDR1，包含与SEQ ID NO：36具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含与SEQ ID NO：37具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含与SEQ ID NO：38具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含与SEQ ID NO：49具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含与SEQ ID NO：50具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含与SEQID NO：51具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在另一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)HCDR1，包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列，优选由其组成。合适地，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：(a)HCDR1，包含与SEQ ID NO：39具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(b)HCDR2，包含与SEQ ID NO：40具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(c)HCDR3，包含与SEQ ID NO：41具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(d)LCDR1，包含与SEQ ID NO：52具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；(e)LCDR2，包含与SEQ ID NO：53具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成；和(f)LCDR3，包含与SEQID NO：54具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，优选由其组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含VH结构域和VL结构域。在本发明的背景下，术语“VH”(可变重链)、“VL”(可变轻链)、“Vκ”和“Vλ”是指根据序列同一性和同源性分组的抗体重链和轻链序列的家族。确定序列同源性的方法，例如通过使用同源性搜索矩阵例如BLOSUM(HeniKoff,S.&HeniKoff,J.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)10915-10919)，以及根据同源性对序列进行分组的方法是本领域普通技术人员众所周知的。对于VH、Vκ和Vλ，可以鉴定出不同的亚家族，例如Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86所示，其将VH1A、VH1B和VH2中的VH分组为VH6，将Vκ1中的Vκ分组为Vκ4，将Vλ1中的Vλ分组为Vλ3。在体内，抗体Vκ链、Vλ链和VH链分别是种系κ链V和J片段、种系λ链V和J片段以及重链V、D和J片段的随机重排的结果。给定的抗体可变链属于哪个亚家族由相应的V片段，特别是由框架区FR1至FR3确定。因此，在本申请中仅以特定的一组框架区HFR1至HFR3为特征的任何VH序列可以与任何HFR4序列结合，例如从重链种系J片段之一中取得的HFR4序列，或从重新排列的VH序列取得的HFR4序列。
合适地，本发明提供了特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含VH4或VH3结构域，优选VH4结构域，更优选VH3结构域。
属于VH3家族的VH的一个具体实例由SEQ ID NO：17表示。特别地，取自SEQ ID NO：17的框架区FR1至FR4属于VH3家族(表1，非粗体标记的区域)。合适地，本文所用的属于VH3家族的VH包含与SEQ ID NO：17的FR1至FR4具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的序列同一性的FR1至FR4。
属于VH4家族的VH的一个具体实例由SEQ ID NO：14表示。特别地，取自SEQ ID NO：14的框架区FR1至FR4属于VH4家族(表1，非粗体标记的区域)。合适地，本文所用的属于VH4家族的VH包含与SEQ ID NO：14的FR1至FR4具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的序列同一性的FR1至FR4。
VH序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中找到。
合适地，本发明提供了一种特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3框架，优选Vκ1框架FR1至3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4。合适的Vκ1框架FR1至3在SEQ ID NO：27中列出(表1，FR区以非粗体标记)。合适的Vκ1框架FR1至3包含与对应于FR1至3并选自SEQ ID NO：27(表1，FR区以非粗体标记)的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列。
Vκ1序列的其他实例，以及Vκ2、Vκ3或Vκ4序列的其他实例可以在Knappik等人,J.Mol.Biol.296(2000)57-86中找到。
合适的VλFR4如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68所示。在一个优选的实施方案中，VλFR4如SEQ ID NO：62或63所示，更优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62所示。在一个实施方案中，本发明提供了一种特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列，优选与SEQ ID NO：62或63，更优选与SEQ ID NO：62具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(i)
a.分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或
b.分别为SEQ ID NO：36、37和38的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：49、50和51的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；优选VH3结构域框架序列FR1至FR4；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，更特别是包含选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列的VλFR4，优选包含氨基酸序列SEQ ID NO：62的VλFR4。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了对人CD137具有结合特异性的抗体，包含：
(i)
a.分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
b.分别为SEQ ID NO：5、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或
c.分别为SEQ ID NO：39、40和41的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：52、53和54的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列
(ii)VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；优选VH4结构域框架序列FR1至FR4；更优选VH3结构域框架序列FR1至FR4；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO：64至SEQ ID NO：70中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一所示的VλFR4，优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68所示，更优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62所示。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，所述抗体对人CD137具有结合特异性并且包含VL，所述VL包含：
(i)CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；
(ii)人Vκ框架区FR1至FR3，特别是人Vκ1框架区FR1至FR3；
(iii)FR4，其选自(a)FR4的人Vλ种系序列，特别是选自下列的Vλ种系序列：SEQ IDNO：62至68，优选SEQ ID NO：62；和(b)基于Vλ的序列，与最接近的FR4的人Vλ种系序列相比，所述基于Vλ的序列具有一个或两个突变，特别是一个突变，所述最接近的FR4的人Vλ种系序列包含选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一，优选SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体，所述抗体对人CD137具有结合特异性并且包含：
(i)
a.分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
b.分别为SEQ ID NO：5、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或
c.分别为SEQ ID NO：39、40和41的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：52、53和54的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列
(ii)VH4结构域框架序列；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，以及VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列，特别是如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68，优选SEQID NO：62所示的VλFR4。
在一个更优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(i)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH3结构域框架序列；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，以及VλFR4，所述VλFR4包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列，特别是如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68所示的VλFR4，优选SEQ ID NO：62。
本发明提供了特异性结合CD137(例如人CD137蛋白)的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VH结构域。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VH氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约20个。
本发明的其他抗体包括已突变、但仍与CD137特异性结合，并且在VH区中与表1中描述的序列中描述的VH区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
本发明提供了与CD137蛋白特异性结合的分离的抗体，所述抗体包含表1中列出的VL结构域。
本发明还提供了与PCD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约10个。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含表1中列出的VL氨基酸序列，其中框架序列(例如，不是CDR的序列)中已经突变(其中，作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)的氨基酸不超过约20个。
本发明的其他抗体包括已突变、但仍与CD137特异性结合，并且在VL区中与表1中描述的序列中描述的VL区具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
本发明还提供了与CD137特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其包含与选自由SEQ ID NO：14、15、16、17和48组成的组，优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含与选自由SEQ ID NO：27、28、29、30和58组成的组，优选SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：重链可变区，其包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17和48中任意之一，优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO：27、28、29、30和58中任意之一，优选SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(a)分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(b)分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，VH序列，其包含与SEQ ID NO：15至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：28至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(c)分别为SEQ ID NO：5、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：16至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：29至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；或
(d)分别为SEQ ID NO：39、40和41的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：52、53和54的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：48至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：58至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含：
(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；与氨基酸序列SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和与氨基酸序列SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列；
(b)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；与氨基酸序列SEQ ID NO：15至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和与氨基酸序列SEQ ID NO：28至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列；
(c)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；与氨基酸序列SEQ ID NO：16至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和与氨基酸序列SEQ ID NO：29至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列；
(d)分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；与氨基酸序列SEQ ID NO：17至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和与氨基酸序列SEQ ID NO：30至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列，优选地，其中所述VH包含G51C突变(AHo编号)，并且所述VL包含T141C突变(AHo编号)；或
(e)分别为SEQ ID NO：36、37和38的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：49、50和51的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；与氨基酸序列SEQ ID NO：48至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和与氨基酸序列SEQ ID NO：58至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列。
在一个优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的抗体包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；与氨基酸序列SEQ ID NO：17至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VH序列；和与氨基酸序列SEQ ID NO：30至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的VL序列，优选地，其中所述VH包含G51C突变(AHo编号)，并且所述VL包含T141C突变(AHo编号)。合适地，本发明的所述抗体被突变以在框架区内形成人工结构域间二硫键，特别是其中半胱氨酸对取代了所述VH上的Gly 51(AHo编号)和所述VL上的Thr 141(AHo编号)。令人惊讶地发现，包含结构域间二硫键的本发明的这种抗体具有显著提高的热稳定性。
关于二硫桥(“SS桥”或“diS”)的术语“人工的”是指S-S桥不是由野生型抗体天然形成的，而是由亲本分子的工程突变体形成的，其中至少一种外来氨基酸对二硫键做出了贡献。人工二硫桥的定点工程改造明显不同于天然免疫球蛋白或模块化抗体中天然可得的那些，例如WO 2009/000006A1中描述的那些，因为人工二硫桥的桥墩的至少一个位点通常位于野生型抗体中Cys残基的位置之外，因此提供了框架区内的替代的或另外的二硫键。本发明的人工二硫桥(“结构域间桥”)可以在抗体结构域内进行工程改造，其将稳定β-折叠结构或桥接结构域(“结构域间桥”)或结构域的链(“链间桥”)，以限制本发明的多特异性抗体的结构并支持其与潜在结合伴侣的相互作用。
在另一个实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含：(a)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列；(b)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ IDNO：28的VL序列；(c)SEQ ID NO：16的VH序列和SEQ ID NO：29的VL序列；(d)SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：30的VL序列；或(e)SEQ ID NO：48的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列。在一个优选的实施方案中，对人CD137具有结合特异性的本发明的分离的抗体包含SEQ IDNO：17的VH序列和SEQ ID NO：30的VL序列。
在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体是表1中描述的抗体。在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：60所示。在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：34所示。在一个实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35所示。在一个优选的实施方案中，与CD137特异性结合的抗体如SEQ ID NO：35所示。
本发明的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经突变，但与表1中所述的序列具有至少60、70、80、90或95％同一性的那些抗体。在一个实施方案中，包括当与表1中描述的序列中描述的可变区相比时，可变区中已经突变的氨基酸不超过1、2、3、4或5个，同时保留了基本上相同的治疗活性的氨基酸序列。如本文所用，术语“基本上相同的活性”是指由基本上相同的活性表示的活性是针对亲本抗体(例如本发明的抗体，特别是表1中所述的本发明的抗体)确定的活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％或至少110％，或至少120％，或至少130％，或至少140％，或至少150％，或至少160％，或至少170％，或至少180％，或至少190％，例如高达200％。
鉴于这些抗体中的每一种都可以与CD137结合并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，因此可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列“混合并匹配”(即，可以将来自不同抗体的CDR混合并匹配，但是每种抗体必须包含VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3)以产生本发明的其他的结合CD137的结合分子。可以使用本领域已知的结合测定法和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA)来测试这种“混合并匹配的”CD137结合抗体。当混合并匹配VH CDR序列时，应当将特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列替换为结构相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，应当将特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列替换为结构相似的CDR序列。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以通过用来自本文所示的本发明的单克隆抗体的CDR序列的结构上相似的序列来突变一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新的VH和VL序列。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，其包含与表1中描述的序列同源的氨基酸序列，并且所述抗体与CD137结合，并保留了表1中描述的那些抗体的所需功能特性。
例如，本发明提供了一种分离的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO：14、15、16、17和48组成的组，优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO：27、28、29、30和58组成的组，优选SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；其中所述抗体与CD137蛋白特异性结合。
在一个实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表1所示的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，除了在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置上的氨基酸取代之外，VH和/或VL氨基酸序列可以是相同的。
在一个实施方案中，本发明的抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述的抗体或其保守修饰的指明的氨基酸序列，其中所述抗体保留了本发明的CD137结合抗体的所需功能特性。
术语“保守修饰的变体”或“保守变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由一个密码子明确规定的每个位置上，可以将该密码子改变为所描述的相应密码子中任意之一，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个所述序列中。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”或“保守变体”包括对多肽序列的单个取代、缺失或添加，其导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。这些保守修饰的变体是以下的补充并且不排除以下：本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。以下八个组包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见，例如Creighton,Proteins(1984))。在一个实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。
因此，本发明提供了分离的单克隆抗体，包含以下或由其组成：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
其中：重链可变区CDR1包含选自SEQ ID NO：1、4、5、8、11、36、39、42和45中任意之一，优选SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；重链可变区CDR2包含，优选由其组成选自SEQ ID NO：2、6、9、12、37、40、43和46中任意之一，优选SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其保守变体；重链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO：3、7、10、13、38、41、44和47中任意之一，优选SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；
轻链可变区CDR1包含选自SEQ ID NO：18、21、24、49、52和55中任意之一，优选SEQID NO：18的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；轻链可变区CDR2包含选自SEQ IDNO：19、22、25、50、53和56中任意之一，优选SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；轻链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO：20、23、26、51、54和57中任意之一，优选SEQID NO：20的氨基酸序列或其保守变体，优选由其组成；
其中所述抗体与CD137特异性结合并且能够在有或没有另外的交联的情况下激活CD137信号传导。
在一个实施方案中，本发明的抗体被优化用于在哺乳动物细胞中表达，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述的抗体或其保守修饰的指定氨基酸序列，其中所述抗体保留了本发明的CD137结合抗体的所需功能特性。因此，本发明提供了优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17和48的任何一个，优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列，和其保守变体；并且所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：27、28、29、30和58中任意之一，优选SEQ ID NO：30的氨基酸序列，和其保守变体；其中所述抗体与CD137特异性结合并且能够在有或没有另外的交联的情况下激活CD137信号传导。
在一个实施方案中，本发明的抗体被优化用于在哺乳动物细胞中表达，其具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述的抗体或其保守修饰的指定氨基酸序列，其中所述抗体保留了本发明的CD137结合抗体的所需功能特性。
如本文所用，术语“优化的”是指将核苷酸序列改变为使用在生产细胞或生物(通常是真核细胞，例如毕赤酵母属细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人类细胞)中优选的密码子编码氨基酸。对优化的核苷酸序列进行工程改造，以完全或尽可能保留最初由起始核苷酸序列(也称为“亲本”序列)编码的氨基酸序列。已经对本文的优化序列进行了改造，使其具有在哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，本文中还设想了这些序列在其他真核细胞或原核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为被优化的。
可变区修饰的另一种类型是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)，称为“亲和力成熟”。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以如本文所述和实施例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目的功能的影响。可以引入保守修改(如上所述)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，CDR区中通常不超过1、2、3、4或5个残基被改变。
“亲和力成熟的”抗体是一种抗体，在其一个或多个可变结构域中具有一个或多个改变，与不具有那些改变的亲本抗体相比，这导致抗体对抗原的亲和力得到改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的方案产生。例如，Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。高变区(HVR)和/或框架残基的随机诱变描述于例如：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
在一个实施方案中，本发明的“亲和力成熟的”抗体包含：VH4，所述VH4包含I44V；F89V；Y105F突变，特别是包含根据SEQ ID NO：15的氨基酸序列；和VL，所述VL包含A51P突变，特别是包含根据SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的“亲和力成熟的”抗体包含：VH4，所述VH4包含V25A；I44V；V82K；F89V；Y105F突变，特别是包含根据SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和VL，所述VL包含I2L；A51P突变，特别是包含根据SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
本发明的抗体可以进一步通过如下方法制备：使用具有本文所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来工程改造修饰的抗体，该修饰的抗体可能具有与起始抗体不同的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来工程化抗体。另外地或可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如以改变抗体的效应子功能。
可以执行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，各个抗体之间CDR中的氨基酸序列比CDR之外的序列更具多样性。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可以通过构建表达载体来表达模仿特定天然存在抗体的特性的重组抗体，该表达载体包含来自该特定天然存在抗体的CDR序列，并且该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(参见，例如，Riechmann,L.等人,1998Nature 332:323-327；Jones,P.等人,1986Nature 321:522-525；Queen,C.等人,1989Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033；美国专利号5,225,539(Winter)，和美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370(Queen等人))。
这样的框架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列或重排的抗体序列的公开参考文献中获得。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列也可以在“VBase”人类种系序列数据库(可以在互联网上在www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)以及Kabat,E.A.等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health和Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.等人,1992J.fol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人,1994Eur.JImmunol.24:827-836中找到；各自的内容通过引用明确地并入本文。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列和重排抗体序列可以在“IMGT”数据库中找到(可以在网上在www.imgt.org获得；参见Lefranc,M.P.等人,1999Nucleic Acids Res.27:209-212；其各自的内容通过引用明确地并入本文)。
用于本发明的抗体的框架序列的实例是与本发明的选择的抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些，例如，本发明的单克隆抗体所使用的共有序列和/或框架序列。可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列移植到框架区上，该框架区具有与框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列，或者可以将CDR序列移植到与种系序列相比包含一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在某些情况下，使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如，美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370(Queen等人))。
可以使用多种抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要得到的多肽包括至少一个与CD137特异性结合的结合区域即可。这样的框架或支架包括人免疫球蛋白的五种主要的个体基因型(idiotype)，其抗原结合片段，并且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化特征。
一方面，本发明涉及一种使用非免疫球蛋白支架生产基于非免疫球蛋白的抗体的方法，可以将本发明的CDR移植到所述非免疫球蛋白支架上。可以使用已知的或将来的非免疫球蛋白框架和支架，只要它们包含对靶CD137蛋白具有特异性的结合区即可。已知的非免疫球蛋白框架或支架包括但不限于纤连蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,Mass.)、锚蛋白(ankyrin)(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、脂质运载蛋白(lipocalin)(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小型模块化免疫药物(smallmodular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,Wash.)、maxybodies(Avidia,Inc.,Mountain View,Calif)、蛋白质A(Protein A)(Affibody AG,Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
合适地，本发明的抗体与CD137特异性结合，并以下列参数中的一个或多个为特征：
(i)与人CD137结合的解离常数(KD)小于50nM，特别是小于10nM，特别是小于5nM，特别是小于1nM，特别是小于500pM，更特别是小于100pM，更特别是小于50pM，特别是如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；
(ii)与人CD137结合的Koff速率为10-3s-1或更低，或10-4s-1或更低，或10-5s-1或更低，如通过SPR所测量的；
(iii)与人CD137结合的Kon速率为至少104M-1s-1或更高，至少105M-1s-1或更高，至少106M-1s-1或更高，如通过SPR所测量的；
(iv)任选地，不与urelumab和/或utolimumab交叉竞争；
(v)与食蟹猕猴(食蟹猴)CD137交叉反应，特别是与食蟹猴CD137结合的KD小于15nM，特别是小于10nM，特别是小于5nM，如通过SPR所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；和/或
(vi)不与人CD40和/或人OX40结合，特别是如通过SPR所测量的；
(vii)任选地，不抑制CD137与其配体CD137L之间的相互作用，特别是如通过竞争ELISA所测定的。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点上抗体和抗原之间的相互作用的强度。在每个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；相互作用越大，亲和力越强。
“结合亲和力”通常是指分子的(例如，抗体的)单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”或“与……结合”是指反映结合对的成员(例如抗体片段和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常会缓慢结合抗原并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常会更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合时间。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。下面描述用于测量结合亲和力，即结合强度的具体说明性和示例性实施方案。
本文所用的术语“Kassoc”、“Ka”或“Kon”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kdis”、“Kd”或“Koff”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施方案中，本文所用的术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。在一个实施方案中，根据本发明的“KD”或“KD值”或“KD”或“KD值”通过使用MASS-1SPR仪器(Sierra Sensors)使用表面等离子体共振测定法来测量。为了测量亲和力，使用标准的胺偶联方案将对兔IgG Fc区具有特异性的抗体(Bethyl Laboratories，货号A120-111A)固定在传感器芯片(SPR-2Affinity Sensor,High Capacity Amine,SierraSensors)上。B-细胞上清液中的兔单克隆抗体被固定的抗兔IgG抗体捕获。B细胞上清液中的IgG最低浓度要求足以捕获。捕获单克隆抗体后，将人CD137 ECD(Peprotech，货号310-15-1MG)以90nM的浓度注入流动池中3分钟，然后使蛋白质从传感器芯片上捕获的IgG中解离5分钟。每个注射循环后，两次注射10mM甘氨酸-HCl使表面再生。使用MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)使用一对一Langmuir结合模型计算表观解离速率常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)，并根据相对Chi2(将Chi2标准化为分析物的外推最大结合水平)监控拟合质量，其中相对Chi2是对曲线拟合质量的度量。Chi2的值越小，对一对一Langmuir结合模型的拟合越准确。如果配体结合的反应单位(RU)为抗体捕获的RU的至少2％，则认为结果有效。配体结合的RU少于2％的抗体捕获的RU的样品被认为CD137与捕获的抗体没有特异性结合。平衡解离常数(KD)计算为比率Koff/Kon。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。
合适地，本发明的抗体对CD137的亲和力可以与CD137L对CD137的亲和力相当或更高。合适地，本发明的抗体对CD137的亲和力可以与urelumab对CD137的亲和力相当或更高。应当理解，CD137抗体的较高亲和力可能特别适合使用，其中所述抗体对于CD137是单价的。抗体的结合亲和力可以例如通过解离常数(KD)确定。较低的KD表示较强的亲和力，而较高的KD表示较弱的亲和力。
因此，在合适的实施方案中，本发明的抗体的KD可以为5至50,000pM，5至40,000pM，5至30,000pM，5至20,000pM，5至10,000pM，5至5,000pM，5至2,500pM，5至1,000pM，5至750pM，5至500pM，5至250pM，5至100pM，5至75pM，5至50pM，5至30pM，特别是如通过SPR所测量的。在另一个实施方案中，本发明的抗体与人CD137结合的KD在10nM至10pM之间，优选在10nM至0.1nM之间，更优选在5nM至1nM之间，特别是如通过SPR所测量的。
在合适的实施方案中，本发明的抗体的KD可以小于约50nM，小于约45nM，小于约40nM，小于约35nM，小于约30nM，小于约25nM，小于20nM，小于约15nM，小于约10nM，小于约9nM，小于约8nM，小于约7nM，小于约6nM，小于约5nM，小于约4nM，小于约3nM，小于2nM，小于1nM，小于0.5nM，小于0.25nM，or小于0.1nM，小于50pM，小于40pM，小于30pM，小于20pM，特别是如通过SPR测量的。合适地，本发明的抗体具有小于10nM的KD，特别是如通过SPR测量的。优选地，本发明的抗体与人CD137结合的KD小于5nM，特别是如通过SPR测量的。合适地，本发明的抗体具有小于1nM的KD，特别是如通过SPR测量的。合适地，本发明的抗体具有小于50pM的KD，特别是如通过SPR测量的。
合适地，本发明的抗体与人CD137结合的Kon率为至少103M-1s-1或更高、至少104M-1s-1或更高、至少5x104M-1s-1或更高、至少105M-1s-1或更高、至少5x105M-1s-1或更高、至少106M- 1s-1或更高、至少5x106M-1s-1或更高、至少107M-1s-1或更高、至少5x107M-1s-1或更高，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的。合适地，本发明的抗体的Kon率为至少104M-1s-1或更高、特别是至少105M-1s-1或更高，如通过SPR所测量的。
合适地，本发明的抗体与人CD137结合的Koff率为10-3s-1或更低、3x10-3s-1或更低、5x10-3s-1或更低、10-4s-1或更低、5x10-4s-1或更低、10-5s-1或更低、5x10-5s-1或更低、10-6s-1或更低或10-7s-1或更低，如通过表面等离子体共振(SPR)测量的。合适地，本发明的抗体的Koff率为10-4s-1或更低，特别是10-5s-1或更低，如通过SPR所测量的。
合适地，本发明的抗体具有有益的生物物理特征。
合适地，当为scFv形式时，本发明的抗体的解链温度(Tm)(通过差示扫描荧光法测定)为至少50℃，优选至少55℃，更优选至少60℃，特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4、150mM NaCl的50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液中。DSF已在前面进行了描述(Egan等人,MAbs,9(1)(2017),68-84；Niesen等人,Nature Protocols,2(9)(2007)2212-2221)。scFv构建体的热解折叠的转变中点是通过差示扫描荧光法使用荧光染料
Figure BDA0002440959240000481
Orange确定的(参见Wong&Raleigh,Protein Science 25(2016)1834-1840)。在pH 6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液中的样品以50μg/mL的最终蛋白质浓度制备，并且含有5x
Figure BDA0002440959240000482
Orange的终浓度，总体积为100μl。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化，在每次温度递增后，暂停30s。总测定时间为约两个小时。通过GraphPad Prism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算Tm。报告的Tm是三个测量值的平均值。
合适地，当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将本发明的抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃下储存至少两周，特别是至少4周后，本发明的抗体的单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％。合适地，当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将本发明的抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃下储存至少2周，特别是至少4周后，本发明的抗体的单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％。单体含量的损失由SE-HPLC色谱图的曲线下面积计算确定。SE-HPLC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术，如USP第621章所述。该方法利用疏水固定相和水性流动相基于分子的大小和形状来分离分子。分子的分离发生在特定柱的空隙体积(V0)和总渗透体积(VT)之间。通过SE-HPLC测量Chromaster HPLC***(Hitachi High-Technologies Corporation)上进行，该***配备有自动样品注射和检测波长设定为280nm的UV检测器。该设备由软件EZChrom Elite(AgilentTechnologies，Version 3.3.2SP2)控制，该软件还支持对所得色谱图进行分析。在注射前通过离心清除蛋白质样品，并在将自动进样器的温度保持在4-6℃。对于scFv样品的分析，使用Shodex KW403-4F柱(Showa Denko有限公司，#F6989202)，标准缓冲盐水流动相(50mM磷酸钠pH 6.5，300mM氯化钠)，推荐流速为0.35mL/min。每次注射的目标样品加载量为5μg。在280nm的波长下通过UV检测器检测样品，并通过合适的软件套件记录数据。在V0至VT的范围内分析所得色谱图，从而排除洗脱时间>10分钟的基质相关的峰。
在一个实施方案中，本发明的抗体不交叉竞争与urelumab的结合。本发明提供了结合不同于urelumab的表位的抗体。Urelumab，也称为BMS-663513，是来自Bristol-MyersSquibb的完全人源化的IgG4 mAb，并描述于WO2004/010947、US 6,887,673和US 7,214,493，这些文献通过引用整体并入本申请。
在一个实施方案中，本发明的抗体不交叉竞争与utomilumab的结合。本发明提供了结合不同于utomilumab的表位的抗体。utomilumab，也称为PF-05082566，是来自Pfizer的完全人源化的IgG2 mAb，并描述于WO 2012/032433和US 8,821,867，这些文献通过引用整体并入本申请。
在另一个实施方案中，本发明的抗体不交叉竞争与urelumab和utomilumab的结合。本发明提供了结合不同于urelumab和utomilumab的表位的抗体。
如本文所用，术语“识别”是指发现其构象表位并与之相互作用(例如结合)的抗体。
术语“竞争”或“交叉竞争”和相关术语在本文中可互换使用，是指在标准竞争性结合测定中一种抗体干扰其他抗体或结合剂与CD137的结合的能力。
可以使用标准竞争结合测定法来确定一种抗体或其他结合剂能够干扰另一种抗体或结合分子与CD137的结合的能力或程度，并因此确定是否可以说是根据本发明的交叉竞争。一种特别合适的定量交叉竞争测定法使用基于FACS或基于AlphaScreen的方法来测量标记的(例如His标记的、生物素化的或放射性标记的)抗体或其片段与另一种抗体或其片段在它们与靶标结合方面的竞争。通常，交叉竞争抗体或其片段，例如在交叉竞争测定中，将与靶标结合，使得在测定期间并且在存在第二抗体或其片段的情况下，所记录的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的位移高达以给定量存在的待测试潜在交叉阻断抗体或其片段的最大理论位移(例如，需要交叉阻断的冷(例如未标记)抗体或其片段置换)的100％(例如，在基于FACS的竞争测定中)。优选地，交叉竞争抗体或其片段的记录的位移在10％至100％之间，更优选在50％至100％之间。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“构象”表位和“线性”表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。
如本文所用，术语“构象表位”是指，当多肽链折叠形成天然蛋白时，在表面上聚集在一起的抗原氨基酸残基，并且由于Fab结合，它们会显示出显著降低的HD交换速率。构象表位包含但不限于功能性表位。
术语“线性表位”是指一种表位，其中蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生(连续)。
本发明的抗体不抑制urelumab或utomilumab与CD137蛋白的结合，这表明本发明的抗体不能与urelumab或utomilumab竞争与CD137的结合；根据非限制性理论，这样的抗体可以结合CD137上与urelumab或utomilumab不同(例如，结构上不同或空间上偏远)的表位。
本发明还提供了与表1中列出的CD137结合抗体结合相同表位的抗体。因此，可以基于它们在CD137结合测定中与本发明的其他抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性地抑制其结合)的能力来鉴定其他抗体。
合适地，本发明的分离的抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、IgG抗体、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB和基于替代支架的结合结构域，所述基于其他支架的结合结构域包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的Modular Antibody TechnologyTM)。
合适地，本发明的分离的抗体是Fv。合适地，本发明的分离的抗体是scFv抗体片段。“单链Fv”或“scFv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间多肽接头，其使得sFv能够形成所需的靶标结合结构。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间多肽接头，其使得scFv能够形成所需的抗原结合结构(参见，例如，Plückthun,The pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315)。在特定实施方案中，所述功能片段是scFv形式，其包含根据SEQ IDNO：31的接头。在另一个实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：60，优选SEQ ID NO：35所示的单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：33所示的单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：34所示的单链可变片段(scFv)。在一个优选的实施方案中，本发明的分离的抗体是如SEQ ID NO：35所示的单链可变片段(scFv)。
合适地，本发明的分离的抗体是IgG抗体片段。术语“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如，IgM、IgE、IgG例如IgG1或IgG4)。同种型也包括这些类别之一的修饰形式，其中在Fc功能之后进行了修饰，例如以增强或降低效应子功能或与Fc受体的结合。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体是选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的IgG，优选IgG4。合适地，本发明的分离的抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ ID NO：89至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：88至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。合适地，本发明的分离的抗体是IgG4，其包含分别为SEQ IDNO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ ID NO：89至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：88至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中，本发明的分离的抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：17至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：30至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在另一个具体实施方案中，本发明的分离的抗体是多特异性分子，特别是具有至少第二功能分子的多特异性分子，例如双特异性分子、三特异性分子、四特异性、五特异性、六特异性分子。
如本文所用，术语“多特异性分子”或“多特异性抗体”是指与至少两个或更多个不同靶标(例如，CD137和不同于CD137的另一个靶标)上的两个或更多个不同表位结合的抗体，或与同一靶标的两个或更多个不同表位结合的抗体。术语“多特异性分子”包括双特异性、三特异性、四特异性、五特异性和六特异性抗体。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指与两个不同靶标或相同靶标上的两个不同表位结合的抗体。如本文所用，术语“三特异性抗体”是指与三个不同靶标或相同靶标上的三个不同表位结合的抗体。
可以将本发明的抗体衍生化或与另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)连接，以产生与至少两个结合位点和/或不同靶标分子结合的多特异性分子。实际上，可将本发明的抗体衍生化或与不止一个其他功能分子连接，以产生与不止两个不同结合位点和/或靶标分子结合的多特异性分子。为了产生本发明的多特异性分子，可以将本发明的抗体与一个或多个其他结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，从而产生多特异性分子。
因此，本发明包括多特异性分子，其包含至少一个对CD137的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位存在于不同于CD137的另一种靶分子上。
在没有外源聚集的情况下，二价CD137抗体诱导信号传导的能力通常较弱。为了说明，抗CD137抗体utomilumab仅在与抗人F(ab’)2二抗交联或固定在组织培养塑料上时才能够激活CD137信号传导(Fisher at al.,Cancer Immunol Immunother 61:1721-1733(2012))。对CD40(TNFRSF5)(TNFRSF的另一个成员)的啮齿类动物拮抗抗体的研究表明，可以通过与Fcγ受体的相互作用部分实现外源聚集(Li F,Ravetch JV,Science 333(6045):1030–10(2011)；White AL等人,J Immunol 187(4):1754–1763(2011))。但是，与Fcγ受体的相互作用可以通过效应子机制消耗表达CD137的细胞。因此，目前靶向CD137的二价抗体要么是无效的激动剂，要么导致CD137阳性细胞的消耗。合适地，多特异性分子的第二结合特异性能够提供本发明的CD137结合抗体的另外的交联。因此，本发明包括多特异性分子，其包含至少一个对CD137的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位是不同于第一靶表位的CD137的另一表位。除了第一和第二靶表位之外，多特异性分子还可以包括第三结合特异性。
在另一个实施方案中，本发明包括对CD137特异性的单价、二价或多价的多特异性分子，优选单价。
在本发明的另一个具体实施方案中，本发明的分离的抗体是CD137特异性分子的单价或多价，例如二价，三价，四价，五价，六价。
如本文所用，术语“单价分子”或“单价抗体”是指与靶分子(例如CD137)上的单个表位结合的抗体。
术语“多价抗体”是指具有不止一价(valency)的单个结合分子，其中“价”被描述为与相同靶分子上的表位结合的抗原结合部分的数目。这样，单个结合分子可以与不止一个靶分子结合，或者与一个靶分子(其包含多个拷贝的表位)上的不止一个结合位点结合。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体等。如本文所用，术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合部分的抗体，每个都与相同的表位结合。
合适地，本发明的分离的抗体是多特异性分子，例如双特异性分子，和/或多价分子，例如对于CD137特异性分子是单价的，对于CD137特异性分子是二价的，其是选自本领域已知的任何合适的多特异性(例如双特异性)形式的抗体形式，包括但不限于基于以下的形式：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞接合子(BiTE；串联双-scFv)、串联三-scFv、三抗体(Fab-(scFv)2)或双抗体(Fab-(scFv)1)、Fab、Fab-Fv2、Morrison(IgG CH3-scFv融合体(Morrison L)或IgG CL-scFv融合体(Morrison H))、三抗体、scDb-scFv、双特异性Fab2、双微抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、scFv-HSA-scFv融合体、双双抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体例如bsAb(与轻链的C-末端连接的scFv)、Bs1Ab(与轻链的N-末端连接的scFv)、Bs2Ab(与重链的N-末端连接的scFv)、Bs3Ab(与重链的C-末端连接的scFv)、Ts1Ab(与重链和轻链的N-末端连接的scFv)、Ts2Ab(与重链的C-末端连接的dsscFv)、基于异二聚体Fc结构域的双特异性抗体例如Knob-into-Hole抗体(KiH)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)；与异二聚体Fc结构域或任何其他异二聚体结构域的任意一条链的N-和/或C-末端融合的Fv、scFv、scDb、串联双-scFv、串联三-scFv、Fab-(scFv)2、Fab-(scFv)1、Fab、Fab-Fv2、COVD、MATCH(描述于WO 2016/0202457；Egan T.等人,mAbs 9(2017)68-84)和Duobody(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)(MAbs.2017Feb/Mar；9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包含与同一条多肽链中的VL连接的VH(VH-VL)。通过使用接头，该接头太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，以产生两个抗原结合位点。在特定实施方案中，所述多肽接头包含一个或两个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1或2，优选1。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体在例如EP404097、WO 93/01161、Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)和Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中更充分地描述。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。
双特异性scDb，特别是双特异性单体scDb，特别地包含两个可变重链结构域(VH)或其片段和两个可变轻链结构域(VL)或其片段，它们通过接头L1、L2和L3以以下顺序连接VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成第一抗原的抗原结合位点，VLB和VHB共同形成第二抗原的抗原结合位点。
接头L1特别是2-10个氨基酸，更特别是3-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽，并且接头L3特别是1-10个氨基酸，更特别是2-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸的肽。。在特定实施方案中，接头L1和/或L3包含一个或更多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1或2，优选n＝1。
中间接头L2特别是10-40个氨基酸，更特别地15-30个氨基酸，最特别地20-25个氨基酸的肽。在特定实施方案中，所述接头L2包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，优选n＝4。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体是scDb-scFv形式的多特异性和/或多价抗体。术语“scDb-scFv”是指抗体形式，其中单链Fv(scFv)片段通过柔性Gly-Ser接头与单链双抗体(scDb)融合。在一个实施方案中，所述柔性Gly-Ser接头是2-40个氨基酸，例如2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10个氨基酸，特别是10个氨基酸的肽。在特定实施方案中，所述接头包含一个或多个单元的四个(4)甘氨酸氨基酸残基和一个(1)丝氨酸氨基酸残基(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7或8，优选n＝2。
在一个本发明的实施方案中，分离的抗体是WO 2016/0202457；Egan T.等人,mAbs9(2017)68-84中描述的MATCH形式的多特异性和/或多价抗体。
本发明的多特异性和/或多价分子可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来制备(关于双特异性构建体的生产，例如参见Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv的生产，例如参见Hornig,N.&
Figure BDA0002440959240000571
-Schwarz,A.,Methods Mol.Biol.907(2012)713-727和WO 99/57150)。用于制备本发明的双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括Genmab技术(参见Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)和Merus技术(参见de Kruif等人,Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。用于生产包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如，Zhu等人,Cancer Lett.86(1994)127-134)；和Suresh等人,Methods Enzymol.121(1986)210-228)。
可以在本发明的多特异性和多价分子中使用的其他抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可以使用本领域已知的方法通过将组成结合特异性缀合来制备本发明的多特异性分子。例如，可以单独生成双特异性分子的每种结合特异性，然后将其彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺(carbodiimide)、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985BehringIns.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人,1985Science 229:81-83和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375中描述的方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical有限公司(Rockford,Ill.)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键缀合。在一个特别的实施方案中，在缀合之前，将铰链区修饰为包含奇数个巯基残基，例如一个。
或者，可以在相同载体中编码两个或更多个结合特异性，并在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F(ab')2或配体X Fab融合蛋白时，此方法特别有用。本发明的多特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者可以是包含两个结合决定簇的单链多特异性分子。多特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备多特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。
在另一方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明的抗体。本发明还提供了一种核酸序列，其编码与CD137蛋白特异性结合的抗体的CDR、VH、VL、全长重链和全长轻链。可以对此类核酸序列进行优化以在哺乳动物细胞中表达。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指一种或多种单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下所述，简并密码子取代可以通过生成这样的序列来实现，即在所述序列中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基取代(Batzer等人,NucleicAcid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
本发明提供了基本上纯化的核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含上述CD137结合抗体链的区段或结构域。当从合适的表达载体表达时，由这些核酸分子编码的多肽能够表现出CD137抗原结合能力。
本发明还提供了多核苷酸，其编码表1中列出的CD137结合抗体的重链或轻链的至少一个CDR区并且通常编码所有三个CDR区。一些其他多核苷酸编码表1中列出的CD137结合抗体的重链和/或轻链的所有或基本上所有可变区序列。由于密码子的简并性，将有多种核酸序列编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。
多核苷酸序列可以从头通过固相DNA合成或通过PCR诱变编码CD137结合抗体或其结合片段的现有序列(例如，以下实施例中描述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法来完成，例如Narang等人,1979,Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固体支撑法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可以通过例如如下文献中描述的方法来进行：PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),FreemanPress,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人(Ed.),Academic Press,San Diego,Calif,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
本发明还提供了用于生产上述CD137结合抗体的表达载体和宿主细胞。
术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离体(episomal)哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如非游离体哺乳动物载体)可以被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果在合适的宿主细胞或其他表达***中，启动子或增强子序列刺激或调节编码序列的转录，则它与该编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调控序列与转录序列在物理上是连续的，即，它们是顺式的。但是，某些转录调控序列，例如增强子，不必在物理上连续或位于其增强转录的编码序列的附近。
可以使用各种表达载体来表达编码CD137结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和***包括质粒、游离体载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如Harrington等人,Nat Genet.15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达CD137结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPS V载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、***瘤病毒、HBP爱泼斯坦巴尔病毒(HBP Epstein Barrvirus)、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)的载体。参见Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于要在其中表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码CD137结合抗体的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调控序列(例如，增强子)。在一个实施方案中，采用诱导型启动子来防止***序列在非诱导条件下的表达。诱导型启动子包括例如***糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化生物体的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向于表达产物被宿主细胞更好地耐受的编码序列。除启动子外，有效表达CD137结合抗体还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，可以通过包含适合使用中的细胞***的增强子来增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.CellDiffer.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，从而与由***的CD137结合抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。通常，在包含在载体中之前，将***的CD137结合抗体序列与信号序列连接。用于接收编码CD137结合抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这种载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整的抗体及其抗原结合片段。通常，这样的恒定区是人的。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
包含和表达CD137结合抗体链的宿主细胞可以是原核的或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，将存在任意数量的各种众所周知的启动子，例如乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***、β-内酰胺酶启动子***或噬菌体λ的启动子***。启动子通常控制表达(任选地与操纵子序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物，例如酵母，也可以用于表达本发明的CD137结合多肽。还可以将昆虫细胞与杆状病毒载体结合使用。
在一个实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞来表达和生产本发明的CD137结合多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的终将死亡的(mortal)或者正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途在Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCHPublishers,N.Y.,N.Y.,1987中大体地描述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、***诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPS V启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
引入包含目的多核苷酸序列的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(大体上参见Sambrook等人，同上)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道法(ballistic method)、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常需要稳定的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达CD137结合抗体链或结合片段的细胞系，所述表达载体包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体后，可以使细胞在丰富的培养基中生长1-2天，然后将其转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择培养基中生长。有抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合细胞类型的组织培养技术增殖。因此，本发明提供了一种生产本发明的抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：培养宿主细胞，所述宿主细胞包括(特别是表达)编码本发明的抗体的核酸或载体，由此表达本发明的所述抗体或其片段。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。施用途径和/或方式取决于所需结果。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，或在靶部位附近施用。药学上可接受的载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物即抗体和多特异性分子可以用一种材料包被，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的影响。
本发明的药物组合物可以根据本领域众所周知的和常规实践的方法制备。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20thed.,2000；和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的CD137结合抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将CD137结合抗体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得可以针对特定患者、组合物和施用方式有效地实现所需治疗反应，而对病人无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的***速率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素。
抗体通常被多次施用。单剂之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中CD137结合抗体的血液水平所指示的。或者，抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较低频率的施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。通常，人源化抗体的半衰期比嵌合抗体和非人抗体的半衰期更长。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以对患者施用预防方案。
一方面，本发明提供了一种药物组合，其包含如本文所定义的本发明的抗CD137抗体，与一种或多种另外的治疗剂，例如一种或多种抗癌剂、细胞毒性或细胞抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗治疗剂。合适地，本发明的抗CD137抗体可以与选自以下的抑制性(或免疫检查点)分子的抑制剂组合使用：PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ和IDO(吲哚胺-2,3双加氧酶)。抑制性分子的抑制可以通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制来进行。
令人惊奇地发现，当与PDL1抑制剂组合使用时，本发明的抗CD137抗体具有强的有益的协同相互作用和改善的抗增殖活性。因此，本发明提供了一种药物组合，其包含如本文所定义的本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂，特别是用于治疗或预防增生性疾病。本发明进一步涉及一种药物组合，其包含如本文所定义的本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂，特别是用于同时、单独或相继用于治疗或预防增生性疾病。
本文中术语“组合”或“药物组合”定义为指一种剂量单位形式的固定组合、非固定组合或用于组合施用的成套试剂盒(kit of parts)，其中治疗剂(例如本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂)可以一起施用、在同一时间独立施用或在允许组合伴侣表现出合作(例如协同)作用的时间间隔内分开施用。
术语“固定组合”是指治疗剂(例如本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂)以单一实体或剂型的形式同时施用于患者。
术语“非固定组合”是指在没有特定时间限制的情况下，同时、并行或依次将治疗剂(例如本发明的抗CD137抗体和PDL1抑制剂)以单独的实体或剂型施用于患者，其中这样的施用在有此需要的受试者(例如哺乳动物或人)的体内提供两种治疗剂的治疗有效水平。
术语“PDL1”特别是指具有UniProt ID号Q9NZQ7的人PDL1。
术语“阻断剂”或“抑制剂”或“拮抗剂”是指抑制或降低与其结合的靶标分子的生物学活性的剂。在一些实施方案中，抑制剂基本上或完全抑制靶分子的生物学活性。合适的PDL1抑制剂靶向、降低、抑制PDL1与其结合伴侣的结合能力，从而干扰PDL1的功能。特别地，合适的PDL1抑制剂阻断PDL1与PD-1的相互作用。在一些实施方案中，合适的PDL1抑制剂阻断PDL1与PD-1和B7-1的相互作用。合适地，在本发明的药物组合中使用的PDL1抑制剂是抗PDL1抗体。
如本文所用，术语“协同效应”是指这样的作用，即两种治疗剂(例如，(a)本发明的抗CD137抗体和(b)PDL1抑制剂)产生的效果，例如减缓增生性疾病(特别是癌症)或其症状的症状进展，比单独施用每种治疗剂所产生的效果的简单相加更大。例如，可以使用诸如Sigmoid-Emax方程(Holford,N.H.G.and Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981))、Loewe可加性方程(Loewe,S.and Muischnek,H.,Arch.Exp.PatholPharmacol.114:313-326(1926))和中值效应方程(Chou,T.C.and Talalay,P.,Adv.EnzymeRegul.22:27-55(1984))之类的合适方法来计算协同效应。上面提到的每个方程式都可以应用于实验数据，以生成相应的图表，以帮助评估药物组合的效果。与上述方程式相关的对应曲线分别是浓度-效果曲线、isobologram曲线和组合指数曲线。通过根据本领域技术人员已知的方法计算组合的协同作用得分，可以进一步显示协同作用。
如本文所用，术语“组合施用”被定义为涵盖将选择的治疗剂施用给单个患者，并且旨在包括其中不必通过相同的施用途径或在相同时间来施用治疗剂的治疗方案。
术语“组合制剂”在本文中被定义为特别是指“成套试剂盒”，在这种意义上，如上文所定义的治疗剂(a)和(b)可以同时或在不同时间点独立地给药或者通过使用具有突出量的治疗剂(a)和(b)的不同固定组合给药。然后，对于成套试剂盒的任何部分，可以同时或按时间顺序错开(即，在不同的时间点，以相同或不同的时间间隔)施用成套试剂盒的各部分。可以改变组合制剂中待施用的治疗剂(a)与治疗剂(b)的总量之比，例如，以便满足待治疗的患者子群的需求或单个患者的需求。
如本文所用，术语“联合治疗活性”或“联合治疗作用”是指可以以在待治疗的温血动物(尤其是人)中仍然显示出有益(优选协同)相互作用(联合治疗作用)的，治疗剂优选的时间间隔单独(以按时间顺序错开的方式，特别是序列特异性方式)给予治疗剂。是否如此，可以通过追踪血液水平来确定，显示至少在一定时间间隔内两种治疗剂都存在于待治疗的人的血液中。
本发明的药物组合包含本文所定义的本发明的抗CD137抗体，特别是用于治疗或预防增生性疾病。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合包含本发明的抗体，其中所述抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：14至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：27至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明的药物组合包含本发明的抗体，其中所述抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：4、6和7的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：21、22和23的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ IDNO：89至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：88至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明的药物组合包含本发明的抗体，其中所述抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：17至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：30至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的药物组合包含本发明的抗体，其中所述抗体是IgG4，其包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ ID NO：89至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：88至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
本发明的药物组合还包含PDL1抑制剂。在一个实施方案中，所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体。用于本发明的组合的合适的PDL1抑制剂包括但不限于，
(i)阿维鲁单抗(MSB0010718C；人IgG1抗PDL1单克隆抗体；Merck-Serono；描述于WO 2013/079174，其通过引用整体并入本申请)；
(ii)atezolizumab(MPDL3280A，RG7446；人IgG抗-PDL1单克隆抗体；Hoffmann-LaRoche)；
(iii)MDX-1105(BMS-936559；人IgG4抗PDL1单克隆抗体；Bristol-Myers Squibb；描述于WO 2007/005874，其通过引用整体并入本申请)；
(iv)durvalumab(MEDI4736；人源haulIgG1抗PDL1单克隆抗体；AstraZeneca；描述于WO 2011/066389和US 2013/034559，其通过引用整体并入本申请)；
(v)KN035(抗PDL1单克隆抗体；3D Medicines)；
(vi)LY3300054(抗PDL1单克隆抗体；Eli Lilly)；和
(vii)YW243.55.S70(描述于WO 2010/077634和美国专利号8,217,149，其通过引用整体并入本申请)。
用于本发明的组合的优选的PDL1抑制剂包括抗PDL1抗体，其包含：(a)分别为SEQID NO：90、91和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：106、107和108的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(b)分别为SEQ ID NO：93、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：109、110和111的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(c)分别为SEQ ID NO：94、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：109、110和111的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(d)分别为SEQ ID NO：121、122和123的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：137、138和139的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(e)分别为SEQ ID NO：124、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：140、141和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或(f)分别为SEQ ID NO：125、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：140、141和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一个实施方案中，用于本发明的组合的PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：(a)分别与SEQ ID NO：90、91和92具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：106、107和108具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(b)分别与SEQ ID NO：93、95和96具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQID NO：109、110和111具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(c)分别与SEQ ID NO：94、95和96具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：109、110和111具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(d)分别与SEQ ID NO：121、122和123具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：137、138和139具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；(e)分别与SEQ ID NO：124、126和127具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：140、141和142具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或(f)分别与SEQ ID NO：125、126和127具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别与SEQ ID NO：140、141和142具有至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在一个实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：
(i)以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列：
a.分别为SEQ ID NO：93、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：109、110和111的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
b.分别为SEQ ID NO：124、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO：140、141和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或
c.分别为SEQ ID NO：125、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO：140、141和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；优选VH4结构域框架序列FR1至FR4；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR，优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62至SEQID NO：68所示，更优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62所示。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：
(i)分别为SEQ ID NO：94、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：109、110和111的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH1A、VH1B、VH3或VH4结构域框架序列，优选VH1A或VH1B结构域框架序列；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选包含选自SEQ ID NO：62至SEQID NO：68中任意之一的氨基酸序列的VλFR4，更优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62所示。
在一个实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：
(i)分别为SEQ ID NO：90、91和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：106、107和108的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；优选VH3结构域框架序列FR1至FR4；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68所示，更优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62所示。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：
(i)分别为SEQ ID NO：121、122和123的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO：137、138和139的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
(ii)VH3或VH4结构域框架序列FR1至FR4；优选VH4结构域框架序列FR1至FR4；和
(iii)VL结构域，其包含VL框架，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选包含选自SEQ ID NO：62至SEQID NO：68中任意之一的氨基酸序列的VλFR4，更优选地，VλFR4如SEQ ID NO：62所示。
在一个实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：
(i)CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；
(ii)人Vκ框架区FR1至FR3，特别是人Vκ1框架区FR1至FR3；
(iii)FR4，其选自(a)FR4的人Vλ种系序列，特别是选自以下组的Vλ种系序列：SEQID NO：62至68，优选SEQ ID NO：62；和(b)基于Vλ的序列，与最接近的FR4的人Vλ种系序列相比，所述基于Vλ的序列具有一个或两个突变，特别是一个突变，所述最接近的FR4的人Vλ种系序列包含选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一，优选SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：
(a)分别为SEQ ID NO：90、91和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：106、107和108的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：103至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：115至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(b)分别为SEQ ID NO：90、91和92的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：106、107和108的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：105至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：116至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(c)分别为SEQ ID NO：93、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：109、110和111的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：103至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：115至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(d)分别为SEQ ID NO：94、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：16、21和22的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：104至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：115至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(e)分别为SEQ ID NO：121、122和123的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO：137、138和139的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：135至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：147至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(f)分别为SEQ ID NO：121、122和123的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO：137、138和139的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：136至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：146至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；
(g)分别为SEQ ID NO：124、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO：140、141和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：134至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：146至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；或
(h)分别为SEQ ID NO：125、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQID NO：140、141和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：135至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：147至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO：103的VH序列和SEQ ID NO：115的VL序列；
(b)SEQ ID NO：105的VH序列和SEQ ID NO：116的VL序列；
(c)SEQ ID NO：103的VH序列和SEQ ID NO：115的VL序列；
(d)SEQ ID NO：104的VH序列和SEQ ID NO：115的VL序列；
(e)SEQ ID NO：135的VH序列和SEQ ID NO：147的VL序列；
(f)SEQ ID NO：136的VH序列和SEQ ID NO：146的V序列；
(g)SEQ ID NO：134的VH序列和SEQ ID NO：146的VL序列；或
(h)SEQ ID NO：146的VH序列和SEQ ID NO：147的VL序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1 IgG1抗体，其包含分别为SEQ ID NO：121、122和123的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：137、138和139的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，和：(i)VH序列，其包含与SEQ ID NO：135至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：147至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；或(ii)VH序列，其包含与SEQ IDNO：136至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：146至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1 IgG1抗体，其包括：分别为SEQ ID NO：93、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：109、110和111的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：103至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：115至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1 IgG1抗体，其包含：分别为SEQ IDNO：93、95和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：109、110和111的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ ID NO：155至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：154至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1 IgG1抗体，其包含：分别为SEQ ID NO：121、122和123的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：137、138和139的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，和：(i)VH序列，其包含与SEQ ID NO：135至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：147至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；或(ii)VH序列，其包含与SEQID NO：136至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：146至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1 IgG1抗体，其包含：分别为SEQ ID NO：124、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：140、141和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；VH序列，其包含与SEQ ID NO：134至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和VL序列，其包含与SEQ ID NO：146至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明的药物组合包含PDL1抑制剂，其中所述PDL1抑制剂是抗PDL1 IgG1抗体，其包含：分别为SEQ ID NO：124、126和127的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：126、127和142的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；重链序列，其包含与SEQ ID NO：153至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列；和轻链序列，其包含与SEQ ID NO：152至少60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，优选至少90％相同的氨基酸序列。
在下文中，包含(a)本文定义的本发明的抗CD137抗体和(b)本文定义的PDL1抑制剂的药物组合将被称为“本发明的组合”。
增生性疾病的性质是多方面的。在某些情况下，可以组合具有不同作用机理的治疗剂。然而，仅考虑具有不同作用方式的治疗剂的任何组合并不一定导致有利效果的组合。已经发现，与每种单一疗法相比，施用本发明的组合具有改善的抗肿瘤活性，并且对于治疗增生性疾病，特别是癌症可能是有效的。在本发明中，与任一单一治疗剂相比，施用本发明的组合预期会产生更有益的效果，例如协同的或改善的抗增殖效果，例如就延迟进展或抑制增殖性疾病或其症状而言，但还会产生其他有益效果，例如副作用少，例如改善生活质量或发病率降低。
本发明的组合对于治疗或预防有此需要的受试者的增生性疾病特别有用。本发明的组合的治疗剂可以单独、同时或相继施用于有此需要的受试者。优选地，这些治疗剂以当组合时提供有益效果的治疗有效剂量施用。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的组合用于治疗或预防增生性疾病，特别是癌症。
一方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合。
一方面，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病(特别是癌症)的本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合。
另一方面，本发明涉及本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病(特别是癌症)中的用途。
另一方面，本发明涉及本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合在制备用于治疗有此需要的受试者的增生性疾病(特别是癌症)的药物中的用途。
一方面，本发明提供了一种治疗有此需要的受试者的增生性疾病(特别是癌症)的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可能是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病消退。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以引起对疾病的这种治疗的剂的量。“治疗有效量”将根据剂、疾病及其严重程度以及被治疗受试者的年龄、体重等而变化。
在一个实施方案中，增生性疾病是癌症。术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴***扩散到身体的其他部位。术语“肿瘤”和“癌症”在本文可互换使用，例如，两个术语均涵盖实体和液体(例如扩散或循环的)肿瘤。如本文所用，术语“癌”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。本文使用的术语“癌症”是指广泛的肿瘤，包括所有实体和血液恶性肿瘤。此类肿瘤的例子包括但不限于：良性或特别是恶性肿瘤、实体瘤、脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、腹部癌(例如胃肿瘤)、食道癌、卵巢癌、子***、结肠癌、直肠癌、***癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、***癌、甲状腺癌、黑素瘤(例如不可切除的或转移性黑素瘤)、肾细胞癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤或胃肠道癌尤其是结肠癌或结直肠腺瘤、头颈部肿瘤、子宫内膜癌、Cowden综合征、Lhermitte-Duclos病、Bannayan-Zonana综合征、***增生、赘生物尤其是上皮特征的赘生物优选乳癌癌或鳞状细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病(例如费城染色体阳性慢性骨髓性白血病)、急性淋巴细胞性白血病(例如费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病及其任意组合。在一个优选的实施方案中，癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，所述癌症是结直肠癌。
本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合抑制实体瘤的生长，但也抑制液体瘤的生长。在另一个实施方案中，增生性疾病是实体瘤。术语“实体瘤”尤其是指乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、***癌、腹部癌(尤其是胃癌)、子***、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)和头颈部肿瘤。此外，取决于肿瘤类型和所使用的特定组合，可以获得肿瘤体积的减小。本发明的抗体或本发明的组合物或本发明的组合还适合于预防患有癌症的受试者中的肿瘤的转移扩散和微转移瘤(micrometastases)的生长或发展。
术语“预防(preven)”或“预防(prevention)”是指完全抑制疾病的发展或疾病的任何继发作用。如本文所用，术语“预防”包括预防疾病或病况发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的个体中。
一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含本发明的抗体或本发明的药物组合物或本发明的组合。试剂盒可以包括一个或多个其他元件，包括：使用说明；其他试剂，例如标记，治疗剂或可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其他方式偶联的试剂，或放射防护组合物；用于制备用于施用的抗体分子的装置或其他材料；药学上可接受的载体；以及用于向受试者施用的装置或其他材料。在一个具体的实施方案中，试剂盒包含药学有效量的本发明的抗体。在另一个实施方案中，试剂盒包含药学有效量的冻干形式的本发明的抗体和稀释剂，以及任选地使用说明。所述试剂盒还可以包括用于重构的过滤针和用于注射的针。
表1.本发明的CD137抗体的实例(CDR残基以粗体和斜体字母显示)。
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表2.与本发明有关的其他序列。
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表3A.包含本发明的抗体的分子的实例。
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表3B：适用于本发明药物组合的PDL1抗体的实例(CDR残基以粗体和斜体字母显示)。
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在本申请的全文中，如果说明书的文本(例如，表1至表3)与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。
***
应当理解，为清楚起见在单独的实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合的形式提供。与本发明有关的实施方案的所有组合都被本发明特别地涵盖，并且在本文中公开，就好像每个组合都被单独地明确地公开了一样。另外，各种实施方案及其元素的所有子组合也被本发明特别地涵盖，并且在本文中公开，就好像每个这样的子组合都在本文中被单独地明确地公开了一样。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
在各自的专利法允许的范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用并入本文。
下列实施例举例说明了上述发明，但并不意图以任何方式限制本发明的范围。相关领域技术人员已知的其他测试模型也可以确定所要求保护的发明的有益效果。
实施例
针对人CD137的新型抗体
实施例1：针对人CD137的兔抗体的生成
已经用重组生产和纯化的人CD137细胞外结构域(Peprotech，货号310-15-1MG)对兔进行了免疫。在免疫过程中，通过确定多克隆血清抗体依旧能够与抗原产生可检测的结合的每只兔的血清的最大稀释度(滴度)，定性评估了针对抗原的体液免疫应答的强度。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)评估了针对固定化抗原(重组人CD137 ECD)的血清抗体滴度。所有免疫的兔都显示出非常高的滴度，为至少1：702’175稀释的血清。第一次抗原注射前来自相同兔的血清用作背景对照。
实施例2：命中物鉴定和选择。
在命中物鉴定程序中，开发了基于流式细胞术的分选方案，其特异性地检测高亲和力人CD137 ECD结合B细胞，并将其分离。为了鉴定结合CD137的B细胞，用荧光染料R-藻红蛋白(RPE)标记CD137 ECD。由于标记的CD137上的CD137L结合位点和抗CD137抗体的结合位点可能会被大体积的RPE标记物阻断，因此通过流式细胞术证实了抗原决定簇的可及性。将与人IgG1、urelumab、兔多克隆抗人CD137或山羊多克隆抗人CD137的Fc部分融合的CD137LECD捕获在蛋白G珠上，并通过流式细胞术确认了R-PE标记的CD137的结合。荧光强度与固定在珠上的CD137L结合的标记CD137的数量成正比。发现CD137与CD137L和抗CD137抗体的结合，同时未检测到RPE标记的CD137与英夫利昔单抗(Infliximab)的结合。
筛选：
在筛选阶段获得的结果是基于用来自抗体分泌细胞(ASC)的培养物上清液的未纯化抗体进行的测定，因为高通量培养的规模不允许纯化单个兔抗体。这些上清液允许将大量抗体相对于彼此进行排序，但除了结合亲和力之外不提供绝对值。在至少四个星期的过程中，从每个单独培养的克隆中收集上清液。在培养期结束时，在高通量ELISA中表征每种细胞培养上清液中的兔单克隆抗体对重组人CD137 ECD的结合。进一步表征结合CD137的上清液对人和食蟹猴CD137的结合动力学。另外，通过竞争ELISA确定了CD137与CD137L以及与urelumab相互作用的中和潜力。还评估了与稳定转导的Jurkat细胞上表达的膜CD137的结合。通过直接ELISA分析上清液的小鼠CD137结合潜力，并且仅测定阳性上清液的结合动力学。
直接ELISA
通过添加50μl含有250ng/ml人CD137(Peprotech，货号310-15-1MG)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％Tween20)洗涤3次，并向每个孔中加入270μl阻断缓冲液(PBS，1％BSA，0.2％Tween 20)，在室温下在不振荡的情况下放置1小时。然后，将板以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次，每种上清液加入50μl，将板在室温下轻轻搅拌孵育1.5小时。以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次后，向每个孔中添加1：5,000稀释在阻断缓冲液中的50μl的HRP偶联的山羊抗兔IgG抗体。在室温下在nutating混合器上孵育1h后，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液洗涤三次，然后添加50μl TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。显影5至10分钟后，通过每孔加入50μl1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参考波长在450nm读板。
SPR测定的对hCD137的亲和力
使用MASS-1SPR仪器(Sierra Sensors)通过SPR测量抗体对人CD137的结合亲和力。对于亲和力筛选，使用标准胺偶联程序将对兔IgG的Fc区特异性的抗体(BethylLaboratories，货号A120-111A)固定在传感器芯片(MASS-1Affinity Sensor,HighCapacity Amine,Sierra Sensors)上。B-细胞上清液中的兔单克隆抗体被固定的抗兔IgG抗体捕获。B细胞上清液中的IgG最低浓度要求足以捕获。捕获单克隆抗体后，将人CD137ECD(Peprotech，货号310-15-1MG)以90nM的浓度注入流动池中3分钟，然后使蛋白质从传感器芯片上捕获的IgG中解离5分钟。每个注射循环后，两次注射10mM甘氨酸-HCl使表面再生。使用MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)使用一对一Langmuir结合模型计算表观解离速率常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)，并根据相对Chi2(将Chi2标准化为分析物的外推最大结合水平)监控拟合质量，其中相对Chi2是对曲线拟合质量的度量。Chi2的值越小，对一对一Langmuir结合模型的拟合越准确。对于大多数命中物，相对Chi2值低于15％。如果配体结合的响应单位(RU)是抗体捕获的RU的至少2％，则认为结果有效。配体结合的RU少于2％的抗体捕获的RU的样品被认为CD137与捕获的抗体没有特异性结合。
CD137/CD137L竞争ELISA
通过添加50μl含有50ng/ml CD137 Fc嵌合体(R&D Systems，货号838-4B-100)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％吐温20)洗涤3次，并向每个孔中加入300μl阻断缓冲液(含有1％BSA和0.2吐温20的PBS)，在室温下在nutating混合器上放置1小时。然后，将阳性对照(中和性山羊抗CD137抗体)在第38类的100％阴性上清液中稀释，并将50μl的中和性抗体加入到结合板的相应孔中。另外，将50μl阳性命中物的上清液转移至结合板，并在室温下振荡孵育1小时。然后，将ELISA板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液洗涤3次，然后向孔中加入50μl的在阻断缓冲液中稀释的20ng/ml生物素化的重组人CD137配体(Acro Biosystem，货号41L-H5257)。在室温下振荡孵育1h后，将ELISA板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液洗涤三次。然后，向ELISA板的每个孔中加入50μl的稀释在阻断缓冲液中的10ng/ml链霉亲和素-poly-HRP。在室温孵育1小时后，将板用450μl洗涤缓冲液洗涤3次，并在添加50μl TMB后显影5至10分钟。最后，通过加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参考波长在450nm读板。
通过SPR测定的物种特异性：食蟹猴
还确定了与食蟹猴CD137的结合动力学，使用了与针对与人CD137的结合所描述的相同的SPR设置，但是用食蟹猴CD137 ECD(Acro Biosystem，货号41B-C52H4)代替人CD137ECD。
Urelumab竞争ELISA
通过添加50μl含有2μg/ml urelumab(由Evitria，Schlieren，Switzerland生产)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％Tween 20)洗涤3次，并向每个孔中加入300μl阻断缓冲液(含有1％BSA和0.2吐温20的PBS)，在室温下在nutating混合器上放置1小时。然后，将urelumab稀释于95％的第38类的阴性上清液(其加标5％生物素化的CD137 ECD(Peprotech，货号310-15-1MG)(7.5ng/ml)并预孵育1小时)，然后添加到结合板的相应孔中。另外，也将55μl阳性命中物的上清液加标5％生物素化的CD137 ECD(7.5ng/ml)并预孵育1小时，转移至结合板，并在室温下振荡孵育1小时。接下来，将ELISA板以溢流模式用每孔450μl洗涤缓冲液洗涤三次。然后，向ELISA板的每个孔中加入50μl的稀释在阻断缓冲液中的10ng/ml链霉亲和素-poly-HRP。在室温孵育1小时后，将板用450μl洗涤缓冲液洗涤3次，并在添加50μl TMB后显影5至10分钟。最后，通过加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参考波长在450nm读板。
通过FC进行基于细胞的结合测定：人CD137
方法：收获Jurkat野生型(不表达CD137的对照细胞)和Jurkat CD137细胞(克隆C6、1)，并确定细胞数。将细胞悬液以400xg离心5分钟，然后非结合平板中的指定孔中添加40μl在PBS-EB(1x DPBS，2％BCS H.I.，2mM EDTA)中稀释的细胞悬液(40,000个细胞)。根据板布局，将来自第38类的阳性命中物的上清液直接转移到96孔板中。将阳性对照样品(urelumab)在PBS-EB中稀释并转移到板上，最终样品为95％的第38类的阴性上清液。在4℃孵育1小时后，将板用100μl的PBS-EB洗涤3次。然后，将细胞沉淀物用50μl二抗溶液以2μg/ml的浓度重悬(对于B细胞克隆：AF647标记的山羊抗兔IgG；对于urelumab：PE标记的山羊抗人IgG PE)，并在4℃下孵育1小时。接下来，将细胞再次用100μl的PBS-EB洗涤3次。然后将细胞沉淀用50μl PBS-EB重悬，并用NovoCyte 2060流式细胞仪进行分析。记录每个样品的20,000个事件的PE和AF647的荧光强度，并计算荧光强度MFI的几何平均值。首先针对非特异性抗体结合(空白和Jurkat野生型细胞结合)校正数据，然后将其标准化为urelumab获得的结合水平。
直接ELISA小鼠CD137
通过添加50μl含有250ng/ml小鼠CD137(Acro Biosystem，货号41B-M52H7)的PBS将ELISA板在4℃下包被过夜。第二天，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液(PBS，0.005％Tween 20)洗涤3次，并向每个孔中加入270μl阻断缓冲液(PBS，1％BSA，0.2％Tween20)，在室温下在不振荡的情况下放置1小时。然后，将板以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次，每种上清液加入50μl，将板在室温下轻轻搅拌孵育1.5小时。以溢流模式用300μl洗涤缓冲液洗涤3次后，向每个孔中添加1：5,000稀释在阻断缓冲液中的50μl的HRP偶联的山羊抗兔IgG抗体。在室温下在nutating混合器上孵育1h后，将板以溢流模式用每孔300μl洗涤缓冲液洗涤三次，然后添加50μl TMB。显影5至10分钟后，通过每孔加入50μl 1M HCl终止酶促反应，并以690nm为参考波长在450nm读板。在该测定中，来自85B细胞克隆的上清液产生了明显高于背景的信号(>0.1OD)。
通过SPR测定的物种特异性：小鼠
还确定了与小鼠CD137的结合动力学，使用了与针对与人CD137的结合所描述的相同的设置，但在这种情况下，用小鼠CD137 ECD(Acro Biosystem，货号41B-M52H7)代替人CD137 ECD。
筛选命中的选择
表4列出了B细胞上清液中最终克隆的单克隆抗体的药理特性。在下一步中，使用选定的克隆进行RNA分离和RT-PCR，以扩增兔抗体轻链和重链可变区(38-02-A04和38-27-C05)的序列。
实施例3：选择克隆进行人源化
根据命中物筛选期间获得的数据，通过将CDR移植到基于VH4或VH3的框架上，将2种小鼠交叉反应性CD137结合物38-02-A04和38-27-C05人源化，并将其与抗PDL1结构域一起完成scDb形式。另外，还将所选克隆的CDR区移植到基于VH3的框架上并生产为scFv形式。为了获得最佳的亲和力和效力，用两个不同的结构移植物(STR和IF移植)对一个作为scDb对人CD137表现出最佳亲和力的克隆进行了进一步优化，即38-02-A04。
将以下移植变体应用于克隆38-02-A04：CDR移植–将兔CDR移植到人框架上；IF移植–CDR移植加上所有兔VL/VH界面(interface)残基的移植；完整移植–CDR移植加上遵循AHo人性化方案的框架残基(AIF残基(可能与抗原接触的兔残基(根据AHo))仅限于界面形成后溶剂可及性变化>20％的残基，以减少突变总数(兔框架残疾))。变体38-02-A04 sc09和38-02-A04 sc13都是基于VH3框架上的CDR移植物，其中38-02-A04 sc13包含VH上的G51C突变(AHo编号)和VL链上的T141C突变(AHo编号)，导致在框架区内形成人工结构域间二硫键。令人惊讶地发现，包含结构域间二硫键的38-02-A04sc13具有显著提高的热稳定性。
通过小规模诱导过夜表达，作为不溶性包涵体在大肠杆菌中进行了蛋白质的异源表达(如下表5所示)。通过离心方案从均质化的细胞沉淀中分离包涵体，该离心方案包括几个洗涤步骤以去除细胞碎片和其他宿主细胞杂质。将纯化的包涵体溶解于变性缓冲液中，并通过可扩展的重折叠方案使scFv重折叠，产生毫克量的天然折叠的单体scFv。在这一点上，采用标准化方案纯化scFv。通过亲和层析捕获重折叠后的产物，得到纯化的scFv。表5总结了scFv分子的制备。使用CHOgro瞬时转染试剂盒(Mirus)在CHO-S细胞中进行哺乳动物构建体的表达。在37℃下表达5-7天(细胞活力<70％)后，通过离心收获培养物，并通过蛋白质L亲和色谱法从澄清的培养上清液中纯化蛋白，如果需要，接下来通过尺寸排阻色谱法进行精炼步骤。对于所制备的材料的质量控制，使用了标准分析方法，例如SE-HPLC、UV280和SDS-PAGE。
实施例4：人源化scFv的药效学表征
4.1对人CD137的亲和力
在T200设备(Biacore，GE Healthcare)上通过SPR分析确定了人源化scFv对人CD137的亲和力。在该实验中，使用GE Healthcare的Human Antibody Capture试剂盒(货号BR-1008-39)捕获了Fc标记的人CD137(R&D Systems，货号838-4B-100)。在每个分析物注入循环后，将抗人Fc特异性IgG再生并捕获新抗原。使用相对于捕获的CD137的剂量响应多循环动力学测定法将scFv作为分析物注入，其中分析物的浓度范围为0.19至45nM(三倍稀释步进)，稀释于运行缓冲液中。缔合和解离时间分别设置为300s和720s。使用1：1结合模型拟合获得的传感图。数据示于表6。
4.2物种交叉反应(通过SPR测定的与食蟹猴和小鼠CD137的结合)
用食蟹猴Fc标记的CD137(R&D Systems，货号9324-4B-100)以与用于测量与人CD137的结合的相似测定法测量了与食蟹猴CD137的交叉反应性。表7总结了所有测试的scFv的亲和力。
因为在同系小鼠癌症模型中测试抗体需要与小鼠CD137有交叉反应性，所以对基于为了直接人源化的克隆选择产生的scFv测试了与小鼠CD137的结合。用小鼠Fc标记的小鼠CD137(R&D Systems，货号937-4B-050)以与用于测量与人CD137的结合的相似测定法测量了与小鼠CD137的交叉反应性。表8总结了所有测试的scFv的亲和力。
4.3通过竞争ELISA测定的CD137/CD137L相互作用的中和
为了显示抗人CD137 scFv不会干扰CD137L与CD137的结合，采用了竞争性ELISA。使用商业抑制性多克隆抗CD137山羊抗体(Anti-bodies online,Cat#ABIN636609)作为参考。关于实验设置，将50ng/ml的人CD137(用Fc标记，R&D Systems，货号838-4B-100)在ELISA板上包被过夜，并向ELISA板中加入scFv的三倍步进的系列稀释液，从50μg/ml开始。之后，添加生物素化的CD137L(CD137L的内部生物素化，Acro Biosystem，货号41L-H5257)，并通过添加链霉亲和素-HRP检测结合的配体。最后，添加了HRP底物TMB。显影5分钟后，用1MHCl溶液终止反应。在450nm和690nm处测量吸光度作为参考波长。数据示于表9。基于38-02-A04克隆的scFv未阻断CD137/CD137L相互作用。
4.4通过流式细胞术确定的与人CD137表达细胞的结合
还确定了所选scFv与人CD137表达细胞的结合效力亲和力。将50,000个表达CD137的Jurkat细胞(或作为参照细胞系的Jurkat NFAT)分配到圆底非组织培养处理的96孔板中。通过以400x g离心5分钟，将细胞用100μl PBS洗涤两次。将细胞重悬于100μl的测试scFv以及对照IgG urelumab的五倍步进的系列稀释液中，该系列稀释液是在染色缓冲液(PBS，2％BCS热灭活，2mM EDTA)中制备的，浓度范围为10,000至0.64ng/ml(对于scFv：从381.19至0.02nM)。在nutating混合器上于4℃孵育1小时后，将细胞用100μl染色缓冲液洗涤3次，并以400x g离心5分钟。然后，将用scFv处理过的细胞重悬于100μl含0.5μg/ml APC标记的蛋白质-L的染色缓冲液中，并将用urelumab(人IgG4)处理过的细胞重悬于100μl含2μg/ml APC标记的山羊抗人IgG的染色缓冲液中。将板在nutating混合器上于4℃孵育1小时，然后用100μl染色缓冲液洗涤3次，然后重悬于最终体积为50μl的染色缓冲液中。最后，使用Novocyte流式细胞仪***(ACEA Bioscience)通过流式细胞术分析每孔20,000个事件的APC信号。将每个板上的单个IC50值用在每个板上一起采集的参考分子urelumab的IC50进行校准(相对EC50：EC50,urelumab/EC50，测试scFv)。
如表10中总结的，对于基于38-02-A04克隆的scFv，可以确认与CD137表达细胞的结合。
4.5通过SPR测试的对CD137对CD40和OX40的选择性
除了对食蟹猴CD137的交叉反应性之外，还需要抗人CD137 scFv与人CD137结合而不与TNFR超家族的其他成员(如CD40和OX40)结合的选择性。因此，测试了选择的scFv与人CD40和OX40的结合。在T200设备(Biacore，GE Healthcare)上通过SPR分析确定了scFv与人Fc标记的CD40(AcroBiosystems，货号CD0-H5253)和人Fc标记的OX40(Acro-Biosystems，货号OX0-H5255)的结合。在该实验中，使用GE Healthcare的Antibody Capture试剂盒捕(货号BR-1008-39)获了Fc标记的CD40和OX40。在每个分析物注入循环后，将抗人Fc特异性IgG再生并捕获新抗原。将scFv作为分析物注入，使用在运行缓冲液中稀释的高浓度180nM分析物。缔合和解离时间分别设置为300s和720s。使用1：1结合模型拟合获得的传感图。如表11中总结的，对于基于38-02-A04克隆的scFv，未观察到与人Fc标记的CD40或人Fc标记的OX40的结合。
Figure BDA0002440959240001191
表6.scFv对人CD137的亲和力。
Figure BDA0002440959240001201
表7.scFv对食蟹猴CD137的亲和力
Figure BDA0002440959240001202
表8.scFv对小鼠CD137的亲和力
Figure BDA0002440959240001211
表9.所选scFv抑制CD137和CD137L之间相互作用的效力。
Figure BDA0002440959240001212
表10.测试scFv对细胞CD137结合亲和力的总结。
Figure BDA0002440959240001221
表11.通过SPR测试ScFv与人CD40和OX40的结合。
Figure BDA0002440959240001222
实施例5：人源化scFv的生物物理表征
以更大规模生产所选择的分子(0.2L-1.2L表达体积)，纯化后使用离心浓缩管浓缩至>10mg/mL(表14)。
对scFv进行稳定性研究，例如为期四周的稳定性研究，其中将scFv以10mg/ml配制在水性缓冲液(含有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸盐缓冲液，pH 6.4)中，并在<-80℃、4℃和40℃储存四周。至少在每次研究的一周、两周和结束后，通过SE-HPLC峰面积的积分来评估制剂中单体和低聚物的比例。对于一些分子，记录了额外时间点。表15比较了研究的第7天和第28天得出的终点测量值。
此外，还针对冷冻-融化(F/T)循环评估了scFv分子的相容性(胶体稳定性)。为了进行F/T稳定性评估，采用与存储稳定性研究(SE-HPLC，SDS-PAGE)相同的分析方法和参数(单体含量％和单体损失％)来监测分子随着五个F/T循环的质量。表16示出了随着五个重复F/T循环的单体含量损失(％)。重复F/T循环后，没有一个分子的单体含量损失>4％。
通过使用荧光染料SYPRO orange评估了分子的热解折叠。制备了相关赋形剂条件下的样品，并在qPCR仪中进行了测定。使用该软件的自定义染料校准程序检测了荧光发射。将包含测试样品的PCR板以1℃的递增量进行从25℃到96℃的温度变化。通过GraphPadPrism软件使用数学二阶导数方法计算曲线的拐点来计算解折叠转变的中点(Tm)。报告的Tm是三个测量值的平均值。表17显示了在通用缓冲液(pH 6.4的柠檬酸磷酸盐缓冲液，150mM NaCl)中配制的分子的解链温度。
挑选出的最高分子进行短期pH应力稳定性研究，其中将scFv分子以1mg/ml配制在一组pH值在3.5和7.5之间的水性(柠檬酸)缓冲体系中。在各自的缓冲***中于40℃储存2周后，分析了单体含量(％)和单体损失％(数据未显示)。表18示出了研究过程中单体含量、单体损失、浓度和浓度损失的列表总结。
Figure BDA0002440959240001241
表14.在28天的时间内对F/T稳定性的评估。
Figure BDA0002440959240001251
*F/T后的单体损失％
表15.scFv结构域的差示扫描荧光法。
Figure BDA0002440959240001252
表16.pH稳定性评估的表格总结。
Figure BDA0002440959240001253
包含本发明抗体的多特异性分子
表3包括了包含本发明抗体的示例性多特异性分子。
实施例6：对PDL1、CD137、HSA和MSA的亲和力。
方法：
使用Biacore T200设备(GE Healthcare)通过SPR测量确定了对不同物种的PDL1的亲和力。通过胺偶联将对人IgG的Fc区具有特异性的抗体固定在传感器芯片(CM5传感器芯片，GE Healthcare)上。对于所有形式，除了含有Fc的Morrison形式之外，固定抗体均捕获了不同物种的PDL1-Fc嵌合蛋白。将对PDL1具有特异性的分子的三倍系列稀释液(0.12-90nM)注入流动池中三分钟，并监测解离10分钟。每个注射循环后，用一次注射3M MgCl2溶液使表面再生。使用一对一的Langmuir结合模型计算表观解离常数(kd)和缔合速率常数(ka)以及表观解离平衡常数(KD)。使用与PDL1相同的设置(除了不同物种的CD137-Fc嵌合蛋白被固定抗体捕获)确定对不同物种的CD137的亲和力。
含Fc的形式被对人IgG的Fc区具有特异性的抗体直接捕获。测试了PDL1细胞外结构域或CD137细胞外结构域(范围从90到0.35nM)的两倍系列稀释液与生物传感器芯片上捕获的IgG的结合。每个注射循环后，用一次注射3M MgCl2溶液使表面再生。
使用Biacore T200设备(GE Healthcare)通过SPR测量确定了分子与不同物种的血清白蛋白(SA)的亲和力。使用胺偶联化学试剂将SA直接偶联至CM5传感器芯片(GEHealthcare)。在执行再生搜索和表面性能测试以找到最佳测定条件后，测量剂量响应，并将获得的结合曲线进行双参考(空参考通道和零分析物进样)并使用1：1Langmuir模型拟合以获取动力学参数。该测定在pH 5.5的1X PBS-Tween缓冲液中进行。
结果：
对衍生自克隆38-02-A04和38-27-C05的两个CD137特异性人源化构建体的CDR移植物的结合动力学的测量显示出了几乎相同的亲和力(比较表17中的PRO885和PRO951)。对于克隆38-02-04，移植到框架区中的所述结构残基导致亲和力提高超过200倍(比较表17中的PRO885和PRO1124)。另外，对于衍生自克隆38-02-04的构建体，观察到与小鼠CD137的结合，但是亲和力大大降低。
Figure BDA0002440959240001281
Figure BDA0002440959240001291
实施例7：人源化抗CD137结构域不抑制CD137和CD137中和作用。
为了证明PRO885不会干扰CD137配体(CD137L)与CD137的结合，采用了竞争性ELISA。使用商业抑制性多克隆抗CD137山羊抗体(Antibodies online,Cat#ABIN636609)作为参考。简而言之，将CD137在ELISA板上包被过夜，并向ELISA板添加PRO885的系列稀释液。之后，添加生物素化的CD137L，并通过添加链霉亲和素-HRP检测结合的配体。最后，添加了HRP底物TMB。显影5分钟后，用1M HCl溶液终止反应。在450nm和690nm处测量吸光度作为参考。
在图1A中表示了含有来自克隆38-02-A04的CD137结构域的PRO885所获得的滴定曲线，在图1B中表示了含有来自克隆38-27-C05的CD137结构域的PRO951所获得的结合曲线。尽管参考抗体完全阻止了CD137L与CD137的结合，但是PRO885和PRO951并未显著抑制CD137L与CD137的结合，因此被定义为非中和性的。
实施例8：38-02-A04和38-27-C05针对urelumab和Utolimumab的表位鉴定。
使用MASS-1设备(Sierra Sensors)，在SPR表位鉴定测定中比较了蛋白质PRO885(包含38-02-A04 CDR移植物的scDb)、PRO951(包含38-27-C05 CDR移植物的scDb)和urelumab(BMS)和utomilumab(Pfizer)在CD137上的结合表位。选择了一种三明治设置，以检查这些分子是否阻断彼此与CD137的结合。因此，将PRO885和PRO951固定在高容量的胺传感器芯片(HCA，Sierra Sensors)上。然后，在scDb上捕获90nM的抗原CD137，然后立即注射22.5nM的第二种抗体(PRO885、PRO951、urelumab和utolimumab)。确定每种蛋白质上的CD137捕获水平和第二种结合物应答水平(应答单位，RU)。通过计算理论最大应答(Rmax)(这取决于所涉及的蛋白质的分子量和捕获水平)，确定了捕获的抗原上的蛋白质的相对结合水平(％)。如果分子结合CD137上的重叠或相似表位，则不应观察到注射到捕获的CD137上的抗体的结合。因此，当观察到抗体结合时，两个抗体对结合非重叠的表位。
当将PRO885固定在传感器芯片上时，所有3种抗体PRO951、urelumab和utomilumab均显示出与PRO885捕获的CD137的结合。如所预期的，未观察到与用作对照的PRO885的结合(图2和图3)。当将PRO951固定在传感器芯片上时，urelumab和PRO885显示出结合，而用作对照的utomilumab和PRO951没有显示出任何显著结合(图2和图3)。这些结果表明，源自克隆38-02-A04的PRO885结合的CD137上的表位与urelumab、utolimumab和源自38-27-C05的PRO951不同。相反，PRO951结合的表位与utolimumab重叠，但不与urelumab和PRO885重叠。
实施例9：通过使用表达CD137的转基因NFkB Jurkat报告细胞系的基于细胞的测定对抗PDL1xCD137分子的CD137激动作用的评估。
在该测定中，评估了Jurkat细胞中CD137信号传导的激活。通过测量Jurkat报告细胞系中，由CD137诱导的NFkB活化所驱动的荧光素酶表达来报告CD137信号传导的活性。荧光素酶的表达与CD137的活性直接相关。而且，随后在Jurkat细胞和表达PDL1的细胞系之间形成免疫突触会促进激活信号传导途径所需的CD137的聚集。因此，报告细胞系上CD137的聚集和激活需要PDL1表达。
将表达PDL1的CHO(克隆A2)和HCC827细胞(这些细胞未受刺激，或用10ng/ml IFNγ刺激24小时以增加PDL1表达)接种于96孔培养板上，每孔25,000个细胞。作为阴性对照，将没有PDL1表达的CHO WT细胞以相同的细胞密度接种。然后，制备抗-PDL1xCD137分子以及竞争剂urelumab的系列稀释液，并将其添加到细胞。接下来，在含有或不含25mg/ml HSA的测定培养基中制备Jurkat报告细胞，并以每孔40,000个细胞的细胞密度添加。添加Jurkat细胞后6或24小时，通过添加荧光素酶试剂来检测荧光素酶的表达，并由发光读取器读取。通过将测试样品的相对发光单位(RLU)相对于urelumab(图11A)或PRO885(图11B)测得的RLU进行标准化来分析数据，从而得到CD137信号传导的相对激活值。
结果
I.使用CHO-PDL1细胞测试PRO885和PRO951：
如图5所示，在存在表达PDL1的CHO细胞的情况下，PRO885和PRO951比urelumab更有效地激活CD137信号传导。PRO885表现出最好的效力和最高的激活信号(PRO885，EC50＝11.72ng/ml，PRO951：EC50＝33.68ng/ml；urelumab：EC50＝79.11ng/ml，表18)。在不存在PDL1的情况下，PRO885和PRO951均不能在报告细胞中激活CD137，而urelumab则显示出与PDL1无关的CD137信号传导的激活。
表18.使用CHO-PDL1细胞测定抗PDL1xCD137分子的EC50值。
Figure BDA0002440959240001321
II.使用CHO-PDL1细胞测试STR移植的scDb：
如图6和表21所示，抗PDL1xCD137 scDb分子比urelumab更有效地刺激CD137信号传导。与urelumab相反，仅当存在表达PDL1的靶细胞时，才发现了scDb的刺激作用。在高水平表达PDL1的CHO细胞的存在下，所有scDb均具有相同的刺激NFkB报告基因激活的能力。接下来，在表达较少量的PDL1的细胞的存在下，测试了相同的分子。
III.在没有IFNy的情况下使用HCC827细胞测试STR移植的scDb：
如图7和表20所示，抗PDL1xCD137 scDb分子比urelumab更有效地刺激CD137信号传导。与CDR移植的CD137结构域相比，具有亲和力改善的CD137结构域的scDb(38-02-A04、PRO1120和PRO1124的STR移植物)在CD137激活方面显示出更高的效力(例如，PRO885，EC50＝13.02ng/ml，PRO1124：EC50＝5.62ng/ml，表22)。值得注意的是，与亲本分子PRO885相比，对PDL1的亲和力增加也会导致效力增加，如PDL1结构域的STR移植物(PRO1126)所发现的(PRO885，EC50＝13.02ng/ml，PRO1126：EC50＝6.97ng/ml，表20)。在高浓度下，STR移植的scDb显示出降低激活信号的趋势。这对于具有STR移植的CD137结构域的分子(PRO1120和PRO1126)更为明显。有趣的是，当将PDL1结构域的STR移植物与CD137的CDR移植物结合时，未观察到高浓度下的信号下降(比较图7中的PRO885和PRO1124)。因此，随着对CD137和PDL1亲和力的增强，效力略有增加。随着对CD137亲和力的增加，高浓度下的信号降低(钟形曲线)更加明显，而对PDL1的亲和力的增加却对此效果无影响。因此，对于延长最大活性的浓度窗口而言，对CD137和PDL1的亲和力之比似乎至关重要，而不是每个结构域的绝对亲和力。
Figure BDA0002440959240001341
IV.在具有IFNγ的情况下使用HCC827细胞测试STR移植的scDb：
用IFNγ刺激HCC827会导致激活信号增加，而不改变scDb分子的效力。值得注意的是，在这种情况下，高浓度下测试scDb的信号下降不太明显，表明与PDL1表达相关(图8和表21)。
V.使用CHO-PDL1细胞测试长半衰期分子：
如图11和图12以及表22和23所示，测试的长半衰期抗PDL1xCD137分子刺激CD137信号传导的程度与urelumab相同。将Morrison形式(PRO1060、PRO1062)与scDb-scFv形式(PRO1057、PRO1058)进行比较时，存在差异。尽管Morrison形式显示出更高的效力，但在测试scDb-scFv时，最大激活信号却大大增加了。值得注意的是，孵育24小时后，PRO1057显示出明显的高激活信号。所有测试的长半衰期分子仅在表达PDL1的细胞的存在下才激活CD137信号传导。有趣的是，尽管对两个靶标的亲和力相似，但PRO1057的最大信号却比PRO1058高得多。而且，单价scDb-scFv PRO1057显示出比相应的二价Morrison形式PRO1060更强的激活作用。
VI.在没有和具有IFNy的情况下，使用HCC827细胞测试长半衰期分子
如图11和表24所示，在表达较低量的PDL1的细胞的存在下，测试的长半衰期抗PDL1xCD137分子刺激CD137信号传导的程度与urelumab相同。当目标细胞受到IFNγ刺激时，测试分子的最大激活进一步增加，表明CD137激活与靶细胞上的PDL1表达水平直接相关。如上所述，与Morrison形式相比，PRO1057显示出更高水平的报告基因激活。
PDL1 x CD137多特异性构建体激活NFkB报告基因的数据总结于表26和27中。
实施例10：使用人PBMC和表达PDL1的转基因CHO细胞在基于细胞的测定中对同时发生的PDL1阻断和CD137刺激的T细胞刺激作用的评估。
将表达PDL1的CHO-A2细胞以三种不同的密度(每孔50,000至200,000个细胞)接种到用抗人CD3抗体预先包被的96孔培养板上。将板在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，通过密度梯度离心从新鲜的人全血中分离出外周血单核细胞(PBMC)。向96孔板中每孔添加100,000个PBMC，然后以500、50和5ng/ml的浓度添加抗PDL1xCD137 scDb PRO885。孵育76小时后，收获细胞上清液。根据试剂盒说明书，使用BioLegend的IL-2人ELISA MAX测定法对培养上清液中的人白细胞介素2(IL-2)水平进行定量。从IL-2标准曲线内插IL-2浓度，反算并针对PRO885浓度作图以计算EC50值。
如图12所示，在通过加入双特异性分子PRO885而同时阻断PD-1/PDL1相互作用和刺激CD137之后，T细胞分泌IL-2。分泌的IL-2水平随着抗CD3抗体和CHO-A2细胞密度的增加以及PRO885浓度的增加而增加。在不存在抗CD3抗体的情况下，IL-2水平与基础IL-2分泌相当。PRO885仅激活被抗CD3抗体共同刺激的T细胞。该发现证明，PRO885仅刺激活化的T细胞，并表明，体内PRO885会特异性地刺激肿瘤特异性T细胞。
Figure BDA0002440959240001371
Figure BDA0002440959240001381
表25.用PRO885处理后，T细胞诱导IL-2分泌。
Figure BDA0002440959240001391
Figure BDA0002440959240001401
Figure BDA0002440959240001411
实施例11：使用超抗原SEA刺激的人PBMC在基于细胞的测定中对同时发生的PDL1阻断和CD137刺激的刺激作用的评估。
在该实验中，评估了PD-1/PDL1抑制和CD137激动的协同作用。该测定法使用了的外周血单核细胞(PBMC)，该外周血单核细胞(PBMC)经超抗原葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA)刺激，以分别诱导PDL1在抗原呈递细胞(APC)和T细胞上的表达以及CD137在T细胞上的表达。通过应用抗PDL1xCD137分子，同时靶向两个T细胞调节信号传导途径：通过双特异性抗PDL1xCD137分子(PRO885)介导的免疫突触的形成来抑制抑制性PD-1/PDL1途径以及激活CD137途径。通过白介素2(IL-2)的分泌评估T细胞的活化，并与基准参考抗体阿维鲁单抗介导的PDL1抑制介导的效应进行比较。此外，在相同的实验设置中测试了抗PDL1 scFv PRO997，并将其与阿维鲁单抗进行了比较。
通过密度梯度离心从新鲜的人全血中分离出外周血单核细胞(PBMC)。然后，使用抗CD56抗体和MACS细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)去除PBMC中的NK细胞。接下来，向96孔板中每孔添加100,000个PBMC，然后添加PRO885、PRO997和阿维鲁单抗在测定缓冲液(含有浓度为10ng/ml的SEA)中的系列稀释液。在37℃和5％CO2下孵育96小时后，收集细胞上清液，并根据试剂盒说明，使用BioLegend的IL-2人ELISA MAX测定法定量培养上清液中的人白细胞介素2(IL-2)水平。从IL-2标准曲线内插IL-2浓度，反算并针对阿维鲁单抗和PRO885浓度作图以计算EC50值。
如图13所示，在通过加入双特异性分子PRO885而同时阻断PD-1/PDL1相互作用和刺激CD137之后，T细胞分泌IL-2。与阿维鲁单抗相比，PRO885显示出更高的T细胞活化和更好的效力(PRO885，EC50＝39.92ng/ml；阿维鲁单抗，EC50＝69.89ng/ml，表31)。该发现表明，与仅用阿维鲁单抗阻断PDL1相比，双特异性抗PDL1xCD137 scDb PRO885能够诱导更强的T细胞刺激。此外，发现高亲和力的抗PDL1 scFv PRO997在刺激T细胞方面比阿维鲁单抗更有效(PRO997，EC50＝40.86ng/ml；阿维鲁单抗，EC50＝90.18ng/ml，表28)。
表28.使用SEA刺激在PBMC分析中测定PRO885和PRO997的EC50值。
Figure BDA0002440959240001431
实施例12：在人细胞系来源的肺癌异种移植模型HCC827中对抗CD137抗体的抗肿瘤功效的评估。
使用来自Taconic的免疫缺陷NOG小鼠品系和同种异体人外周血单核细胞，在人HCC827 NSCLC异种移植物中评估了抗CD137抗体PRO1138的抗肿瘤活性。植入的人T淋巴细胞对外来的主要组织相容性(MHC)I和II类以及来自小鼠细胞的其他抗原显示出外来反应性(xeno-reactivity)。结果，T淋巴细胞在不同器官中引起炎性浸润，几周后导致动物死亡，这一过程被称为异种移植物抗宿主病(xGVHD)。已证明用抗PDL1和抗CD137等免疫调节抗体治疗会加剧xGVHD(Sanmamed MF等人Nivolumab and urelumab enhance antitumoractivity of human T lymphocytes engrafted in Rag2-/-IL2Rgnull immunodeficientmice.Cancer Res 2015；75(17):3466-3478)。
研究设置和治疗方案
雌性NOG小鼠接受单侧注射5x106个HCC827细胞。细胞以50％的PBS中的细胞悬浮液和50％的matrigel的混合物注射，总注射量为100μl。将肿瘤细胞注射到NOG小鼠中并成功植入肿瘤后(中位肿瘤体积为80-100mm3)，通过静脉注射用5x106个人PBMC替代小鼠。随机分组当天，将每组四只小鼠用供体A的PBMC重建，另四只小鼠用供体B的PBMC重建。在注射PBMC后1-2小时开始治疗，并按如下方式进行。
Figure BDA0002440959240001441
每周两次通过卡尺测量体重和肿瘤体积。根据研究结果，在规定的时间点处死动物。
除一只动物外，所有动物均在“相同”时间点(在第17天和第18天)处决。由于异种移植物抗宿主病(xGVHD)的发作，已经在第14天对一只动物实施了安乐死。由于生产能力原因，在第一天进行每组的前一半的样品收集和处理，在第二天进行每组的后一半的样品收集和处理。用来自两个不同供体的PBMC重建的动物在两个采样组中均具有相同的代表。
结果
使用免疫缺陷性NOG小鼠品系和同种异体人外周血单核细胞(hPBMC)，通过测量肿瘤体积评估了抗CD137 IgG4(PRO1138或urelumab)在人HCC827NSCLC异种移植物中的抗肿瘤活性(图14)。每周两次测量肿瘤体积，直到在第17天或第18天处死小鼠。将肿瘤体积相对于治疗开始时的肿瘤体积标准化(相对肿瘤体积)。如图14所示，与溶媒对照组或urelumab相比，用PRO1138(抗CD137 IgG4)单克隆抗体治疗显示出降低的肿瘤生长。值得注意的是，用PRO1138进行治疗并未导致中位体重降低，这暗示了该分子在所测试的剂量水平下被良好地耐受，而使用urelumab进行治疗导致治疗开始后17天中位体重降低(图15)。
实施例13：抗CD137抗体与抗PDL1抗体的联合治疗在移植有人脐带血来源的CD34+造血干细胞(UCB HSC)的NOG小鼠中的抗肿瘤功效的评估
使用植入了人脐带血来源的CD34+造血干细胞(UCB HSC)的NOG小鼠品系在人HCC827 NSCLC异种移植物中评估了本发明的抗CD137 IgG4(PRO1138，SEQ ID NO：88和89)与抗PDL1 IgG1(PRO1196，SEQ ID NO：154和155)的联合治疗的抗肿瘤活性。
研究设置和治疗方案
移植有人脐带血来源的CD34+造血干细胞(UCB HSC)的雌性NOG小鼠皮下注射HCC827 NSCLC细胞。小鼠接受单侧注射5x106个HCC827细胞。细胞注射以50％的PBS中的细胞悬浮液和50％的基底胶(matrigel)的混合物注射，总注射量为100μl。将肿瘤细胞注射到NOG小鼠中并成功植入肿瘤后(中位肿瘤体积为80-100mm3)，将小鼠(n＝10)随机分为治疗组：
Figure BDA0002440959240001451
每周两次通过卡尺测量体重和肿瘤体积。
结果
通过测量肿瘤体积评估了本发明的抗CD137抗体与PDL1抑制剂的组合(PRO1138与PRO1196的组合)的抗肿瘤活性(图16至18)。每周两次测量肿瘤体积，直到在第25、29或30天处死小鼠。将肿瘤体积相对于治疗开始时的肿瘤体积标准化(相对肿瘤体积，RTV)。如图16至18所示，PRO1138与PRO1196的组合产生了协同作用并清楚地稳定了肿瘤的生长。与单药治疗相比，联合治疗导致了更强的肿瘤生长减少。所有统计数据均使用GraphPad Prism版本6计算。使用单向ANOVA测试采用Bonferroni校正确定统计显著性。图表显示95％CI(置信区间)的平均值。
实施例14：在同系MC38结肠癌模型中对PDL1阻断和同时发生的CD137的局部刺激的抗肿瘤功效的评估。
另外，将在具有完整免疫***的同系C57BL/6小鼠的MC38结肠癌模型中测试本发明的多特异性抗体的抗肿瘤活性。其他人已经使用过该模型，通过用CD137激动剂和PD-1/PDL1拮抗剂进行联合治疗，显示出增强的抗肿瘤活性(Chen S等人Combination of 4-1BBagonist and PD-1antagonist promotes antitumor effector/memory CD8 T cells ina poorly immunogenic tumor model.Cancer Immunol Res 2014；3(2):149-160和Rodriguez-Ruiz ME等人Abscopal effects of radiotherapy are enhanced bycombined immunostimulatory mAbs and are dependent on CD8 T cells andcrosspriming.Cancer Res 2016；76(20):5994-6005)。
由于本发明的多特异性抗体的抗CD137结构域和抗PDL1结构域两者均与小鼠PDL1不交叉反应，因此将使用CrownBio建立的工程化人CD137敲入模型。在该模型中，使用CRISPR/Cas9***在C57BL/6小鼠背景中，将小鼠CD137的胞外和跨膜结构域替换为人CD137的相应序列。另外，将使用修改的MC38肿瘤细胞系，其表达处于CMV启动子控制之下的人PDL1而非小鼠PDL1。将本发明的多特异性抗体对肿瘤体积的作用与用人源化IgG1和人源化IgG4进行的联合治疗进行比较，所述人源化IgG1含有与ND021相同的PDL1特异性可变结构域，所述人源化IgG4具有相同的CD137特异性可变结构域。为了提供局部抗肿瘤免疫反应的进一步证据，将通过流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞(例如CD8+、CD4+和调节性T细胞)的出现率。为了探索抗CD137/抗PDL1治疗后全身免疫***的调节，将通过流式细胞术和可能的免疫组织化学方法分析肝脏和脾脏中CD4+和CD8+T细胞的出现率。此外，可以使用定量ELISA方法分析全身性IFN水平。为了进一步表征抗CD137/抗PDL1联合治疗的安全性，可以评估主要与肝脏毒性相关的临床化学病理学参数(在临床上针对抗CD137治疗观察到的)，例如丙氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和天冬氨酸转氨酶的升高水平。

Claims (15)

1.对人CD137具有结合特异性的分离的抗体，其包含分别为SEQ ID NO：1、2和3的HCDR1、HCDR2、HCDR3序列，以及分别为SEQ ID NO：18、19和20的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)，其中所述VH是VH3或VH4，优选VH3。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特别是Vκ1或Vκ3FR1至FR3，优选Vκ1FR1至FR3，以及框架FR4，所述框架FR4选自VκFR4，特别是Vκ1FR4、Vκ3FR4和VλFR4，特别是包含与选自SEQ IDNO：62至SEQ ID NO：68中任意之一的氨基酸序列具有至少60、70、80、90％同一性的氨基酸序列的VλFR4，优选如SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68中任意之一所示的VλFR4，优选如SEQID NO：62或63所示的VλFR4，更优选如SEQ ID NO：62所示的VλFR4。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变区，其包含与选自由SEQ ID NO：14、15、16和17组成的组，优选SEQ ID NO：14和17，更优选SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含与选自由SEQ ID NO：27、28、29和30组成的组，优选SEQ ID NO：27和30，更优选SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗体，其包含：(a)SEQ ID NO：14的VH序列和SEQ ID NO：27的VL序列；(b)SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：28的VL序列；(c)SEQ ID NO：16的VH序列和SEQ ID NO：29的VL序列；或(d)SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：30的VL序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体：
(i)与人CD137结合的解离常数(KD)小于10nM，特别是小于5nM，特别是小1nM，特别是如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；
(ii)与人CD137结合的Koff速率为10-3s-1或更低，或10-4s-1或更低，或10-5s-1或更低，如通过SPR所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；
(iii)与人CD137结合的Kon速率为至少104M-1s-1或更高，至少105M-1s-1或更高，至少106M-1s-1或更高，如通过SPR所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；
(iv)与食蟹猕猴(食蟹猴)CD137交叉反应，特别是与食蟹猴PDL1结合的KD小于15nM，特别是小于10nM，特别是小于5nM，如通过SPR所测量的，特别地，其中所述抗体是scFv；和/或
(v)不与人CD40和/或人OX40结合，特别是如通过SPR所测量的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体：
(i)当为scFv形式时，其通过差示扫描荧光法测定的解链温度(Tm)为至少50℃，优选至少55℃，更优选至少60℃，特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4、150mM NaCl的50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液中；
(ii)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在4℃下储存至少2周，特别是至少4周后，所述抗体的单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％；和/或
(iii)当为scFv形式时，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时，并且特别地，其中将所述抗体配制在pH 6.4的具有150mM NaCl的50mM柠檬酸磷酸缓冲液中，在40℃下储存至少2周，特别是至少4周后，所述抗体的单体含量损失小于5％，例如小于4％，小于3％，小于2％，优选小于1％。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb、STAB和基于其他支架的结合结构域，所述基于其他支架的结合结构域包括但不限于基于锚蛋白的结构域、fynomer、avimer、anticalin、纤连蛋白和构建在抗体恒定区中的结合位点(例如F-star的Modular AntibodyTechnologyTM)，优选Fv或scFv。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述scFv具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，优选SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：35，更优选SEQ ID NO：35。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是多特异性分子，特别地，其中所述多特异性分子包含至少第二功能分子。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，或权利要求11所述的组合物，其用作药物。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，或权利要求11所述的组合物，其用于治疗癌症。
14.一种核酸，其编码权利要求1至10中任一项所述的抗体。
15.一种生产权利要求1-10中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养包含权利要求1-8所述的核酸的宿主细胞。
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