CN111979179B - 一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法。将新生仔猪的肝组织剪碎清洗后,加入消化液进行孵育消化,得到类器官细小颗粒;将类器官细小颗粒与基质凝胶混合后进行接种;待基质凝胶凝固后,先用诱导培养基孵育4天,然后换用扩张培养基培养,扩张培养基每3‑4天更换一次,得到猪肝脏组织类器官模型。本发明构建方法简单,构建迅速,可操作性强,直接通过新生动物类器官小颗粒构建类器官模型,不仅能够真实反映猪活体模型中的内环境,还能用于在分子细胞水平研究猪在体模型中肝脏的生长以及脂质代谢,减少对活体猪的采样。
Description
技术领域
本发明属于动物细胞工程技术领域,涉及一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法。
背景技术
类器官(Organoids)是一种通过3D培养技术在体外构建的微器官。因其拥有真实器官的复杂三维结构以及与来源器官高度相似的生理功能,从而在生物学领域得到了广泛的应用,并逐步代替细胞系。使用细胞外基质(如基质凝胶)的独特***使有机物更接近体内组织结构和功能特性的肝脏类器官培养正在成为原代细胞培养的一种流行的替代方法,用于在培养皿中重现组织和研究人体和小鼠的肝脏生理学和疾病发病机制。然而,这种方法虽然可以消除体外较多干扰效应,并提供体内组织的简化模型,但在大型动物中还没有很好的建立。并且,目前人源或者鼠源肝脏类器官的构建还是以肝脏单细胞构建为主,通过干细胞诱导成类器官,其存在的缺点是缺少细胞间的基质,不能完全真实地模拟体内肝脏的生理学功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,以解决现有技术中存在的目前人源或鼠源肝脏类器官构建以肝脏单细胞构建为主,得到的类器官缺少细胞间的基质,不能真实地模拟体内肝脏生理学功能的问题。
为达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,包括以下步骤:
将新生仔猪的肝组织剪碎清洗后,加入消化液进行孵育消化,得到类器官细小颗粒;
将类器官细小颗粒与基质凝胶混合后进行接种;
待基质凝胶凝固后,先用诱导培养基孵育4天,然后换用扩张培养基培养,扩张培养基每3-4天更换一次,得到猪肝脏组织类器官模型。
进一步地,所述消化液,包括:无血清DMEM/F-12培养基和胶原酶D。
进一步地,所述诱导培养基,包括:B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin、A83-01、重组人Noggin或Noggin条件培养基、Wnt3a条件培养基和Rho激酶抑制剂,其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。
进一步地,所述诱导培养基,包括:1:50 B27细胞培养添加剂、1:100 N2细胞培养添加剂、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10%(vol/vol)Rspo1条件培养基、10 mM烟酰胺、10 nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50 ng/ml重组人EGF、100 ng/ml重组人FGF10、25 ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin、5μM A83-01、25ng/ml重组人Noggin或5%(vol/vol)Noggin条件培养基、30%(vol/vol)Wnt3a条件培养基和10μM Rho激酶抑制剂,其中,B27细胞培养添加剂不含维生素A。
进一步地,所述扩张培养基,包括:B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂,N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin和A83-01,其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。
进一步地,所述扩张培养基,包括:1:50 B27细胞培养添加剂、1:100 N2细胞培养添加剂、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10%(vol/vol)Rspo1条件培养基、10 mM烟酰胺、10 nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50 ng/ml重组人EGF、100 ng/ml重组人FGF10、25 ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin和5μM A83-01,其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。
进一步地,所述将新生仔猪的肝组织剪碎清洗,包括:
将采集的新生仔猪的肝组织用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液反复冲洗后剪碎,再用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液进行离心清洗直至上清液清澈。
进一步地,所述类器官细小颗粒的直径在100-200μm。
进一步地,所述将类器官细小颗粒与基质凝胶混合后进行接种,包括:
将类器官细小颗粒与基质凝胶按1:1混合,以每孔1000个的密度接种在24孔板中。
本发明还提供了一种由上述体外构建方法构建的猪肝脏组织类器官模型。
与现有技术相比,本发明提供的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,方法简单,构建迅速,可操作性强。构建的猪肝脏类器官结构稳定,将其扩至20代后,仍然保持肝脏组织的生理活性;将其长时间冻存后进行复苏也可以保持原有活性。本发明直接通过新生动物类器官小颗粒构建类器官模型,不仅能够真实反映猪活体模型中的内环境,直观地展示细胞与细胞以及细胞与基质之间的关系,还能通过分子生物学手段研究肝脏的生长发育以及营养代谢。构建的猪肝脏类器官能够表达细胞周期、增殖以及胆固醇合成代谢基因,可用于在分子细胞水平研究猪在体模型中肝脏的生长以及脂质代谢,从而减少对活体猪的采样,解决了目前原代细胞、细胞系不能反映体内真实结果的问题。该方法构建的类器官可逐步代替细胞系,具有产业化意义。
附图说明
图1使用***处理猪肝脏类器官及采样流程图;
图2染色法检测对照组和限制营养组类器官活力结果图;
图3对照组和限制营养组的细胞活性测定结果图;
图4 对照组和限制营养组的caspase3/7酶活性测定结果图;
图5对照组和限制营养组的相对mRNA水平图;
图6对照组和限制营养组的胆固醇生物合成关键基因的表达图;
图7(A)对照组和限制营养组的总胆固醇水平图,图7(B)对照组和限制营养组的游离胆固醇水平图;
图8对照组和限制营养组的胆固醇生物合成酶蛋白表达图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明实施例涉及到的原料及试剂,如无特殊说明均为市售产品,涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
实施例1 猪肝脏类器官体外构建
在本实施例中,取用3日龄的雄性仔猪肝脏组织,用以建立实验用猪肝脏类器官。
具体步骤如下:
1),将3日龄新生仔猪在无菌实验室中麻醉处死,取出约500mg肝脏组织。将采集的新鲜仔猪的肝脏组织用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液反复冲洗后剪碎,再用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液进行离心清洗直至上清液清澈。
2)将剪碎清洗后的组织转移到50mL无菌离心管中,加入10mL消化液,用封口膜封住离心管。在37℃条件下恒温振荡孵育器中以200rpm的转速进行孵育消化;其中,消化液包括无血清DMEM/F-12培养基(Gibco,基础培养基)和2.5mg/mL胶原酶D(Sigma)。
3)1小时后,取25μL消化后的溶液在盖玻片上,显微镜拍照并用标尺测量类器官细小颗粒的大小,当大部分颗粒的直径在100-200μM范围内停止消化。若大于200μM,则每15分钟检测一次。类器官细小颗粒为单细胞群,其保留了细胞间的基质。
4)完成消化后,将50mL离心管在室温下以530g的转速离心5分钟,小心去除上清,加入5mL红细胞去除液去除红细胞,重悬类器官细小颗粒,37℃孵育5分钟,在室温以530g的转速离心5分钟,小心去除上清。再加入10mL 基础培养基重悬,取25μL在显微镜下计数,在室温下以530g的转速离心5分钟。
5)将步骤4)得到的类器官颗粒在预冷的PBS中重悬,密度调整为4×104,与基质凝胶按1:1混合,以每孔1000个的密度接种在24孔板中,小心放入37℃培养箱。
6)当基质凝固后,在每个孔内加入500μL培养基B,孵育4天,维持类器官正常生长。
其中,培养基B为诱导培养基,包括:1:50 B27细胞培养添加剂(不含维生素A)、1:100 N2细胞培养添加剂、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10%(vol/vol)Rspo1条件培养基、10 mM烟酰胺、10 nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50 ng/ml重组人EGF、100 ng/ml重组人FGF10、25 ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin、5μM A83-01、25ng/ml重组人Noggin或5%(vol/vol)、Noggin条件培养基、30%(vol/vol)Wnt3a条件培养基和10μM Rho激酶(ROCK)抑制剂。
7)从第5天开始,换用培养基C培养,培养基C每3-4天更换一次,诱导成具有生理功能的肝脏类器官。
其中,培养基C为正常肝脏扩张培养基,包括:1:50 B27细胞培养添加剂(不含维生素A)、1:100 N2细胞培养添加剂、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10%(vol/vol)Rspo1条件培养基、10 mM烟酰胺、10 nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50 ng/ml重组人EGF、100 ng/ml重组人FGF10、25 ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin和5μM A83-01。
经测试,将构建的猪肝脏类器官长时间冻存后,再进行复苏,其仍然可以保持肝脏组织的生理活性。此外,将该猪肝脏类器官经过传代扩至20代,也仍然能够保持肝脏组织的生理活性。
在成功构建类器官体外模型后,以得到的类器官模型为基础,通过分子生物学手段研究肝脏的生长发育以及营养代谢,并对细胞周期、增殖、胆固醇合成代谢基因的表达等各种生理学功能进行分析、测定。
实施例2***处理与类器官生物周期重置
类器官接种后第15天,用100nM(最终浓度)的***(DEX,Sigma-Aldrich)处理类器官15分钟以重新设置类器官的生物钟,将其同步到0点。然后用PBS清洗液(37°C)将类器官清洗三次,并在扩张培养基中培养。DEX处理48小时后,将其中6孔的有机物作为对照组,暴露于扩张培养基中,时间为上午8:00~晚上10:00,然后暴露于基础培养基中,暴露时间为晚上10:00~上午8:00,总时间为24小时+1小时。将其他6孔的有机物作为限制营养组,在24小时的循环中,从上午8:00至下午6:00暴露于扩张介质10小时,从下午6:00至上午8:00+1暴露于基础介质14小时。在24小时循环模式下持续暴露5天,然后收集类器官并进行分析。
实施例3 类器官细胞活力检测
(1)染色法检测类器官活力
在对照组和限制营养组类器官中分贝加入100μL活/死细胞双染色试剂盒(calcein-AM/溴化乙锭同二聚体-1,Thermofisher Scientific),在室温下培养30分钟。用荧光显微镜拍摄calcein-AM的信号来代表活细胞,拍摄溴化乙锭同二聚体-1的信号用于鉴别死细胞。
荧光染色结果如图2所示,结果显示:限制营养不影响肝细胞活性。
(2)Cell-Titer GLO检测细胞活性
分别对对照组和限制营养组进行类器官细胞活性检测,检测方式是通过添加Cell-Titer GLO试剂(Promega),并根据制造商的说明在GLOMAX微孔板发光计(Promega)上测量发光。上述测定重复三次,整个实验重复三次。
类器官细胞活性测定结果如图3所示,对照组细胞活性为100%, 限制营养组细胞活性接近100%,表明:限制营养基本不影响肝细胞活性。
实施例4 Caspase 3/7活性检测类器官凋亡
分别对对照组和限制营养组进行类器官细胞凋亡检测,检测方式是通过添加Caspase3/7试剂(Promega),并根据制造商的说明在GLOMAX微孔板发光计(Promega)上测量发光。上述测定重复三次,整个实验重复三次。
类器官细胞凋亡测定结果如图4所示,将对照组细胞凋亡设置为1,与对照组相比,限制营养组类器官细胞凋亡没有显著变化,表明:限制营养基本不影响肝细胞凋亡。
实施例5 荧光定量PCR检测细胞周期基因以及胆固醇合成基因的表达
分别在对照组和限制营养组的类器官中提取出2μg的总RNA,并反转录为cDNA。使用SYBR Green I进行荧光定量PCR。其中SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,适用于各种电泳分析。随后收集荧光值,并进行熔化曲线分析,计算倍数差异。分别对对照组和限制营养组的类器官相对mRNA水平进行测定,并对胆固醇生物合成关键基因的表达进行研究。实验至少进行三次,数据显示为平均值±s.d.。
图5为对照组和限制营养组的相对mRNA水平图,从图中可以看出:与对照组相比,限制营养对类器官的细胞周期基因的表达没有显著的影响。
图6示出了胆固醇生物合成关键基因的表达。从图6以看出:与对照组相比,限制营养组中的MVK(编码甲羟戊酸激酶)、FDPS(编码法尼基焦磷酸合成酶)、FDFT1(编码法尼基二磷酸法尼基转移酶1)、SQLE(编码角鲨烯单加氧酶)、EBP(编码埃莫帕米结合蛋白)、SC5D(编码甾醇-c5-去饱和酶)、DHCR7(编码7-脱氢胆固醇还原酶)和DHCR24等基因均显著下调。结果表明:限制营养降低了胆固醇合成关键基因的表达。
实施例6 通过酶化学法检测类器官胆固醇含量
在4℃操作环境中,用预冷的PBS清洗液将含有对照组和限制营养组类器官的基质胶溶解,离心分析后,收集类器官样品。用含有蛋白酶抑制剂的蛋白质裂解液RIPA裂解类器官细胞,震荡混匀,静置10分钟。取适量上清液转移到1.5ml离心管备用,余下的裂解液用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定。
室温2000g离心5分钟,取上层清液用于酶学测定。首先设置标准品,将5 mM胆固醇标准品用无水乙醇稀释为2500、1250、625、312.5、156、78、39µmol/L。通常稀释4个点即可。注意设置零浓度空白对照管。1)190 µl工作溶液加入微板。2)在各工作液中,分别加入10 µl (5~10µl) 空白对照溶液(无水乙醇或蒸馏水均可)、标准品、待测样品。样品体积不可超过20µL。如测量值超过线性范围可用裂解液稀释,根据稀释倍数计算浓度。3)37ºC或25ºC室温反应20分钟然后进行测定。4)先用蒸馏水+工作液的空白管调零,然后测定各管OD值。5)绘制标准曲线并计算浓度。6)以每mg蛋白浓度或细胞数校正胆固醇含量。
图7(A)、7(B)分别示出了对照组和限制营养组的总胆固醇(CHO)含量和游离胆固醇含量,结果显示在限制营养处理下类器官中的总胆固醇含量和游离胆固醇含量明显低于对照组。
实施例7 Western blotting检测类器官胆固醇合成基因的蛋白表达
在4℃操作环境中,用预冷的PBS将含有对照组和限制营养组类器官的基质胶溶解,离心分析后,收集类器官样品。用含有蛋白酶抑制剂的蛋白质裂解液RIPA裂解类器官细胞,冰上放置30min,每隔10 min漩涡振荡30s。4℃下12000 g离心10min,将上清转移到新的1.5mL指形管中,即得细胞总蛋白产物。通过BCA蛋白定量总蛋白浓度,调整至每组一样的浓度,用6×SDS-PAGE Loading buffer将所有待测组蛋白浓度调平衡,100℃沸水裂解10min。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白后,将蛋白转至碳酸纤维素膜上。含有5 %脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭非特异性蛋白后加入特异性抗体,在4℃低温孵育过夜。次日用二抗识别并结合特异性一抗。最后通过化学发光法检测蛋白的表达量并拍照,如图8所示。
从图8可以看出,限制营养处理导致许多胆固醇生物合成酶蛋白强烈下调,包括MVK、FDFT1、SQLE、EBP和DHCR24,即限制营养导致类器官胆固醇合成蛋白表达显著下调。
本发明直接通过新生动物类器官小颗粒构建类器官模型,构建的类器官模型不仅真实反映了猪活体模型中的内环境,直观地展示细胞与细胞、细胞与基质之间的关系,还能通过分子生物学手段研究肝脏的生长发育以及营养代谢。猪肝脏类器官能够表达细胞周期、增殖以及胆固醇合成代谢基因,可用于在分子细胞水平研究猪在体模型中肝脏的生长以及脂质代谢,从而减少对活体猪的采样,解决了目前原代细胞、细胞系不能反映体内真实结果的问题。
以上已以较佳实施例公布了本发明,然其并非用以限制本发明,凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,将剪碎清洗后的新生仔猪肝组织转移到50mL无菌离心管中,加入10mL消化液,用封口膜封住离心管,在37℃条件下恒温振荡孵育器中以200rpm的转速进行孵育消化;其中,消化液包括无血清DMEM/F-12培养基和2.5mg/mL胶原酶D;
步骤2,1小时后,取25μL消化后的溶液在盖玻片上,显微镜拍照并用标尺测量类器官细小颗粒的大小,当大部分颗粒的直径在100-200μM范围内停止消化;若大于200μM,则每15分钟检测一次;类器官细小颗粒为单细胞群,其保留了细胞间的基质;
步骤3,完成消化后,将50mL离心管在室温下以530g的转速离心5分钟,小心去除上清,加入5mL红细胞去除液去除红细胞,重悬类器官细小颗粒,37℃孵育5分钟,在室温以530g的转速离心5分钟,小心去除上清,再加入10mL基础培养基重悬,取25μL在显微镜下计数,在室温下以530g的转速离心5分钟;
步骤4,将步骤3得到的类器官颗粒在预冷的PBS中重悬,密度调整为4×104,与基质凝胶按1:1混合,以每孔1000个的密度接种在24孔板中,小心放入37℃培养箱;
步骤5,当基质凝胶凝固后,在每个孔内加入500μL诱导培养基,孵育4天,维持类器官正常生长,从第5天开始,换用扩张培养基培养,扩张培养基每3-4天更换一次,得到猪肝脏组织类器官模型。
2.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,其特征在于,所述诱导培养基,包括:B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin、A83-01、重组人Noggin或Noggin条件培养基、Wnt3a条件培养基和Rho激酶抑制剂,其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。
3.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,其特征在于,所述诱导培养基,包括:1:50B27细胞培养添加剂、1:100N2细胞培养添加剂、1mM N-乙酰半胱氨酸、10%(vol/vol)Rspo1条件培养基、10mM烟酰胺、10nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50ng/ml重组人EGF、100ng/ml重组人FGF10、25ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin、5μM A83-01、25ng/ml重组人Noggin或5%(vol/vol)Noggin条件培养基、30%(vol/vol)Wnt3a条件培养基和10μM Rho激酶抑制剂,其中,B27细胞培养添加剂不含维生素A。
4.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,其特征在于,所述扩张培养基,包括:B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂,N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin和A83-01,其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。
5.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,其特征在于,所述扩张培养基,包括:1:50B27细胞培养添加剂、1:100N2细胞培养添加剂、1mM N-乙酰半胱氨酸、10%(vol/vol)Rspo1条件培养基、10mM烟酰胺、10nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50ng/ml重组人EGF、100ng/ml重组人FGF10、25ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin和5μM A83-01,其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。
6.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法,其特征在于,新生仔猪肝组织的剪碎清洗步骤,包括:
将采集的新生仔猪的肝组织用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液反复冲洗后剪碎,再用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液进行离心清洗直至上清液清澈。
7.一种由权利要求1至6任一项所述方法构建的猪肝脏组织类器官模型。
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Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112501111B (zh) * | 2020-12-16 | 2023-04-28 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 一种用于猪小肠类器官培养的分子培养基 |
CN112538457B (zh) * | 2020-12-23 | 2023-03-28 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法 |
CN112608885A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-06 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2201159A1 (en) * | 1994-09-27 | 1996-04-04 | Edward F. Myers | Artificial liver apparatus and method |
CN1869205A (zh) * | 2006-05-23 | 2006-11-29 | 浙江大学 | 永生化猪肝细胞的制备方法 |
CA3148687A1 (en) * | 2014-11-26 | 2016-06-02 | Accelerated Biosciences Corp. | Induced hepatocytes and uses thereof |
CN108546675A (zh) * | 2018-05-17 | 2018-09-18 | 广东芙金干细胞再生医学有限公司 | 促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法 |
CN112538457A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-23 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004078956A2 (en) * | 2003-03-05 | 2004-09-16 | Cilbiotech | Process for detaching confluent cells from two dimensional microsupports and its application for preparing transplants |
US8647867B2 (en) * | 2005-09-30 | 2014-02-11 | National University Corportion Okayama University | Cell cultivation method and cell culture |
EP2412800A1 (en) * | 2010-07-29 | 2012-02-01 | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen | Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them |
CN102643778A (zh) * | 2012-05-13 | 2012-08-22 | 韶关学院 | 一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法 |
CN106188289A (zh) * | 2016-07-11 | 2016-12-07 | 王胜军 | 制备“人猪嵌合肝脏等器官”的方法 |
AU2018273233B2 (en) * | 2017-05-23 | 2021-11-18 | EMULATE, Inc. | Advanced pulmonary models |
CN110272860B (zh) * | 2019-06-30 | 2020-07-14 | 东南大学苏州医疗器械研究院 | 一种细胞三维培养微环境构建方法及应用 |
CN111394299B (zh) * | 2020-03-26 | 2020-12-25 | 南京鼓楼医院 | 一种肝脏类器官的体外构建方法及应用 |
-
2020
- 2020-08-24 CN CN202010854860.7A patent/CN111979179B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2201159A1 (en) * | 1994-09-27 | 1996-04-04 | Edward F. Myers | Artificial liver apparatus and method |
CN1869205A (zh) * | 2006-05-23 | 2006-11-29 | 浙江大学 | 永生化猪肝细胞的制备方法 |
CA3148687A1 (en) * | 2014-11-26 | 2016-06-02 | Accelerated Biosciences Corp. | Induced hepatocytes and uses thereof |
CN108546675A (zh) * | 2018-05-17 | 2018-09-18 | 广东芙金干细胞再生医学有限公司 | 促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法 |
CN112538457A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-23 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 一种猪肝脾脏导管干细胞分离及三维类器官培养方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Liver organoids in domestric animal: an expected promise for metabolic studies;Camille Baquerre 等;《Veternary Research》;20210318;第52卷;第1-7页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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