CN111172050B - 一株伯克霍尔德氏菌高产毒黄素的发酵策略 - Google Patents

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Abstract

提高伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.HDXY‑02)的毒黄素产量发酵策略，属于微生物发酵技术领域。菌株HDXY‑02已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14054。本发明确定最佳接种量为3%，培养温度为30℃。通过单因子实验和统计分析，确定最优培养基为：葡萄糖（19.24 g/L）、蛋白胨（20.45 g/L）、苯丙氨酸（0.472 g/L）、K2HPO4（1.5 g/L）、MgSO4（0.75 g/L），pH7.0。优化后毒黄素产量达1533 mg/L，较优化前提高了296%，为微生物发酵法高产毒黄素提供了一种可行的发酵策略。

Description

一株伯克霍尔德氏菌高产毒黄素的发酵策略
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体地说，是一株伯克霍尔德氏菌产毒黄素的发酵策略，尤其是一种大幅度提高该菌株毒黄素产量的发酵条件的优化策略。
背景技术
毒黄素是由微生物合成的一种小分子物质，分子式为C7H7N5O2，摩尔质量为193g/mol。研究发现其可以用作抗菌剂和抗肿瘤剂。毒黄素对多种病原菌具有拮抗能力。此外，其还具有较强的抗肿瘤活性，对肺癌细胞、卵巢癌细胞及胃癌细胞等多种癌症细胞都具有很好的抑制活性。因此，毒黄素作为新兴抗生素和抗肿瘤剂药物在细胞凋亡方面的研究具有很高的研究价值，在应用上，通过各种结构修饰，可降低其毒性，作为抗生素和抗癌药物，具有一定的商业前景。
目前可以通过化学或微生物法合成毒黄素，但化学合成一般步骤复杂，所需有机试剂较多，具有副产物多、污染环境等缺点。微生物法生产毒黄素，其较化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。但目前毒黄素在微生物中的产量较低，其产量的提升仍有很大潜力。
微生物合成代谢物的能力，不仅仅取决于菌种本身的代谢特性，也取决于培养条件和培养基成分，如碳氮源、培养温度、pH值、溶氧等。
统计学方法已被广泛地运用于发酵条件和高产培养基优化的研究中。Plackett-Burman设计(PBD)和响应面分析(RSM)克服了传统的单因素法实验次数多、实验周期长等缺点，可以从众多影响因子中快速有效地筛选出主效因子并实现其水平的优化。PBD和Box-Behnken设计(BBD)等统计学方法的应用大大提高了优化工作的效率，已被广泛地应用于多种微生物发酵条件优化工作中。
同样，影响微生物合成毒黄素的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、培养时间和培养基成分等。通过分离环境中高产毒黄素菌株，并在此基础上优化菌株的发酵条件及培养基配方，保持菌株的最佳生长条件以及代谢物合成的最佳培养基成分，使菌株处于合成目标代谢物的最佳状态中，可最大程度提高菌株产毒黄素的效率，是解决目前毒黄素原料来源制的一条重要途径。
发明内容
本发明的目的在于提供：一株伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)HDXY-02的发酵策略，尤其是一种大幅度提高该菌株毒黄素产量的发酵条件的优化策略。
本发明所涉及的一株伯克霍尔德菌(拉丁文分类命名为Burkholderia sp.)，所述菌株的登记入册编号为CGMCC No.14054，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年4月20日。
本发明的技术方案：首先通过单因子实验，优化了Burkholderia sp.HDXY-02发酵产毒黄素过程中的发酵条件，其中包括发酵液初始pH、发酵温度、接种量三个方面。其次，采用前期筛选得到的发酵KMB培养基为出发培养基，采用单因素优化的方法筛选了碳氮源的种类、金属离子等培养基成分。再次，采用Plackett-Burman设计，筛选了对于Burkholderiasp.HDXY-02毒黄素产量有显著性影响的培养基成分。最后，通过响应面分析的方法对显著影响毒黄素产量的3个因素的水平进行优化，从而得到菌株Burkholderia sp.HDXY-02高产毒黄素的发酵培养基配方。本发明成功获得了一种Burkholderia sp.HDXY-02发酵产毒黄素的优化策略，其毒黄素产量较优化前有大幅提高，达到1533mg/L，较优化前的387mg/L提高了296％。
毒黄素标准品购自美国SIGMA公司。
种子培养基：
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0。
基础发酵培养基：
King's B(KMB)培养基(g/L)：蛋白胨20，K2HPO41.5，甘油15mL，MgSO40.75。
初始培养条件：
种龄14h，温度30℃，接种量4％，摇床转速200rpm，三角瓶装液量75/250mL，培养48h。
毒黄素含量测定：
紫外检测方法：取培养结束的Burkholderia sp.HDXY-02菌液1mL，4℃，8000g离心10min，去除菌体，将上清液用等体积三氯甲烷进行萃取，提取物用1mL 80％甲醇(v/v)溶解，紫外检测，测定OD393。毒黄素标准品用80％甲醇梯度稀释，并绘制标准曲线，用于计算发酵液中的毒黄素浓度。
菌株发酵策略的优化：
1.Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成的培养条件优化
(1)接种量对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明考察不同接种量对毒黄素产量的影响，将接种量分别设定1％、2％、3％、4％、5％及6％，培养条件如上所述，进行毒黄素含量测定，以确定有利于Burkholderiasp.HDXY-02毒黄素合成的最佳接种量。
(2)初始pH对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明在确定接种量的基础上，考察初始pH对毒黄素产量的影响，将培养基初始pH分别设定pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0及pH9.0，培养条件如上所述，测定发酵上清液中毒黄素含量，以确定有利于Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成的培养基最佳初始pH。
(3)培养温度对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明在确定接种量和初始pH值的基础上，考察培养温度对毒黄素产量的影响，将培养温度分别设为25、28、30、33、37和40℃，培养条件如上所述，测定发酵上清液中毒黄素含量，以确定有利于Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成的培养基最佳培养温度。
2.用于菌株Burkholderia sp.HDXY-02生物合成毒黄素的培养基成分优化
(1)碳源对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明考察碳源——葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露糖、琥珀酸、柠檬酸和乳糖对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成量的影响，碳源浓度为1％。
(2)有机氮源对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明考察有机氮源——蛋白胨、黄豆粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成的影响。将选取的氮源作为唯一氮源加入即可，浓度为0.5％。
(3)无机氮源及氨基酸对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明考察无机氮源——(NH4)2SO4、KNO3、NaNO3和氨基酸——酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸，对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响，无机氮源浓度设定为0.2％，氨基酸设定为0.01％。
(4)无机盐对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明考察无机盐——NaCl、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、Na2SO4和KCl对Burkholderiasp.HDXY-02毒黄素合成的影响，浓度0.2％。
(5)金属离子对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
本发明考察金属离子——Fe、Ca、Cd、Mn、Zn和Cu对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成的影响，浓度0.01％。
(6)统计学方法优化Burkholderia sp.HDXY-02产毒黄素培养基成分
本发明在以上单因素的基础上，采用Plackett-Burman设计来进一步筛选对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成显著影响的因子。根据Plackett-Burman设计筛选出的主要影响因素进行响应面分析并最终确定菌株Burkholderia sp.HDXY-02产毒黄素的发酵培养基各组分水平。
本发明的有益效果：通过单因子实验和统计学方法，对菌株Burkholderiasp.HDXY-02进行了发酵策略的研究，对该毒黄素高产菌株的培养条件和发酵培养基组分进行了优化并进行了发酵实验验证。摇瓶条件下Burkholderia sp.HDXY-02产毒黄素的最优培养条件为：接种量3％，培养温度30℃，初始pH 7.0。最优培养基为葡萄糖(19.24g/L)、蛋白胨(20.45g/L)、苯丙氨酸(0.472g/L)、K2HPO4(1.5g/L)、MgSO4(0.75g/L)。成功获得了菌株Burkholderia sp.HDXY-02合成毒黄素的发酵策略，其毒黄素产量较优化前有较大提高。优化后毒黄素合成量高达1533mg/L，其产毒黄素的能力获得了较大幅度的提高，较优化前的387mg/L提高了296％，约为优化前的4倍，获得了理想的结果，也为微生物发酵生产毒黄素的工业化提供了有益的指导。
附图说明
图1初始pH对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图2培养温度对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图3碳源对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图4有机氮源对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图5无机氮源和氨基酸对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图6无机盐对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图7金属离子对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图8帕累托图分析各因素对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图9主效应图分析各因素对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图10各因素相互作用对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
图11响应面分析主效因素对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
具体实施方式
实施例1接种量对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
接种量过大或过小都不利于产物毒黄素的合成。因此需要在发酵过程中应将接种量控制适宜范围内。发酵液中毒黄素含量随接种量的增加而增大，而当接种量高于3％时，发酵液中毒黄素含量达到最高，随着接种量继续提高，发酵液中毒黄素含量逐渐下降。可确定Burkholderia sp.HDXY-02发酵产毒黄素的最适接种量为3％，因此，选择接种量3％进行后续试验。
实施例2初始pH对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
pH是影响细胞生长和产物代谢的重要因素。通过摇瓶培养，研究不同初始pH毒黄素合成的影响。结果如图1所示。在pH在5.0-7.0范围内，随着pH的升高，毒黄素产量逐渐增加，pH为7.0时，达到最大值，为387mg/L，当pH高于7.0后，随着pH的增长，毒黄素产量开始下降。Burkholderia sp.HDXY-02发酵产毒黄素的最佳初始pH值在中性范围内，以pH 7.0为最佳。因此，选择初始pH7.0进行后续试验。
实施例3培养温度对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
温度通过影响微生物膜的结构，酶和蛋白质的合成与活性，进而影响微生物的生物进程。由图2中可以看出，Burkholderia sp.HDXY-02发酵产毒黄素的最适温度为30℃，30℃条件下更利于毒黄素的合成，此时发酵液中毒黄素含量最高，之后随着培养温度的升高，Burkholderia sp.HDXY-02发酵液中毒黄素含量开始下降。因此，选择30℃这一培养温度进行后续试验。
实施例4碳源对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
选取六种碳源——葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露糖、琥珀酸、柠檬酸和乳糖研究其对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素合成的影响，碳源浓度为1％。初始发酵培养基为KMB培养基。其它组分都保持不变。接种量3％，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养48h，测定毒黄素产量。由图可知(图3)，结果可见，葡萄糖，甘油作为碳源时毒黄素产量最高，分别为485mg/L和460mg/L，两者作为碳源有利于Burkholderia sp.HDXY-02发酵液中毒黄素的积累。
实施例5有机氮源对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
氮源对菌体生长和产物合成具有重要影响，有机氮源对于抗生素类物质的积累起着关键的作用。如图4中可见中以蛋白胨作为氮源，Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素的产量最高，为471mg/L。
实施例6无机氮源和氨基酸对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
如图5中所示，无机氮源明显不利于Burkholderia sp.HDXY-02中毒黄素的合成。因此，有机氮源是细菌生长和次级代谢产物积累的最好选择。另外，还将KMB培养基中有机氮源替代为单一氨基酸作为氮源。选取酪氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。结果表明三种氨基酸对毒黄素产量有一定的促进作用，Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量可分别达到601mg/L、582mg/L和613mg/L。
实施例7无机盐对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
无机盐可影响次级代谢物积累。选取几种常见的无机盐，添加至发酵培养基中。如图6所示，试验结果表明NaCl、MgSO4、K2HPO4对Burkholderia sp.HDXY-02中毒黄素产量相对较高，毒黄素产量可分别达到504mg/L、540mg/L和451mg/L。其他无机盐对Burkholderiasp.HDXY-02中毒黄素的积累并没有明显作用。
实施例8金属离子对Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量的影响
微量元素作为生物活性物质的组成或生理活性作用的调节物。镁、磷、钾、硫、钙离子等常以盐的形式加入，并在细胞生长及代谢中起到重要作用。通过添加各种微量元素，试验结果(图7)表明Fe2+、Ca2+和Mn2+的添加可以促进毒黄素产量，分被为638mg/L、520mg/L和580mg/L。其他矿物质影响对Burkholderia sp.HDXY-02中毒黄素的积累产生负的调控作用。
实施例9统计学方法优化Burkholderia sp.HDXY-02产毒黄素培养基
根据单因素试验的结果，碳源(葡萄糖甘油)，氮源(蛋白胨)，无机盐(NaCl、MgSO4、K2HPO4)，氨基酸(酪氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸)和金属离子(Fe2+、Ca2+和Mn2+)对Burkholderia sp.HDXY-02发酵上清液中毒黄素的积累具有促进作用。因此，选取这12个营养成分作为Plackett-Burman设计筛选的变量，设计采用软件Minitab 17.0进行设计，共计20个组合，设置各变量的高低水平值。具体12个变量的水平如表1所示。
表1 Plackett-Burman设计中12个变量水平
Figure GDA0003549059210000061
采用20个不同组合的发酵培养基，Burkholderia sp.HDXY-02产毒黄素的检测结果见表2。结果表明：12个营养成分配制的20组不同的发酵培养基对毒黄素产率具有很大的影响，表3统计分析各营养因子影响的显著水平。置信区间设为95％(p<0.05)，Minitab统计分析结果表明3个因素对毒黄素产率具有显著的促进作用，它们分别是：葡萄糖(p＝0.016)、蛋白胨(p＝0.003)和苯丙氨酸(p＝0.021)。因此，选择这3个营养因子作为关键组分进一步优化，确定其最佳浓度。
表2 Plackett-Burman设计阵列图及各组合实际毒黄素产量
Figure GDA0003549059210000062
表3 Plackett-Burman设计统计学分析
Figure GDA0003549059210000071
R2＝87.06％；R2(adjust)＝64.88％
选择Plackett-Burman设计筛选出的置信水平大于95％的三个因素葡萄糖、蛋白胨和苯丙氨酸，进一步通过中心组合设计为核心的响应面进行优化。Box-Behnken设计的三因素的水平表(表4)显示各选定变量的编码值和真实值。3因素3水平的中心组合试验共有15次试验组合，所有试验批次发酵毒黄素产量，如表4所示，每个组合试验重复三次并取平均值。
表4 Box-Behnken设计和结果
Figure GDA0003549059210000072
表5 Box-Behnken设计结果的统计学分析
Figure GDA0003549059210000081
R2＝95.48％；R2(adjust)＝87.33％
将15个组合试验结果应用多元回归分析，建立回归分析方程式：
Y＝-7960+496.4X1+373X2+3785X3–13.29X1 2–8.79X2 2–4330X3 2–0.22X1X2+38.6X1X3–21.0X2X3
Y值中每组试验结果均有一个利用回归方程得到的预测值和试验的真实值相对应。表5中可见，两组数值相近，有很好的一致性，回归方程的相关系数R2为95.48％，说明回归方程各变量的拟合值和实际值相关性，根据回归方程，考察拟合响应曲面的形状，分析葡萄糖、蛋白胨和苯丙氨酸3个因素对毒黄素产量的影响，结果见附图11。
综上，在建立回归方程的基础上计算相关系数并进行方差分析，结果表明这个回归方程的模型能够充分地预测变量在给定范围内变化趋势。并且模型预测值和试验值高度相近，此回归方程回归效果显著。回归系数和显著性分析表明，葡萄糖和蛋白胨对毒黄素的产量有显著影响(p<0.05)。葡萄糖和苯丙氨酸的平方同样也有显著影响(p<0.05)。
对模型进行计算得到培养基中各组分最佳用量最优培养基为葡萄糖(19.24g/L)、蛋白胨(20.45g/L)、苯丙氨酸(0.472g/L)、K2HPO4(1.5g/L)MgSO4(0.75g/L)。利用最佳培养基配方再次进行摇瓶试验验证，毒黄素产量可达1533mg/L。该发酵策略大大提高了Burkholderia sp.HDXY-02毒黄素产量，比优化前提高了3倍左右。为了检验模型预测的准确性，在优化条件：共重复3次平行验证试验。此条件下平均产毒黄素为1533mg/L，与模型预测值相比无明显差异，证明了方程的可靠性和响应面分析方法的有效性。较优化前使用KMB培养基在相同的条件下毒黄素产量为387mg/L。
实施例10发酵罐验证
为了验证模型模拟适用性，通过10L发酵罐的放大试验验证结果的科学性，结果表明发酵60h达到1.87g/L，发酵罐的数据表明通过响应面方法在摇瓶条件得到的最佳培养基依然适用于扩大规模的发酵试验，发酵罐试验也再次验证了响应面优化Burkholderiasp.HDXY-02产毒黄素培养基的结果。

Claims (1)

1.一种提高伯克霍尔德氏菌（Burkholderiasp.）HDXY-02毒黄素合成量的培养基的使用方法，其特征在于：
所述伯克霍尔德氏菌HDXY-02菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14054；
培养基配方：葡萄糖19.24 g/L、蛋白胨20.45 g/L、苯丙氨酸0.472 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4 0.75 g/L，初始pH7.0；
发酵培养条件：种龄14 h，接种量为3%，摇床转速200 rpm，三角瓶装液量为250 mL 三角瓶装75 mL液体培养基，30℃振荡培养48 h。
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