CN103361289A - 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株产L-赖氨酸的菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichiacoli）NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M2013239。本发明还提供该菌株的诱变筛选方法及利用该菌株生产L-赖氨酸的方法。大肠杆菌（Escherichiacoli）NT1003△Met△Thr菌株连续传代7次后发酵液中L-赖氨酸含量为60g/L左右，无显著变化，遗传稳定性好。

Description

一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L-赖氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株产L-赖氨酸的菌株及其生产L-赖氨酸的方法。
背景技术
L-赖氨酸（L-Lysine，Lys）是生物体维持生命活动的必需氨基酸之一，是世界上仅次于味精的第二大氨基酸品种，也是生物基尼龙等新型材料的重要前体。L-赖氨酸的生产方法包括抽提法、化学合成/酶法和微生物发酵法。传统的抽提工艺虽工艺简单，但动物血粉等原料来源有限，仅限于小规模生产；合成法生产赖氨酸过程需要使用剧毒原料光气，且可能残留催化剂，产品安全性差，环保问题严重；化学合成的DL-赖氨酸还需要经过酶法拆分或转化才能得到L-赖氨酸，大幅度提高了生产成本；微生物发酵法是目前工业生产赖氨酸的最重要方法，发酵原料广泛易得且价格便宜，如淀粉（木薯淀粉、玉米淀粉等）、糖蜜（甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等）。
微生物发酵法是利用营养缺陷型菌株，通过代谢控制发酵，人为地改变和控制微生物的代谢途径来实现L-赖氨酸的生产。生物合成赖氨酸的途径有两种：一种是通过2-氨基己二酸途径（如酵母菌、链孢霉等），另一种是通过2,6-二氨基庚二酸途径（如细菌、蓝藻、高等植物等）。前者的起始物是α-酮戊二酸，后者的起始底物为天冬氨酸。野生细菌细胞中的苏氨酸和蛋氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制作用，而赖氨酸对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶同时具有反馈抑制作用，从而限制了赖氨酸在细胞中的积累。1960年日本的木下祝郎、中山清等用紫外线照射谷氨酸捧杆菌得到一株高丝氨酸营养缺陷型变异株，使赖氨酸生产达到工业生产水平。US4066501公开了一种多重抗性短杆菌属和帮杆菌属菌株的筛选方法，其通过反复的α-氨基酸月桂酰胺（ALL）、γ-甲基-赖氨酸（ML）和Nω-苄氧羰基-赖氨酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸（AEC）抗性筛选使得菌株L-赖氨酸产量提高50-60%。WO2009/014117通过基因工程途径修饰和降低了内消旋α-ε-二氨基庚二酸合成途径酶的活性，并导入编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因，获得了一种具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌。
离子束生物工程技术作为一种全新的诱变育种技术已广泛地应用于生物育种方面。低能氮离子作用于微生物时，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。此诱变技术已分别应用于谷氨酸、L-乳酸（CN 102653724 A）生产菌株选育，使得谷氨酸、L-乳酸分别提高35%、46%。
发明内容
本发明的第一目的是提供了一种能够简单、高效、安全生产L-赖氨酸的菌株。
本发明第二目的是提供一种上述菌株的获取方法。
本发明第三目的是提供一种利用上述菌株生产L-赖氨酸的方法。
为了实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下：
一种生产L-赖氨酸的菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。
本发明菌株的形态学及生理生化特征如下：
菌落颜色：灰白色。
需氧方式：好氧生长。
菌落大小：0.3~0.8×1~4μm
适宜生长温度：34-40℃。
适宜生长pH：6.8-7.2。
菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。
革兰氏染色：阴性。
上述大肠杆菌NT1003△Met△Thr的获取方法，是以E. coli A301为出发菌株，通过紫外-氯化锂复合诱变，低能离子注入诱变，初、复筛而得到。
具体地说，所述大肠杆菌NT1003△Met△Thr的获取方法包括如下步骤：
1）菌悬液制备
E. coli A301与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度为106个/mL； 
2）紫外-氯化锂复合诱变
将步骤1）的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在搅拌速率100-150 rpm下，进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的LB平板培养基中，在34-40 ℃下避光倒置培养1-2 d；
3）低能离子注入诱变
将步骤2）中培养后的菌株洗涤，并制成菌悬液涂布于无菌空平皿上，吹干后，进行氮离子注入，后洗脱 、涂布到LB平板培养基上，在34-40℃下避光倒置培养1-2 d；
4）初筛
挑取步骤3）培养得到的单菌落，接种至斜面培养基上活化，在34-40℃下倒置培养1-2 d后，移至种子培养基中搅拌培养8-12 h；
将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到1L发酵罐中，同时通入空气，搅拌发酵32-80 h，检测发酵液中L-赖氨酸含量，初筛出L-赖氨酸含量大于55 g/L的菌落； 
发酵过程中，采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH；
5）复筛
将步骤4）初筛得到的单菌落接种至斜面培养基上活化，在34-40 ℃下倒置培养1-2 d后，移至种子培养基中搅拌培养8-12 h；
将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到5L发酵罐中，同时通入空气，搅拌发酵32-80 h；检测发酵液中L-赖氨酸含量，筛选出L-赖氨酸产量高的菌落；
重复步骤1）至步骤5），最终筛选出发酵液中L-赖氨酸含量为60 g/L及以上的目标菌株大肠杆菌 NT1003△Met△Thr。
上述大肠杆菌NT1003△Met△Thr的获取方法中，所述步骤1）中氯化锂的添加量为无菌水质量的3-5%，优选4%；
所述步骤2）中氯化锂的添加量为LB平板培养基质量的3-5%，优选4%；所述紫外照射条件：30W紫外灯；照射距离25cm；照射时间30-110 s，优选50 s；
所述步骤3）中低能氮离子注入条件：2-4 Kv/cm×3-9 min（在电场强度为2-4 Kv/cm的条件下，诱变3-9 min），优选为：3 Kv/cm×7 min；注入剂量为20×1014-50×1014 ions/cm2；优选40×1014 ions/cm2。
所述步骤4）和5）中，种子培养中搅拌速度为180-220 rpm；接种量为3-10%(v/v)；发酵中搅拌速度为200-500 rpm。
本发明中，所述LB培养基，包含如下质量百分数组分：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
所述种子培养基包含如下质量百分数组分：碳源 0.1%-0.2%、氮源3%-8%、无机盐0.5%-1.3%，其余为水，pH 6.8-7.2。其中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；所述氮源为蛋白胨、酵母提取物或硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐或钙盐中的一种或几种混合。优选种子培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖 0.05%、蔗糖0.15%、蛋白胨3%、酵母提取物3%、硫酸铵2%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.1%、硫酸亚铁0.05%、硫酸锰0.03%、磷酸二氢钠0.25%、碳酸钙0.17%，其余为水，pH 6.8-7.2。
所述发酵罐中的发酵培养基包含如下质量百分数组分：碳源 1.5%-20%，氮源0.5%-2%，无机盐0.1%-1%，其余为水，pH 6.8-7.2；其中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母提取物或硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐或钙盐中的一种或几种混合。发酵过程采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH。优选发酵培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖 6%、蔗糖14%、玉米浆1%、花生饼粉0.4%、黄豆饼粉0.4%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.08%、硫酸镁0.02%、硫酸亚铁0.04%、硫酸锰0.05%、磷酸二氢钠0.15%、碳酸钙0.13%，其余为水，pH 6.8-7.2。发酵过程采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH。
一种利用大肠杆菌NT1003△Met△Thr生产L-赖氨酸的方法，包括如下步骤：
1）斜面培养
将NT1003△Met△Thr接种于斜面培养基中，培养温度34-40 ℃，培养时间1-2 d；
2）种子培养
将步骤1）斜面培养的菌株NT1003△Met△Thr接种于种子培养基中，培养温度为34-40 ℃，搅拌培养8-12 h；
3）发酵培养
将步骤2）种子培养后的菌株NT1003△Met△Thr按一定接种量移到5L发酵罐中，5L发酵罐中装液量为2-3L，培养温度为34-40 ℃；同时通入空气，以保持发酵体系中适宜的溶氧环境，搅拌发酵32-80 h。
在利用菌株NT1003△Met△Thr生产L-赖氨酸的方法中，所述斜面培养基为LB培养基，具体配方同上。
所述步骤2）中，搅拌速度为180-220 rpm；种子培养基配方同上。
所述步骤3）中，搅拌速度为200-500 rpm；接种量为3-10%(v/v)；发酵培养基配方同上。
作为本发明大肠杆菌NT1003△Met△Thr生产L-赖氨酸的一个优选实施方式，所述斜面培养基的配方：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2；
所述种子培养基的配方：蔗糖2%、蛋白胨2%、硫酸铵2%、酵母提取物1%、磷酸氢二钾0.4%、硫酸镁0.3%、硫酸亚铁0.02%、硫酸锰0.07%，其余为水，pH 6.8-7.2；
所述发酵培养基的配方：葡萄糖20%、玉米浆1.5%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0. 5%、硫酸锰0. 2%、硫酸亚铁0.4%、硫酸镁0.1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
本发明有益效果：
本发明采用将低能氮离子注入和紫外-氯化锂复合诱变相结合，最终筛选获得一株生产L-赖氨酸的大肠杆菌NT1003△Met△Thr，菌株连续传代7次后发酵液中L-赖氨酸含量为100 g/L左右，无显著变化，遗传稳定性好；利用该菌株生产L-赖氨酸，可较大幅度提高发酵产物中L-赖氨酸含量。
附图说明
图1 为大肠杆菌NT1003△Met△Thr的诱变筛选流程图。
具体实施方式
本发明所述的生物材料，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址是：中国.武汉.武汉大学），保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。
下面列举实施例对本发明进行进一步说明，但并不因此限制本发明的内容。
实施例1：本实施例说明将 E. coli A301作为出发菌株诱变筛选大肠杆菌NT1003△Met△Thr的方法。
本实施例中：
1）LB培养基，由如下质量百分数组分组成：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
2）种子培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖 0.05%、蔗糖0.15%、蛋白胨3%、酵母提取物3%、硫酸铵2%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.1%、硫酸亚铁0.05%、硫酸锰0.03%、磷酸二氢钠0.25%、碳酸钙0.17%，其余为水，pH 6.8-7.2。
3）发酵培养基，由如下质量百分数组分组成：葡萄糖 6%、蔗糖14%、玉米浆1%、花生饼粉0.4%、黄豆饼粉0.4%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.08%、硫酸镁0.02%、硫酸亚铁0.04%、硫酸锰0.05%、磷酸二氢钠0.15%、碳酸钙0.13%，其余为水，pH 6.8-7.2。发酵过程采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH。
以重组大肠杆菌E. coli A301 (陈可泉等，氮源对重组大肠杆菌发酵产L-精氨酸的影响，生物加工过程，2011年11月第9卷第6期，P11-14)为出发菌株。该出发菌株系申请人拥有的在先公开文献公开的菌株，由申请人自行保藏，申请人在此声明从本专利申请日起免费向公众发送该出发菌株。
如图1所示，获取大肠杆菌NT1003△Met△Thr的具体步骤如下：
1）菌悬液制备
取37℃恒温培养1 d的E. coli A301新鲜斜面，加无菌水15 mL，刮洗下菌株并转入带有玻璃珠的250 mL三角瓶内，向三角瓶中加入含4%氯化锂的无菌水制成菌悬液，调整细菌浓度在106个/mL；
2）紫外-氯化锂复合诱变
取15 mL步骤1）的菌悬液，转入含有磁力转子的无菌空平板中，在100 rpm搅拌速度下，置于30W紫外灯下25cm处进行紫外照射诱变，照射时间为50s，诱变结束后取菌悬液涂布于含4%氯化锂的LB平板培养基中，在37℃下避光倒置培养1d；
3）低能离子注入诱变
用无菌水洗涤步骤2）中培养后的大肠杆菌2次，并制成菌悬液，取0.1 mL菌悬液均匀涂布于无菌空平皿上，以无菌风吹干，在3 Kv/cm×7min，注入剂量为40×1014 ions/cm2 条件下对大肠杆菌进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到LB平板培养基上，37℃下避光倒置培养1d；
4）初筛
将步骤3）诱变得到的若干单菌落接种至斜面培养基上活化，在37℃下倒置培养1d后，用接种环分别挑取一环活化菌株至其种子培养基中，搅拌速度200 rpm，培养10h后，再按10%(v/v)的接种量接入到1L发酵罐中的发酵培养基中，同时通入空气，搅拌速度400 rpm，发酵80 h。检测发酵液中L-赖氨酸含量，初筛出发酵液中L-赖氨酸含量大于55 g/L的单菌落。
5）复筛
将步骤4）初筛的单菌落接种至斜面培养基上活化，在37℃下倒置培养1 d后，用接种环挑取一环活化菌株至种子培养基中，搅拌速度200 rpm，培养10h后，按10%(v/v)的接种量接入到5L发酵罐中的发酵培养基中，同时通入空气，搅拌速度400 rpm，发酵80 h；检测发酵液中L-赖氨酸含量，复筛出发酵液中L-赖氨酸含量高的单菌落。
再将步骤5）复筛得到的单菌落配制成菌悬液，重复步骤1）至步骤5），当SBA-40E生物传感仪测定发酵液中L-赖氨酸含量为60 g/L及以上时，所对应的菌株为目标菌株大肠杆菌NT1003△Met△Thr。
实施例2
按照实施例1的诱变筛选方法获取大肠杆菌NT1003△Met△Thr。
其中，氯化锂添加量为LB平板培养基质量的3%；紫外照射时间为110s；低能氮离子注入条件为4 Kv/cm×3 min，注入剂量为50×1014 ions/cm2.。
实施例3
按照实施例1的诱变筛选方法获取大肠杆菌NT 1003。
其中，氯化锂添加量为LB平板培养基质量的5%；紫外照射时间为30s；低能氮离子注入条件为42 Kv/cm×9 min，注入剂量为20×1014 ions/cm2.。
上述实施例1-3获得的大肠杆菌 NT 1003的形态学及生理生化特征如下：
菌落颜色：灰白色。
需氧方式：好氧生长。
菌落大小：0.3~0.8×1~4μm。
适宜生长温度：34-40℃。
适宜生长pH：6.8-7.2。
菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。
革兰氏染色：阴性。
实施例1-3的大肠杆菌NT1003△Met△Thr的遗传稳定性测试
在以葡萄糖和蔗糖为碳源的发酵培养基中，检测实施例1-3获取的突变株大肠杆菌NT1003△Met△Thr的遗传稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示。发酵液中L-赖氨酸含量由SBA-40E生物传感仪测定。
表1 大肠杆菌NT1003△Met△Thr的遗传稳定性试验
Figure 201310285525X100002DEST_PATH_IMAGE002
从实验结果可以看出，经过7次传代，突变株大肠杆菌NT1003△Met△Thr的L-赖氨酸产量稳定，具有较好的遗传稳定性。
实施例4：本实施例说明大肠杆菌NT1003△Met△Thr生产L-赖氨酸的方法
本实施例所用的培养基配方：
斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
种子培养基：葡萄糖 0.1%、蔗糖0.1%、蛋白胨2%、硫酸铵1%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.03%、硫酸亚铁0.05%、硫酸锰0.02%、磷酸二氢钠0.05%、碳酸钙0.05%，其余为水，pH 6.8-7.2。
发酵培养基：葡萄糖 1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.5%、硫酸铵1%，磷酸二氢钾0.05%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.02%、氯化钠0.01%，其余为水，pH 6.8-7.2。
1）斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌NT1003△Met△Thr接种于斜面培养基中，在37 ℃条件下活化1 d；
2）种子培养
将步骤2）斜面培养的菌株NT1003△Met△Thr接种于种子培养基中，500 mL三角瓶中装液量为20 mL，培养温度为34 ℃，180 rpm摇床转速下培养12 h；
3）发酵培养
将步骤3）种子培养的菌株NT1003△Met△Thr接种到发酵培养基中，接种量为3%(v/v)，5 L发酵罐中装液量为2 L，培养温度为34 ℃，同时通入空气，以保持发酵体系中适宜的溶氧环境，搅拌速度在400 rpm，发酵过程采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH，发酵时间为32 h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸含量为60 g/L。
实施例5：本实施例说明大肠杆菌NT1003△Met△Thr生产L-赖氨酸的方法
本实施例所用的培养基配方：
斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
种子培养基：蔗糖2%、蛋白胨3%、硫酸铵5%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.3%、硫酸亚铁0.5%、碳酸钙0.5%，其余为水，pH 6.8-7.2。
发酵培养基：蔗糖10%、硫酸铵1.5%，磷酸二氢钾0. 5%、硫酸锰0. 3%、硫酸镁0.4%、硫酸镁0.3%、碳酸钙0.5%，其余为水，pH 6.8-7.2。
1）斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌将NT1003△Met△Thr接种于斜面培养基中，在40 ℃条件下活化1 d；
2）种子培养
将步骤2）斜面培养的菌株NT1003△Met△Thr接种于种子培养基中，500 mL三角瓶中装液量为30 mL，培养温度为40 ℃，220 rpm摇床转速下培养8 h；
3）发酵培养
将步骤3）种子培养的菌株NT1003△Met△Thr接种到发酵培养基中，接种量为10%(v/v)，5 L发酵罐中装液量为3 L，培养温度为40 ℃，同时通入空气，以保持发酵体系中适宜的溶氧环境，搅拌速度在400 rpm，发酵过程采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH，发酵时间为80 h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸含量为57 g/L。
实施例6：本实施例说明大肠杆菌NT1003△Met△Thr发酵生产L-赖氨酸的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
种子培养基：蔗糖2%、硫酸铵5%、酵母提取物1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.3%、硫酸亚铁0.5%、碳酸钙0.5%，其余为水，pH 6.8-7.2。
发酵培养基：蔗糖20%、硫酸铵1.5%，磷酸二氢钾0. 5%、硫酸锰0. 3%、硫酸镁0.4%、硫酸亚铁0.3%、碳酸钙0.1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
1）斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌NT1003△Met△Thr接种于斜面培养基中，在38 ℃条件下活化2 d；
2）种子培养
将步骤2）斜面培养的菌株NT1003△Met△Thr接种于种子培养基中，500 mL三角瓶中装液量为30 mL，培养温度为38 ℃，200 rpm摇床转速下培养8 h；
3）发酵培养
将步骤3）种子培养的菌株NT1003△Met△Thr接种到发酵培养基中，接种量为8%(v/v)，5 L发酵罐中装液量为3 L，培养温度为38 ℃，发酵罐中通入空气，以保持发酵体系中适宜的溶氧环境，搅拌速度在400 rpm，发酵过程采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH，发酵时间为72 h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸含量为62 g/L。
实施例7：本实施例说明大肠杆菌NT1003△Met△Thr生产L-赖氨酸的方法
本实施例所用的培养基配方：
斜面培养基：LB培养基，质量百分数组分为：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
种子培养基：蔗糖2%、蛋白胨2%、硫酸铵2%、酵母提取物1%、磷酸氢二钾0.4%、硫酸镁0.3%、硫酸亚铁0.02%、硫酸锰0.07%，其余为水，pH 6.8-7.2。
发酵培养基：葡萄糖10%、蔗糖10%、玉米浆1.5%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0. 5%、硫酸锰0. 2%、硫酸亚铁0.4%、硫酸镁0.1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
1）斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌NT1003△Met△Thr接种于斜面培养基中，在37 ℃条件下活化2 d；
2）种子培养
将步骤2）斜面培养的菌株NT1003△Met△Thr接种于种子培养基中，500 mL三角瓶中装液量为50 mL，培养温度为37 ℃，200 rpm摇床转速下培养10 h；
3）发酵培养
将步骤3）种子培养的菌株NT1003△Met△Thr接种到发酵培养基中，接种量为10%(v/v)，5 L发酵罐中装液量为2 L，培养温度为37 ℃，发酵罐中通入空气，以保持发酵体系中适宜的溶氧环境，搅拌速度在500 rpm，发酵过程采用氨水、2 mol/L盐酸控制发酵液pH，发酵时间为80 h。经SBA-40E型生物传感仪测得发酵液中L-赖氨酸含量为58g/L。

Claims (10)

1.一株产L-赖氨酸的菌株，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。
2.权利要求1所述的大肠杆菌NT1003△Met△Thr的获取方法，其特征在于，是以E. coli A301为出发菌株，通过紫外-氯化锂复合诱变，低能离子注入诱变，初、复筛而得到的。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）菌悬液制备
E. coli A301与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度为106个/mL； 
2）紫外-氯化锂复合诱变
将步骤1）的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在100-150 rpm搅拌速度下，进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的LB平板培养基中，在34-40 ℃下避光倒置培养1-2 d；
3）低能离子注入诱变
将步骤2）中培养后的菌株洗涤，并制成菌悬液涂布于无菌空平皿上，吹干后，进行氮离子注入，后洗脱 、涂布到LB平板培养基上，在34-40℃下避光倒置培养1-2 d；
4）初筛
将步骤3）培养得到的单菌落接种至斜面培养基上活化，在34-40℃下倒置培养1-2 d后，移至种子培养基中搅拌培养8-12 h；
将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到1L发酵罐中，同时通入空气，搅拌发酵32-80 h，检测发酵液中L-赖氨酸含量，初筛出L-赖氨酸含量大于55 g/L的菌落； 
5）复筛
将步骤4）初筛得到的单菌落接种至斜面培养基上活化，在34-40 ℃下倒置培养1-2 d后，移至种子培养基中搅拌培养8-12 h；
将若干培养好的菌落按一定接种量分别接种到5L发酵罐中，同时通入空气，搅拌发酵32-80 h；检测发酵液中L-赖氨酸含量，筛选出L-赖氨酸产量高的菌落；
重复步骤1）至步骤5），最终筛选出发酵液中L-赖氨酸含量稳定在60 g/L及以上的目标菌株大肠杆菌 NT1003△Met△Thr。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中氯化锂的添加量为无菌水质量的3-5%；
所述步骤2）中氯化锂的添加量为LB平板培养基质量的3-5%；
所述步骤4）和5）中，种子培养中搅拌速度为180-220 rpm；接种量为3-10%(v/v)；发酵中搅拌速度为200-500 rpm。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中紫外照射条件：30W紫外灯；照射距离25cm；照射时间30-110 s。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中低能氮离子注入条件：2-4 Kv/cm×3-9 min，注入剂量为20×1014-50×1014 ions/cm2。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB培养基包含如下质量百分数组分：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠 1%，其余为水，pH 6.8-7.2；
所述种子培养基包含如下质量百分数组分：碳源 0.1%-0.2%、氮源3%-8%、无机盐0.5%-1.3%，其余为水，pH 6.8-7.2；其中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；所述氮源为蛋白胨、酵母提取物或硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐或钙盐中的一种或几种混合；
所述发酵培养基包含如下质量百分数组分：碳源 1.5%-20%，氮源0.5%-2%，无机盐0.1%-1%，其余为水，pH 6.8-7.2；其中，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母提取物或硫酸铵中的一种或几种混合；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐或钙盐中的一种或几种混合。
8.一种利用权利要求1所述的大肠杆菌NT1003△Met△Thr生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）斜面培养
将NT1003△Met△Thr接种于斜面培养基中，培养温度34-40 ℃，培养时间1-2 d；
2）种子培养
将步骤1）斜面培养的菌株NT1003△Met△Thr接种于种子培养基中，培养温度为34-40 ℃，搅拌培养8-12 h；
3）发酵培养
将步骤2）培养后的菌株NT1003△Met△Thr接种到发酵培养基中，培养温度为34-40 ℃；同时通入空气，搅拌发酵32-80 h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中的斜面培养基为LB培养基，具体配方同权利要求7所述；
所述步骤2）中，搅拌速度为180-220 rpm；种子培养基配方同权利要求7；
所述步骤3）中，搅拌速度为200-500 rpm；发酵培养基配方同权利要求7。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的配方：蔗糖2%、蛋白胨2%、硫酸铵2%、酵母提取物1%、磷酸氢二钾0.4%、硫酸镁0.3%、硫酸亚铁0.02%、硫酸锰0.07%，其余为水，pH 6.8-7.2；
所述发酵培养基的配方：葡萄糖20%、玉米浆1.5%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0. 5%、硫酸锰0. 2%、硫酸亚铁0.4%、硫酸镁0.1%，其余为水，pH 6.8-7.2。
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