CN111153995A - Nkg2a抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Nkg2a抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向NKG2A的抗体、其制备方法和用途。具体地，本发明公开了一种新的靶向NKG2A的鼠源或人源化单克隆抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合NKG2A抗原，其具有很高的亲和力并且具有显著抗肿瘤等活性。

Description

NKG2A抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗体领域，具体地涉及一种NKG2A抗体及其制备方法和应用。
背景技术
保持有效的免疫监视而不引起自身免疫反应需要效应T细胞反应的准确性。当免疫***针对自身抗原发起免疫反应时便出现自身免疫性疾病。尽管在引发和维持自身免疫性反应中涉及的机制还不清楚，但是可能涉及在次级淋巴器官中以前在免疫方面被忽视的抗原的出现。
自然杀伤(NK)细胞是包括在非传统免疫中涉及的淋巴细胞的亚种群。NK细胞提供一种有效的免疫监督机制，由此可消除不希望的细胞如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。NK细胞活性是通过包含两种活化和抑制信号的复杂机制进行调控的。
已证实多种不同的NK特异性受体在NK细胞介导的对HLA I类缺陷型靶细胞的识别和杀伤中起重要作用。这些受体(称为NKp30、NKp46和NKp44)是Ig超家族的成员。它们的交联(通过特异性mAb诱导)导致強烈的NK细胞激活，致使细胞内Ca++水平升高，触发细胞毒性和淋巴因子释放。重要的是，单克隆抗体介导的NKp30、NKp46和/或NKp44的活化导致对于多种靶细胞的NK细胞毒性的激活。这些发现为这些受体在天然细胞毒性中的ー种中心性作用提供了证据。
NK细胞上的另一重要的抑制性受体CD94-NKG2A，其与非典型的MHC I类分子HLA-E相互作用。这些受体中的一些具有调节T细胞抗原受体-依赖性T细胞活化的阈值的能力。在罕见的抑制性受体缺乏的情况下，这些活化同类型(isoform)可能扩大T细胞效应器的功能并且促成自身免疫病理。NKG2A的氨基酸序列在哺乳动物(包括灵长类动物)中发生变化。例如，人NKG2A蛋白的和猕猴同源性少于90％。
对于用于调节NKG2A的疗法的努力(主要用于防止炎症)已集中在对非典型MHCI类分子、用于人类受体的HLA-E和用于小鼠受体的Qa-Ib的研究上。对于细胞表面表达，这些MHC分子优选与来源于其他MHC I类分子的信号肽的肽结合。其他I类MHC分子的表达可以调控HLA-E的表达，因此，允许NK细胞在潜在的靶细胞中监控MHC I类依赖性抗原呈递途径的状态。细胞表面HLA-E的水平对于针对肿瘤和病毒感染细胞的NK细胞毒性是至关重要的。用于调节HLA-E表达或功能的治疗方案通常集中在利用HLA-I或HSP60肽来诱导用于防止发炎的保护状态，致使NK细胞不被活化。
尽管目前关于靶向NKG2A的抗体已经开展相关研究，但仍需获得活性更强，亲和力更高的特异性抗体。
发明内容
本发明公开了一种NKG2A抗体及其制备方法和应用。所述NKG2A抗体包括NKG2A抗体的重链可变区重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和NKG2A抗体的轻链可变区轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.8n+3所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+4所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.8n+1所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面述的重链可变区。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源或鼠源的。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.8n+7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+8所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.8n+5所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与NKG2A结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生抗体与NKG2A结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与NKG2A结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)抑制肿瘤细胞迁移或转移；
(b)抑制肿瘤生长。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure BDA0002262950420000051
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；其中，
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.3所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.4所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.11所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.12所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.14所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.15所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.16所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.18所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.19所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.20所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.22所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.23所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.24所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.26所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.27所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.28所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.30所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.31所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.32所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、9、17、25、33、41、49、57或65所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.5、13、21、29、37、45、53、61或69所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体选自下组：
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1 M15-5 1 5
2 Mpb416 9 13
3 Mab031 17 21
4 Mab032 25 29
5 Mab033 33 37
6 Mab036 41 45
7 2F10 49 53
8 9B10 57 61
9 14G3 65 69
。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.1、9、17、25、33、41、49、57或65所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.5、13、21、29、37、45、53、61或69所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括：
(i)选自下组的抗体，
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1 M15-5 1 5
2 Mpb416 9 13
3 Mab031 17 21
4 Mab032 25 29
5 Mab033 33 37
6 Mab036 41 45
7 2F10 49 53
8 9B10 57 61
9 14G3 65 69
以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.73、75、77、79、81、83、85、87或89所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ IDNO.74、76、78、80、82、84、86、88或90所示。
在另一优选例中，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure BDA0002262950420000081
Figure BDA0002262950420000091
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合；和(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第十一方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第十二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在本发明的第十三方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与NKG2A表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述NKG2A表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自身免疫疾病，炎性疾病。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：
(1)检测样品中NKG2A蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的NKG2A蛋白；和/或
(3)检测表达NKG2A蛋白的肿瘤细胞；
而所述药物用于预防和/或治疗与NKG2A表达或功能异常相关的疾病，所述与NKG2A表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫疾病，炎性疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：淋巴细胞白血病，卵巢癌，非小细胞肺癌，头颈癌。
在另一优选例中，所述癌症为HLA-E过表达的癌症。
在另一优选例中，所述癌症为HLA-E过表达的癌症，所述癌症选自下组：淋巴细胞白血病，卵巢癌，非小细胞肺癌，头颈癌。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断NKG2A相关疾病。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中NKG2A蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中NKG2A蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在NKG2A蛋白。
在本发明的第十五方面，提供了一种体外检测样品中NKG2A蛋白的组合物，其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有如本发明的第十六方面所述的检测板。
在本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十九方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
在另一优选例中，所述化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第二十方面，提供了本发明的第五方面所述的抗体，或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、和/或本发明的第十二方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗NKG2A表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
在本发明的第二十一方面，提供了一种治疗与NKG2A表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述与NKG2A表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫疾病，炎性疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：淋巴细胞白血病，卵巢癌，非小细胞肺癌，头颈癌。
在另一优选例中，所述癌症为HLA-E过表达的癌症。
在另一优选例中，所述癌症为HLA-E过表达的癌症，所述癌症选自下组：淋巴细胞白血病，卵巢癌，非小细胞肺癌，头颈癌。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：PD-1抗体、CTLA4抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为对照抗体与NKG2A/CD94蛋白的结合活性。
图2a为ELISA检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价。
图2b为FACS检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价。
图3a为ELISA检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价。
图3b为FACS检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价。
图4为动物免疫的技术流程。
图5a为ELISA检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价。
图5b为ELISA检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价。
图6a为FACS检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价，其中，cyno是指猕猴。
图6b为FACS检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价。
图7为动物免疫的技术流程。
图8a为ELISA检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价。
图8b为ELISA检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价。
图9a为FACS检测免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价。
图9b为FACS检测免疫后SJL小鼠血清抗体效价。
图10为FACS检测NKG2A抗体与CHOK1-hNKG2A/CD94的结合反应。
图11为FACS检测NKG2A抗体与CHOK1-cNKG2A/CD94的结合反应。
图12为FACS检测NKG2A抗体与CHOK1-hNKG2C/CD94的结合反应。
图13为ELISA检测NKG2A抗体与NKG22E的结合反应。
图14为FACS检测抗体的阻断活性。
图15为NKG2A抗体在NK92杀伤实验中的活性检测(抗体增强NK92细胞的杀伤活性)。
图16为NKG2A抗体在原代NK细胞杀伤实验中的活性检测(PBMC供体-1)抗体增强原代NK细胞的杀伤活性，供体1。
图17为NKG2A抗体在原代NK细胞杀伤实验中的活性检测(PBMC供体-2)抗体增强原代NK细胞的杀伤活性，供体2。
图18a为FACS检测人源化NKG2A抗体与CHOK1-hNKG2A/CD94的结合反应。
图18b为FACS检测人源化NKG2A抗体与CHOK1-hNKG2A/CD94的结合反应。
图19a为FACS检测人源化NKG2A抗体与CHOK1-hNKG2C/CD94的结合反应。
图19b为FACS检测人源化NKG2A抗体与CHOK1-hNKG2C/CD94的结合反应。
图20a为FACS检测人源化NKG2A抗体与CHOK1-cNKG2A/CD94的结合反应。
图20b为FACS检测人源化NKG2A抗体与CHOK1-cNKG2A/CD94的结合反应。
图21为FACS检测人源化NKG2A抗体的阻断活性，阻断HLA-E与NKG2A/CD94细胞的结合。
图22人源化NKG2A抗体增强NK92的杀伤活性。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，分别通过噬菌体展示技术和杂交瘤技术，意外地获得一组具有全新氨基酸序列的人鼠嵌合以及人源化的NKG2A抗体(例如M15-5、Mpb416)。本发明所述NKG2A抗体可以和人NKG2A结合，具有高亲和力(KD达到1.04×10-11)(本发明所获抗体较阳性参比抗体的亲和力高出18倍)；并且所述NKG2A抗体能够结合NKG2A蛋白受体的胞外区，并能够在细胞水平有效封闭NKG2A蛋白，阻止NKG2A蛋白与配体HLA-E的结合；所述NKG2A抗体能够显著增加NK92或人NK细胞对靶细胞的杀伤效果；基于原代NK细胞活性实验检测，其生物学活性显著优于参比抗体。此外，本发明所述的NKG2A抗体特异性高，缺乏与人NKG2C和NKG2E同家族蛋白抗原的交叉反应。本发明所述的NKG2A抗体能够用于阻断NKG2A/HLA-E介导的信号通路的负调控、激活机体对肿瘤的天然免疫反应、单独或与抗PD-1等单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合的肿瘤免疫治疗中。本发明抗体能够运用于***、自身免疫性疾病等药物的制备中。在此基础上完成了本发明。
术语
NKG2A
自然杀伤细胞(NK)是体内一类十分重要的淋巴细胞，在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用。在NK细胞表面存在两类表面受体，根据其功能可分为抑制型和激活型两类受体，分别介导NK细胞的不同识别模式，传递不同的活化信号和抑制信号。CD94/NKG2家族是研究较多的一类受体家族，主要包括NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2D，NKG2E，NKG2F，NKG2H等成员。其中，NKG2A属抑制性受体，其配体是非经典主要组织相容性复合物I类分子-HLA-E。表达于靶细胞上的HLA-E分子与NKG2A结合后，对NK细胞的杀伤功能具有抑制作用。因此抑制CD94/NKG2A的抗体可能提高肿瘤特异性淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。另外，某些淋巴瘤例如，NK-淋巴瘤，特征为CD94/NKG2A表达。在这样的患者中，靶向和杀死CD94/NKG2A-表达细胞的治疗性抗体可能能够根除肿瘤细胞。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0002262950420000171
Figure BDA0002262950420000181
抗NKG2A的抗体
本发明中，所述抗体为抗NKG2A的抗体。本发明提供一种针对NKG2A的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.8n+3所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+4所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.8n+7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+8所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
优选地，重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.8n+3所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+4所示的VH-CDR3；
轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.8n+7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+8所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向NKG2A(例如人NKG2A)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、9、17、25、33、41、49、57或65所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.5、13、21、29、37、45、53、61或69所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向NKG2A的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列，和/或，轻链可变区氨基酸序列如下表2-1所示：
表2-1
Figure BDA0002262950420000201
Figure BDA0002262950420000211
在另一优选例中，所述靶向NKG2A的抗体为M15-5、Mpb416、Mab031、Mab032、Mab033、Mab036、2F10、9B10、14G3。
在另一优选例中，所述靶向NKG2A的抗体为M15-5。
在另一优选例中，所述靶向NKG2A的抗体为Mpb416。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白，其包括NKG2A抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，NKG2A抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种，
所述重链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.8n+2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.8n+3所示的VH-CDR2，
SEQ ID NO.8n+4所示的VH-CDR3；
所述轻链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.8n+6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.8n+7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+8所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8、；较佳地n为0；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括NKG2A抗体的重链可变区和/或NKG2A抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、9、17、25、33、41、49、57或65所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.5、13、21、29、37、45、53、61或69所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括NKG2A抗体的重链可变区和NKG2A抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、9、17、25、33、41、49、57或65所示的氨基酸序列，且所述抗体的轻链可变区含有SEQ IDNO.5、13、21、29、37、45、53、61或69所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表2-2所示：
表2-2重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号
Figure BDA0002262950420000221
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体(例如抗NKG2A的抗体)或重组蛋白或抗NKG2A的抗体的重链可变区或轻链可变区。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.73、75、77、79、81、83、85、87或89所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.74、76、78、80、82、84、86、88或90所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.73、75、77、79、81、83、85、87或89所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQID NO.74、76、78、80、82、84、86、88或90所示。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coliBL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drugconjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure BDA0002262950420000281
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与NKG2A表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明中，所述与NKG2A表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与NKG2A表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与NKG2A表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫疾病，炎性疾病。
本发明中，所述癌症为本领域常规的癌症，较佳地为HLA-E过表达的癌症，例如HLA-E过表达的淋巴细胞白血病，卵巢癌，非小细胞肺癌，头颈癌等。
本发明中，所述自身免疫疾病为本领域常规的自身免疫疾病，较佳地为溶血性贫血，恶性贫血，结节性多动脉炎，***性红斑狼疮，阿尔兹海默症，糖尿病等。
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：
(i)诊断、预防和/或***发生、生长和/或转移，尤其是NKG2A高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于)：较佳地为HLA-E过表达的癌症，例如HLA-E过表达的淋巴细胞白血病，卵巢癌，非小细胞肺癌，头颈癌等。
(ii)诊断、预防和/或治疗自身免疫疾病，所述自身免疫疾病包括(但并不限于)：较佳地为溶血性贫血，恶性贫血，结节性多动脉炎，***性红斑狼疮，阿尔兹海默症，糖尿病等。
(ii i)诊断、预防和/或治疗炎性疾病，所述炎性疾病包括(但并不限于)：类风湿关节炎，血管球性肾炎，重症肌无力，多发性硬化，斑秃等。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与NKG2A表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合NKG2A蛋白分子，因而可用于预防和***等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与NKG2A表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与NKG2A表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫疾病，炎性疾病。
检测样品中NKG2A蛋白的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中NKG2A蛋白(例如检测过表达NKG2A细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指NKG2A蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中NKG2A蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所述的NKG2A抗体，其与NKG2A蛋白具有高度亲和力(亲和力常数KD达到1.04×10-11)；
(2)本发明NKG2A抗体能够结合NKG2A蛋白受体的胞外区，并能够在细胞水平有效封闭NKG2A蛋白，阻止NKG2A蛋白与配体HLA-E的结合；
(3)本发明所述的NKG2A抗体特异性高，缺乏与人NKG2C和NKG2E同家族蛋白抗原的交叉反应；
(4)通过原代分离的NK细胞和NK92细胞系介导的杀伤实验证明，本发明抗体能显著增加两种细胞来源NK细胞对高表达HLA-E肿瘤细胞的裂解杀伤活性。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。
实施例1NKG2A抗体的制备
(一)、免疫原A的制备
将含有编码人源NKG2A蛋白胞外区氨基酸序列Pro94-Leu233(如序列表SEQIDNO.91所示)的核苷酸序列克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。同时将含有编码人源CD94蛋白胞外区氨基酸序列Lys32-Ile179(如序列表SEQ ID NO.92所示)的核苷酸序列克隆到带有人IgGFc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50,并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press)。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle TM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含NKG2A和CD94蛋白胞外区异源二聚蛋白的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(Mabselect Sure，购自GE Healthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的NKG2A/CD94蛋白(NKG2A/CD94-hFc)，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原A。免疫原A在使用前进行一系列质控检测，如检测其蛋白浓度、纯度、分子量、生物活性等。
结果如图1所示。NKG2A/CD94蛋白与对照抗体在蛋白水平的结合随抗体的浓度变化而变化，其中对照蛋白为非NKG2A/CD94融合蛋白，表中的数据为OD450nm值。
(二)、免疫原B的制备
NKG2A全长氨基酸序列cDNA(如序列表SEQ ID NO.93所示)与CD94全长氨基酸从DNA序列(如序列表SEQ ID NO.94所示)被克隆到Pcho1.0载体(购自Invitrogen)，并包被到1.0um金胶体子弹上，用Helios基因枪(Helios Gene Gun System，Bio-rad，货号165-2431)免疫。其中，包被到1.0μm金胶体子弹和免疫的方法参见Helios基因枪说明书。免疫后即获得了免疫原B。
(三)、免疫原C的制备
将已制备好的免疫原B对HEK293细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(PEI，购自Polysciences)后，在含0.5μg/ml的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO2培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的NKG2A抗体(CP in house)与CD94抗体(购自eBioscience)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原C。具体选择结果如表3所示，表3中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比。即获得一系列NKG2A与CD94均阳性表达的HEK293细胞系。
表3 NKG2A/CD94蛋白转染的HEK293细胞FACS筛选检测结果
Figure BDA0002262950420000341
(四)、免疫原D的制备
将已制备好的免疫原B对CHOK1细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(PEI，购自Polysciences)后，在含0.5μg/ml的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO2培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的NKG2A抗体(CP in house)与CD94抗体(购自eBioscience)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原C。具体选择结果如表4所示，表4中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比。
表4 NKG2A/CD94转染的CHOK1细胞FACS筛选检测结果
Figure BDA0002262950420000351
表4说明，已经制得一系列NKG2A与CD94均阳性表达的CHOK1细胞系。
(五)、免疫原E的制备
将猕猴NKG2A全长氨基酸序列(如序列表SEQ ID NO.95所示)与CD94全长氨基酸(如序列表SEQ ID NO.96所示)被克隆到Pcho1.0载体(购自Invitrogen)。将已制备好的质粒对293细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(PEI，购自Polysciences)后，在含0.5μg/ml的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO2培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的NKG2A抗体(CP in house)与CD94抗体(购自eBioscience)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原E。
(四)、杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
A、免疫原A免疫采用6～8周龄Balb/c小鼠，小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时，免疫原A蛋白用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白。加强免疫时，免疫原A蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中免疫原A的抗体效价和特异性。
结果如图2a,经人NKG2A/CD94ECD-Fc免疫的小鼠血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在十万左右。图2b则显示小鼠血清对细胞表面人NKG2A也能够特异性结合，其中最高稀释度在1000倍。
B、免疫原D免疫采用6～8周龄SJL小鼠，小鼠在SPF条件下饲养。将免疫原D在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用F12K基础培养基(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(购自Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用F12K基础培养基洗涤2次，进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释至2×107细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中抗体效价和特异性。
结果如图3a,小鼠血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在一万左右。图3b则显示小鼠血清对细胞表面人NKG2A也能够特异性结合，其中最高稀释度在1000倍。
C、免疫原E免疫采用6～8周龄SJL和Balb/c小鼠，小鼠在SPF条件下饲养。将免疫原E在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用DMEM基础培养基(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(购自Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用DMEM基础培养基洗涤2次，进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释至2×107细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用FACS检测血清中抗体效价和特异性。在第二次免疫后，更换免疫原A进行免疫，初次免疫时，免疫原A用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白,第三次免疫时，免疫原A蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白(图4)。加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中免疫原A的抗体效价和特异性。
结果如图所示(图5a，图5b，图6a，图6b)，经NKG2A/CD94-ECD-Fc免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中批次TB3指第三次加强免疫后第七天的小鼠血清。FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上，ELISA效价在1:100，000以上。
D、免疫原B免疫采用6～8周龄的Balb/c或SJL小鼠在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用Helios基因枪免疫4次，每次4枪，每枪1.0微克cDNA。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用ELISA或FACS检测血清中抗体效价。在第二次加强免疫后，更换免疫原A进行免疫，初次免疫时，免疫原A用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白,第三次免疫时，免疫原A蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白(图7)。加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中免疫原A的抗体效价和特异性。
结果如图所示(图8a，图8b，图9a，图9b)，经NKG2A/CD94-ECD-Fc免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，其中批次指第三次加强免疫后第七天的小鼠血清。FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上，ELISA效价在1:100，000以上。
A～D步骤完成前，将所选择的每只小鼠最后一次免疫腹腔注射100微克纯化的hNKG2A/CD94-ECD-Fc(针对免疫原A，免疫原C和免疫原D进行免疫反应的小鼠)或含人NKG2A和CD94的CHOK1稳定细胞系(针对免疫原B进行免疫反应的小鼠)，3-4天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH4OH至终浓度1％(w/w)，裂解脾细胞中的红细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)混合，采用高效电融合方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1×HAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1×105/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO2、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后用ELISA和Acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，将ELISA中OD450nm>1.0和Acumen中Percentage％值>15的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)HT胎牛血清，DMEM(invitrogen)在37℃，5％(v/v)CO2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，用FACS确定对NKG2A/CD94阳性细胞的结合活性(结合活性的检测方法请分别参见实施例3A和实施例3B)，配体受体结合实验确定抗体样品对NKG2A受体的封闭活性(结合活性的检测方法请分别参见实施例4)。
根据24孔板筛选结果，挑选FACS实验中与表达人NKG2A和CD94，表达猴NKG2A和CD94的CHOK1细胞结合呈阳性，且与表达人NKG2C和CD94的CHOK1细胞结合呈阴性的杂交瘤克隆进行克隆，同时检测杂交瘤细胞培养上清对NKG2A受体的封闭作用，作为挑选克隆的备选标准。
选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)37℃，5％(v/v)CO2条件下培养。亚克隆后10天用ELISA和Acumen进行初步筛选，挑选单个阳性单克隆，扩增到24孔板继续培养。3天后用FACS确定抗原结合阳性并用NKG2A受体配体结合实验评估生物活性。
根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，并于含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)在37℃，5％(v/v)CO2条件下将该最优的克隆进行扩大培养，液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产和纯化。
实施例2先导抗体的生产和纯化
杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1-10μg/毫升，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5毫克)抗体生产纯化。
将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridomaserum free medium，购自Invitrogen公司)驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入500毫升生产培养基，接种细胞密度为1.0×105/毫升。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速3转/分钟。连续旋转培养14天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用0.45微米的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。
澄清的杂交瘤细胞的培养上清液(300mL)中的单克隆抗体用2mL蛋白G柱(购自GEHealthcare)纯化。蛋白G柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白G柱，控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白G柱，平衡缓冲液的体积为4倍蛋白G柱柱床体积。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH2.5)洗脱结合在蛋白G柱上的NKG2A抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％1.0MTris-HCl缓冲液中和pH，所述百分比为体积百分比，然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析3小时。收集透析后的NKG2A抗体，用0.22微米的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的NKG2A抗体。
将纯化的NKG2A抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度等检测分析，结果如表5所示，结果发现，抗体最终产品内毒素浓度在1.0EU/毫克以内。
表5纯化抗体的性质分析
Figure BDA0002262950420000391
实施例3轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA分离：将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例3～6的检定和活性测定后)，通过离心搜集5×107个杂交瘤细胞，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟；加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清；加入1mL 75％(v/v)乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促进溶剂10分钟)，即得总RNA。
逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μl体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μl PCR体系，包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs；设置PCR程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒包括Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。
克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为
Figure BDA0002262950420000401
Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞(Ecos 101competent cells,购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟，而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μl无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μlPCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株；PCR反应结束后，取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析[参见Kabat，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]。
测序结果见附录中本发明的序列信息。
实施例4噬菌体展示制备NKG2A抗体
获取脾脏细胞：分别将HNKG2A/CD94-ECD-Fc和CHOK-1/HNKG2A/CD94作为抗原免疫过的小鼠，用293/cynoNKG2A/CD94细胞做冲刺免疫，3天后分离小鼠脾脏细胞制备免疫库。将分离的脾细胞重悬到DMEM培养基中，2000rpm，4℃离心10min，弃去上清。用RNAiso plus(购自Takara，货号：9108)裂解细胞沉淀，比例为1ml RNAiso plus加入一只小鼠的脾脏，室温孵育5min后，保存于-80℃。
抽提RNA:将冻存的小鼠脾脏细胞于室温解冻并涡旋5min。每1ml的RNAisoplus样品中加入0.2ml的1-溴-3-氯丙烷(1-Bromo-3-chloropropane，购自Sigma，货号：B9673-200ml)，剧烈震荡15seconds，然后于室温孵育5min。将样品4℃，12000g离心10min，将水相转移到一只新管，加入0.7ml异丙醇沉淀RNA,室温孵育10min后，12000g离心10min，4℃，弃去上清。将RNA沉淀用1ml 75％乙醇(无RNAase)洗涤一次，12000g离心5min，4℃，弃去上清。干燥RNA沉淀15min后，用40ul含DEPC的水(购自Invitrogen，46-2224)溶解RNA，轻柔混匀并于室温放置5min。将所有样品的RNA各取一半混合，并对所获得RNA库进行浓度测定，结果为2175.6ng/ul。
cDNA文库的制备：参照逆转录试剂盒5*PrimeScriptTMRT Master Mix(购自Takara，货号RR036A)准备逆转录反应体系如下表，进行热循环。设定条件为37℃20min，85℃20s，4℃持续。将所获得逆转录产物混合，并分为两份。一份保存于-80℃，一份储存于4℃进行后续实验。
表6 PCR反应体系
试剂 体积(ul) Master Mix(*3)
5*Mix 20 60
RNA 6.9 21
H2O 补充至100
VH和VL库的扩增和纯化：扩增用引物设计参见Journal ofImmunologicalMethods 201(1997),35-5。分别混合重链，轻链的正向，反向扩增引物，并准备PCR反应如下：
表7-1 PCR反应
Figure BDA0002262950420000411
Figure BDA0002262950420000421
设定PCR程序如下：
表7-2 PCR程序
94℃ 1min 30s
94℃ 1min
63℃ 30s
58℃ 50s
72℃ 1min
94℃ 1min
63℃ 1min
72℃ 1min
72℃ 5min
4℃ 持续
PCR结束，对扩增产物进行凝胶纯化，结果显示分别获得230ng/ul，170ng/ul的VH和VL。将获得的VH和VL库通过SOE(splicing overlap extension)PCR的方法组装scFvs，将所得PCR产物进行纯化(QIAquick Gel)/PCR纯化试剂盒，购自QIAGEN,货号28706)，最终获得纯化scFv的浓度为130ng/ul。
制备噬菌粒：将pCAN载体与scFv用Sfi酶(购自NEB,货号R0123S)进行酶切，并胶回收酶切产物，对所获得pCAN载体和scFv用T4连接酶(购自NEB)进行酶连反应，并用纯化试剂盒(购自Qiagen，货号：28014)纯化所得连接产物，用于制备免疫噬菌体库。
免疫噬菌体库的制备：将500ng上述纯化所得DNA与200ul TG1感受态大肠杆菌(可通过常规方法获得该感受态)混合并进行电转。将电转产物于1ml YT培养中震荡培养1h，37℃。取10ul细胞悬液以10倍梯度稀释后(10-4,10-5,10-6)，涂平板检测库容。
离心收集细菌沉淀，弃去多余菌液，将细菌沉淀重悬后涂平板，培养过夜。第二天刮下培养板中细菌克隆，离心收集沉淀，并重悬于4ml 2*YT培养基(medium)(含40％甘油)，将所得免疫库冻存于-80℃。
淘选：
方案一：将上述获得免疫库用CHOK1/NKG2C/CD94细胞进行负筛选。将收集的CHOK1/NKG2C/CD94细胞用10ml噬菌体液体重悬，4℃转动孵育1h，离心去除细胞，收集上清中的噬菌体库进行下一步的淘选。将上述所得上清与CHOK1/hNKG2A/CD94和CHOK1细胞进行正筛选，等体积孵育细胞与上清，4℃转动孵育1.5h。用PBS重复洗涤细胞沉淀，并重悬至1mlGlycine(购自ShanghaiLingfeng化学，货号：56-40-6)洗脱缓冲液中(ph2.2)洗脱噬菌体，室温孵育15min，并轻柔颠倒混匀。18000g离心10min后，将上清转移至新的离心管，加入100ul 2M Tris(pH8)进行中和。将1mL的上述溶液加到4mL处于对数生长期的大肠杆菌TG1中，37℃孵育30分钟，得到TG1的培养液。将TG1的培养液梯度稀释，涂布平板，37℃培养过夜。计算所得的HNKG2A/CD94结合的和对照管的克隆数，并挑选30个克隆测序。第一轮淘选后共获得1300个克隆。
方案二：首先将上述获得免疫库用CD94-ECD-Fc与CHOK-1细胞进行负筛选。将免疫小管用40ug的Anti-hFc(购自ROCKLAND,货号009-1103)于2ml PBS中进行包被，随后加入23ug的CD94-Fc蛋白室温孵育1h。同时用3ml的2％MPBS(含2％脱脂奶粉(Non-fat DryMilk)，购自Bio-Rad，货号170-6404)对phage于4℃封闭1h，将封闭好的phage加入偶联CD94蛋白的免疫小管，室温孵育1h，随后将封闭好的CHOK1细胞沉淀用phage上清重悬，补足2％MPBS至11ml，4℃转动孵育1h。对CD94和CHOK1细胞负筛选过的phage进行CHOK-hNKG2A/CD94细胞正筛选。用上述所得phage重悬，并于4℃孵育2h，并轻柔震动。用PBS重复洗涤细胞沉淀，并重悬至1ml Glycine(购自Shanghai Lingfeng化学，货号：56-40-6)洗脱缓冲液中(ph2.2)洗脱噬菌体，室温孵育15min，并轻柔颠倒混匀。18000g离心10min后，将上清转移至新的离心管，加入100ul 2M Tris(pH8)进行中和。将1mL的上述溶液加到4mL处于对数生长期的大肠杆菌TG1中，37℃孵育30分钟，得到TG1的培养液。将TG1的培养液梯度稀释，涂布平板，37℃培养过夜。计算所得的HNKG2A/CD94结合的和对照管的克隆数，并挑选30个克隆测序。第一轮淘选后共获得6000个克隆。
从上述两种淘选策略的平板中挑选单克隆于96孔板培养，每孔中含有200μL加抗生素的2YT培养基，37℃、1000rpm振荡培养过夜。取10μL过夜培养的上清加到4mL含抗生素培养基中，37℃、250rpm振荡培养1.5-2.5小时。添加终浓度为1mM的IPTG，30℃振荡培养16小时，4000rpm离心10分钟，上清即得到单链抗体。
首先用ELISA方法确定筛选得到的scFv抗体与NKG2A/CD94-ECD-Fc和NKG2C/CD94-ECD-Fc的结合活性。将二者(NKG2A/CD94-ECD-Fc/NKG2C/CD94-ECD-Fc)OD450nm读数比例大于4的克隆挑选出来。部分克隆用FACS方法确定筛选得到的scFv抗体与CHOK1/NKG2A/CD94-ECD-Fc和CHOK1/NKG2C/CD94细胞的结合活性。将特异的只与CHOK1/hNKG2A/CD94细胞结合的克隆挑选出来。将上述所有特异性的克隆通过FACS方法确定其与猕猴(cyno)NKG2A的结合活性，对仍旧呈现阳性的克隆进行测序，得到具有不同重链CDR3序列的克隆,共21个，见表8。
表8可变区测序结果
Figure BDA0002262950420000441
Figure BDA0002262950420000451
噬菌体来源的先导抗体的生产和纯化：扩增重链与轻链可变区：根据阳性克隆的测序结果，通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区。配置50μL反应体系，包括0.5μL含有转染阳性克隆大肠杆菌TG1中提取的质粒、每种引物10pmol、25μL Q5高保真DNA聚合酶以及加水补足至50μL。设置PCR程序，预变性95℃5分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸68℃30秒，25个循环后再额外68℃延伸1分钟，得到PCR产物。其中PCR所用的DNA聚合酶，购自NEB，货号E0555L。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为QIAquick Gel extraction kit，购自Qiagen，货号28706。
人IgG4型抗体的制备：进行连接反应：***片段3μL，酶切过的表达载体2μL，重组酶Exnase 2μL，缓冲液4μL，反应体系20μL，于37℃反应半小时得到连接产物，即构建好的重组载体。其中，重组酶购自Vazyme，货号C112-01/02；缓冲液为该重组酶配套购买使用的缓冲液；将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG4(S228P)恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链Kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)中。将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competentcells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴30分钟。再于42℃水浴热激90秒，放回冰上2分钟后加入800μL无抗生素的2YT培养基，于37℃摇床上以200rpm培养45分钟，取出200μL涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃孵箱过夜培养。次日，使用表达载体上引物pTT-EF1a-F和pSV40(其核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No.97～98所示)，配置30μLPCR体系，进行菌落PCR。菌落PCR的体系为：引物各1μL，10μL的PCR预混液(购自Novoprotein)，补足至20μL。用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析[参见Kabat,“Sequences ofProteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]。
经过菌落PCR验证，将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体瞬时转染FreeStyleTM 293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。转染时，293-F细胞的密度应为1-1.5×106个/mL，100mL细胞需要100μg上述已构建好的重组载体(其中，重组重链载体和轻链载体的质量比为2:3)和200μg的转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)。将重组载体和PEI分别加入到5mL培养基中，室温静置5分钟，0.22μm滤膜过滤后，将重组载体和PEI的混合物于室温静置15分钟。然后将上述混合物缓慢地加入到细胞中，在37℃、8％(v/v)CO2培养箱中以120rpm的转速培养。7天后，3500g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。用1mL蛋白A柱(购自GE Healthcare)纯化200mL澄清上清液中的单克隆抗体。蛋白A柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡，然后将上清液上样到蛋白A柱，控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的20倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在蛋白A柱上的单克隆抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的NKG2A抗体作为先导抗体。将先导抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析。结果如下表9所示。
表9噬菌体展示筛选抗体纯化结果
Figure BDA0002262950420000461
Figure BDA0002262950420000471
结果显示：11G5抗体的产量与纯度均较低，无法进行进一部分的纯化分析。其余抗体的产量，纯度，内毒素均分析均表现正常。
实施例5先导抗体的检定
A.流式细胞实验(FACS)检测抗体与NKG2A/CD94表达细胞的结合
将实施例1步骤(二)中所述含有编码人源NKG2A/CD94全长氨基酸序列的核苷酸序列的pCHO1.0质粒转染CHOK1细胞株得含人NKG2A和CD94的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOk1-hNKG2A/CD94稳定细胞株)，将带有猴源NKG2A和CD94全长基因的pCHO1.0质粒(其制备方法与实施例1步骤(一)“免疫原A的制备”中带有人源IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体的制备方法相同，转染CHOK1细胞株得含猴NKG2A/CD94的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOk1-cNKG2A/CD94稳定细胞株)，用同样方法制备CHOK1-hNKG2C/CD94稳定细胞株。将CHOk1-hNKG2A/CD94稳定细胞株，CHOk1-cNKG2A/CD94稳定细胞株和CHOK1-hNKG2C/CD94稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS缓冲液(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution,购自Life technology公司)处理和收集细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用PBS缓冲液稀释至2×106细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，所述百分比为质量百分比，冰上孵育30分钟，然后用PBS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(PBS+1％BSA，所述百分比为质量百分比)悬浮至2×106细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入实施例2所得的纯化的NKG2A抗体待测样品每孔100微升，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗(购自Invitrogen)，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，后用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Calibur，购自BD公司)检测和分析结果。结果如图10-13所示。结果表明：待测抗体可特异性结合细胞表面的人NKG2A(图10)，猕猴NKG2A(图11)，而不结合细胞表面NKG2C/CD94(图12)，与NKG2E蛋白也无交叉反应性(图13)。其中IgG对照为人IgG。
B.NKG2A抗体亲和常数的测定
使用Octet red96仪器(购自Fortiebio)进行亲和常数的测定。具体操作和方法根据仪器说明书和厂家提供的详细方法。具体为：用链霉素亲和素传感器(SA sensor，购自Fortiebio)进行亲和力测定。将生物素标记的人源NKG2A/CD94-ECD-Fc(即免疫原A)用含0.1％(w/w)BSA，0.02％(v/v)Tween，pH 7.4的PBS溶液稀释至10μg/ml，然后与链霉素亲和素传感器反应；结合免疫原A的传感器与五个不同浓度梯度稀释的NKG2A抗体在30℃下温育三分钟，再和含0.1％(w/v)BSA，0.02％(v/v)Tween，pH 7.4的PBS溶液30℃温育5分钟；通过Octet仪器检测干涉波长的变化来检测抗体与免疫原A结合与解离，然后用
Figure BDA0002262950420000481
UserSoftware软件拟合得到解离常数与结合常数，亲和力常数为解离常数与结合常数的比值。结果如表10所示：
表10 NKG2A抗体对免疫原A的亲和常数
Figure BDA0002262950420000482
实施例6检测NKG2A抗体阻断NKG2A与其配体HLA-E的结合
将CHOk1-hNKG2A/CD94稳定细胞株，在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS缓冲液(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versenesolution,购自Life technology公司)处理和收集细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用PBS缓冲液稀释至2×106细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，所述百分比为质量百分比，冰上孵育30分钟，然后用PBS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(PBS+1％BSA，所述百分比为质量百分比)悬浮至2×106细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，离心洗涤一次后，将纯化所得NKG2A抗体用FACS缓冲液进行梯度稀释，按每孔50微升重悬细胞，同时每孔加入稀释好的HLA-E-PE，每孔50ul；避光冰上孵育2.5-3小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，后用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACSCalibur，购自BD公司)检测和分析结果。结果如图14所示,待测抗体可阻断HLA-E结合细胞表面的NKG2A蛋白。其中同型对照为人IgG，表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。
实施例7检测NKG2A抗体增加NK92对靶细胞的杀伤作用
将LCL721.221细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS缓冲液(购自Invitrogen)洗涤2次。用含有1mM peptide的培养基重悬细胞至1*106/500ul，在26℃培养箱中培养过夜后，用PBS洗涤2次。用分析缓冲液(1640培养基加入5％FBS)将LCL721.221细胞重悬至2*105cells/ml，取50ul加入96孔板中，确保每个孔细胞数为10000个。将已经与抗体孵育好的NK92细胞(37℃30min)按照效应细胞：靶细胞比例2:1，以体积100ul加入上述96孔板中，与LCL721.221细胞充分混合后，250g离心5分钟，将96孔板放置在37℃培养箱中4h。
加入75ul/孔AAF-GloTM反应液，15分钟后读取荧光值，反映死细胞的数量。再加入75ul/孔的裂解液，15分钟后读取荧光值，反映总细胞的数量。
结果如图15所示，结果表明：所测抗体均能增强NK92细胞对LCL721.221的杀伤活性，并且表现优于参比抗体Z270。
实施例8检测NKG2A抗体原代NK细胞对靶细胞的杀伤作用
(一)Ficoll分离全血获取外周血单核淋巴细胞PBMC。
将新鲜获取的全血用磷酸缓冲液PBS以1:1的体积比例稀释得稀释后的全血，用无菌吸管轻轻将稀释后的全血铺平在Ficoll液面(购自GE Healthcare)，Ficoll与稀释后的全血的体积比为3:4，避免震荡混匀，以400g转速室温20℃梯度离心30分钟，离心后的离心管分为三层，上层为血浆，中间乳白色分层即为单核淋巴细胞，用无菌吸管轻轻吸取中间层细胞，收集至新的离心管，用PBS磷酸缓冲液稀释至三倍体积，100g转速室温离心10分钟，弃上清。将淋巴细胞用PBS磷酸缓冲液重悬至10mL，重复前面步骤取出血小板，最后将淋巴细胞重悬至10mL含有10％胎牛血清的多组份RPMI 1640培养基(购自Invitrogen)备用，即为外周血单核淋巴细胞PBMC，所述百分比为质量百分比。
随后从PBMC中分离得到原代NK，在体外培养4天，1640培养基配方如下：0.01mm 2-me,1*L-Glu,1*NEAA,10％FBS,10ng/ml IL-2，20ng/ml IL-12。将LCL721.221细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS缓冲液(购自Invitrogen)洗涤2次。用含有1mM peptide的培养基重悬细胞至1*106/500ul，在26℃培养箱中培养过夜后，用PBS洗涤2次。用培养基(assay buffer)将LCL721.221细胞重悬至2*105cells/ml，取50ul加入96孔板中，确保每个孔细胞数为10000个。将已经与抗体孵育好的NK92细胞(37℃30min)按照效应细胞：靶细胞比例2:1，以体积100ul加入上述96孔板中，与LCL721.221细胞充分混合后，250g离心5分钟，将96孔板放置在37℃培养箱中4h。
加入75ul/孔AAF-GloTM反应液，15分钟后读取荧光值，反映死细胞的数量。再加入75ul/孔的裂解液，15分钟后读取荧光值，反映总细胞的数量。
结果如图16、图17所示，结果表明：在不同的供体中，所测抗体均能增强原代NK细胞对LCL721.221的杀伤活性。
实施例9人源化抗体的制备
分析12G8即mpb416克隆的轻重链CDR区，其中CDRH2与CDRL1中的NG序列被突变为NA，获得M15抗体，将以下重链，轻链可变区作为人源化模板。
表11M15的轻重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0002262950420000501
Figure BDA0002262950420000511
通过序列比对(NCBI-Igblast)选择与候选抗体重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架：IGHV1-46*01(60.2％)和IGKV2-28*01(80.0％).在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸,对嫁接的骨架区进行回复突变设计。
根据以上原则，分别设计5个重链可变区序列(Mpb416-M15VH_g0，Mpb416-M15VH_g1，Mpb416-M15VH_g2，Mpb416-M15VH_g3，Mpb416-M15VH_g4)和3个轻链可变区序列(Mpb416-M15VL_g0,Mpb416-M15VL_g1，Mpb416-M15VL_g2)，随后做交叉组合进行表达，共15种表达组合，见表12。
表12人源化抗体表达组合
M15VH.g0 M15VH.g1 M15VH.g2 M15VH.g3 M15VH.g4
M15VL.g0 M15-1 M15-2 M15-3 M15-4 M15-5
M15VL.g1 M15-6 M15-7 M15-8 M15-9 M15-10
M15VL.g2 M15-11 M15-12 M15-13 M15-14 M15-15
载体构建：扩增引物由Genewiz合成，随后通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区。配置50μL反应体系，包括50-100ng的重链可变区，轻链可变区、正向反向引物各1ul、1ul pfxD酶(购自invitrogen，12344-012)、10*pfx缓冲液5ul(供应商同pfx同酶)以及加水补足至50μL。设置PCR程序，预变性95℃5分钟，变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸68℃30秒，25个循环后再额外68℃延伸10min，得到PCR产物。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为PureLink QuickGelextraction kit，购自Qiagen，货号28706。
人源化抗体的制备：进行连接反应：***片段20-40ng，酶切过的表达载体60-100ng，重组酶Exnase(购自Vazyme，货号C112-01/02)1μL，缓冲液2μL，反应体系10μL，于37℃反应半小时得到连接产物，即构建好的重组载体。缓冲液为该重组酶配套购买使用的缓冲液；将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG4(S228P)恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)中。将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，42℃水浴热激60秒，放回冰上3分钟，取出80μL涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃孵箱过夜培养。次日，使用表达载体上引物pEF1A和pSV40，配置30μL PCR体系，进行菌落PCR。菌落PCR的体系为：引物各1μL，15μL的PCR预混液(购自Novoprotein)，补足至30μL。用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出4.5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。
将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体进行扩增，随后瞬时转染FreeStyleTM293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。转染时，293-F细胞的密度应为1-1.2×106个/mL，100mL细胞需要100μg上述已构建好的重组载体和200μg的转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)。将重组载体和PEI分别加入到5mL培养基中，室温静置5分钟，0.22μm滤膜过滤后，将重组载体和PEI的混合物于室温静置15分钟。然后将上述混合物缓慢地加入到细胞中，在37℃、8％(v/v)CO2培养箱中以130rpm的转速培养。每天采取培养上清和细胞沉淀检测抗体的表达。5天后，3000g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。用1mLMabSelectTMSuReTMcolumn(购自GE Healthcare)纯化200mL澄清上清液中的单克隆抗体。MabSelectTMSuReTMcolumn先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡，MabSelectTMSuReTMcolumn。上样完毕后用平衡缓冲液清洗MabSelectTMSuReTMcolumn，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的5倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在MabSelectTMSuReTMcolumn上的单克隆抗体。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的NKG2A人源化抗体。将所得抗体进行蛋白浓度、纯度检测分析。结果如下表13所示，结果显示，M15-3抗体的纯度均较低。剩余抗体的产量，纯度分析均表现正常。
表13人源化抗体纯化结果分析
Figure BDA0002262950420000521
Figure BDA0002262950420000531
人源化抗体的活性鉴定(方法同实施例5)
A.流式细胞实验(FACS)检测抗体与NKG2A/CD94表达细胞的结合,结果如图18a,图18b,图19a,图19b,图20a,图20b所示，所得抗体均可结合细胞表面的人NKG2A，猴NKG2A，并不结合人NKG2C与人CD94。其中IgG对照为人IgG，表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。
B.检测NKG2A抗体阻断NKG2A与其配体HLA-E的结合，方法同实施例6。结果如图21所示,待测抗体可阻断HLA-E结合细胞表面的NKG2A蛋白。其中同型对照为人IgG，表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。
C.检测NKG2A抗体阻断NKG2A与其配体HLA-E的结合，方法同实施例7。M15-5，M15-10，M15-15进行检测，结果如图22所示，抗体均能加强NK92对肿瘤细胞的杀伤活性。
D.NKG2A抗体亲和常数的测定，方法同实施例5B。
对人源化改造后抗体的亲和力进行评估，结果显示其亲和力显著优于参比阳性抗体。结果见表14。
表14 NKG2A抗体对免疫原A的亲和常数
Figure BDA0002262950420000532
Figure BDA0002262950420000541
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
附录本发明的序列信息
表17 NKG2A抗体氨基酸序列编号
Figure BDA0002262950420000551
表18 NKG2A抗体基因序列编号
克隆号 重链可变区 轻链可变区
M15-5 73 74
Mpb416 75 76
Mab031 77 78
Mab032 79 80
Mab033 81 82
Mab036 83 84
2F10 85 86
9B10 87 88
14G3 89 90
M15-5
SEQ ID NO.1
>QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIQNTYIHWVKQAPGQGLEWIGKIDPANADTKYAPTFQGRATITADTSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCARYRDYLFYYALGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO.2
>NTYIH
SEQ ID NO.3
>IDPANADTKYAPTFQG
SEQ ID NO.4
>YRDYLFYYALGY
SEQ ID NO.5
>DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNANTYLYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.6
>RSSKSLLHSNANTYLY
SEQ ID NO.7
>RMSNLAS
SEQ ID NO.8
>MQHLEYPYT
Mpb416
SEQ ID NO.9
>QVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIQNTYIHWVKQRPEQGLEWIGKIDPANGDTKYAPTFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTPEDTAIYYCARYRDYLFYYALGYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.10
>NTYIH
SEQ ID NO.11
>IDPANGDTKYAPTFQG
SEQ ID NO.12
>YRDYLFYYALGY
SEQ ID NO.13
>DIVMTQSAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.14
>RSSKSLLHSNGNTYLY
SEQ ID NO.15
>RMSNLAS
SEQ ID NO.16
>MQHLEYPYT
Mab031
SEQ ID NO.17
>
EVQLQQSVAELVRPGASVRLSCTGSGFNIQNTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCTRYGNYLYYYSLDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.18
>NTYIH
SEQ ID NO.19
>IDPANGDTKYAPKFQG
SEQ ID NO.20
>YGNYLYYYSLDY
SEQ ID NO.21
>
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDMGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.22
>RSSKSLLHSNGNTYLY
SEQ ID NO.23
>RMSNLAS
SEQ ID NO.24
>MQHLEYPYT
Mab032
SEQ ID NO.25
>EVQLQQSVAELVRPGASVRLSCTGSGFNIENTYMHWLKQRPEQGLEWIGRIDPADGDTQYAPKFQGKATITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCARYGNYLFYYSMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.26
>NTYMH
SEQ ID NO.27
>IDPADGDTQYAPKFQG
SEQ ID NO.28
>YGNYLFYYSMDY
SEQ ID NO.29
>DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSATAFTLRISRVEAEDVGIYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.30
>RSSKSLLHSNGNTYLY
SEQ ID NO.31
>RMSNLAS
SEQ ID NO.32
>MQHLEYPYT
Mab033
SEQ ID NO.33
>EVQLQQSVAEFVRPGASVRLSCTASGFNIENTYIHWLKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTQYDPKFQGKATLTAATSSNTAYLQLSGLTSEDTAIYYCTRYGDYLFYYSLKYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.34
>NTYIH
SEQ ID NO.35
>IDPANGDTQYDPKFQG
SEQ ID NO.36
>YGDYLFYYSLKY
SEQ ID NO.37
>DIVMTQAAPSVSVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLESPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.38
>RSSKSLLHSNGNTYLY
SEQ ID NO.39
>RMSNLAS
SEQ ID NO.40
>MQHLESPYT
Mab036
SEQ ID NO.41
>
EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIENTFMHWLKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTQYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAIYYCARYGNYLFYYSMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.42
>NTFMH
SEQ ID NO.43
>IDPANGNTQYAPKFQG
SEQ ID NO.44
>YGNYLFYYSMDY
SEQ ID NO.45
>
DIVMTQAAPSLPVTPGESVSISCRSSQSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.46
>RSSQSLLHSNGNTYLY
SEQ ID NO47
>RMSNLAS
SEQ ID NO.48
>MQHLEYPYT
2F10
SEQ ID NO.49
>QVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNAYVHWVKQRPEQGLEWIGQIDPANGNTKYAPKFQAKATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCARSYLGGQYYFDYSGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.50
>NAYVH
SEQ ID NO.51
>IDPANGNTKYAPKFQA
SEQ ID NO.52
>SYLGGQYYFDY
SEQ ID NO.53
>DILMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO.54
>KASQDINSYLS
SEQ ID NO.55
>RANRLVD
SEQ ID NO.56
>LQYDEFPLT
9B10
SEQ ID NO.57
>QVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIQNTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNIKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCAIYYDFGRAFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.58
>NTYMH
SEQ ID NO.59
>IDPANGNIKYAPKFQG
SEQ ID NO.60
>YYDFGRAFAY
SEQ ID NO.61
>DIVMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO.62
>KASQDINSYLS
SEQ ID NO.63
>RANRLVD
SEQ ID NO.64
>LQYDEFPFT
14G3
SEQ ID NO.65
>EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNAYVHWVKQRPEQGLEWIGQIDPANGNTKYAPKFQAKATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCARSYLGGQYYFDYSGQGTTLTVSSSEQ ID NO.66
>NAYVH
SEQ ID NO.67
>IDPANGNTKYAPKFQA
SEQ ID NO.68
>SYLGGQYYFDY
SEQ ID NO.69
>DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO.70
>RSSKSLLHSNGITYLY
SEQ ID NO.71
>QMSNLAS
SEQ ID NO.72
>MQHLEYPFT
M15-5
M15-5 heavy chain
SEQ ID NO.73
>CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCAATATCCAGAACACCTACATCCACTGGGTGAAGCAAGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAAGATCGACCCCGCCAACGCCGACACCAAGTACGCCCCCACCTTCCAGGGCAGAGCCACCATCACCGCCGACACCAGCACCAACACCGCCTACCTGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTACAGGGACTACCTGTTCTACTATGCCCTGGGCTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGAGCAGCC
M15-5 light chain
SEQ ID NO.74
>GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACCCCTGGAGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAGGAGCAGCAAAAGCCTGCTGCACAGCAACGCCAACACCTACCTGTACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAGGATGAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCTGATAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGG
Mpb416 heavy chain
SEQ ID NO.75
>CAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAATTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTCAAAACACCTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGAAAGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTAAATATGCCCCGACGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTAACACCTGAGGACACTGCCATCTATTACTGTGCTAGATACCGTGACTACCTATTTTACTATGCTTTGGGCTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCG
Mpb416 light chain
SEQ ID NO.76
>GACATTGTGATGACGCAGTCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
Mab031 heavy chain
SEQ ID NO.77
>GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTCAAAACACATATATTCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTAAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATCTATTACTGTACTAGATATGGTAACTACTTATATTACTATAGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Mab031 light chain
SEQ ID NO.78
>GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCTGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATATGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAG
Mab032 heavy chain
SEQ ID NO.79
>GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAGGTTCTGGCTTCAACATTGAAAACACCTATATGCACTGGCTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGGATGGTGATACTCAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTACAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATTTATTACTGTGCTAGATATGGTAACTACTTATTTTACTATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Mab032 light chain
SEQ ID NO.80
>GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGCAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTATTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
Mab033 heavy chain
SEQ ID NO.81
>GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAATTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTGAAAACACCTATATACACTGGCTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCAGCGAATGGTGATACTCAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTTTGACTGCAGCCACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCGGCCTGACATCTGAAGACACAGCCATCTATTATTGTACTAGATATGGTGACTATTTATTTTACTATTCTCTGAAGTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Mab033 light chain
SEQ ID NO.82
>GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTATCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTCGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAGTCTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
Mab036 heavy chain
SEQ ID NO.83
>GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTGAAAACACCTTTATGCACTGGCTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTCAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGACTGACATCTGAGGACACTGCCATCTATTACTGTGCTAGATATGGTAACTACTTATTTTACTATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAMab036light chain
SEQ ID NO.84
>GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTTTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
2F10 heavy chain
SEQ ID NO.85
>CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAAACGCCTATGTCCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGACAGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGCCCCGAAGTTCCAGGCCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGTCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATCCTATCTTGGTGGCCAGTACTACTTTGACTACTCGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCG
2F10 light chain
SEQ ID NO.86
>GACATTCTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
9B10 heavy chain
SEQ ID NO.87
>CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTCAAAACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATATTAAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACACTGCCATCTATTACTGTGCTATCTACTATGATTTCGGCAGGGCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCG
9B10 light chain
SEQ ID NO.88
>GATATTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
14G3 heavy chain
SEQ ID NO.89
>GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCCTCTGGCTTCAACATTAAAAACGCCTATGTCCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGACAGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGCCCCGAAGTTCCAGGCCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGTCTACCTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCTATCTTGGTGGCCAGTACTACTTTGACTACTCGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCG
14G3 light chain
SEQ ID NO.90
>GATATTGTGATGACTCAGTCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO.91(NKG2A ECD)
>PSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL
SEQ ID NO.92(CD94 ECD)
>KNSFTKLSIEPAFTPGPNIELQKDSDCCSCQEKWVGYRCNCYFISSEQKTWNESRHLCASQKSSLLQLQNTDELDFMSSSQQFYWIGLSYSEEHTAWLWENGSALSQYLFPSFETFNTKNCIAYNPNGNALDESCEDKNRYICKQQLI
SEQ ID NO.93(NKG2A full length核酸)
>ATGGATAACCAAGGAGTAATCTACTCAGACCTGAATCTGCCCCCAAACCCAAAGAGGCAGCAACGAAAACCTAAAGGCAATAAAAGCTCCATTTTAGCAACTGAACAGGAAATAACCTATGCGGAATTAAACCTTCAAAAAGCTTCTCAGGATTTTCAAGGGAATGACAAAACCTATCACTGCAAAGATTTACCATCAGCTCCAGAGAAGCTCATTGTTGGGATCCTGGGAATTATCTGTCTTATCTTAATGGCCTCTGTGGTAACGATAGTTGTTATTCCCTCTACATTAATACAGAGGCACAACAATTCTTCCCTGAATACAAGAACTCAGAAAGCACGTCATTGTGGCCATTGTCCTGAGGAGTGGATTACATATTCCAACAGTTGTTACTACATTGGTAAGGAAAGAAGAACTTGGGAAGAGAGTTTGCTGGCCTGTACTTCGAAGAACTCCAGTCTGCTTTCTATAGATAATGAAGAAGAAATGAAATTTCTGTCCATCATTTCACCATCCTCATGGATTGGTGTGTTTCGTAACAGCAGTCATCATCCATGGGTGACAATGAATGGTTTGGCTTTCAAACATGAGATAAAAGACTCAGATAATGCTGAACTTAACTGTGCAGTGCTACAAGTAAATCGACTTAAATCAGCCCAGTGTGGATCTTCAATAATATATCATTGTAAGCATAAGCTTTAG
SEQ ID NO.94(CD94 full length核酸)
>ATGGCAGCTTTTACTAAACTGAGTATTGAGCCAGCATTTACTCCAGGACCCAACATAGAACTCCAGAAAGACTCTGACTGCTGTTCTTGCCAAGAAAAATGGGTTGGGTACCGGTGCAACTGTTACTTCATTTCCAGTGAACAGAAAACTTGGAACGAAAGTCGGCATCTCTGTGCTTCTCAGAAATCCAGCCTGCTTCAGCTTCAAAACACAGATGAACTGGATTTTATGAGCTCCAGTCAACAATTTTACTGGATTGGACTCTCTTACAGTGAGGAGCACACCGCCTGGTTGTGGGAGAATGGCTCTGCACTCTCCCAGTATCTATTTCCATCATTTGAAACTTTTAATACAAAGAACTGCATAGCGTATAATCCAAATGGAAATGCTTTAGATGAATCCTGTGAAGATAAAAATCGTTATATCTGTAAGCAACAGCTCATTTAA
SEQ ID No.95(猕猴NKG2A全长氨基酸序列)
>MDNQGVIYSDLNLPPNQKRQQQKPKGNSRSTLVIEQEITYAELNLQKTSQDFQGNDKTNHCKDLPSAPEKLIAGILGIICLVLMASVVTIVVIPSTLTQKHNNSSLNTRTQKARHCGHCPKEWITYSNSCYYIGKEKRTWAESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLTAILSSSWIDVFRDSSHHPWVTINGLTFKHEIKDSDNAEHNCAMLHARGLKSDECGSSKIYHCKHKL
SEQ ID No.96(猕猴CD94全长氨基酸序列)
>MAVFKTTLWRLISGTLGIICLSLMATLGILLKNSFTKLSVEPAYTPGPNIELQKDSDCCSCHEKWVGYRCNCYFISSEEKTWNESRHFCASQKSSLLQLQNRDELDFMSSSQHFYWIGLSYSEEHTAWLWENGSALSQYLFPSFETFKPKNCIAYNSKGNALDESCETKNRYICKQQLI
SEQ ID No.97 pTT-EF1a-F
>gccctttttg agtttgga
SEQ ID No.98 pSV40
>cactgcattc tagttgtg
SEQ ID No.99 M15重链可变区
>QVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIQNTYIHWVKQRPEQGLEWIGKIDPANADTKYAPTFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTPEDTAIYYCARYRDYLFYYALGYWGQGTSVTVSS
SEQ ID No.100 M15轻链可变区
>DIVMTQSAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNANTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
序列表
<110> 上海开拓者生物医药有限公司
钜川生物医药
<120> NKG2A抗体及其制备方法和应用
<130> P2019-1922
<150> 201811320004.2
<151> 2018-11-07
<160> 124
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln Asn Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Thr Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Arg Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ala Leu Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Asn Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Thr Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Tyr Arg Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ala Leu Gly Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln Asn Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Thr Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Arg Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ala Leu Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Asn Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Thr Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Tyr Arg Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ala Leu Gly Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Gln Asn Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Gly Asn Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
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100 105 110
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20 25 30
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65 70 75 80
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln His
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Phe Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asn Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Gln Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Ala Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Gly Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ser Leu Lys Tyr Trp Gly
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20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
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Leu Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
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<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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20 25 30
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50 55 60
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Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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<400> 65
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Ala
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<211> 11
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
Ser Tyr Leu Gly Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 112
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 70
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 73
<211> 364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaagaaac ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggctt caatatccag aacacctaca tccactgggt gaagcaagcc 120
cctggccagg gcctggagtg gatcggcaag atcgaccccg ccaacgccga caccaagtac 180
gcccccacct tccagggcag agccaccatc accgccgaca ccagcaccaa caccgcctac 240
ctggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc caggtacagg 300
gactacctgt tctactatgc cctgggctac tggggccagg gcacaaccgt gaccgtgagc 360
agcc 364
<210> 74
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 74
gacatcgtga tgacccagag ccctctgagc ctgcctgtga cccctggaga gcctgccagc 60
atcagctgca ggagcagcaa aagcctgctg cacagcaacg ccaacaccta cctgtactgg 120
tacctgcaga agcccggaca gagcccccag ctgctgatct acaggatgag caacctggcc 180
agcggcgtgc ctgataggtt tagcggcagc ggcagcggaa ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcagcacct ggagtacccc 300
tacaccttcg gccagggaac caagctggag atcaagg 337
<210> 75
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 75
caggttcagc ttcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaaattg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattcaa aacacctata tacactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggaatg gattggaaag attgatcctg cgaatggtga tactaaatat 180
gccccgacgt tccagggcaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctaac acctgaggac actgccatct attactgtgc tagataccgt 300
gactacctat tttactatgc tttgggctac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tcg 363
<210> 76
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 76
gacattgtga tgacgcagtc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa atcaaa 336
<210> 77
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 77
gaggttcagc tgcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaggttg 60
tcctgcacag gttctggctt caacattcaa aacacatata ttcactgggt gaaacagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtga tactaaatat 180
gccccgaagt tccagggcaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccatct attactgtac tagatatggt 300
aactacttat attactatag tttggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 78
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 78
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtctgtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tatgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaag 336
<210> 79
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 79
gaggttcagc tgcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaggttg 60
tcctgcacag gttctggctt caacattgaa aacacctata tgcactggct gaaacagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cggatggtga tactcaatat 180
gccccgaagt tccagggcaa ggccactata actacagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccattt attactgtgc tagatatggt 300
aactacttat tttactattc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 80
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 80
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcagcaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtatt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 81
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 81
gaggttcagc tgcagcagtc tgtggcagaa tttgtgaggc caggggcctc agtcaggttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattgaa aacacctata tacactggct gaaacagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatccag cgaatggtga tactcaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactttg actgcagcca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcggcctgac atctgaagac acagccatct attattgtac tagatatggt 300
gactatttat tttactattc tctgaagtac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 82
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 82
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtatctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtcgagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agagtctccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 83
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 83
gaggttcagc tgcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattgaa aacaccttta tgcactggct gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactcaatat 180
gccccgaagt tccagggcaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagactgac atctgaggac actgccatct attactgtgc tagatatggt 300
aactacttat tttactattc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 84
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 84
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct ttacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 85
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 85
caggtccagc tgcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa aacgcctatg tccactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggacag attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180
gccccgaagt tccaggccaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagtctac 240
ctgcaactca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatcctat 300
cttggtggcc agtactactt tgactactcg ggccaaggca ccactctcac agtctcctcg 360
<210> 86
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 86
gacattctga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggaatat 240
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt tcccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 87
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 87
caggttcagc tgcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattcaa aacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tattaaatat 180
gccccgaagt tccagggcaa ggccactata actgcagaca catcctccaa tacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaagac actgccatct attactgtgc tatctactat 300
gatttcggca gggcctttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcg 357
<210> 88
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 88
gatattgtga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 89
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 89
gaggtccagc tgcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cctctggctt caacattaaa aacgcctatg tccactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggacag attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180
gccccgaagt tccaggccaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagtctac 240
ctgcaactca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc taggtcctat 300
cttggtggcc agtactactt tgactactcg ggccaaggca ccactctcac agtctcctcg 360
<210> 90
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 90
gatattgtga tgactcagtc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcct 300
ttcacgttcg gtgctgggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 91
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 91
Pro Ser Thr Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg
1 5 10 15
Thr Gln Lys Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr
20 25 30
Tyr Ser Asn Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu
35 40 45
Glu Ser Leu Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile
50 55 60
Asp Asn Glu Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser
65 70 75 80
Trp Ile Gly Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met
85 90 95
Asn Gly Leu Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu
100 105 110
Leu Asn Cys Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys
115 120 125
Gly Ser Ser Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu
130 135 140
<210> 92
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 92
Lys Asn Ser Phe Thr Lys Leu Ser Ile Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly
1 5 10 15
Pro Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser Asp Cys Cys Ser Cys Gln Glu
20 25 30
Lys Trp Val Gly Tyr Arg Cys Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Gln
35 40 45
Lys Thr Trp Asn Glu Ser Arg His Leu Cys Ala Ser Gln Lys Ser Ser
50 55 60
Leu Leu Gln Leu Gln Asn Thr Asp Glu Leu Asp Phe Met Ser Ser Ser
65 70 75 80
Gln Gln Phe Tyr Trp Ile Gly Leu Ser Tyr Ser Glu Glu His Thr Ala
85 90 95
Trp Leu Trp Glu Asn Gly Ser Ala Leu Ser Gln Tyr Leu Phe Pro Ser
100 105 110
Phe Glu Thr Phe Asn Thr Lys Asn Cys Ile Ala Tyr Asn Pro Asn Gly
115 120 125
Asn Ala Leu Asp Glu Ser Cys Glu Asp Lys Asn Arg Tyr Ile Cys Lys
130 135 140
Gln Gln Leu Ile
145
<210> 93
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 93
atggataacc aaggagtaat ctactcagac ctgaatctgc ccccaaaccc aaagaggcag 60
caacgaaaac ctaaaggcaa taaaagctcc attttagcaa ctgaacagga aataacctat 120
gcggaattaa accttcaaaa agcttctcag gattttcaag ggaatgacaa aacctatcac 180
tgcaaagatt taccatcagc tccagagaag ctcattgttg ggatcctggg aattatctgt 240
cttatcttaa tggcctctgt ggtaacgata gttgttattc cctctacatt aatacagagg 300
cacaacaatt cttccctgaa tacaagaact cagaaagcac gtcattgtgg ccattgtcct 360
gaggagtgga ttacatattc caacagttgt tactacattg gtaaggaaag aagaacttgg 420
gaagagagtt tgctggcctg tacttcgaag aactccagtc tgctttctat agataatgaa 480
gaagaaatga aatttctgtc catcatttca ccatcctcat ggattggtgt gtttcgtaac 540
agcagtcatc atccatgggt gacaatgaat ggtttggctt tcaaacatga gataaaagac 600
tcagataatg ctgaacttaa ctgtgcagtg ctacaagtaa atcgacttaa atcagcccag 660
tgtggatctt caataatata tcattgtaag cataagcttt ag 702
<210> 94
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 94
atggcagctt ttactaaact gagtattgag ccagcattta ctccaggacc caacatagaa 60
ctccagaaag actctgactg ctgttcttgc caagaaaaat gggttgggta ccggtgcaac 120
tgttacttca tttccagtga acagaaaact tggaacgaaa gtcggcatct ctgtgcttct 180
cagaaatcca gcctgcttca gcttcaaaac acagatgaac tggattttat gagctccagt 240
caacaatttt actggattgg actctcttac agtgaggagc acaccgcctg gttgtgggag 300
aatggctctg cactctccca gtatctattt ccatcatttg aaacttttaa tacaaagaac 360
tgcatagcgt ataatccaaa tggaaatgct ttagatgaat cctgtgaaga taaaaatcgt 420
tatatctgta agcaacagct catttaa 447
<210> 95
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 95
Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn
1 5 10 15
Gln Lys Arg Gln Gln Gln Lys Pro Lys Gly Asn Ser Arg Ser Thr Leu
20 25 30
Val Ile Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Thr
35 40 45
Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Asn His Cys Lys Asp Leu
50 55 60
Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Ala Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys
65 70 75 80
Leu Val Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr
85 90 95
Leu Thr Gln Lys His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys
100 105 110
Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Lys Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn
115 120 125
Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Lys Arg Thr Trp Ala Glu Ser Leu
130 135 140
Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu
145 150 155 160
Glu Glu Met Lys Phe Leu Thr Ala Ile Leu Ser Ser Ser Trp Ile Asp
165 170 175
Val Phe Arg Asp Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Ile Asn Gly Leu
180 185 190
Thr Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu His Asn Cys
195 200 205
Ala Met Leu His Ala Arg Gly Leu Lys Ser Asp Glu Cys Gly Ser Ser
210 215 220
Lys Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu
225 230
<210> 96
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 96
Met Ala Val Phe Lys Thr Thr Leu Trp Arg Leu Ile Ser Gly Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ile Ile Cys Leu Ser Leu Met Ala Thr Leu Gly Ile Leu Leu Lys
20 25 30
Asn Ser Phe Thr Lys Leu Ser Val Glu Pro Ala Tyr Thr Pro Gly Pro
35 40 45
Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser Asp Cys Cys Ser Cys His Glu Lys
50 55 60
Trp Val Gly Tyr Arg Cys Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Glu Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asn Glu Ser Arg His Phe Cys Ala Ser Gln Lys Ser Ser Leu
85 90 95
Leu Gln Leu Gln Asn Arg Asp Glu Leu Asp Phe Met Ser Ser Ser Gln
100 105 110
His Phe Tyr Trp Ile Gly Leu Ser Tyr Ser Glu Glu His Thr Ala Trp
115 120 125
Leu Trp Glu Asn Gly Ser Ala Leu Ser Gln Tyr Leu Phe Pro Ser Phe
130 135 140
Glu Thr Phe Lys Pro Lys Asn Cys Ile Ala Tyr Asn Ser Lys Gly Asn
145 150 155 160
Ala Leu Asp Glu Ser Cys Glu Thr Lys Asn Arg Tyr Ile Cys Lys Gln
165 170 175
Gln Leu Ile
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 97
gccctttttg agtttgga 18
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 98
cactgcattc tagttgtg 18
<210> 99
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 99
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln Asn Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Thr Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Arg Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ala Leu Gly Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 100
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 101
Ser Phe Asp Tyr Pro His Tyr Gly Met Asp Phe
1 5 10
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 102
Gln Gln Tyr Ser Ile Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 103
Ser Phe Asp Tyr Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 104
Leu Gln Phe Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 105
Ser Tyr Leu Gly Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 106
Asn Gly Gly Phe Thr Tyr Gly Ser Arg Gly Trp Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 107
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 108
Ala Leu Asn Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Ser Tyr
1 5 10
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 109
Leu Gly Asp Trp Glu Trp Leu Gly Val Leu Ala Tyr
1 5 10
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 110
Gln Gln Ser Asn Lys Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 111
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 112
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 113
Asn Tyr Glu Arg Arg Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 114
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 115
Ser Phe Asp Tyr Pro His Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 116
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 117
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 118
His Gln Tyr Leu Ile Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 119
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 119
Thr Tyr Gly Asp Tyr Gly Arg Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 120
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 121
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 122
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 123
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 123
Tyr Arg Asp Phe Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Gly Tyr
1 5 10
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 124
Ser Gln Gly Thr His Val Pro Leu Thr
1 5

Claims (17)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.8n+3所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+4所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8n+6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.8n+7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+8所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述的抗体具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure FDA0002262950410000021
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留NKG2A结合亲和力的衍生序列。
7.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、9、17、25、33、41、49、57或65所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ IDNO.5、13、21、29、37、45、53、61或69所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自下组：
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号 1 M15-5 1 5 2 Mpb416 9 13 3 Mab031 17 21 4 Mab032 25 29 5 Mab033 33 37 6 Mab036 41 45 7 2F10 49 53 8 9B10 57 61 9 14G3 65 69
。
9.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
10.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
(2)如权利要求9所述的重组蛋白。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.73、75、77、79、81、83、85、87或89所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.74、76、78、80、82、84、86、88或90所示。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure FDA0002262950410000031
13.一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
14.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求13所述的载体或基因组中整合有权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
15.一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
16.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5-8中任一项所述的抗体。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、如权利要求15所述的抗体偶联物、权利要求16所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
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