CN111135157B - 一种包含3-苯乳酸的胚芽乳杆菌tci378的发酵培养液及益生质的组合用于改善菌相的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及3‑苯乳酸的新用途领域，尤其是一种包含3‑苯乳酸的胚芽乳杆菌TCI378的发酵培养液及益生质的组合用于改善菌相的用途，本发明包含3‑苯乳酸的胚芽乳杆菌TCI378的发酵培养液及益生质的组合的功效在于：可通过调节与改善女性***内的菌相，降低病原菌生长，达到保健女性私密处的功效。

Description

一种包含3-苯乳酸的胚芽乳杆菌TCI378的发酵培养液及益生 质的组合用于改善菌相的用途

技术领域

本发明涉及3-苯乳酸的新用途领域，尤其是一种3-苯乳酸(3-phenyllacticacid)及益生质(prebiotics)的组合用于改善菌相的用途。

背景技术

在正常的情况下，女性的***会分泌少许的分泌物，该分泌物具有润滑***的作用，其对于***是不可或缺的。但在卫生不佳或抵抗力下降的情形，有时会发生***分泌物增多，颜色改变且具有异味的现象，即罹患了***炎。这些不正常的分泌物会造成患者患部极度搔痒或疼痛，因而导致患者心理与生理上极大的不适。而***炎所产生的分泌物尚可能造成外阴红肿及痒痛的现象，即是所谓的外阴炎，***炎及外阴炎可通称为***感染。一般会造成女性***感染的原因包括：1.念珠菌属物种(Candida spp.)，例如白色念珠菌(Candida albicans)感染，白色念珠菌容易在温暖潮湿的环境下生长，在个人抵抗力不足时，容易反复发生感染(如睡眠不足、感冒、月经前后及怀孕期间)，其感染后的症状包括搔痒、灼热、外***红肿、奶酪块状的白色分泌物、尿道口酸痛红肿、小便疼痛等，特别是月经前后会特别不舒服。2.细菌感染，常见的症状包括，***后有大量灰白色或黄色的分泌物，且有类似鱼腥味的臭味，大部分患者并没有搔痒的情形。过于频繁的***或太常冲洗***会导致***pH值上升，此为细菌感染的主要原因，这是因为会造成感染的细菌适合生存在偏碱性的环境(pH＞4.5)。造成细菌感染的细菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、***加德纳菌(Gardnerella vaginalis)及链球菌属(Streptococcus)等。

正常的***环境并不是无菌的，它包含了大约六种细菌，当中有葡萄球菌、大肠杆菌、类白喉菌、念珠菌属物种及乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)等菌。其中含量最多的乳杆菌属物种为益生菌，而葡萄球菌、大肠杆菌、类白喉菌及念珠菌属物种等为病原菌，但病原菌在量少的时候，对***的健康并不会产生不良的影响，且只要***维持在正常菌相，也就是益生菌占优势时，病原菌就不致大量滋生，因此就不会有前述感染的情形发生。另外，***正常的酸碱值约为pH 3.8～4.2，也就是较偏弱酸性，如果***的酸碱值改变成较偏中性或碱性，则会有感染的情形发生。乳杆菌属物种可使***的酸碱值维持在pH 3.8～4.2，而在此种弱酸性的环境，大部分造成***感染的病原菌无法生长，因此***得以维持健康。

然而，当前述***中菌相受到破坏时，即会发生前述的感染状况。现有治疗女性***感染的方法，一般为使用抗生素、类固醇等药品进行治疗，但此往往会将益生菌与病原菌一并杀死，因而会造成治疗初期***环境呈现无菌状态，益生菌与病原菌互相竞争，但竞争的结果，病原菌的生长往往胜于益生菌，因此容易发生重复感染的状况，而需反复进行治疗。但反复使用抗生素及类固醇治疗，容易使病原菌产生抗药性，甚至会造成人体免疫是统受损。另外，现在市售的***保养品多为含碘的化学药剂，其在短期内虽然可减轻感染症状，但由于其pH值为中性，使用后会造成***pH值上升，转变为适合病原菌生长的环境，因此症状容易复发，致使该症状难以根治。

为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有改善菌相的功效的新颖医药组合物以造福有此需求的广大族群。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的为提供一种3-苯乳酸(3-phenyllactic acid)及益生质的组合用于制备一改善菌相的组合物的用途。

在本发明的一实施例中，该益生质是乳糖醇。

在本发明的一实施例中，该菌相是一女性***内的菌相。

在本发明的一实施例中，该菌相包括乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、***加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、念珠菌属物种(Candida spp.)及大肠杆菌(Escherichia coli)。

在本发明的一实施例中，3-苯乳酸及益生质的组合增加乳杆菌属物种的数量，及减少***加德纳菌、念珠菌属物种及大肠杆菌的数量。

在本发明的一实施例中，3-苯乳酸与乳糖醇的体积比例介于1∶10～25。

在本发明的一实施例中，该组合物是医药组合物。

在本发明的一实施例中，该医药组合物包含一医药上可接受的载剂。

在本发明的一实施例中，该医药组合物是呈一供局部施用的形式。

在本发明的一实施例中，该医药组合物是呈卫生棉片或喷剂的形式。

在本发明的一实施例中，3-苯乳酸是藉由高效能液相层析法(high performanceliquid chromatography,HPLC)而纯化出。

综上所述，本发明3-苯乳酸及益生质的组合的功效在于：可通过调节与改善女性***内的菌相，降低病原菌生长，达到保健女性私密处的功效。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第1位受试者的菌相的功效的数据图；

图2是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第2位受试者的菌相的功效的数据图；

图3是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第3位受试者的菌相的功效的数据图；

图4是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第4位受试者的菌相的功效的数据图。；

图5是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善4位受试者的平均菌相的功效的数据图。

具体实施方式

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

依据本发明，3-苯乳酸(3-phenyllactic acid)具有下列化学式(I)：

如本文中所使用的，用语「益生质(prebiotics)」意指透过选择性刺激有益微生物的生长或者生物活性，对一个体施加生物学效应的物质。

依据本发明，乳糖醇具有下列化学式(II)：

依据本发明，医药组合物可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部(topically)施用的形式，这包括，但不限于，喷剂、凝露、凝胶、乳液、霜、膏、塞剂、粉末、纸巾、棉棒及棉片。

依据本发明，医药组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

实施例1.3-苯乳酸(3-phenyllactic acid)及益生质的组合的制备

首先，胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TCI378的分离流程如下：

(1)筛选

将韩国泡菜的均质物(包含泡菜及酱汁)与MRS培养液(MRS broth)以体积比1∶100的比例混合，并置于37℃下进行厌氧培养(氧气浓度低于5％)，历时18小时。其后，将前述培养液涂布于MRS固态培养基(MRS agar)上，并置于37℃下进行厌氧培养，以生成不同的菌落。接着，为确保菌株的单一性，使用无菌接种环挑选一菌落，于固态培养基上进行分区划线，再置于37℃的厌氧培养箱中培养直到单一菌落(single colony)出现。

(2)鉴定

取上面筛选流程所分离出的单一菌落的菌株，进行基因族谱分析(phylogeneticanalysis)，确认该菌株具有如SEQ ID NO：11所示的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)在线数据库进行比对，确认该SEQ ID NO：11与胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段具有约99％的相似度，故依亲缘关系鉴定该目标菌株是胚芽乳杆菌，且命名为胚芽乳杆菌TCI378，其中，该胚芽乳杆菌TCI378已于2016年12月27日寄存于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC910760，参见中国台湾专利案TWI645854。

(3)保存

使用液态培养的方式将上面筛选流程所获得的具单一性的菌株培养于MRS培养液中，以提供菌液，接着于菌液中添加25％的甘油，将所得混合液移至冷冻保存管中后，置于-80℃保存。

接着，将胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TCI378菌种保存管经一次活化后，以1％～10％的殖菌量培养在MRS培养基并于37℃培养18小时。接着，将菌液以5,000rpm离心20分钟，然后收集上清液，取此上清液作为分析样品。

之后，取2L的上清液并减压浓缩至300mL的体积，然后以大孔树脂(Diaion HP-20，100cm x 8cm)进行管柱层析，梯度由水至甲醇，得到5个分层(分层1：0％甲醇、分层2：20％甲醇、分层3：40％甲醇、分层4：60％甲醇、分层5：100％甲醇)。接着，取分层3进行RP-C18快速管柱层析(HPLC管柱：Luna 5u RP-C18，250x10mm，Phenomenex，USA)，线性梯度由20％甲醇至100％甲醇，经薄层色层分析(Thin Layer Chromatography,TLC)(Silica gel 60F₂₅₄；RP-18F₂₅₄-S，Merck，EMD Millopore Co.，德国)得到8个次分层。之后，将次分层7以Sephadex LH-20凝胶(Pharmacia，Piscataway,NJ，USA)进行管柱层析，经薄层色层分析得到8个次次分层。由次次分层5经逆相-高效能液相层析法(reversed phase-highperformance liquid chromatography,RP-HPLC)纯化(甲醇/水＝2/3)，得到化合物。

接着，将化合物经1H及13C核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)(Ascend400′54 400MHz，Bruker Co.，德国)、异核单量子相关光谱(heteronuclear singlequantum correlation，HSQC)、异核多重键相关光谱(heteronuclear multiple bondcorrelation，HMBC)、关联性磁振频谱(Correlation Spectroscopy,COSY)及电喷洒游离质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESIMS)分析，确认化学结构为3-苯乳酸。接着，添加1～5％(w/w)乳醣醇至含有3-苯乳酸的胚芽乳杆菌TCI378的发酵培养液中，得到3-苯乳酸及益生质(即乳糖醇)的组合。

实施例2.3-苯乳酸及益生质的组合在改善菌相上的效用评估

在本实施例中，将3-苯乳酸及益生质(例如乳糖醇)的组合拿来进行女性***内的菌相改善的效用评估。

3-苯乳酸及益生质的组合是以女性卫生棉片的形式来施用，施用数量为4片/天。首先，募集4位成年女性作为受试者，然后于每日三餐后及睡前更换一片包含3-苯乳酸及益生质的组合的卫生棉片。接着，于洗澡前以棉棒进行***口的涂抹采样，采样时间点为0、3、7及14天。采样流程如下：取灭菌棉棒来回涂抹女性***部上部5～6次，然后将涂抹后的棉棒头放进含有0.5mL保存液(17mM柠檬酸钠(sodium citrate)、13mM EDTA、46.7％(w/v)硫酸铵(ammonium sulfate)，pH5.2)的采样管中。接着，折断棉棒上部，留下保存液中的棉棒头，继而将采样管盖旋紧，常温保存直至送交实验室分析。

之后，取采样后的棉棒，然后将棉棒中的微生物相检体以Presto Buccal SwabgDNA萃取套组(Presto Buccal Swab gDNA Extraction kit)(Geneaid，Cat.No.GSK300-DG)萃取纯化，接而测量萃取后的DNA样品浓度以及纯度。接着，针对作为益生菌的乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)及作为病原菌的***加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、念珠菌属物种(Candida spp.)及大肠杆菌(Escherichia coli)进行16S核糖体基因(16Sribosomal gene)的定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)检测。以qRT-PCR分析4ng的DNA样品中的菌相组成，每个样品均进行三重复试验。qRT-PCR的反应条件显示于表1。

表1

用于qRT-PCR分析的目标微生物、引子序列及扩增物(amplicon)大小显示于表2。

表2

本实施例的结果显示于图1至图5。图1是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第1位受试者的菌相的功效的数据图。图2是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第2位受试者的菌相的功效的数据图。图3是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第3位受试者的菌相的功效的数据图。图4是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善第4位受试者的菌相的功效的数据图。图5是本发明3-苯乳酸及益生质的组合在改善4位受试者的平均菌相的功效的数据图。由图1至图5可见，与第0天相较之下，受试者在施用包含3-苯乳酸及益生质的组合的卫生棉片之后的益生菌(亦即乳杆菌属物种)数量有提升的情形，而病原菌(包括***加德纳菌、念珠菌属物种及大肠杆菌)数量有减少的情形，其中以第1位受试者的菌相改善情形最为显着，第2位受试者因为本身无病原菌感染，故无明显差异。

综上所述，本发明3-苯乳酸及益生质的组合可藉由调节与改善女性***内的菌相，降低病原菌生长，降低发炎，达到保健女性私密处的功效。

以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的申请专利范围中。

Claims (8)

1.一种包含3-苯乳酸(3-phenyllactic acid)的胚芽乳杆菌TCI378的发酵培养液及益生质的组合用于制备一改善菌相的组合物的用途，所述益生质是乳糖醇(lactitol)，所述菌相是一女性***内的菌相。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述菌相包括乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、***加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、念珠菌属物种(Candidaspp.)及大肠杆菌(Escherichia coli)。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述包含3-苯乳酸的胚芽乳杆菌TCI378的发酵培养液及益生质的组合增加所述乳杆菌属物种的数量，及减少所述***加德纳菌、该念珠菌属物种及该大肠杆菌的数量。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述包含3-苯乳酸的胚芽乳杆菌TCI378的发酵培养液与所述乳糖醇的体积比例介于1∶10～25。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是医药组合物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述医药组合物包含一医药上可接受的载剂。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述医药组合物是呈一供局部施用的形式。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述医药组合物是呈卫生棉片或喷剂的形式。

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