DE60205646T2

DE60205646T2 - Einen lactobacillus-stamm enthaltende zusammensetzung und verwendungen davon

Info

Publication number: DE60205646T2
Application number: DE60205646T
Authority: DE
Inventors: G. Anthony WYNNE; R. Glenn GIBSON; Jonathan Brostoff
Original assignee: University of Reading
Current assignee: University of Reading
Priority date: 2001-10-12
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2022-10-12
Also published as: JP2007308504A; DE60205646D1; ES2245411T3; EP1436380A2; WO2003033681A3; GB0124580D0; US20050031601A1; EP1436380B1; ATE302265T1; DK1436380T3; CN1568365A; JP3993168B2; JP2005505298A; CN1297653C; WO2003033681A2; AU2002350530A1; BR0213189A; US7125708B2; CA2459572A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen neuen probiotischen Stamm von Lactobacillus pentosus, essbare und pharmazeutische Zusammensetzungen, in die dieses Bakterium eingearbeitet ist und medizinische Anwendungen des Bakteriums bei der Förderung guter Gesundheit, insbesondere bei der Stimulierung des Immunsystems, bei der Bekämpfung der Candidiase, bei der Hilfe der Verdauung im allgemeinen und bei der Linderung der Symptome des irritablen Darmsyndroms (IBS).
Hintergrund der Erfindung
Die gesunde dauerhafte Darmmikroflora umfasst eine Vielzahl an nützlichen Bakterien, vorwiegend Vertreter der Gattungen Lactobacillus und Bifidobakterium. Die Balance der Mikroorganismen kann durch Infektion, Veränderung der Nahrung, durch antibiotische Behandlung und durch Stress oder physiologisches Trauma zerstört werden. Wenn dies auftritt, können viele schädliche Wirkungen ausgelöst werden. Verdauungsmuster können verändert werden, wobei Diarrhoe, Verstopfung und andere Symptome der Darmstörung auftreten. Das Immunsystem kann gestört werden, woraus eine verringerte Resistenz gegenüber infektiösen Erkrankungen folgt. Pathogene Bakterien oder Pilze nehmen überhand und kolonialisieren das Verdauungssystem und andere Teile des Körpers.
Traditionellerweise werden fermentierte Milchprodukte, wie Joghurts, als gesunde Lebensmittel angesehen, die zur Beruhigung des Verdauungssystems fähig sind, wobei diese Beobachtung nun durch das Vorkommen von Milchsäurebakterien erklärt wird. Mikroorganismen, wie Lactobacillen und Bifidobakterien, die die Gesundheit fördern können, werden "Probiotika" genannt. Die Forschung hat gezeigt, dass bestimmte probiotische Mikroorganismen die Zusammensetzung die Darmmikroflora durch Konkurrenz gegenüber pathogenen Bakterien und Hefen beeinflussen können. Von Probiotika wird auch behauptet, dass sie die Heilung der Dünndarmmukosa fördern können, beispielsweise bei Patienten mit Milchallergie durch die Verringerung der Darmpermeabilität und durch Förderung der lokalen Immunreaktionen des Dünndarms. Die Verwendung von Probiotika wird für die Prophylaxe und Behandlung von Durchfall und zur Erhöhung der Wiedergewinnung der kommensalen Flora nach einer antibiotischen Therapie befürwortet. Es wurde in klinischen Versuchen mit Probiotika auch eine anticarzinogene Aktivität gezeigt.
Von einer Vielzahl an "lebenden" Milchprodukten auf dem Markt wird behauptet, dass sie eine besonders hohe Anzahl an probiotischen Lactobacillen- oder Bifidobakterienarten zur Förderung der Verdauung und eines gesunden Immunsystems enthalten. Jedoch ist der gesamte Bereich an erwünschten probiotischen Effekten nur durch wenige ausgewählte Stämme ausgelöst. Es muss auch in das Bewusstsein gelangen, dass die Überlebensfähigkeit eines Stamms im Gastrointestinaltrakt (GI) für die biologische Wirksamkeit des Stamms in situ entscheidend ist. Damit sich der Stamm selbst im Dünndarm einnisten und etablieren kann, sollte er Idealerweise an die Mukosaoberfläche des GI Trakts haften und zum Überleben in den Transitkräften der Darmpassage fähig sein, wie der Exposition gegenüber Magen- und Gallensäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen probiotischen Stamm von Lactobacillus, der Lactobacillus pentosus LPK genannt wird und am 28. August 2001 unter dem Budapester Abkommen bei der NCIMB, Aberdeen, UK hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer NCIMB 41114 erhalten hat. Zusätzlich zu den gezeigten Eigenschaften typischer Lactobacillen im allgemeinen hat dieser Stamm eine weitere überraschende Eigenschaft: Er ist zur Unterdrückung des Wachstums von Candida Spezies in einem Ausmaß fähig, das vorher nie durch die Verwendung eines Probiotikums erreicht wurde. Ferner haben Tetracyclin und verwandte Antibiotika keinen Einfluss auf diesen Stamm. Diese einzigartige Kombination an Eigenschaften kann zur Bekämpfung des unerwünschten Wachstums von Candida in jeder Region des Körpers ausgenutzt werden. Da Candida insbesondere als ein verursachender Faktor beim irritablen Darmsyndrom (IBS) betrachtet wird, wird in Betracht gezogen, dass dieser neue Stamm von L. pentosus bei der Behandlung oder Prävention der Störung verwendet werden könnte.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Stamm von Lactobacillus pentosus mit der Hinterlegungsnummer NCIMB 41114 bereitgestellt.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine biologisch reine Kultur eines Lactobacillus Stamms bereitgestellt, der alle identifizierenden Charakteristiken des Lactobacillus pentosus Stamms NCIMB 41114 aufweist.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wird eine Ernährungszusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die den Lactobacillus pentosus Stamm NCIMB 41114 umfasst.
In einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine Ernährungszusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Kit bereitgestellt, welche den Lactobacillus pentosus Stamm NCIMB 41114 und ein Antibiotikum enthalten.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung des Lactobacillus pentosus Stamms NCIMB 41114 als Arzneimittel bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung des Lactobacillus pentosus Stamms NCIMB 41114 zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Ernährungsformulierung zur Förderung einer gesunden Darmmikroflora und zur Prophylaxe oder Behandlung von Bakterien- oder Hefeinfektionen, Candidiase, Diarrhoe oder anderen gastrointestinalen Störungen, irritablem Darmsyndrom oder der Symptome hiervon und einem geschwächten Immunsystem bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung eines probiotischen Stamms der Milchsäurebakterien bereitgestellt, das die Anzucht einer fäkalen Zellkultur in Gegenwart einer bakteriziden Menge an Tetracyclin und die Gewinnung der lebensfähigen Milchsäurebakterienzellen aus der Kultur und einem Milchsäurebakterienstamm bereitgestellt, der durch dieses Verfahren erhalten werden kann.
Beschreibung der Figuren
Die 1 zeigt das Co-Kulturwachstum von Candida albicans (∎) und L. pentosus NCIMB 41114 (♦) und das reine Kulturwachstum von Candida albicans (
) unter denselben Bedingungen und in identischen Medien.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der neue L. pentosus Stamm, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, wurde aus einer fäkalen Kultur isoliert, die aus einem gesunden erwachsenen Individuum erhalten wurde und in Gegenwart von Tetracyclin kultiviert wurde.
Zwei bemerkenswerte und unerwartete Beobachtungen führen zur Auffindung und Isolierung des Mikroorganismus. Erstens überleben und vermehren sich der Lactobacillus Stamm der Erfindung und der bakterielle Stamm alleine in einem Medium, das Tetracyclin enthält, einem Breitspektrumantibiotikum, das alle anderen Milchsäurebakterien in den Kulturen abtötet. Zweitens wurde, obwohl Candida in den meisten Fäkalkulturen von Beginn an vorhanden war, das Wachstum dieser Hefe in Gegenwart des erfindungsgemäßen Lactobacillus eingestellt. Im Gegensatz dazu wächst in den Kulturen, denen der neue Stamm der Erfindung fehlt, Candida bis zur Dominanz der Nische, die von den durch Tetracyclin getöteten Bakterien zurückgelassen wurde.
Das neue Bakterium der Erfindung und die Zusammensetzungen, die dieses Bakterium enthalten, sind für die Gesundheit allgemein nützlich und werden von Personen aller Alterstufen gut toleriert. L. pentosus NCIMB 41114 kann prophylaktisch oder therapeutisch bei gesunden Personen verwendet werden, um gegen kleinere Leiden vorzubeugen, wie Magenverstimmungen, Gastritis, Magengeschwüre, milde Diarrhoe (einschließlich Antibiotikum-assoziierter Diarrhoe), unregelmäßiger Verdauung, Sodbrennen und anderen Verdauungsbeschwerden. Die Wirkungen der Förderung einer gesunden Darmflora, Immunstimulierung, Krebsvorsorge, Stimulierung des Knochenwachstums und der Cholesterinreduktion können auch von der allgemeinen Population genossen werden. Das neue Bakterium der Erfindung kann auch besonders nützlich sein für Patienten in Krankenhäusern, Individuen, die in Pflegeheimen leben, immungeschwächten Personen, Patienten, die Antibiotikumbehandlungen erhalten, wie auch Kinder, beispielsweise Neugeborene. Beispielsweise kann das Bakterium der Erfindung auch dazu verwendet werden, um die Mikroflora von Kindern ähnlicher zur Mikroflora von gestillten Kindern zu machen.
Das Bakterium der Erfindung kann auch verwendet werden, um bestimmte Erkrankungszustände anzugehen, insbesondere als Alternative oder zusammen mit einer pharmazeutischen Arzneimittelbehandlung. Beispielsweise können Kleinkinddiarrhoe (die beispielsweise durch Rotaviren verursacht wird), Cholera, Ruhr und Infektionen mit Shigella, E. coli 0157:H7, Clostridium difficile und Salmonella durch die Einnahme des erfindungsgemäßen Bakteriums geheilt oder gelindert werden. Für Personen, die aus irgendeinem Grund immungeschwächt sind (beispielsweise nach einer Chemotherapie, Leukämie, HIV/AIDS usw.) kann die Einnahme von L. pentosus NCIMB 41114 eine sehr brauchbare prophylaktische und therapeutische Behandlung sein, um Infektionen durch pathogene Mikroorganismen vorzubeugen oder diese zu unterdrücken.
Da L. pentosus LPK gegenüber Tetracyclin und verwandten Antibiotika resistent ist, bleibt der probiotische Nutzen der Einnahme oder der Anwendung dieses Mikroorganismus während der Behandlung mit Antibiotika bestehen.
Ein Hauptvorteil dieser Lactobacillus Spezies gegenüber anderen Lactobacillen ist, dass der Stamm zur Bekämpfung des übermäßigen Wachstums von Hefen, speziell Candida Infektionen fähig ist. Candida Infektionen finden man speziell bei bestimmten Kategorien von empfindlichen Individuen, einschließlich Individuen, die in Pflegeheimen leben, immungeschwächten Patienten, wie HIV-positiven oder AIDS Patienten, Patienten, die sich einer Strahlentherapie, Chemotherapie oder Knochenmarkstransplantation unterziehen, Krankenhauspatienten mit einer erhöhten Exposition gegenüber Candida, Neugeborenen, Frauen mit Empfängnisverhütungspillen und allen, die eine Antibiotikumbehandlung erhalten. Die Candidiase kann durch Candida parapsilosis, Candida tropicalis oder Torulopsis glabrata verursacht werden, wird aber typischerweise durch Candida albicans verursacht.
Candida albicans kann den Mund (Mundsoor), den Harntrakt, die Vagina (Vaginalsoor oder Vaginitis), den Ösophagus, den Intestinaltrakt und die Haut (beispielsweise Windelausschlag) infizieren und so zu Reizung, Entzündung und anderen Symptomen führen. Diese Infektionen werden herkömmlicherweise durch die Verwendung von Antipilzmitteln geheilt. Es wurde auch eine Rolle von übermäßigem Wachstum von Candida bei IBS postuliert. Derzeitige Behandlungen von IBS sind primär pharmazeutische Präparationen, die sich auf die Linderung der Symptome anstatt auf die zugrunde liegenden Ursachen der Erkrankung richten. Obwohl von bestimmten probiotischen Bakterien eine anti-Candida Aktivität berichtet wurde, ist die scheinbare Aktivitätsstärke nicht ausreichend groß, um ein großes Interesse unter Gastroenterologen als potentielle therapeutische Behandlung hervorzurufen. Aufgrund der starken Fähigkeit von L. pentosus LPK, das heißt von Stamm NCIMB 41114, das Candidawachstum zu unterdrücken, ist die vorliegende Erfindung ein Durchbruch bei der Behandlung und Prävention von Candidainfektionen.
Daher kann in einem Aspekt der Erfindung die Verabreichung einer wirksamen Menge des Lactobacillus pentosus Stamms NCIMB 41114 in einem Verfahren zur Prävention oder Behandlung von Bakterien- oder Hefeinfektionen, Candidiase, insbesondere Harntraktinfektionen, beispielsweise Harnröhreninfektionen, Soor, Diarrhoe oder gastrointestinalen Störungen, irritablem Darmsyndrom oder Symptomen hiervon und einem geschwächten Immunsystem verwendet werden. Das neue Bakterium der Erfindung kann auch in einem Verfahren zur Förderung einer gesunden Darmmikroflora verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Bakterien- oder Hefeinfektionen, beispielsweise Candidainfektionen, Harnröhreninfektionen, Soor, irritablem Darmsyndrom (IBS) oder der Symptome hiervon, Diarrhoe oder anderen gastrointestinalen Störungen bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die lebenden, attenuierten oder abgetöteten Lactobacillus pentosus Stamm NCIMB 41114 enthält, an einen Patienten umfasst, der einer solchen Behandlung bedarf.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Förderung einer gesunden Darmmikroflora und zur Stimulierung des Immunsystems bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die lebenden, attenuierten oder abgetöteten Lactobacillus pentosus Stamm NCIMB 41114 enthält, an einen Patienten umfasst, der einer solchen Behandlung bedarf.
Die Ernährungszusammensetzungen oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, die L. pentosus NCIMB 41114 enthalten, können enteral, beispielsweise oral, parenteral oder durch physikalischen Kontakt mit der Haut oder den Mukosamembranen verabreicht werden. Die Ernährungszusammensetzungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können direkt oder in den Darm, beispielsweise durch einen Tubus oder einen Katheter verabreicht werden.
Der L. pentosus Stamm der Erfindung kann in großem Maßstab kultiviert und in lyophilisierter, gefriergetrockneter oder hydratisierter Form therapeutisch verwendet werden. Das neue Bakterium der Erfindung kann auch zusammen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz oder einer Ernährungsmatrix verabreicht werden.
Im Fall einer pharmazeutischen Präparation kann das Produkt in Form von Tabletten, Kapseln, Implantaten, Zäpfchen, Pessaren, beispielsweise Vaginalpessaren, Pulvern, Lösungen, Gelen, flüssigen bakteriellen Suspensionen und so weiter bereitgestellt werden. Langsame Freisetzungsformen sind besonders erwünscht. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der neue L. pentosus Stamm als Zusatztherapie zu einer antibakteriellen Antibiotikabehandlung (beispielsweise Tetracyclin) verabreicht, um die Risiken und Nebenwirkungen der Antibiotika zu verringern. Zu diesem Zweck können das Antibiotikum und das Bakterium zusammen in einer einzelnen Dosierungsform formuliert werden. Alternativ dazu können die Bakterien und Antibiotika in Kitform bereitgestellt werden für eine getrennte, gleichzeitige oder sequenzielle Verwendung. Eine weitere Option ist die Co-Verabreichung von L. pentosus NCIMB 41114 und eines Antipilzmittels, wie sie herkömmlich zur Behandlung der Candidiase verwendet werden, einschließlich Fluconazol, Itraconazol und Clotrimazol. Diese zwei Komponenten wirken zur Bekämpfung des Pilzwachstums zusammen und können in einer einzelnen Dosierungsform oder als Kit für eine getrennte, gleichzeitige oder sequenzielle Verabreichung zugänglich gemacht werden.
Wenn L. pentosus NCIMB 41114 in einer Ernährungsformulierung verabreicht wird, kann dieser zu allen Nahrungsmittel- oder Getränkeprodukten zugegeben werden, insbesondere gekühlten, gefrorenen oder Langzeitmilchprodukten, wie Milch, auf Milch basierende Pulver, Joghurt, Kefir, Eiscreme, Milchshakes, Käse, Sahne, Quark, fermentierte Milch und auf Milch basierende, fermentierte Produkte, aber auch Sojaprodukte, fermentierte, auf Getreide basierende Produkte, Nahrungsaufstriche, gebackene Produkte, fertige Ernährungsprodukte, Sondenernährungsformulierungen und Kleinkindformulierungen. Es ist auch möglich, die Bakterien in essbaren Formen bereitzustellen, die zum Füttern von Tieren geeignet sind, wie Pferden und Haustieren.
Oft ist es bevorzugt, den Bakterienstamm der Erfindung auf einem fermentierbaren Substrat zu kultivieren, wie Milch oder stärkehaltigen Substraten, wie einer Getreideaufschlämmung und dann das fermentierte Produkt in einer Ernährungszusammensetzung zu verwenden, beispielsweise einem Nahrungsmittel oder einem Getränk.
In einer Ernährungszusammensetzung, beispielsweise Nahrungsmittel- oder Getränkeformulierungen, kann das Produkt eine oder mehrere Ernährungskomponenten enthalten, die ausgewählt sind aus Fett, Protein, Kohlenhydraten, Fasern, Mineralien und Vitaminen zusätzlich zu den L. pentosus LPK Bakterien. In Anbetracht der Wichtigkeit der Faser bei der Regulierung der Verdauung ist es bevorzugt, dass eine Sorte an Fasern in ein Ernährungsprodukt oder ein pharmazeutisches Produkt der Erfindung einbezogen wird. Es ist bekannt, dass probiotische Bakterien zur Proliferation stimuliert werden, wenn sie mit Nahrungsfasersubstraten versorgt werden, die "präbiotische" Komponenten genannt werden. Dies hat Vorteile bei der Förderung der Kolonialisierung des Gastrointestinaltrakts und der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Kultur sogar nachdem der Konsum des Probiotikums beendet wurde. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der probiotische Stamm der Erfindung zusammen mit einem präbiotischen Substrat entweder in einer einzelnen, gemeinsamen Dosierungsform oder als Kit aus Bestandteilen zur gleichzeitigen, getrennten oder sequenziellen Verabreichung verabreicht.
Obwohl der neue Stamm von L. pentosus zur Bereitstellung von Gesundheitsnutzen an sich fähig ist, existiert auch die Möglichkeit der Co-Verabreichung dieses Bakteriums mit anderen Bakterien, die bekanntermaßen probiotische Eigenschaften haben.
Der Stamm wird vorzugsweise zu einem Nahrungsmittelträger oder pharmazeutischen Träger in einer Menge von 10⁵ CFU/g bis etwa 10¹¹ CFU/g, vorzugsweise etwa 10⁶ bis 10¹⁰ CFU/g und vor allem etwa 10⁷ bis etwa 10⁹ CFU/g des Trägers gegeben. Es ist bevorzugt, dass der Bakterienstamm in lebender Form verabreicht wird, aber vor der Verabreichung können die Bakterien attenuiert oder getötet werden.
Typischerweise ist die Verabreichung von zumindest 10⁴ CFU/Tag des erfindungsgemäßen Stamms klinisch wirksam. Bevorzugter liegen Tagesdosierungen im Bereich von 10⁶ bis 10¹² CFU/Tag. Am bevorzugtesten sind 10⁷ bis 10¹⁰ CFU/Tag.
Beispiele
Beispiel 1: Isolierung des L. pentosus Stamms LPK (NCIMB 41114)
(i) Kontinuierliches Kultursystem: Es werden 3 Chemostaten parallel angesetzt, wobei jeder unter Stickstoffgas bei 37°C pH 6,5 und einer Verdünnungsrate von 0,066 h^–1 gehalten wird. Diese Bedingungen werden so eingestellt, dass sie den Bedingungen ähneln, die typischerweise in der distalen Region des menschlichen Kolons gefunden werden. Die Chemostaten werden mit einem Kontrollwachstumsmedium versorgt, das sich zusammensetzt aus (gl^–1 in destilliertem Wasser): Hefeextrakt 2, Peptonwasser 2, NaCl 0,1, K₂HPO₄ 0,04, KH₂PO₄ 0,04, MgSO₄ × 7 H₂O 0,01, CaCl₂ × H₂O 0,01, NaHCO₃ 2, Tween 80 2, Hämin 0,05, Vitamin K1 0,01, Cystein × HCl 0,5, Gallensalze 0,5, Glucose 0,4, Stärke 3, Pectin 2 und Arabinogalactan 1. Das Medium wird bei 121 °C für 30 Minuten autoklaviert und während es noch heiß ist, unter Stickstoffgas gesetzt. Nachdem sich das Medium abgekühlt hat wird 1 gl^–1 sterilfiltriertes Tetracyclin oder 1 gl^–1 filtersterilisiertes Nystatin aseptisch zum Mediumreservoir gegeben. Kontrollchemostaten ohne antimikrobielle Mittel werden ebenfalls angesetzt.
(ii) Beimpfung: Frisch entleerte Fäkalproben werden aus gesunden Freiwilligen (n = 6) erhalten und es werden 10 % (G/V) Aufschlämmungen anaerob mittels 0,1 mol l^–1 Phosphatpuffer pH 7 (26) hergestellt. Keiner der Freiwilligen hatte eine gastrointestinale Störung und hat Antibiotika für zumindest 3 Monate vor der Studie vermieden. Die 300 ml Chemostatenbehälter sind halb mit Medium gefüllt und es werden 150 ml Aufschlämmung zu jedem Behälter gegeben. Das System wird dann für 24 Stunden stehengelassen, bevor die Mediumpumpen gestartet werden. Das Experiment wird mit 6 unterschiedlichen Fäkeldonoren jeweils dreifach wiederholt.
(iii) Mikrobielle Kulturtechniken: Es wird eine Probe aus jeder fäkalen Aufschlämmung als Inokulum entnommen und 1 ml Proben werden ebenfalls aus jedem Chemostaten entfernt, wenn das Fermentationssystem einen statischen Zustand erreicht hat (nach 164 Stunden). Diese werden dann seriell mit vorreduziertem Peptonwasser der halben Konzentration verdünnt (sechsfach). Jede Verdünnung wird dreifach auf vorreduzierte Agarmedien plattiert (unter einer anaeroben Atmosphäre mit 10 % CO₂, 10 % H₂, 80 CO₂ bei 37°C) die zur Selektion von prädominanten Gruppen der Darmbakterien entwickelt wurden: Wilkins Chalfren (Oxoid) für gesamte Anaerobe, Rogosa (Oxoid) für Lactobacillen, Beerens für Bifidobakterien, KVLB für Bakteroides, verstärkter Clostridienagar (Oxoid) + Novobiocin 8 mg/l und Colostin 8 mg/l für Clostridien und Azidagar (Oxoid) für Gram-positive Kokken. Jede Verdünnung wird dann aerob auf Nutrient Agar (Oxoid) plattiert, um auf Gesamtaerobe zu selektieren, Sabouraud Dextroseagar + Chloramphenicol und Cyclohexamid für Hefe und Mac Conkey Agar Nr. 3 (Oxoid) für Coliforme und bei 37°C inkubiert. Nach einer Inkubation für 24–48 Stunden werden die aeroben Kolonien gezählt und nach einer Inkubation für 48–72 h werden die anaeroben Platten ausgezählt. Es werden auch Kolonien mit unterschiedlichen Morphotypen von den Platten für die Gramfärbung, die mikroskopische Untersuchung und die phänotypische (biochemische) Charakterisierung gepickt, um die Kulturidentitäten zu bestätigen.
Ergebnisse: Die Anzahl der prädominanten Darmorganismen in den 6 verwendeten Inokula wird nach den Bedingungen des statischen Zustands in den Kontrollchemostaten aufrechterhalten. Dies bestätigt, dass das verwendete Wachstumsmedium bei der Erhaltung der Populationen in den kontinuierlichen Kulturexperimenten effizient ist. Daher sind alle Unterschiede in den Profilen, die aus einer Antibiotikaexposition kommen, auf diese Zusätze anstatt auf andere experimentale Variationen zurückzuführen. Hefen werden in 4 der 6 getesteten Fäkalproben der Freiwilligen detektiert.
Die Wirkung von Tetracyclin ist die deutliche Verringerung der Populationen aller getesteten Bakterien im Vergleich zu den Kontrollen, wobei das breite Aktivitätsspektrum bestätigt wird. Eine interessante Beobachtung ist, dass die Wirkung von Tetracyclin es Hefen erlaubt, in den Fermentationssystemen im Vergleich zu Kontrollchemostatenmengen zahlenmäßig zuzunehmen. Dies hat klinische Auswirkungen auf die Verwendung von Tetracyclin und assoziierten Risiken durch ein übermäßiges Wachstum von Hefen. Tatsächlich werden in einem der hierin verwendeten Inokula Hefen anfänglich nicht detektiert, aber im Verlauf der Tetracyclinchemostaten angereichert.
Wie erwartet werden die Hefen in den Nystatinchemostaten gehemmt. Jedoch werden auch bestimmte Bakteriengattungen beeinflusst. Prinzipiell umfasst dies eine Reduktion der Lactobacillen, die allgemeine probiotische Mikroorganismen sind, welche als wichtig für die gastrointestinale Gesundheit betrachtet werden. Die klare Indikation ist, dass die Nystatinverwendung nicht zum Erhalt der inhärenten probiotischen Spiegel beiträgt.
Während der Tetracyclinchemostatenexperimente zeigt einer der Läufe ein unerwartetes Ergebnis. Die Hefen sind am Anfang des Experiments vorhanden, aber im Gegensatz zum allgemein beobachteten Trend, wachsen sie nicht weiter. Anstelle dessen ist ein Gram-positives Stäbchen vorherrschend, wobei keine anderen Zelltypen detektiert werden. Es wurde daher eine genotypische Arbeit ausgeführt, um diesen Mikroorganismus zu identifizieren.
(iv) 16S rRNA Isolierung und Amplifizierung: Die gesamt DNA wird aus dem Lactobacillus mittels einer InstaGene Matrix (Biorad, Hemel Hempstead, Hertfordshire, UK) gemäß den Anleitungen des Herstellers extrahiert. Die 16S rRNA Gene werden dann durch PCR mittels konservierter Primer nahe den 3' und 5' Enden des Gens amplifiziert. Das amplifizierte Fragment entspricht den Positionen ~30 bis ~1500 des Escherichia coli 16S rRNA Gens. In einem Endvolumen von 50 μl enthält das Reaktionsgemisch die Amplifizierungsprimer, die vorgemischten Desoxynukleosidtriphosphate, MgCl₂, die Matrize und Taq DNA Polymerase, die nach einer Vorzyklusstufe zugegeben wird, bei der das Reaktionsgemisch für 4 Minuten auf 96°C erhitzt wird und dann bei 0°C gehalten wird. Die PCR Amplifizierungsbedingungen betragen 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 55°C und 1,5 Minuten bei 72°C für 30 Zyklen. Nach dem letzten Zyklus wird die Reaktion für 10 Minuten verlängert und dann auf 10°C gehalten. Die Amplifizierungsprodukte werden durch Elektrophorese mittels eines 1 % (G/V) Agarosegels in 1 × TEA (40 mM Tris-Acetat, 1 mmol l^–1 EDTA) sichtbar gemacht, das Ethidiumbromid enthält (0,5 μg ml^–1). Die Reaktionsprodukte, die Banden zeigen, die den Produkten mit der korrekten Größe entsprechen (1500 Basenpaare für die Primer pA-pH) werden mittels eines QIA-Quick PCR Reinigungskits (QIAgen, Crawley, West Sussex, UK) gemäß den Anleitungen des Herstellers gereinigt.
(v) rRNA Sequenzierung: Zur Sequenzierung der PCR Produkte werden etwa 1500 Nukleotide proximal zum 5' Ende der rRNA mittels eines dRhodamin-Terminationszyklussequenzierkits (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City California, USA) und eines automatischen Modell 377 DNA Sequenziergeräts (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City California, USA) angegangen. Die erzeugten Sequenzen werden mit 16S rRNA Gensequenzen verglichen, die in der GenBank/EMBL Datenbank mittels des FASTA Programms und des Ribosomalen Database Projects (RDP) unter Bildung der prozentualen Identitätsbewertungen mit anderen Bakterienspezies verglichen.
Ergebnisse:
Von den 1600 Basen in diesem Gen werden etwa 1500 sequenziert und zeigen, dass der Organismus ein naher Verwandter des Lactobacillus pentosus und Lactobacillus plantarum ist, die phylogenetisch ähnlich sind.
L. pentosus LPK wird anschließend gemäß dem Budapester Abkommen am 28. August 2001 bei der NCIMB, Aberdeen, UK hinterlegt und erhält die Hinterlegungsnummer NCIMB 41114.
Beispiel 2: Wechselwirkungen zwischen dem isolierten Lactobacillus und Candida albicans
Experiment 1: Candida albicans und ein Lactobacillus, der aus den Chemostaten isoliert wurde, werden über Nacht jeweils in Sabouraud Dextrose Medium (Oxoid) und MRS Medium (Oxoid) angezogen. Dann wird jeweils 1 ml in einem 750 ml Batchfermenter angeimpft, der die folgenden Medienbestandteile enthält (gl^–1 in destilliertem Wasser): Hefeextrakt 2, Peptonwasser 2, NaCl 0,1, K₂HPO₄ 0,04, KH₂PO₄ 0,04, MgSO₄ × 7 H₂O 0,01, CaCl₂ × H₂O 0,01, NaHCO₃ 2, Tween 80 2, Cystein × HCl 0,5 und Glucose 1,0. Das Medium wird bei 121 °C für 30 Minuten autoklaviert und solange es noch heiß ist unter Stickstoffgas gestellt. Die Co-Kulturfermentation wird anaerob bei 37°C und pH 6,5 gehalten. Es werden regelmäßig Proben über 48 Stunden entnommen und die Zellzahlen mikroskopisch ausgezählt. Die Kulturidentität wird durch eine Kombination aus phänotypischen und biochemischen Merkmalen bestätigt. Am Ende der Fermentation wird 1 ml aus dem Fermenter entfernt, seriell verdünnt und auf MRS und Sabouraud Dextrose Agar plattiert und anaerob für 48 Stunden inkubiert.
Experiment 2: Candida albicans und der isolierte Lactobacillus werden über Nacht jeweils in Sabouraud Dextrose und MRS angezogen. 6 MRS Agarplatten (2 % G/V) werden auf eine gleiche Dicke gegossen und anaerob reduziert. Die isolierte Lactobacillus Kultur wird dann auf jede Platte ausgestrichen. 7 ml Sabouraud Dextrose Agar (0,7 % G/V) wird bei 50°C gehalten und in 50 μl der C. albicans Kultur angeimpft. Diese wird dann gleichmäßig über die mit der Lactobacillus Kultur ausgestrichenen Platten gegossen. Die Platten werden anaerob für 48 Stunden bei 37°C inkubiert und auf Hemmzonen untersucht. Beide Experimente werden sechsmal wiederholt.
(Falls nichts anderes angegeben ist, werden alle Chemikalien von Sigma Chemical Co. bezogen).
In Experiment 1 wächst dieser neue Lactobacillus Stamm gut und hemmt das Wachstum von Candida, wobei er diese auf die Animpfmengen reduziert (1). Im Experiment 2 gibt es große Hemmzonen über den Lactobacillus Kolonien, in denen Candida nicht fähig war zu wachsen (Daten nicht gezeigt). Die Resistenz dieses Stamms gegenüber der antimikrobiellen Attacke und dessen kräftiger Antagonismus gegenüber Candida spp. hat eine Relevanz für eine mögliche Aufrechterhaltung der Darmfunktion während einer Therapie für Zustände, wie IBS.
Auf der Basis dieser Experimente wird antizipiert, dass der Mikroorganismus als Zusatz oder alternativ zu einer herkömmlichen Therapie für mit Hefe zusammenhängende Zustände, wie Soor und IBS angewendet werden kann.

Claims

Lactobacillus Stamm, wie er unter der Nummer NCIMB 41114 hinterlegt wurde.
Biologisch reine Kultur eines Lactobacillus Stamms mit all den identifizierenden Charakteristiken des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114.
Ernährungszusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung, die einen lebenden, attenuierten oder abgetöteten Lactobacillus Stamm NCIMB 41114 und einen herkömmlichen Träger enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, die 10⁵ bis 10¹¹ CFU des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114 pro Gramm der Zusammensetzung enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, die in Form einer Tablette, einer Kapsel, eines Implantats, eines Zäpfchens, eines Pessars, eines Pulvers, einer Lösung, eines Gels oder einer flüssigen bakteriellen Suspension vorliegt.
Ernährungszusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung oder Kit, welche den Lactobacillus Stamm NCIMB 41114 und ein Antibiotikum enthalten.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder Kit nach Anspruch 6, worin das Antibiotikum Tetracyclin oder ein verwandtes Antibiotikum ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder Kit nach Anspruch 6, worin das Antibiotikum ein Antipilzmittel ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, die in einer Tagesdosis 10⁶ bis 10¹² CFU des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114 liefert.
Lactobacillus Stamm NCIMB 41114 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114 zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Ernährungszusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von Bakterien- oder Hefeinfektionen.
Verwendung des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114 zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Ernährungsformulierung zur Prävention oder Behandlung der Candidiase.
Verwendung des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114 zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Ernährungsformulierung zur Förderung einer gesunden Darmflora und zur Prävention oder Behandlung des irritablen Darmsyndroms oder der Syndrome hiervon.
Verwendung des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114 zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Ernährungsformulierung zur Prävention oder Behandlung von Diarrhöe oder anderen gastrointestinalen Störungen.
Verwendung des Lactobacillus Stamms NCIMB 41114 zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Ernährungsformulierung zur Stimulierung des Immunsystems.
Lactobacillus Stamm nach Anspruch 1, der durch ein Verfahren erhalten wurde, das die Anzucht einer fäkalen Zellkultur in Gegenwart einer bakteriziden Menge an Tetracyclin und die Gewinnung der lebensfähigen Milchsäurebakterienzellen aus der Kultur umfasst.