KR102555418B1

KR102555418B1 - 바실러스 서브틸리스 j2k-351 균주를 이용하여 발효된 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부보호용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102555418B1
Application number: KR1020210114832A
Authority: KR
Inventors: 서영교; 박현우; 이광식; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2023-07-17
Also published as: KR20230032236A

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주를 이용한 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물은 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 피부 장벽 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주를 이용하여 발효된 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부보호용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR PROTECTING SKIN COMPRISING MIXED EXTRACTS OF ANDROGRPHIS PANICULTA AND SELAGINELLA TAMARICINA FERMANATED BY BACILLUS SUBTILLUS J2K-351 STRAIN}

본 발명은 천심련(Andrographis paniculata) 및 바위손(Selaginella Tamariscina)의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효시킨 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

아름답고 건강한 피부를 유지하는 것을 목표로 하는 화장료는 나이가 들어가면서 자연적으로 생기는 피부 노화를 지연시키는데 목적을 두고 있다. 일반적으로 노화는 자유라디칼(free radical)에 의한 산화적 손상에 기인한다. 이는, 슈퍼옥사이드 라디칼, 하이드록시 라디칼, 과산화수소 등의 활성산소와 같은 반응성이 높은 자유 라디칼이 생체물질인 단백질을 산화시키며, 세포막을 구성하는 지질을 과산화시켜 세포막을 파괴하고 핵산을 공격하여 산화적 손상을 일으켜 생체물질을 파괴하고 결국 세포를 죽게 한다. 주름과 탄력저하, 피부의 칙칙함은 노화로 인해 가장 크게 나타나는 특성으로, 이와 같은 특성 외에도 40대 이후가 되면 얼굴색이 맑지 않고 칙칙하고 어두운 경우가 많다.

젊은 여성들의 경우에는 출산을 경험하면서 어혈이 생기고, 혈액순환장애가 생기면서 이로 인해 신진대사 능력이 떨어지면서 피부가 거칠어지고 칙칙해지는 현상이 쉽게 발생한다. 이러한 현상은 또한 수분량이 쉽게 줄어들게 되는데, 사람의 인체는 약 70~75%의 수분을 함유하고 있으며 표피층으로 갈수록 감소하여 각질세포층에서는 약 10~30%가 된다. 친수성의 수분 보유 능력을 가진 천연보습 인자(Natural Moisturizing Factor: NMF)는 각질세포층에 존재하며, 피부의 보습에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 피부의 표피층에서는 분화되는 과정을 통하여 수분을 가지면서 얇은 각질층으로 발달하게 되고, 구조적으로 각질층(Stratum corneum)의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하며, 각질세포의 세포간 지질들은 몰타르로 작용하여 피부 장벽을 구성하게 된다.

피부는 외부 자극으로부터 몸을 보호하며, 내측의 수분을 막아 주는 기능을 하며, 외부에서부터 표피, 진피, 피하 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 체내의 기온 및 습도 변화, 자외선, 물리적, 화학적인 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능이 있다. 피부의 표피층에서는 분화되는 과정을 통하여 수분을 함유하면서 얇은 각질층으로 발달하게 된다. 표피는 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 각질층의 세포들은 구조적으로 벽돌과 같은 역할을 하며, 각질세포의 세포간 지지들은 모르타르로 작용하여 피부 장벽을 구성한다.

따라서 피부 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것도 피부 노화를 예방하는데 매우 중요하나, 다른 천연 보습인자인 요소, 젖산나트륨(Sodium lactate), 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na) 등은 전해성이 강해 화장료의 유화 안정성을 해치는 문제점이 있다. 엘라스틴, 콜라겐 아미노산 등도 보습 능력이 있다고는 하나 보습능력에 한계가 있었다. 각질층의 수분을 보유할 수 있는 능력은 피지성분과 무기염, 요소, 젖산 및 아미노산 등으로 이루어진 천연보습인자(NMF)에 의해 조절되어질 수 있는데, 피부 외용제에서 천연 보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습효과가 높은 물질의 개발이 화장품에서 중요한 연구과제 중 하나이다. 또한, 항산화작용을 갖는 것으로 알려진 물질은 아스코르빈산(ascorbic acid), 베타-카로틴(β-carotene), 디부틸히드록실톨루엔(BHT), 디엘-알파토코페롤(dl-α-tocopherol), 등이 있으나 이러한 물질들은 합성품으로 사용되기 때문에, 장기간 사용하거나 다량으로 사용 시 피부 안전성의 문제를 일으킬 수 있으므로 보다 안전하고 유용하게 피부에 적용할 수 있는 새로운 항산화 화장료의 개발이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.

또한 최근에는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

한국공개특허 제2009-0131767호에서는 천심련 추출물 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 포함하는 피부미백 화장료 조성물을 개시한다.

또한 한국등록특허 제10-1796286호에서는 바위손 발효액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 개시한다.

본 발명자들은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 천심련 및 바위손을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효하여 제조된 천심련 및 바위손 혼합추출물에서 항산화, 항염증, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

본 발명은 천심련 및 바위손을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효한 천연추출물을 유효성분으로 포함하여 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 피부 장벽 개선효과를 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제는, 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효시킨 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 화장료 조성물은, 항산화 효과, 항염증 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 보습 효과 또는 피부 장벽 개선 효과를 갖는다.

또한 바람직하게는, 상기 혼합발효추출물은 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 20 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 1 내지 7일 동안 발효시켜 얻을 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 혼합발효추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001~30.0 중량%로 포함될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명은 피부 화장료에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 매우 뛰어난 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 천심련 및 바위손을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효한 혼합발효추출물 유효성분으로 포함하여 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명자들은 다수의 천연물을 원료로 하여 다양한 추출방법으로 추출물을 제조하였고, 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 피부 장벽 개선 효과 등의 효과가 우수한 물질을 선별하는 연구를 수행하였다. 그 결과, 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효하여 제조된 추출물이 상술한 본 발명의 목적에 가장 부합된다는 사실을 발견하게 되었다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 천심련(Andrographis paniculata)은 쥐꼬리망초과의 일년생 초목으로 열대 아시아 지역의 들판이나 숲속, 인도 전역, 특히 남부의 들판이나 숲속의 그늘지고 수분이 충분한 곳에서 주로 자라는 식물이다. 키는 0.3~1.0미터, 줄기는 진한 녹색으로 굵기 2~6mm이며, 잎은 길이 8cm, 폭2.5cm의 버들잎 모양으로 뽀족하고, 꽃은 흰색 또는 연분홍빛 꽃잎에 자색 반점이 있다. 천심련은 모든 식물 부위의 맛이 극히 쓰므로, 'Maha-tita'(King of bitters)라고 알려져 있으며, 님나무보다 크기는 훨씬 작지만 모양이 비슷하고 쓴 맛으로 인해 'bhui-neem'이라고도 불린다. 이러한 천심련은 항암, 항염증, 항균, 항바이러스 작용 등이 알려져 있으며 민간약재로서 면역증, 이담, 해열 작용 등에 사용되어 왔다. 본 발명의 천심련 추출물은 상기한 천심련의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 수피, 가지, 꽃, 뿌리, 열매, 줄기 등) 중 전초를 사용한다.

바위손(Selaginella Tamariscina)은 부처손과(Selaginellaceae)에 속하는 여러해살이 상록초본에 해당하는 것으로서, 이 식물은 5~20cm 내외로 자라며 밑에서 파생된 근경은 짧고 매우 단단하며 많은 수염뿌리가 나고 직립하며 거칠게 자란다. 줄기는 여러 갈래로 갈라지고 줄기 끝에는 가늘고 넓적한 바늘 모양의 잎이 밀생하며 겉면은 녹색이고 뒷면은 백녹색이다. 대체로 습한 바위 위에서 자라며 습기가 있을 때에는 옆으로 퍼져 있으나 건조하게 되면 주먹모양으로 오그라지게 되는데, 이 때문에 생약명을 권백(Selaginellae Herba)이라 한다. 우리나라 전지역에서 자라며 일본, 대만, 중국에도 분포한다. 상기 바위손은 민간요법으로 오랫동안 안전하게 사용되어온 천연 약재로서, 주요성분으로는 페놀성 성분, 플라본류(flavone), 아미노산, 트레할로스(trehalose) 등의 다당류, 소량의 탄닌(tannin)을 함유한다.

본 발명에 사용되는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) J2K-351 균은 대두발효에 사용되는 균과 유사한 균으로서 다래로부터 분리, 동정하였으며, 전분질 분해능이 우수하고, 단백질 분해능이 우수할 뿐 아니라 지방질이나 고분자의 탄수화물을 분해하여 저분자의 아미노산, 핵산, 지방산, 비타민, 알카로이드, 점성이 있는 폴리머(Polymer) 등을 생산하는 특징이 있으며, 그 배양물의 액상이나 건조물을 사람이나 동물이 섭취할 경우 매우 성장촉진과 관련하여 유익하며, 전통적으로 안전한 균 또는 배양물이다. 다래에서 유래된 바실러스 서브틸리스 J2K-351 발효 여과물은 아미노산, 핵산, 펩타이드, 미네랄, 비타민이 풍부하다. 바실러스 서브틸리스 J2K-351 발효 여과물은 천연보습인자 NMF를 포함하고 아미노산 30%, 핵산 15%, 펩타이드 30% 이상을 포함하고 있다. 아미노산과 펩타이드는 콜라겐 합성을 촉진하며 피부 잘 흡수하여 피부세포를 활성화에 도움을 준다. 핵산은 피부 세포 대사의 필수적인 성분으로 피부 세포의 재활성화를 해주며 피부를 부드럽게 윤기 있게 해준다. 저분자로 피부에 빠르게 흡수되며 2차 대사물질이 보습성분을 높여준다.

본 발명의 화장료 조성물은 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균사체로 발효하여 얻는 혼합발효추출물을 포함하며, 뛰어난 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선 효과를 나타낸다. 본 발명의 일실시형태에 따르면, 상기 천심련 및 바위손의 혼합추출물은 천심련과 바위손이 1:10 내지 10:1의 중량비로 혼합될 수 있고, 보다 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합될 수 있다.

본 발명에서 천심련 및 바위손의 혼합 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 제조될 수 있다. 구체적으로 천심련 및 바위손의 전초를 건조 및 분쇄한 후, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 구체적으로는, 천심련 및 바위손 혼합추출물은 물, 탄소수 1~4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하거나 천심련 및 바위손의 전초를 상기 용매를 이용하여 추출한 후, 이를 혼합하여 제조할 수 있다.

상기 용매로는 알코올이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에탄올이다. 이때, 에탄올은 바람직하게 70% 에탄올이다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 천심련 및 바위손 건조물 중량의 1~15 배이며, 더욱 바람직하게는 5~10배이며, 가장 바람직하게는 7배이다.

한편, 본 발명의 천심련 및 바위손 혼합 추출물은 상술한 용매 추출법에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 천심련 및 바위손 혼합 추출물에 포함된다고 해석된다.

또한, 본 발명의 천심련 및 바위손의 혼합 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수도 있다.

본 발명에 따른 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물은 상기한 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효시켜 제조할 수 있으며, 구체적으로는 다음의 방법으로 제조할 수 있다. 먼저, 천심련 및 바위손의 혼합추출물에 탄소원으로 포도당 1~5 중량%를 첨가하고, 펩톤 0.1~1%, 바람직하게는 0.2~0.5 중량%를 추가로 첨가하여 멸균할 수 있다. 여기에 25g/L이 되도록 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) J2K-351 균주 배양액을 접종하여 배양할 수 있다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 1 내지 7일간, 20 내지 40℃에서 pH 5-7로 유지하며 배양할 수 있다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 후 더 이상 배양이 되지 않도록 멸균(121℃, 15분, 1.5기압)하였다.

발효 후 배양균을 1차 제거한 천심련 및 바위손의 혼합 추출물을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 환류추출하고 냉침한 후, 여과할 수 있다. 여과가 완료되면 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하여 본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화장료 조성물에 첨가되는 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~80.0 중량%이며, 바람직하게는 0.01~50.0 중량%이며, 가장 바람직하게는 0.1~30.0 중량%로 포함될 수 있다. 상기 혼합발효추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 항산화, 항염, 콜라겐 합성 촉진, 피부 주름 개선, 보습, 미백, 피부 장벽 개선효과가 미미하다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 다만, 이에 반드시 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물은 항산화 효과(실험예 1), 항염 효과(실험예 3), 콜라겐 합성 효과(실험예 4) 및 피부 미백 효과(실험예 5)를 나타낸다. 또한, 이러한 효과를 갖는 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하여 제조한 화장료 조성물의 경우, 피부 보습 개선 효과(실험예 6), 피부 장벽 개선 효과(실험예 7)가 뛰어난 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 제조예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기 제조예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 권리범위가 하기 제조예에만 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 천심련 및 바위손의 혼합추출물의 제조

동일 중량의 천심련 및 바위손의 전초를 정제수로 세척하고 건조한 다음 모두 분쇄한 후 100메시의 체를 이용하여 미세하게 만들었다. 천심련 및 바위손의 분쇄물을 100g/L가 되도록 70% 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과 후, 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하여 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 제조하였다.

제조예 2: 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물의 제조

제조예 1에서 제조된 천심련 및 바위손의 혼합추출물 5g에 탄소원으로 포도당 2%를 첨가하였으며, 펩톤 0.5%를 추가로 첨가하여 멸균하였다. 여기에 25g/L이 되도록 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) J2K-351 균주 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 37℃, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 후 더 이상 배양이 되지 않도록 멸균(121℃, 15분, 1.5기압)하였다.

발효 후 배양균을 1차 제거한 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과하였다. 여과가 완료되면 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하였다.

비교제조예 1

탄소원으로 포도당 2%를 첨가하였으며, 펩톤 0.5%를 추가로 첨가하여 멸균하였다. 여기에 25g/L이 되도록 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) J2K-351 균주 배양액을 접종하여 배양하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 37℃, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 후 더 이상 배양이 되지 않도록 멸균(121℃, 15분, 1.5기압)하였다.

발효 후 배양균을 1차 제거하고, 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과하였다. 여과가 완료되면 상기 여과액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하여 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 포함하지 않는 바실러스 서브틸리스 J2K-351 발효액을 제조하였다.

제조예 3 내지 6

바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) J2K-351 대신에 아래 표 1의 균주를 사용한 것 이외에는 제조예 2와 동일한 방법으로 천심련 및 바위손 혼합발효추출물을 제조하였다.

	균주
제조예 3	흑효모(Aureobasidium pullulans)
제조예 4	유산균(Lactobacillus casei)
제조예 5	누룩균(Asperillus oryzae)
제조예 6	고초균(Bacillus subtilis)

실험예 1: 천심련 및 바위손 혼합추출물과 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물의 DPPH법을 이용한 항산화 평가

상기 제조예 1 내지 6에서 수득한 천심련 및 바위손의 혼합추출물 및 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물의 자유라디칼 소거 활성(free radical scavenging acticity)을 평가하였다.

DPPH 측정법은 억제제(inhibitor)가 안정한 라디칼 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical)를 소거하여 탈색되는 정도를 540 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다. 사용한 시료는 하기 표 3에 나타내었으며, 하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다. 대조군은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, Epigallocatechin gallate)로 하였다.

	재료	대조군	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	DPPH(MeOH)	180	(180)	180	(180)
B	샘플(용매)	(20)	(20)	20	20

A: Abs of experimental group

B: Abs blank of experimental group

C: Abs of control group

D: Abs of blank of control group

구분	제조예1	비교제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	EGCG
25uM	-	-	-	-	-	-	-	54.34
0.001wt%	12.23	4.93	44.13	22.13	14.54	13.23	20.19	-
0.002wt%	22.10	6.09	67.54	30.09	22.19	24.17	28.42	-
0.005wt%	24.54	8.12	83.48	37.40	31.41	33.20	35.54	-
0.01wt%	36.24	9.09	96.60	54.10	41.28	44.42	45.20	-

상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물(제조예 2 내지 6)이 천심련 및 바위손의 혼합추출물(제조예 1)에 비하여 자유라디칼 소거활성이 우수하였다. 또한, 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물 중에서는 특히 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효시킨 천심련 및 바위손의 혼합발효출물(제조예 2)이 가장 높은 자유라디칼 소거활성을 나타내었다. 또한 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효액만 포함하는 비교제조예 1과 비교하여도 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물이 천심련 및 바위손 혼합 추출물에 비해 항산화 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.

실험예 2: 천심련 및 바위손 혼합추출물과 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물의 세포 생존율 평가

상기 제조예 1 내지 6 과 비교제조예 1에서 수득한 천심련 및 바위손 혼합추출물과 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물이 세포에 미치는 독성을 측정하였다. 세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다.

HDF를 96-웰 플레이트에 1 × 10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 시료를 농도별로 처리한 배지에 24 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline) 두 번씩 세척하였다. MTT를 5 mg/mL 로 PBS에 녹여 50 μL 첨가하고 37℃, 5%의 CO₂ 에서 2 시간 동안 배양하였다. DMSO를 한 웰(well) 당 100 μL 넣고 10분 동안 교반한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과를 아래 표 4(세포생존율(%))에 나타내었다. 표 4를 보면, 각 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 나타나지 않았다. 이로부터 본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물은 인체에 무해하며 안전성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

시료명	처리농도(PPM)	세포생존율(%)
제조예 1	50	101.1
제조예 1	100	103.3
비교제조예 1	50	99.8
비교제조예 1	100	101.2
제조예 2	50	103.8
제조예 2	100	102.5
제조예 3	50	98.6
제조예 3	100	100.3
제조예 4	50	99.7
제조예 4	100	103.3
제조예 5	50	98.2
제조예 5	100	98.4
제조예 6	50	99.2
제조예 6	100	101.3

실험예 3: 천심련 및 바위손 혼합추출물과 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물의 항염 평가(5-Lipoxygenase 저해)

상기 제조예 1 내지 6과 비교제조예 1에서 수득한 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물과 천심련 및 바위손의 혼합추출물의 5-리폭시게나제(5-Lipoxygenase) 저해 활성 실험을 하여 항염 효과를 평가하고자 하였다.

리폭시게나제는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생체내 염증반응이나 알레르기 반응 등에 관여하는 다양한 화학적인 매개체 역할을 하는 여러 물질들을 생성한다. 따라서 리폭시게나제를 저해하는 물질은 각종 화학적 매개체(chemical mediators)의 생성을 억제하는 결과를 가져오게 되므로 알레르기에 유효할 것이라고 추정할 수 있다. 리폭시게나제의 활성정도는 기질과 효소를 이용하여 과산화물 생성정도로 측정하는 실험이다.

사용한 시료는 하기 표 5과 같이 시험하여 상기 수학식 1을 이용하여 5-리폭시게나제 저해 활성을 측정하였다. 대조군은 노르디히드로구아이아레트산(NDGA, Nordihydroguaiaretic acid)로 하였다.

구분	재료	대조군	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	완충용액	2ml	2ml	2ml	2ml
B	Sample(용매)	(20ul)	(20ul)	20ul	20ul
C	효소(Enzyme)	40ul	-	40ul	-
D	기질(Substrate)	70ul	70ul	70ul	70ul

구분	제조예1	비교제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	NDGA
250nM	-	-	-	-	-	-	-	51.55
0.001wt%	19.20	3.25	39.10	23.41	23.51	21.39	26.10	-
0.002wt%	21.80	4.03	46.84	28.31	31.31	34.15	31.54	-
0.005wt%	30.18	5.42	61.35	31.21	34.76	38.70	32.80	-
0.01wt%	32.70	5.32	78.45	43.33	40.53	42.04	41.60	-

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물(제조예 2~6)이 천심련 및 바위손의 혼합추출물(제조예 1)과 비교제조예 1에 비하여 5-리폭시게나제 저해능이 우수하였다. 발효 추출물 중에서는 특히 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물(제조예 2)이 가장 높은 5-리폭시게나제 저해능을 나타내었다. 일반적으로 5-리폭시게나제 저해능이 높을수록 항염 효과가 있으므로, 상기의 결과는 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물이 일반 천심련 및 바위손 혼합 추출물에 비해 항염 효과가 높다는 것을 확인시켜 준 것이다.

실험예 4: 천심련 및 바위손의 혼합추출물과 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물의 콜라겐 합성량 평가

상기 제조예 1~6과 비교제조예1 에서 수득한 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물과 천심련 및 바위손 혼합 추출물의 콜라겐 생합성 증가율을 평가하였다.

HDF를 24-웰 플레이트에 5 x 10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5 %CO₂ 에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 제조예 1 내지 6과 비교제조예 1에 의해 제조된 추출물을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 천심련 및 바위손 혼합 발효 추출물이나 천심련 및 바위손 혼합 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 well의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드(PICP) 양을 측정하여 ng/ml 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 수학식 2에 따라 계산하였으며, 대조군은 엘-아스코르빅애씨드(L-AA, L-ascorbic acid)로 하였다.

구분	제조예1	비교제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6	L-AA
0.3mM	-	-	-	-	-	-	-	131.51
0.001wt%	81.03	58.22	156.73	105.10	113.15	104.78	113.84	-
0.002wt%	84.15	62.54	168.38	114.00	115.25	114.84	125.37	-
0.005wt%	86.64	67.65	179.64	120.40	120.32	124.30	129.60	-
0.01wt%	92.42	72.74	192.45	125.35	130.55	125.82	132.42	-

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물 (제조예 2~6)이 천심련 및 바위손 혼합 추출물(제조예 1)과 제조비교예1에 비하여 콜라겐 합성량이 우수하였다. 발효 추출물 중에서는 특히 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물(제조예 2)이 가장 높은 콜라겐 합성량을 나타내었다.

실험예 5: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물의 멜라닌 합성 억제효과 측정

실험예 5에서는 상기 제조예 1 내지 6과 비교제조예1 에서 수득한 샘플의 멜라닌 합성 억제효과를 확인하기 위해 미백제로 알려진 알부틴을 비교샘플로 사용하였고, B16F1 멜라닌 세포를 이용하였다.

실험예 6에서 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 수행하였다.

B16F1 멜라닌 세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2Х10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후, 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후, 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(R Lotan and D Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후, 균질화 완충액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하고, 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후, 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였다.

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B: 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

	제조예 1	제조비교예1	제조예 2	제조예 3	제조예 4	제조예 5	제조예 6	알부틴
0.2 wt%	-	-	-	-	-	-	-	55.3
0.001wt%	5.03	2.22	44.62	7.10	5.15	5.96	13.80	-
0.002wt%	10.15	8.54	68.35	8.53	9.36	14.47	19.20	-
0.005wt%	15.64	11.65	73.74	16.50	13.52	20.24	23.51	-
0.01wt%	23.22	15.74	84.35	25.44	22.64	24.32	30.42	-

B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과를 표 8에 나타내었다. 제조예 2로 제조된 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물은 알부틴보다 우수한 효능을 확인 할 수 있었으며. 다른 제조예들보다 우수한 미백효과를 갖는 것을 확인하였다.

상기의 결과로부터 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물의 우수한 멜라닌 합성 저해율을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 알 수 있었다.

처방예: 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물을 함유하는 화장료의 제조

제조예 2의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물을 30.0 중량%가 포함된 화장료 조성물을 하기 표 9의 조성으로 제조하여 이를 처방예 1이라 하고, 천심련 및 바위손 혼합추출물(제조예 1)을 포함하는 화장료 조성물을 비교처방예 1로, 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효액을 포함하는 화장료 조성물을 제조하여 비교처방예 2라 하였다.

성분	처방예 1 (중량%)	비교처방예 1 (중량%)	비교처방예 2 (중량%)
제조예 1	-	30.0	-
제조예 2	30.0	-	-
비교제조예1	-	-	30.0
1,3-BG	8.0	8.0	8.0
글리세린	5.0	5.0	5.0
프로필렌글리콜	4.0	4.0	4.0
토코페릴아세테이트	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	4.5	4.5	4.5
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.2	3.2	3.2
마카다미아너트오일	1.0	1.0	1.0
폴리아위베이트60	1.6	1.6	1.6
아위비탄세스퀴롤레이트	1.6	1.6	1.6
프로필파라벤	0.6	0.6	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5	1.5	1.5
향	미량	미량	미량
방부제	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100

실험예 6: 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합발효추출물의 피부 보습력 개선 효과

본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-451 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 피부 질환이 없는 20~40대 25명을 대상으로 1조 당 20명 씩 2개조로 나누고, 각 조별로 상기 처방예에서 제조한 처방예 1 및 비교처방예 1의 크림의 영양크림을 매일 2회씩 1개월간 얼굴 및 전박부에 도포하게 하였다. 미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 corneometer(CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 기본 값을 삼고, 1주, 2주, 4주 경과 후의 피부 전도도 증가율(%)을 측정하여 그 증가율을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

시료	1 주 후	2 주 후	4 주 후
처방예 1	51	58	68
비교처방예 1	33	35	37
비교처방예 2	21	23	24

상기 표 10의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물을 함유하는 화장료인 처방예 1의 경우, 비교처방예 1, 2에 비하여 피부 전도도 증가율이 매우 우수하였다. 일반적으로 피부 전도도는 피부 수분량에 비례하므로, 상기의 결과는 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물을 함유하는 화장료가 그렇지 않은 화장료에 비해 피부 수분 함량도 높게 유지한다는 것을 확인시켜 준 것이다.

실험예 7: 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물의 피부 장벽 개선 효과

본 발명의 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물을 함유하는 화장료의 피부 장벽 개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 본 실험예는 제조예 7의 화장료를 사람을 대상으로 경피수분손실량(TEWL: Trans-Epidemal Water Loss)을 Tewameterr(TM300, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 비교실험을 행하여 평가하였다. 20 ~ 40대 여성 40명을 대상으로 오른쪽과 왼쪽 얼굴에 각 시료를 바르고 눈가에서 3cm 우측으로 1cm 아래로 떨어진 부위를 바르기 전과 바른 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간의 경피수분손실량을 Tewameterr(TM300, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 3회 측정하여 평균값을 사용하여 경피수분손실량을 평가하였다.

구분	1시간	2시간	4시간	6시간
처방예 1	13.0	10.4	8.0	7.1
비교처방예 1	17.1	17.0	15.2	14.0
비교처방예 2	18.5	18.1	17.5	14.8

표 11에서 나타낸 바와 같이, 경피수분손실량을 측정한 결과, 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주 발효 천심련 및 바위손 혼합 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 경피수분손실량이 감소한 것으로 보아, 피부장벽 개선에 더 좋은 효과가 있음을 알 수 있었다.

Claims

피부 보호용 화장료 조성물로서,
바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 발효시킨 천심련 및 바위손의 혼합발효추출물을 유효성분으로 함유하고,
상기 화장료 조성물은 항산화 효과, 항염증 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 보습 효과 또는 피부 장벽 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 피부 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혼합발효추출물은 천심련 및 바위손의 혼합추출물을 바실러스 서브틸리스 J2K-351 균주로 20 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 1 내지 7일 동안 발효시켜 얻은 것을 특징으로 하는 피부 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혼합발효추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001~30.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 보호용 화장료 조성물.
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