CN1111286A

CN1111286A - 从赤霉素混合物中分段提取赤霉素a4和a7的方法

Info

Publication number: CN1111286A
Application number: CN 95102240
Authority: CN
Inventors: 颜方贵
Original assignee: Beijing Agricultural University
Current assignee: Beijing Agricultural University; Beijing University of Agriculture
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 1995-11-08
Anticipated expiration: 2015-03-16
Also published as: CN1045959C

Abstract

一种从赤霉素发酵液中提取赤霉素A₄、A₇的方法，将赤霉素发酵液在pH7.0—6.8条件下浓缩20—30倍，调pH6.0，使GA₄沉淀，分离的滤液调pH4.5，使GA₇沉淀，再分离出的滤液调pH2.2，用乙酸乙脂萃取GA₃。这一工艺的特点主要是采取了分段提取法。由于赤霉素发酵滤液浓缩倍数高，每段提取过程纯度不够时，只用缓冲液清洗每一段的提取液，而不必使用反复萃取的方法，使乙酸乙酯的用量减少，这种方法不仅降低了成本，而且简化生产工艺。

Description

本发明涉及赤霉素各成份的分离提取工艺，特别是从微生物发酵的赤霉素过滤液中分段提取赤霉素A₄和A₇（GA₄、GA₇）的工艺。

目前已从自然界中发现82种赤霉素，按顺序排列为GA₁、GA₂、GA₃……GA₈₂，还有十多种组合型。这些赤霉素主要来自微生物和植物。目前活性最高的赤霉素这种类都可从微生物中发现，如GA₃、GA₄、GA₇等等。微生物还具有生长迅速、制备容易、产量高等优点，所以商业赤霉素都来自微生物发酵所获得产品。微生物中几乎都以藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）作为生产菌。该菌的多数菌株都产生多种赤霉素，例如GA₃、GA₄、GA₇、GA₉、GA₁₃等。GA₃是最早开发应用的一种赤霉素，它对植物茎叶生长的促进作用活性最强。GA₄、GA₇对植物果实细胞伸长的促进作用最为明显，目前最主要的例子是用于使苹果果实增高，称之谓“高庄苹果”或“蛇果”的生产。这种“高庄苹果”由于形状美观，颜色鲜艳而深受消费者欢迎，售价高出普通苹果数倍至数十倍。赤霉素A₄、A₇的商品通常是两者的混合物，即GA₄₊₇产品中不能混有GA₃，否则就会在增高果实的同时引起枝叶的徒长而带来落花落果弊病。另一方面，GA₇和GA₄虽有相同的方面，但也有不同的作用，比如GA₇有抑制花芽分化的现象，而GA₄没有;在引起植物单性结实的效果方面，GA₄大于GA₇;此外，还有其它方面的不同作用。为了用户的不同需要，GA₄与GA₇的分离也势在必行。

GA₄₊₇的分离提取工艺，据目前所知，有两个专利，一是82年的日本专利59106478，二是64年英国专利1174924。前者的工艺要点是先经一般的赤霉素萃取，蒸出大部分乙酸乙脂，加入正丙酮，再加N-苄基甲胺得GA₄₊₇N-苄基甲胺盐沉淀，分出不发生沉淀的GA₃。GA₄₊₇胺盐用甲醇水溶解，加酸加水使GA₄₊₇结晶析出。后一工艺是在发酵滤液中调pH4.2-5.5，乙酸乙脂萃取得GA₄₊₇，然后脱色浓缩，再在乙酸乙脂、2乙脂醚中结晶，萃取过GA₄₊₇的滤液再调pH2，乙酸乙脂萃取，脱色浓缩得GA₃结晶。

日本工艺需使用N-苄基甲胺、正丙醇、草酸等价格较高的化合物。其缺点是工序多，不能分离GA₄和GA₇。英国工艺的缺点是只分出GA₄₊₇，GA₄与GA₇也同样不能分离，纯度不够时需反复多次萃取，较繁杂。

本发明的目的是提供一种从微生物发酵液的赤霉素混合物中分离提取赤霉素A₄和A₇（GA₄、GA₇）的生产方法。

本发明的工艺是先将赤霉素发酵液在pH7.0-6.8的条件下浓缩20-30倍，调pH6.0，使GA₄沉淀，分离的滤液调pH4.5，使GA₇沉淀，再次分离出的滤液调pH2.2，用乙酸乙脂萃取GA₃。按这一工艺的特点称为分段提取法。由于赤霉素发酵滤液浓缩倍数高，每段提取过程使用乙酸乙脂很少。纯度不够时，只需用缓冲液清洗每一段的提取液，而不使用反复萃取的方法。

本发明每段分离提取的详细工艺过程为：赤霉素发酵液必须清彻透亮，压滤或离心。得到的滤液经薄膜浓缩器减压浓缩，使其浓缩到原体积的1/20-1/30。开启搅拌，缓慢加入HCl或H₃PO₄，使pH达到6.0，即出现白色至灰白片状沉淀。分出的沉淀用pH6.0缓冲液洗一次。沉淀用乙酸乙脂溶解，经高效液相色谱检测，如还有少量GA₃，GA₇，可用pH6缓冲液清洗，清洗合格后，加热有机相至60℃并加入活性炭，不断搅拌以便充分脱色，通过过滤除去炭，过滤液减压回收乙酸乙脂得GA₄结晶。

沉淀过GA₄后的滤液和清洗液，经浓缩或不浓缩再用HCl或H₃PO₄调pH4.5，使其GA₇沉淀。得到的沉淀按上述GA₄的操作步骤进行清洗，用pH4缓冲液和pH6的缓冲液清洗，以便分别洗去GA₃和GA₄的残余，直至检测合格为止，然后浓缩获得GA₇结晶。

沉淀过GA₄和GA₇的滤液和清洗液，经浓缩或不浓缩，调pH2.2，加乙酸乙脂萃取，然后脱色浓缩得GA₃结晶。

本发明的生产工艺与以前的专利工艺相比，具有下列优点和积极效果：

1、由于发酵滤液先经浓缩，溶液中赤霉素浓度加大。根据GA₃、GA₇、GA₄在不同pH值时的分配系数Kd（水相中的溶质重/有机相中的溶质重），当pH6时，GA₃的kd＝50，不出现沉淀，GA₇的kd＝0.61，GA₄的kd＝0.09，此时GA₄kd为GA₇的1/6，GA₄首先沉淀，特别在GA₇的含量小于GA₄时。pH4.5时，GA₇的kd＝0.27，GA₃的kd＝1.37，GA₃在水中的溶解度大于GA₇五倍，于是出现GA₇的沉淀。

2、清除GA₄中混入的GA₇和GA₃以及清除GA₇中混入的GA₄和GA₃，均用缓冲液清洗，而不是采用反复萃取的方法，极大的简化了工艺。

3、发酵滤液浓缩萃取，只消耗少量乙酸乙脂，清洗代替反复萃取，不用乙酸乙脂。与N-苄甲胺法相比省去的有机溶剂更多，从而降低了生产成本。

4、比以前工艺更具特色的是，可以将大部分的GA₄和GA₇分离，这是以前工艺所没有的。

图1从微生物发酵液中分段提取GA₄、GA₇工艺流程图

下面用实施例进一步叙述本发明：

实施例1：藤仓赤霉菌农大17菌株（任何能产GA₄、GA₇的菌株都可代替）发酵液60l，过滤得滤液54l，内含GA₃12.49lg，GA₇13.016g，GA₄21.199g，其它赤霉素（主要为GA₉）7.293g，薄膜浓缩后得浓缩液2.5l，搅拌下缓慢滴加2N HCl，不断出现白色片状沉淀，达到pH6.0后，继续搅拌30分钟，然后静置30分钟，使沉淀充分聚集。分出的沉淀加0.5lpH6.0缓冲液，搅拌10分钟，静置30分钟，抽出上清液。清洗过的沉淀，加乙酸乙脂1l，加热至60℃并加活性炭30g搅拌脱色30分钟，趁热过滤，滤渣用少量热乙酸乙脂洗涤，高效液相色谱（HPLC）检测，GA₇已属微量（<2%）。过滤液减压浓缩，回收乙酸乙脂得9.8g结晶和90ml母液（GA₄含量6.4%）。

将沉淀过GA₄的浓缩液2.5l和清洗液0.5l浓缩至1.5l，搅拌下，缓慢滴入2N HCl调pH4.5，沉淀GA₇。上清液吸去，0.5lpH4.5缓冲液清洗沉淀，700ml乙酸乙脂溶解沉淀，加20g活性炭脱色，除滤渣后，过滤液用pH4.5缓冲液洗5次（0.5l/次），用pH6.0缓冲液洗二次（0.5l/次），用HPLC检测合格。两种清洗液分别处理。过滤液回收乙酸乙脂后得GA₇结晶4.3克，母液65ml（含GA₇5.6%）。

将pH4.5缓冲液洗出的清洗液浓缩至0.4l，加入沉淀过GA₇的浓缩液1.5l，继续浓缩至1.0l，2NHCl调pH2.2，加乙酸乙脂萃取，浓缩回收GA₃结晶3.8克（GA₃含量70%，其它赤霉素16%），母液60ml（GA₃4.5%）。萃余液弃去。

以上得到的GA₄、GA₇、GA₃结晶，如有更高纯度要求，可以按常规进行重结晶。

实施例2：发酵浓缩滤液2.1l（浓缩25.7倍），含GA₃12.460g，GA₇14.105g，GA₄22.418g.GA₄的分离和实施例1操作相同，当沉淀溶解脱色过滤后，发现GA₇达3.2%，于是用pH6.0缓冲液1l进行清洗后才达合格，最后得GA₄结晶9.7克母液90ml（含GA₄7.2%）。

以上萃余液，清洗液一并浓缩至1.5l，沉淀操作同实施例1，用pH4.5缓冲液洗5次（0.5l/次）后，即行浓缩得结晶4.9克，其中GA₄占13%，得母液70ml（GA₇4.7%，GA₄1.8%）。

GA₃回收同实施例1。

实施例3：发酵浓缩滤液3.2l（浓缩30倍），用2NHCl调pH2.2，按实施例1中GA₃回收的方法，进行萃取浓缩，回收乙酸乙脂，得混合结晶19.2克，母液280ml。

结晶用pH8缓冲液溶解，19.2克溶于1000ml缓冲液，然后按实施例1的操作，分离GA₄、GA₇和GA₃，分别得GA₄9.5g，GA₇4.7g和GA₃4.3克。

母液也和结晶一样萃取，得GA₄母液100ml（含量5.9%），GA₇80ml（含量5.3%），GA₃60ml（含量4.5%）。

Claims

1、一种从赤霉素发酵液中提取赤霉素A₄、A₇的方法，其特征在于：

(1)、先将赤霉素发酵液在pH7.0-6.8条件下浓缩20-30倍，调pH6.0，使GA₄沉淀，分离滤液；

(2)、将上述分离的滤液，调pH4.5，使GA₇沉淀，再次分离出滤液；

(3)、将上述再次分离出的滤液，调pH2.2，用乙酸乙脂萃取GA₃。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：GA₄的提取方法是，赤霉素发酵液必须清彻透亮，压滤或离心，得到的滤液经薄膜浓缩器减压浓缩，使其浓缩到原体积的1/20-1/30，开启搅拌，缓慢加入HCl或H₃PO₄，使pH达到6.0时，即出现白色至灰白片状沉淀，分出的沉淀用pH6.0缓冲液洗一次，沉淀用乙酸乙脂溶解，经高效液相色谱检测，如还有少量GA₃，GA₇，可用pH6缓冲液清洗，清洗合格后，加热有机相至60℃并加入活性炭，不断搅拌以便充分脱色，通过过滤除去炭，过滤液减压回收乙酸乙脂得GA₄结晶。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：沉淀过GA₄后滤液和清洗液，经浓缩或不浓缩，再用HCl或H₃PO₄调pH4.5，使其GA₇沉淀;得到的沉淀按GA₄的操作步骤进行清洗，用pH4.5缓冲液和pH6的缓冲液清洗，以便分别洗去GA₃和GA₄的残余，直至检测合格为止，从而获得GA₇结晶。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：沉淀过GA₄和GA₇的滤液和清洗液，经浓缩或不浓缩，调pH2.2，加乙酸乙脂萃取，然后脱色浓缩得GA₃结晶。