CN111122752A

CN111122752A - 一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法

Info

Publication number: CN111122752A
Application number: CN202010119461.6A
Authority: CN
Inventors: 王兴龙; 任一平; 蔡强; 诸寅; 杨大进; 许娇娇
Original assignee: Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Current assignee: Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2040-02-26
Also published as: CN111122752B

Abstract

本发明公开了一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，以河豚鱼为样本，经清洗、去杂、均质、定量混合、冻干、粉碎、过筛、分装、辐照、保藏等工艺，制得候选标准物质。对分装好的标准物质，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验，确保其满足国家标准物质特性的需求。本发明的制备方法，可更好地保留基质中的原有成分，且具有较好的均匀性、稳定性、复水性以及更长的保质期，填补了国内外河豚毒素基质标准物质的空白；本发明的基质标准物质可有效评价相关实验室的河豚毒素检测能力和水平，可用于河豚毒素定性定量分析的质量控制，确保水产品中河豚毒素检测的准确性，为食品安全保驾护航。

Description

一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法

技术领域

本发明属于计量技术领域，具体涉及一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法。

背景技术

河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）是鲀鱼类（俗称河豚鱼）及其它生物体内含有的一种生物碱，其分子式为C₁₁H₁₇O₈N₃，为氨基全氢喹唑啉型化合物，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，其毒性比氰化物还要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。长期以来，国内外学者对河豚毒素的起源进行了一系列研究。目前，多数专家学者认为，TTX 的真正来源不是动物本身, 而是通过食物链聚集或由其共生的微生物产生。人工饲养时，通过把握水源与投喂的饲料，改变河豚的食物链，能有效控制河豚毒素的产生，但对于人工养殖的河豚鱼也需要严格监控其毒素含量，确保食用安全。

随着河豚毒素的毒理、形态以及代谢分析的深入，水产品中河豚毒素必将是食品安全检测关注的重点内容，与之配套的检测技术需要进一步成熟并成体系，河豚毒素相关的基质标准物质的需求更加迫切。截止目前，查阅文献与国际权威标准物质数据库（例如国际标准物质数据库COMAR、欧盟标准物质数据库IRMM和ERM、美国National Institute ofStandards and Technology (NIST) 、加拿大National Research Council of Canada(NRCC)等），世界各国食品基质生物毒素类标准物质均不包括河豚毒素基质标准物质。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，填补国内外河豚毒素基质标准物质的空白，且制备的标准物质具有良好的均匀性和稳定性。

为达到上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：

一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，包括以下步骤：

S1. 样本采集：采集野生河豚鱼作为基质标准物质的阳性样本，养殖的河豚鱼作为阴性样本；

S2. 样本处理：分别将阳性样本和阴性样本分解出肌肉、肝脏，称量后将组织剪碎，充分均质；

S3. 候选物制备：

① 利用液相色谱-串联质谱法，对阳性、阴性样本中的河豚毒素含量进行测定，然后按照预设的标准物质总质量、毒素含量，计算出阳性样本、阴性样本混合所需的质量，按计算值混合阳性样本和阴性样本；

② 将混合样本搅拌混匀，再进行冷冻干燥；

③ 将干燥后的块状样本粉碎过筛，得到河豚毒素成分分析候选物；

S4. 候选物的分装、保藏：将得到的候选物混匀，然后随机抽取至少10份小样，进行均匀性初筛，如果测得小样的河豚毒素含量的RSD≤5%，则可作为河豚毒素成分分析标准物质进行样本分装，否则继续延长混匀时间；样本分装密封，经Co-60 γ 射线照射灭菌后，在-20～-80℃冷冻保存。

S5. 性能评估：对步骤S4制备的候选物，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验。

本发明所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法选取野生河豚鱼和养殖河豚鱼分别作为阳性样本和阴性样本，并选择河豚鱼的肝脏、肌肉作为基体，通过阳性样本和阴性样本的混合获得所述毒素含量的标准物质，因此本发明的标准物质基质全部来自于河豚鱼，无任何添加物，避免了其应用时杂质的干扰，可更好的保留基质中的原有成分，提高了检测的准确性，还对制得的标准物质进行最小取样量、均匀性、稳定性检验来评价标准物质的质量，满足一级标准物质技术规范（JJG 1006-94）的要求，因此本发明的制备方法科学、可靠。

优选的，步骤S5中最小取样量和均匀性采用F检验进行分析；稳定性包括25℃短期稳定性和4℃长期稳定性。

进一步的，分别对均匀性和稳定性的检验结果合成标准物质定值不确定度。

优选的，步骤S3中冷冻干燥的具体过程和工艺参数如下：预冻温度 -25～-30℃，预冻时间1 h；升华干燥设定为两个阶段，第一阶段升华温度设定为-15～-25℃，升华时间10～15h，第二阶段升华温度设定为 -4～-8℃，升华时间10～15h；解析干燥温度设定为10～20℃，解析干燥时间5～10h。通过预冻-两阶段升华-解析干燥过程确保混合样本脱水完全，避免后期储存过程快速变质，提高稳定性，延长保质期。

进一步的，冷冻干燥前需要将混匀的组织样本平铺，平铺厚度在1～4cm。将混合样本平铺后进行预冻-两阶段升华-解析干燥处理，并控制平铺厚度，降低样本内部脱水难度，确保脱水完全的同时有效加快了脱水速度。

优选的，步骤S3混合样本混匀过程采用旋转搅拌机连续搅拌至少2h；步骤S4候选物混匀过程采用三维混匀机至少混匀12h。严格控制混匀时间，确保混匀效果良好，提高标准物质的均匀性。

优选的，步骤S3中过筛目数为75～100目，提升样本均质化程度，进而提高成品质量。

优选的，所述步骤S4中样本分装密封后经Co-60γ射线照射灭菌再进行冷冻保存。

本发明的目的之二在于提供由上述方法制备的河河豚毒素成分分析标准物质。

本发明的目的之三在于提供所述河豚毒素成分分析标准物质的用途，包括水产品中河豚毒素检测方法的验证，以及实验室间对河豚毒素检测能力和水平的考核。

本发明的有益效果如下：

本发明的河豚毒素成分分析标准物质和制备方法，填补了国内外河豚毒素基质标准物质的空白，响应了国务院印发的《计量发展规划（2013-2020年）》，且制备方法简单、可靠，得到的样品具有较好的均匀性、稳定性、复水性以及更长的保质期。本发明的标准物质可有效评价相关实验室的河豚毒素检测能力和水平，可用于河豚毒素定性定量分析的质量控制，确保水产品中河豚毒素检测的准确性，为食品安全保驾护航。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂

仪器：Aquity H超高压液相色谱仪美国沃特世有限责任公司；Waters TQD 三重四级杆串联质谱仪美国沃特世有限责任公司；Milli-Q 超纯仪美国Millipore 公司；涡旋振荡器德国海道夫有限公司；高速冷冻离心机德国Sigma公司；1ml 移液枪德国brand公司

试剂：河豚毒素纯标准物质西班牙Laboratorio CIFGA S.A.；免疫亲和净化柱江苏美正生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）德国Merck；甲酸、乙酸、甲酸铵（均为色谱纯），0.22 μm 尼龙针式滤膜上海安普实验科技股份有限公司；超纯水（Millipore 纯水仪制备）；50 mL离心管美国康宁公司。

1.2 河豚毒素含量测定方法

依据标准：GB5009.206—2016水产品中河豚毒素的测定液相色谱-串联质谱法；

方法原理：样本经1%乙酸-甲醇溶液提取，免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定；

前处理过程：准确称取0.4 g样品（精确到0.001g）加入1.6 ml水复溶，在加20ml 1%乙酸-甲醇溶液，涡旋振荡15 min，8000r/min离心5min，准确移取1mL上清液，加入10mLPBS溶液进行稀释，用氢氧化钠溶液（1mol/L）调pH 在7～8范围内，待净化；将免疫亲和柱中封存的PBS溶液以自然流速放出，加入待净化液，以1滴/s的流速过柱，再用10mL水淋洗，抽干，先后用4mL乙酸-甲醇溶液（2+98），1ml 水洗脱，洗脱液过0.22μm 的有机相微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱分析。

2 标准物质样品制备

根据持续几年的我国舟山沿海区域野生河豚鱼不同种类、不同部位、不同季节的监测结果发现，大多数种类的河豚鱼均含有河豚毒素，卵巢、肝脏部位中的毒素含量明显高于鱼肉中的含量，且春季时节的含量高于冬季时节的含量。在舟山沿海区域的渔民手中收集到500 kg 野生河豚鱼用以制作标准物质。

具体过程如下：

S1. 样本采集：春季时节，采集野生河豚鱼作为基质标准物质的阳性样本。同时，购买养殖的河豚鱼作为阴性样本；快速冷冻后，寄往实验室。

S2. 样本处理：将样本分别解冻后，用去离子水洗净，滤纸吸干，去除鱼皮、内脏、鱼骨等，分解出肌肉、肝脏，称量后将组织剪碎，置于斩拌机中高速均质30 min左右，至无明显丝状物质。

S3. 候选物制备：

① 利用液相色谱-串联质谱法，对阳性、阴性样本中的河豚毒素含量进行测定，然后按照预设的标准物质总质量、毒素含量，计算出阳性样本、阴性样本混合所需的质量，按计算值混合阳性样本和阴性样本；本研究标准物质总质量预设40kg，含量为2500μg/kg（以湿重记）。初步测试阳性样本TTX含量为11600μg/kg，阴性样本的TTX含量为57μg/kg。经计算，需要阳性样本约8.47kg，阴性样本约31.53kg。

②利用旋转搅拌机，将混合样本连续搅拌2小时以上；将混匀后的组织平铺在相适应的

干净金属盘内，平铺厚度2 cm；将样本进行冷冻干燥脱水：预冻温度 -30℃，设定时间1h，持续时间1h；升华干燥初步设定为2个阶段，第1阶段升华温度设定为-20℃，升华时间12h，第2阶段升华温度设定为-5℃，升华时间12h；解析干燥温度设定为15℃，解析干燥时间8 h；

③ 将干燥后的块状样本粉碎机粉碎后，过80目筛，得到河豚毒素成分分析候选物。

S4. 标准物质制备：将得到的候选物，在三维混匀机中再次混匀12h；将混匀后的样本，随机抽取10份小样，进行均匀性初筛，测得10份小样的河豚毒素含量（μg/kg）分别为10497.2 、10625.8 、10836.5、 10714.7 、11664.7 、11047.4、 11360.4 、11642.7 、11460.9 、11487.7， RSD≤5%；将样本，以每瓶5g的质量分装于棕色聚乙烯瓶中，螺旋密封后，在-20℃冷冻保存（为保证河豚鱼肉中TTX标准物质的稳定性，防止其变质，所有包装经Co-60 γ射线照射灭菌，照射剂量为5KGy）。

S5. 性能评估：对步骤S4制备的标准物质，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验，

具体方法和结果如下：

① 最小取样量

根据一级标准物质技术规范（JJG 1006-94）、标准物质定值的通用准则及统计学原理的要求（JJF 1343-2012）的规定，按不同取样量（0.2g、0.4g和0.8g）考察取样量对河豚鱼组织中河豚毒素成分分析基质标准物质均匀性的影响。在同一瓶样品中，同时称取0.2g、0.4g和0.8g，对同一取样量，取9份做平行性检测。采用单因素方差分析（F检验）对测试结果进行分析：计算F值，查F分布临界值Fa，当样品F﹤Fa时，表明设定的取样量对检测结果无显著性影响；当样品F>Fa时，表明设定的取样量对检测结果有显著性影响，从而确定最小取样量。最小取样量的检验结果见表1。

表1 不同取样量的河豚毒素含量测定结果/（含量单位：μg/kg）

从检测结果可以看出，0.2g、0.4g与0.8g的取样量对检测结果无显著性影响。但是称样量越小，对均匀性影响越大。从整个检测过程考虑，建议最小取样量设定为0.4 g，后续均匀性、稳定性检验，均按照0.4g的称样量进行检测。

② 均匀性检验

根据标准物质定值的通用准则及统计学原理的要求（JJF 1343-2012）的规定，在分装的1200瓶标准物质中，随机抽取30瓶样本进行均匀性检验，每个样本取3份做平行性检测。样本检测顺序严格按照事先设定的随机顺序进样检测，以防止测量***的时间变差（测量过程中的飘移）干扰均匀性评估。采用单因素方差分析（F检验）对测试结果进行分：计算F值，查F分布临界值Fa，当样品F﹤Fa时，表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。均匀性检验结果见表2。

表2河豚鱼中TTX均匀性分析检测及统计结果

③ 稳定性检验

稳定性是标准物质的重要参数之一，它是指在规定的时间间隔和环境条件下，标准物质的特性量值保持在规定范围内的性质。标准物质的稳定性是用来描述标准物质的特性量值随时间变化的。规定的时间间隔越长，表明该标准物质的稳定性越好。本专利中考察了所研制标准物质在模拟运输条件下的短期稳定性和储存条件下的长期稳定性。

a. 短期稳定性检验

短期稳定性检验采用同步稳定性评估的方式，考察样品14天内在25℃条件下的稳定性。按照先密后疏的原则，将放置在25℃环境温度中的样品分别于第0、1、3、7、14天后转移到参考温度条件（-20℃）下继续保存。每个时间点取3个单元样品，在同一时间检测所有的15个单元样品，每个单元取1个子样，按照“1.2 分析方法”进行检测，做短期稳定性检验。检验结果见表3。

表3 标准物质短期稳定性检验分析结果（µg/kg）

利用直线拟合法，对所得结果进行统计分析，结果见表4。|b1/ S(b1)| <t（0.95,13），说明研制的标准物质在短期内运输期间不会发生明显变化。我们不期望标准物质的量值在运输过程中发生变化，所以其引起的不确定忽略不计。

表4 标准物质短期稳定性统计结果（µg/kg）

b. 长期稳定性检验

长期稳定性检验采用同步稳定性评估的方式，考察样品6个月内在4℃条件下的稳定性。按照先密后疏的原则，将放置在4℃环境温度中的样品分别于第0、1、3、6月后转移到参考温度条件（-20℃）下继续保存。每个时间点取4个单元样品，在同一时间检测所有的16个单元样品，每个单元取1个子样，按照“1.2 分析方法”进行检测，做长期稳定性检验。检验结果见表5。

表5标准物质短期稳定性统计结果（µg/kg）

利用直线拟合法，对所得结果进行统计分析，结果见表6。|b1/ S(b1)| <t（0.95,13），说明研制的标准物质在4℃条件下，避光保存6个月是稳定的，其引起的相对不确定为4.29%。表6 标准物质长期稳定性结果（µg/kg）

综上所述，本发明涉及一种河豚鱼组织中河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，以野生河豚鱼、饲养河豚鱼的鱼肉、鱼肝为原料，经过清洗、去皮、均质、冻干、粉碎、过筛、辐照、保藏等工艺，制备成均匀、稳定的标准物质。

上述具体实施方式是对本发明的解释，但本发明的设计构思不局限于此，但凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims

1.一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S3. 候选物制备：

② 将混合样本搅拌混匀，再进行冷冻干燥；

S4. 标准物质制备：将得到的候选物混匀，然后随机抽取至少10份小样，进行均匀性初筛，如果测得小样的河豚毒素含量的RSD≤5%，则可作为河豚毒素成分分析标准物质进行样本分装，否则继续延长混匀时间；样本分装密封，在-20～-80℃冷冻保存，

S5. 性能评估：对步骤S4制备的标准物质，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验。

2.根据权利要求1所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：步骤S5中最小取样量和均匀性采用F检验进行分析；稳定性包括25℃短期稳定性和4℃长期稳定性。

3.根据权利要求2所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：分别对均匀性和稳定性的检验结果合成标准物质定值不确定度。

4.根据权利要求1所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：步骤S3中冷冻干燥的具体过程和工艺参数如下：预冻温度 -25～-30℃，预冻时间1 h；升华干燥设定为两个阶段，第一阶段升华温度设定为-15～-25℃，升华时间10～15h，第二阶段升华温度设定为 -4～-8℃，升华时间10～15h；解析干燥温度设定为10～20℃，解析干燥时间5～10h。

5.根据权利要求4所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：冷冻干燥前需要将混匀的组织样本平铺，平铺厚度在1～4cm。

6.根据权利要求1所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：步骤S3混合样本混匀过程采用旋转搅拌机连续搅拌至少2h；步骤S4候选物混匀过程采用三维混匀机至少混匀12 h。

7.根据权利要求1所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：步骤S3中过筛目数为75～100目。

8.根据权利要求1所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中样本分装密封后经Co-60γ射线照射灭菌再进行冷冻保存。

9.根据权利要求1～8任一所述的制备方法制得的河豚毒素成分分析标准物质。

10.根据权利要求9所述河豚毒素成分分析标准物质的用途，包括水产品中河豚毒素检测方法的验证，以及实验室间对河豚毒素检测能力和水平的考核。